Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes för engineering neural-liknande vävnad

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62691

Summary

Här rapporterar vi en metod för 3D bioprinting murine när astrocyter för biofabricating neural-liknande vävnader att studera funktionaliteten hos astrocyter i centrala nervsystemet och mekanismerna som involverar gliaceller i neurologiska sjukdomar och behandlingar.

Abstract

Astrocyter är gliaceller med en viktig roll i centrala nervsystemet (CNS), inklusive neuronalt stöd och funktionalitet. Dessa celler svarar också på neurala skador och verkar för att skydda vävnaden från degenerativa händelser. In vitro-studier av astrocyternas funktionalitet är viktiga för att belysa de mekanismer som är involverade i sådana händelser och bidra till att utveckla terapier för att behandla neurologiska störningar. Detta protokoll beskriver en metod för att biofabricera en neural-liknande vävnad struktur rik på astrocyter genom 3D bioprinting astrocyter-lastad bioink. En extrudering-baserade 3D bioprinter användes i detta arbete, och astrocyter extraherades från C57Bl/6 möss pups hjärnan cortices. Bioinken förbereddes genom att blanda när astrocyter från upp till passage 3 till en biomaterial lösning bestående av gelatin, gelatin-metakryloyl (GelMA) och fibrinogen, kompletterad med laminin, som presenterade optimala bioprinting villkor. 3D bioprinting villkor minimerade cell stress, bidrar till hög livskraft av astrocyterna under processen, där 74,08% ± 1,33% av cellerna var livskraftiga direkt efter bioprintning. Efter 1 veckas inkubation ökade astrocyternas livskraft signifikant till 83,54% ± 3,00%, vilket indikerar att 3D-konstruktionen representerar en lämplig mikromiljö för celltillväxt. Biomaterial kompositionen tillät cellfäste och stimulerat astrocytiskt beteende, med celler som uttrycker den specifika astrocytmarkören glia fibrillary acidic protein (GFAP) och har typisk astrocytisk morfologi. Detta reproducerbara protokoll ger en värdefull metod för att biofabricera 3D neuralliknande vävnad rik på astrocyter som liknar cellernas inhemska mikromiljö, användbar för forskare som syftar till att förstå astrocyternas funktionalitet och deras relation till mekanismerna som är involverade i neurologiska sjukdomar.

Introduction

Astrocyter är den vanligaste celltypen i centrala nervsystemet (CNS) och spelar en nyckelroll i hjärnans homeostas. Förutom bestående neuronalt stöd är astrocyter ansvariga för att modulera signalsubstanser upptag, upprätthålla blod - hjärnbarriärens integritet och reglera neuronal synaptogenes1,2. Astrocyter har också en viktig roll i CNS-inflammation, som svarar på skador på hjärnan i en process som leder till astrocitär reaktivitet eller reaktiv astroglios3,4, som bildar ett gliaärr som förhindrar hälsosam vävnadsutställning till degenerativa medel5. Denna händelse resulterar i förändringar i astrocyternas genuttryck, morfologi och funktion6,7. Därför är studier som involverar astrocyters funktionalitet till hjälp för utvecklingen av terapier för att behandla neurologiska störningar.

In vitro-modeller är avgörande för att studera mekanismer relaterade till neurologiska skador, och även om framgångsrik isolering och tvådimensionell (2D) kultur av kortikala astrocyter har etablerats8, misslyckas denna modell med att ge en realistisk miljö som efterliknar infödda cellbeteenden och reproducerar hjärnans komplexitet9 . I 2D-tillstånd påverkar det dåliga mekaniska och biokemiska stödet, lågcells- och cellmatrisinteraktioner och cellutplattande som leder till frånvaron av basala-apisk polaritet cellsignaleringsdynamik och experimentella resultat som leder till förändrad cellmorfologi och genuttryck, vilket äventyrar svaret på behandlingar10. Därför är det viktigt att utveckla alternativ som ger en mer realistisk neural miljö, som syftar till att översätta resultaten till kliniken.

Tredimensionell (3D) cellkultur representerar en mer avancerad modell som rekapitulerar med ökade trohetsegenskaper hos organ och vävnader, inklusive CNS11. När det gäller gliakultur bidrar 3D-modeller till upprätthållandet av astrocytermorfologi, cell basala-apisk polaritet och cellsignalering12,13. 3D-bioprinting-tekniken framträdde som ett kraftfullt verktyg för att biofabricera 3D-levande vävnader på ett kontrollerat sätt genom att använda celler och biomaterial för att återskapa strukturen och egenskaperna hos inhemska vävnader. Användningen av denna teknik har lett till en betydande förbättring av resultatprognosen och har bidragit till regenerativ medicin som tillämpas på CNS14,15,16.

Protokollet som beskrivs här beskriver isoleringen och kulturen av när astrocyter. Protokollet beskriver också en reproducerbar metod för bioprint astrocyter inbäddade i gelatin/gelatin metakryloyl (GelMA)/fibrinogen, kompletterad med laminin. I detta arbete användes en extruderingsbaserad bioprinter för att skriva ut biomaterialkompositionen som innehåller näraly astrocyter med en densitet av 1 x 106 celler/ml. Bioprinting skjuvning stress minimerades genom att kontrollera utskriftshastigheten, och astrocyter visade hög livskraft efter processen. Bioprintade konstruktioner odlades i 1 vecka, och astrocyter kunde sprida, fästa och överleva inom hydrogelen, upprätthålla den astrocytiska morfologin och uttrycka en specifik markör glia fibrillary surt protein (GFAP)4.

Denna procedur är kompatibel med kolvdrivna extruderingsbaserade bioprinters och kan användas för att bioprint astrocyter som härrör från olika källor. Den 3D-bioprintade modellen som föreslås här är lämplig för ett brett spektrum av neurala tekniska tillämpningar, såsom studier av mekanismerna som är involverade i astrocytfunktionalitet i friska vävnader och förståelse för progressionen av neurologiska patologier och behandlingsutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurs försök följde internationella riktlinjer för djuranvändning inom forskning (http://www.iclas.org) och godkändes av Kommittén för etik vid Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Möss hjärn dissekering

  1. Överför 10 ml kall hanks buffrad saltlösning (HBSS) till en 100 mm odlingsfat och 1 ml till ett 1,5 ml mikrorör. Förbered ett mikrorör per djur.
    OBS: Både odlingsfatet och mikrotuben måste förvaras på is.
  2. Förbered astrocyter odlingsmedium med DMEM F12 + 10% fetala nötkreatursserum (FBS), 2% glutamin och 1% Penicillin-Streptomycin (P/S). Sterilisera mediet genom filtrering med ett 0,2 μm-filter.
  3. Avliva C57Bl/6 mössvalpar (postnatal dag 1) genom halshuggning med en vass arbetssax. Använd tång, dra huden och exponera skallen. Se till att både saxar och tångar steriliseras med 70% etanol.
  4. Skär skallen från foramen magnum till toppen av huvudet längs sagittalplanet med en skarp böjd spetssax.
    OBS: Se till att encefalisk vävnad inte är skadad.
  5. Använd en spatel som tidigare steriliserats med etanol 70%, lyft hjärnan från hjärnskålen och placera den i odlingsskålen som innehåller 10 ml kall HBSS.
  6. Placera odlingsfatet som innehåller hjärnan under stereomikroskopet och ta bort hjärnhinnorna från hjärnanmedtvå trubbiga spetsar .
  7. Separera cortices från resten av hjärnan genom att försiktigt rulla dem bort från hjärnans medianlinje med hjälp av en spatel.
  8. Samla båda cortices och överför dem omedelbart till samma mikrorör som innehåller 1 ml kall HBSS.

2. Astrocytes isolering och kultur

  1. Skär den kortikala vävnaden i små bitar under laminärt flöde och tvätta dem med 1 ml HBSS genom att pipettera upp och ner 3x. Vänta tills vävnaden lugnar ner sig. Ta bort HBSS och tillsätt färsk HBSS, upprepa processen ytterligare två gånger.
  2. Ta bort HBSS och inkubera vävnaden med 1 ml 0,05% trypsin vid 37 °C i 5 min.
    OBS: Endast trypsin matsmältning är tillräckligt vid denna tidpunkt.
  3. Separera vävnaden mekaniskt genom att försiktigt pipettera upp och ner 15x.
    OBS: Den fullständiga dissociationen av vävnaden observeras av ökningen av suspensionen grumlighet och av frånvaron av stora fragment av vävnad i suspensionen.
  4. Överför lösningen till ett koniskt rör på 15 ml, neutralisera trypsinaktiviteten genom att tillsätta en lika stor mängd FBS och filtrera lösningen i ett cellsilfilter på 0,4 μm för att avlägsna icke-dissocierade fragment.
  5. Tvätta filtret med 1 ml astrocytermedium, samla cellfjädringen som passerade genom silen och centrifugera det i 5 min vid 200 x g och 25 °C. Efter centrifugering kassera supernatanten och suspendera pelleten i 1 ml astrocytkulturmedium.
  6. Överför cellfjädringen till en T25-odlingskolv, utgör volymen av mediet till 3,5 ml och inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2.
  7. Se till att cellerna är vidhäftande efter 24 timmar. Byt sedan ut mediet och byt det var tredje dag.
  8. Efter 7 dagar, ta bort mikroglia och oligodendrocyter från kulturen genom att tvätta cellerna med 2 ml 1x PBS.
  9. Byt ut PBS-lösningen mot astrocytkulturmediet och lämna odlingskolven i en orbital shaker vid 180 varv/min över natten.
    OBS: Astrocyter bildar ett sammanflöde monolayer i cirka 10-12 dagars kultur.

3. Syntes av gelatin metakryloyl (GelMA)

  1. Väg 10 g gelatin från svinhud och lös upp i 100 ml PBS genom att låta lösningen röra om på en värmeplatta vid 240 varv/min och 50 °C tills den är helt upplöst.
  2. Tillsätt 2 ml metakrylichydrid (MA) under en huva för en låg grad av funktionalisering och låt gelatinemulsionen röra om vid 240 varv/min och 50 °C i 2 timmar.
    VARNING: MA-farobeskrivning: H302 + H332 (skadligt vid förtäring eller inandning), H311 (giftigt i kontakt med huden), 314 (orsakar svåra hudbrännskador och ögonskador), 315 (orsakar hudirritation), H317 (kan orsaka allergisk hudreaktion), H318 (orsakar allvarliga ögonskador), 331 (giftig vid inandning), H332 (skadlig vid inandning), H335 (kan orsaka andningsirritation). Hanteringsriktlinjer: P261 (undvik att andas damm/rök/gas/dimma/ånga/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (OM I ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta bort kontaktlinser, om de finns och är lätta att göra. Fortsätt skölja. Ring omedelbart giftcenter/läkare), P301 + P312 + P330 (OM DU SVÄLJER: Ring giftcentralen/läkaren om du känner dig sjuk. Skölj munnen).
    OBS: Lägg till MA mycket långsamt, släpp för droppe.
  3. Späd gelatin-MA-lösningen i 100 ml förvärmd PBS (50 °C) för att erhålla 200 ml slutlig volym och låt lösningen röra vid 240 varv/min och 50 °C i 10 min.
  4. Skär ~20 cm dialysmembran (molekylär cutoff 12-14 kDa) och blötlägg det i avjoniserat vatten tills det är mjukt.
    OBS: Fyll membranen med avjoniserat vatten för att se till att det inte finns några hål eller defekter.
  5. Överför gelatin-MA-lösningen till membranen med hjälp av en tratt.
    OBS: Stäng båda sidor och lämna extra utrymme inuti för att tillåta blandning.
  6. Placera membranen som innehåller gelatin-MA-lösningen i en behållare med 2 L destillerat vatten för dialys, så att de kan röra vid 40 °C i 5 dagar (500 varv/min).
    OBS: Täck behållaren för att undvika vattenavdunstning.
  7. Byt destillerat vatten två gånger på en dag. Vänd membranen upp och ner för homogenisering varje gång.
  8. Blanda 200 ml förvärmt ultrapurvatten (40 °C) på den dialyserade gelatin-MA på femte dagen och låt det röra sig i 15 minuter vid 40 °C.
  9. Överför gelatin-MA-lösningen till 50 ml koniska rör upp till 25 ml och låt rören ligga kvar vid -80 °C i 2 dagar.
    OBS: Förvara rören horisontellt för att underlätta frystorka.
  10. Frys frys de frysta lösningarna i 3-5 dagar och förvara den frystorkade GelMA som är skyddad mot fukt.

4. Bioink-beredning

OBS: För att erhålla 1 ml biobläck rekommenderas att tillverka minst 3 ml biomateriallösning, eftersom det kan finnas förluster under filtreringen.

  1. Beredning av fibrinogenlösning
    1. Förbered saltlösning (NaCl 0, 9%) i avjoniserat vatten och lös upp 10 mg fibrinogen från bovin plasma i 1 ml av saltlösningen för att erhålla en koncentration på 10 mg/ml.
      OBS: Använd inte glaskolvar för att förbereda fibrinogenlösningen som fibrinogen adsorberar till glas.
    2. Låt lösningen omröras vid 37 °C tills fullständig upplösning av fibrinogen har upplösts.
      OBS: För fibrinogenupplösning, använd ett roterande system placerat inuti en ugn vid 37 °C. Magnetisk omrörning (180 varv/min) av fibrinogen på en kokplatta vid 37 °C är också lämplig. Under detta tillstånd tar 10 mg/ml fibrinogen cirka 40 minuter att lösa upp.
  2. Beredning av gelatin/GelMA-lösning
    1. Väg 0,12 g gelatin och tillsätt det till 1,9 ml förvärmt PBS (40 °C) för att erhålla en slutlig koncentration på 4% (w/v) gelatin. Virvel för att underlätta upplösning.
    2. Håll emulsionen vid 40 °C tills den är helt upplöst.
    3. Väg 0,06 g frystorkad GelMA och överför till gelatinlösningen för att få en slutlig koncentration på 2% (w/v) GelMA. Virvel för att underlätta upplösning.
    4. Håll lösningen vid 40 °C tills den är helt upplöst.
  3. Beredning av astrocytladdat gelatin/GelMA/fibrinogen bioink
    1. Pipett 0,9 ml av 10 mg/ml fibrinogenlösning och överför till gelatin/GelMA-lösningen för att erhålla en slutlig koncentration på 3 mg/ml fibrinogen.
    2. Väg 0,015 g fotoinitator (PI) och överför till gelatin/GelMA/fibrinogenlösningen för att uppnå en slutlig koncentration på 0,5% (w/v) PI. Blanda lösningen genom att vända röret upp och ner och håll det vid 40 °C skyddat mot ljus för att undvika PI-nedbrytning.
      OBS: Fyll biobläcket vid 4 °C i högst 24 timmar.
    3. Filtrera lösningen med ett 0,2 μm-filter under laminärt flöde i ett sterilt koniskt rör på 15 ml.
      OBS: Biomateriallösningen ska vara vid 37-40 °C för att möjliggöra filtrering.
    4. Överför 980 μL av biomateriallösningen till ett koniskt rör på 15 ml.
    5. Späd laminin i saltlösning för att erhålla en lagerlösning på 100 μg/ml.
    6. Pipett 20 μL laminin och överför till röret som innehåller biobläcket för att erhålla en slutlig koncentration på 2 μg/ml laminin.
    7. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner och undvik bubblor. Om några bubblor kvarstår, centrifugera det koniska röret vid 200 x g i 2 min. Håll biobläcket vid 37 °C tills det blandas med cellerna.
    8. Trypsinize primära astrocyter med 0.05% trypsin i 5 min.
      OBS: Använd astrocyter från passagerna 1 till 3.
    9. Neutralisera trypsinaktiviteten med FBS i ett förhållande av 1:1 och överför cellerna till ett koniskt rör på 15 ml. Centrifugera den vid 200 x g i 5 min.
    10. Räkna cellerna och överför 1 x 106 celler till ett annat koniskt rör. Centrifugera den vid 200 x g i 5 min.
    11. Ta bort supernatanten och lämna en liten volym (~200 μL) för att suspendera cellpelleten genom att försiktigt knacka på botten av det koniska röret.
    12. Överför 1 ml gelatin/GelMA/fibrinogenlösning till röret som innehåller cellerna och rör försiktigt upp och ner för att homogenisera, vilket ger en slutlig koncentration på 1 x 106 celler/ml.

5. Beredning av tvärlänkslösningen

  1. Thrombin rekonstitution
    1. Förbered en stamlösning av trombin 100 U/ml i sterilt avjoniserat vatten med 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i ett koniskt rör på 15 ml. Lager i mikrorör vid -20 °C.
      OBS: Använd inte glaskolvar för att förbereda lagerlösningen eller förvara alikvoterna som trombin adsorberar till glas.
  2. Beredning av thrombin-CaCl2-lösning
    1. Pipettera 100 μL trombinbuljonglösning och överför till ett koniskt rör på 50 ml som innehåller 8,9 ml sterilt avjoniserat vatten för att erhålla en slutlig koncentration av 1 U/ml trombin.
    2. Förbered en 10% (w/v) CaCl2-lösning i avjoniserat vatten och sterilisera med ett 0,2 μm-filter.
    3. Överför 1,1 ml av 10% CaCl2-lösningen till koniskt rör som innehåller trombin, för att erhålla ett slutligt förhållande på 1:9 (CaCl2 till trombin).
      OBS: Förbered tvärlänkslösningen på den volym som ska användas i experimentet och undvik lagring.

6. Bioprinting astrocyt-laddad biobläck med hjälp av en extruderingsbaserad bioprinter

  1. Design av neural vävnaden
    1. Med hjälp av G-koden: konstruera ett rutnät på 6 x 6 mm (kvadratisk form) med 1 mm avstånd mellan varje biotryckt linje på X- och Y-axeln och 6 lager på Z-axeln (0,2 mm mellan varje linje); ställ in extruderingen (E) till 0,01 mm och öka 0,001 mm vid varje nytt skikt på Z-axeln, och ställ in utskriftshastigheten (F) till 400 mm/min(Kompletterande information).
  2. Bioprinter konfigurerad
    1. Utsätt maskinen för UV-ljus i 15 minuter och torka sedan av den med etanol 70%.
    2. Slå på bioprintern med strömbrytaren. Anslut maskinen till datorn via en USB-kabel. Öppna styrprogramvaran för att ansluta den till bioprintern och ladda fildesignen.
  3. Beredning av bioprintningsspruten
    1. Överför den astrocytladdade gelatin-gelma/fibrinogenbioinken till en 5 ml plastspruta med en 1 000 μL-pipett.
      OBS: Överför långsamt för att undvika bubbelbildning.
    2. Anslut en steril 22 G trubbig nål till sprutan.
      OBS: Låt sprutan vara 4 °C i 2 minuter.
    3. Anslut sprutan till bioprinterns skrivhuvud och spola biobläcket manuellt för att ta bort de återstående bubblorna.
  4. Bioprinting
    OBS: Bioprinting utfördes utanför laminär huven.
    1. Placera en 35 mm skål på bioprinterbordet och placera nålen 0,1 mm bort från odlingsskålens yta för att tillåta nålens rörelse.
      OBS: Använd en 35 mm odlingsskål för varje bioprinting.
    2. Tryck på knappen Skriv ut.
    3. När bioprinten är över, se till att sprutan rör sig bort från skålen. Stäng sedan kulturrätten och förbered dig för tvärbindningsprocessen.
      OBS: Bioprintningen av en konstruktion tar cirka 1 min och 10 s.
  5. Korslänkning av den biotryckta konstruktionen och kulturen
    1. Placera odlingsfatet under UV-ljus på 2 mW/cm2 för 2 x 60 s (upp och ner) för GelMA-tvärbindning.
    2. Överför den biotryckta konstruktionen under laminärt flöde till en 24-välplatta med en steril spatel.
    3. Tillsätt 500 μL trombin/CaCl2-lösning och låt fibrinlinka i 30 minuter.
    4. Ta bort tvärbindningslösningen och tvätta konstruktionen med 2 ml PBS 1x. Byt sedan ut PBS med 1 ml astrocytkulturmedium och inkubera vid 37 °C och 5% CO2. Byt medium var tredje dag.

7. Bedömning av astrocyternas livskraft

  1. Livskraften hos bioprintade astrocyter
    1. Överför den biotryckta konstruktionen till en 35 mm odlingsfat med en spatel.
    2. Tvätta konstruktionen med 1 ml 1x PBS.
    3. Sätt 100 μL av levande/döda reagens över konstruktionen och håll det vid 37 °C i 30 minuter, så att det skyddas mot ljus.
    4. Ta bort Live/Dead-reagenset och tvätta konstruktionen med 1 ml 1x PBS.
    5. Överför provet till en konfokal skål med hjälp av en spatel och observera cellerna i konstruktionen under ett konfokalt mikroskop med hjälp av 488 och 570 nm excitation för bildförvärv.
      OBS: Använd en förstoring på 10x för en övergripande visualisering av cellerna i konstruktionen.
    6. Se till att provet sitter platt. Placera vid behov ett täckblad över provet för att öka planheten.
      OBS: Se till att den konfokala skålen är väl förseglad under avbildningen för att förhindra att provet torkar ut.
    7. Beräkna antalet livskraftiga (gröna) och döda (röda) med hjälp av en beräkningsprogramvara.
  2. Livskraften hos 2D-astrocytkulturen
    1. Frö 0,5 x 106 astrocyter (passage 1-3) i en 35 mm konfokal skål, tillsätt astrocytermedium och inkubera dem vid 37 °C och 5% CO2.
    2. När cellerna är sammanflöde, ta bort odlingsmediet och tvätta med 1 ml 1x PBS.
    3. Sätt in 200 μL av det levande/döda reagenset och håll skålen vid 37 °C i 30 minuter, skyddad mot ljus.
    4. Ta bort live/dead-reagenset och tvätta cellerna med 1 ml 1x PBS.
    5. Ta skålen till ett konfokalt mikroskop i kombination med en digitalkamera och använd 488 och 570 nm excitation för bildförvärv.
    6. Beräkna antalet livskraftiga (gröna) och döda (röda) med hjälp av en beräkningsprogramvara.

8. Immunstaining av astrocyter

  1. Glialfibrillary surt protein (GFAP) färgning av 3D bioprinted astrocyter
    OBS: För att undersöka förekomsten av andra cellmarkörer, ändra den primära antikroppen i enlighet därmed.
    1. Ta bort mediet från brunnen och tvätta konstruktionen med 1 ml 3x PBS.
    2. Tillsätt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS till brunnen tills konstruktionen är helt täckt och lämna den i 2 h vid 4 °C.
    3. Ta bort PFA och tvätta konstruktionen med 1 ml 3x PBS.
      OBS: Denna procedur kan pausas i flera månader om den förvaras vid 4 °C i PBS. Se till att brunnsplattan är förseglad för att undvika PBS-avdunstning.
    4. Behandla provet med glycin 0,1 mol/L i 5 minuter.
    5. Tvätta med 1 ml 1x PBS i 5 min.
    6. Permeabilisera provet med PBS som innehåller 0,1% Triton X-100 och 10% FBS för 1 h vid 25 °C under omrörning i omloppsbana.
    7. Inkubera konstruktionen med kyckling anti-GFAP (primär antikroppsutspädning 1:500) vid 4 °C över natten.
    8. Aspirera den primära antikroppen och tvätta provet med 1 ml PBS i 5 min, 3 gånger.
      OBS: Primär antikropp kan återanvändas flera gånger när den förvaras vid 4 °C.
    9. Inkubera provet med Alexa fluor 488-konjugerad anti-kyckling (sekundär antikroppsutspädning 1:500) och 1 μg/ml DAPI i 1 h vid 25 °C under omloppsbana.
      OBS: Håll provet skyddat mot ljus.
    10. Tvätta provet med 1 ml PBS i 5 min, 3 gånger.
    11. Överför konstruktionen till en 35 mm konfokal skål.
      OBS: Se till att skålen är väl förseglad för att förhindra att provet torkar ut.
  2. Glialfibrillär surt protein (GFAP) färgning av 2D astrocytkultur
    1. Frö 0,5 x 106 astrocyter (passage 1-3) i en 35 mm konfokal skål, tillsätt astrocytermedium och inkubera dem vid 37 °C och 5% CO2.
    2. När cellerna är sammanflöde, ta bort odlingsmediet och tvätta dem med 1 ml 1x PBS.
    3. Upprepa steg 8.1.2-8.1.10.
  3. Astrocyter cytoskeleton färgning
    1. Upprepa steg 8.1.1-8.1.6.
    2. Tillsätt 200 μL 50 μg/ml fluorescerande konjugerad falloidinlösning i PBS och 1 μg/ml DAPI över konstruktionen.
    3. Inkubera i 1 h vid 25 °C under omloppsbana, vilket håller provet skyddat mot ljus.
    4. Tvätta provet med 1 ml PBS i 5 min 3 gånger och överför konstruktionen till en konfokal skål med en spatel.
      OBS: Se till att skålen är väl förseglad för att förhindra att provet torkar ut.

9. Konfokal avbildning

  1. Ta disken till ett konfokalt mikroskop i kombination med en digitalkamera för avbildning (359, 488 och 570 nm excitation).
  2. Använd förstoring på 10x för en övergripande visualisering och 40 eller 63x för zoomade bilder av celler.
    OBS: Se till att provet sitter platt. Placera vid behov ett täckblad över provet för att öka planheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta arbete syftade till att utveckla en neuralliknande vävnad med hjälp av 3D-bioprinting-tekniken för att deponera lager för lager primär astrocyt-laddad gelatin / GelMA / fibrinogen bioink. Astrocyter extraherades och isolerades från hjärnbarken hos mössvalpar (figur 1), lades till en biomaterialkomposition, vilket möjliggör biofabricering av en levande 3D-konstruktion.

Den datorstödda designen (CAD) utvecklades med hjälp av G-koden (Kompletterande fil) som en sammankopplad ram av kvadratisk form (0,6 x 0,6 mm), med porer på 1 mm, i syfte att underlätta diffusionen av näringsämnen och syre. Ramen bestod av 6 lager placerade ovanpå varandra och ändrades i en vinkel på 90° i varje lager (figur 2A i). Den konstruerade strukturen hade cirka 5 mm hög (figur 2A ii), vilket möjliggör vävnadsmanipulation. Bioinkkompositionen tillät också tillverkning av konstruktioner av olika former (figur 2B).

Beredningen av bioink består av gelatin, GelMA och fibrinogen bestod av två tvärbindning steg. För det första korsades GelMA under UV-ljus, där inter- och intramolekylära kovalenta bindningar bildas, följt av fibrin tvärbindning. I detta steg klyver trombin enzymatiskt fibrinogenkedjor, vilket resulterar i bildandet av fibrinfibrer17, en reaktion stabiliserad av Ca2 + joner18. Sedan bildar GelMA och fibrinfibrer ett stabilt interpenetrerat polymernätverk (IPN) kompletterat med laminin, lämpligt stöd för cellfäste och spridning19,20 (Figur 2C).

Före bioprinting, efter 12 dagars isolering, kännetecknades astrocyter av närvaron av GFAP, en proteinbeståndsdel av astrocyt mellanglödtrådar4 (figur 3A). Sedan blandades trypsinized astrocyter med gelatin/GelMA/fibrinogen lösning med en densitet av 1 x 106 celler/ml, vilket genererar en astrocyt-laddad bioink. Biobläcket överfördes till en 5 ml spruta ansluten till en 22 G trubbig nål, komponera bioprinter skrivhuvudet (figur 3B i). Nålen tillät bioink extrudering utan igensättning och förhindrar hög skjuvning stress till cellerna.

På grund av gelatinets viskoelastiska egenskaper, som beter sig som en vätska vid högre temperaturer och som en gel vid lägre temperaturer21,behöll den biotryckta konstruktionen formåtergivningen (figur 3B ii). Efter bioprinting av två på varandra följande lager av bioink observerades bildandet av en väldefinierad struktur (figur 3C), med celler fångade i biomaterialet.

Efter bioprinting och tvärbindningsprocesser inkuberades konstruktionen med astrocytmedium, och efter 1 dag av bioprinting presenterade de flesta cellerna fortfarande en rund morfologi (figur 3D). Bioprintade byggnadsställningar behöll integriteten efter 7 dagars inkubation, och även om vissa runda celler observerades spred sig ett stort antal astrocyter över hela konstruktionen och presenterade astrocytisk morfologi och sammanlänkning (figur 3E).

Eftersom parametrarna för bioprinting, såsom hastighet, direkt kan påverka cellens livskraft, testades olika bioprintningshastigheter (400, 600 och 800 mm/min) och astrocyternas överlevnad utvärderades med hjälp av Live/Dead-analysen med kalcein-AM (levande celler, grön fluorescens) och etidium homodimer-III (EthD-II) (döda celler, redescensfluorescens). Andelen livskraftiga celler kvantifierades med hjälp av en beräkningsprogramvara, genom att beräkna antalet levande och döda celler. Cellviabiliteten utvärderades vid tid 0 (direkt efter bioprintning), och resultaten visade att vid den lägre hastigheten, 400 mm/min, representerade livskraftiga celler 74,08% ± 1,33% av de totala cellerna, vilket är betydligt högre än celler bioprintade vid 600 respektive 800 mm/min (60,25% ± 1,93% respektive 62,94 ± 6,94%, respektive 6, 18%, (figur 60,25% ± 1,93% respektive 62,94). Därför användes hastigheten på 400 mm/min i detta arbete.

Före bioprinting, 2D odlade astrocyter karakteriserades som andelen livskraftiga celler, och livskraften av bioprinted astrocyter normaliserades till detta villkor. Resultaten visade att 2D-kulturen presenterade 90,98% ± 0,94% av livskraftiga celler. Livskraften hos bioprintade astrocyter (dag 7) var 83,54% ± 3,00%, vilket motsvarar 0,92 ± 0,03 av 2D-värdet, vilket var betydligt högre än dag 0 (0,81 ± 0,01) (figur 4B). Bilder av astrocyter färgade med levande/död reagens presenteras i figur 4C, och visar att efter bioprinting, celler besatt en rund morfologi (figur 4C i). Efter 1 veckas inkubation spred sig astrocyter över hela konstruktionen (figur 4C ii), som visar en distinkt morfologi av celler från 2D-odling(figur 4C iii).

Bioprintade astrocyter färgades för att visa celltäthet och cellmorfologi inom konstruktionen. Figur 5A visar en bioprintad konstruktion efter 7 dagars inkubation, med hög densitet av astrocyter färgade med falloidin, ett F-aktin cytoskeletonfärgämne. Även om få runda celler observerades, presenterade astrocyter främst en stjärnliknande morfologi. Bioprintade astrocyter visade sig vara GFAP-positiva när de färgades efter 7 dagars bioprinting, vilket indikerar att cellerna behöll sin astrocytiska fenotyp (figur 5B i). Figur 5B ii och 5B iii visar de Z-staplade bilderna av de biotryckta GFAP+-astrocyterna i konstruktionen. Dessa resultat visar att bioink kompositionen gav en biokompatibel mikromiljön för att främja astrocyter vidhäftning, spridning och tillväxt.

Figure 1
Figur 1: Utvinning av hjärn- och hjärnbarkseparation för primär astrocytkultur. Primära astrocyter isolerades från cortex av C57Bl/6 möss valpar (postnatala dag 1) hjärnan. Efter att ha extraherat hjärnan från djuret togs hjärnhinnorna bort under ett mikroskop, och cortex separerades följt av vävnad matsmältning och astrocyter kultur. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Schematisk illustration av 3D-bioprintningsprocessen. ( A) CAD-fil utformad för 3D-bioprinting av neural vävnad som visari) 2 lager, övervy och (ii) 6 lager, sidovy, av konstruktionen. b)Bilder som visar biobläckets förmåga att skriva ut strukturer av olika former (i) kvadratiska,ii) kapillär och (iii) stjärna. c)System för korslänkning av biomaterial efter 3D-bioprinting som visar var GelMA är tvärlänkat under UV-ljus följt av fibrinkorslänkning i ett trombin:Ca2+ bad. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: 3D-boprinting av astrocyt-laddat gelatin/GelMA/fibrinogen bioink. (A) Karakterisering av astrocyter efter 12 dagars isolering och kultur, färgade för GFAP, grön och DAPI, blå. b)i) Utskriftshuvudinställning och (ii) 3D bioprintad konstruktion direkt efter bioprintning. (B) Tvåskiktskonstruktion som visar den biotryckta ramen. Förstoring av 4x. (C) Bild av bioprintade astrocyter 1 dag efter bioprinting, som visar celler i en rund morfologi. ( D) Bild av bioprintade astrocyter 7 dagar efter bioprintningsprocessen, som visar celler med astrocytisk morfologi med få runda celler, vilket indikerar deras affinitet med den mimetiska vävnaden. Förstoring av 10x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Bedömning av bioprintad astrocyt livskraft. A) A) Astränters livskraft bioprintad i olika hastigheter. b) Livskraften hos bioprintade astrocyter påi) dag 0 (direkt efter bioprintning) ochii) efter 7 dagars bioprintning, normaliserad till livskraft hos astrocyter i 2D-odling. Statistisk analys med hjälp av Enkelriktad Anova med Tukeys test, n = 3, *p < 0,05. (C) Fluorescerande bilder av astrocyter färgade med levande/död reagens. Bioprintade astrocyter på (i) dag 0 (direkt efter bioprinting), (ii) dag 7 ochiii) 2D-odling av astrocyter. Förstoring av 10x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Karakterisering av 3D-bioprintade astrocyter. Immunofluorescens av 3D bioprintade astrocyter efter 7 dagars inkubation fläckad för (A) F-aktin (falloidin, röd) och kärnor (DAPI, blå) med förstoring av 10x och 40x och för (B) GFAP, grön (i) med förstoring av 10x,ii) Z-staplad som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och iii) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii ) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii ) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii ) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii ) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii ) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii) bild som visar X-Y-Z-axeln för den bioprintade konstruktionen, och ( iii) bild som visar X-Y-Z-axeln i den bioprintade konstruktionen, och ( iii) bild som visar X-Y-Z-axeln i den bioprintade konstruktionen, och ( iii) bild som visar X-Y-Z-axeln i den bioprintade konstruktionen, och (iii)bild som visar X-Y-Z- Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D-bioprinting-tekniken har dykt upp som ett biofabriceringsalternativ som möjliggör teknik av raffinerade konstruktioner som strukturellt och fysiologiskt liknar inhemska vävnader22, inklusive hjärnan23. Biofabriceringen av neurala-liknande vävnader möjliggör in vitro infödda mikromiljömodellering, vilket är ett viktigt verktyg för att förstå de cellulära och molekylära mekanismerna i samband med utveckling och behandling av många sjukdomar som påverkar CNS11. På grund av den viktiga rollen av gliaceller i neural funktionalitet har kortikala astrocyter använts i många studier, såsom hjärnutveckling24, biomolekylertransporterar 25, neurit utväxt26, och i hjärnliknande vävnad biofabricering14.

Metoder för teknik 3D-odling av astrocyter rapporterades tidigare, med hjälp av olika biomaterial och byggnadsställningartekniker 27,28,29. På samma sätt rapporterades också en metod för 3D-bioprinting av humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) härledda neurala aggregat, och visade kapaciteten hos dessa bioprintade celler att differentiera och mogna in vitro30. Det finns dock inga rapporter om metoder för biofabricering av 3D brioprinted astrocyter konstruktioner i litteraturen. Sedan syftade detta protokoll till att beskriva en reproducerbar metod för 3D bioprinting när astrocyter.

I detta protokoll isolerades astrocyter från cerebrala cortices av C57Bl/ 6 mössvalpar, en djurmodell som ofta används i forskning31,32, som kan ersättas av astrocyter som härrör från andra källor, såsom hiPSCs och ryggmärg. Efter isolering, kultur och subkultur förblir astrocyter i ett proliferativt tillstånd fram till passage 3, vilket är det maximala antalet delning som rekommenderas på grund av deras inneboende begränsning av spridning8. det kontrollerades att spridningen av astrocyter från passage 4 var begränsad, vilket är svårt att uppnå önskad mängd celler för 3D bioprinting.

I den beskrivna metoden användes en koncentration av 1,0 x 106 celler/ml biomateriallösning, som ett konceptbevis för att utvärdera cellernas förmåga att överleva bioprintningsprocessen och för att bibehålla deras livskraft och inneboende egenskaper under odling inom hydrogelen. I det tidigare arbetet biofabricerades en 3D-bioprintad neuralliknande vävnad av samodling astrocyter och nervceller, och för att öka cellulär interaktion var astrocytkoncentrationen 8,0 x 106 celler/mL14. Då kan koncentrationen av celler optimeras för specifika studier.

En biobläck för 3D-bioprinting består av celler och ett biomaterial eller en kombination av biomaterial33. I detta protokoll användes en kombination av gelatin/GelMA/fibrinogen, som visade sig vara gynnsam för både bioprinting och upprätthållande av astrocyter i kultur. Produktionen av en bioprintbar biobläck är utmanande vid användning av extruderingsbaserad bioprintningsteknik. Biomaterialkompositionen måste ha viskoelastiska egenskaper som samtidigt tillåter extrudering av biobläcket, samtidigt som 3D-formen behålls efter tryckprocessen34. Dessutom bör det kunna upprätthålla cellens livskraft under processen, vilket beroende på bioprintingförhållandena kan orsaka skjuvningsstress på cellerna som leder till döden35.

Bioprintability säkerställdes av gelatin, ett biomaterial som har optimala viskoelastiska egenskaper på grund av dess sol-gel övergångskapacitet36. Detta gör det möjligt för gelatin makromolekyler att omorganisera och bete sig som en vätska under extrudering, och som en gel efter bioprinting, upprätthålla 3D-strukturen. Dessutom, som en kollagen härledning, gelatin består av glycin-aminosyra peptid triplett repetitioner, som säkerställer cell-specificitet21. Intra och intermolecular bindningar av gelatin är dock svaga, och på grund av dess termoreversibilitet har gelatin ingen stabilitet vid 37 °C, som frigörs från konstruktionen under cellkulturen. Därför blev GelMA ett alternativ som en stabil hydrogel, på grund av de kovalenta bindningarna som bildades efter UV-ljusutställning, vilket bibehåller cellspecifika egenskaper19. De fysiska egenskaperna hos GelMA, såsom porositet, nedbrytning och elastisk modulus kan justeras för att passa olika vävnadstekniska applikationer19. Styvheten hos GelMA-ställningar kan kontrolleras genom att variera metakryloylersättningen37, vilket gör det möjligt att uppnå en styvhet som liknar den för vävnaden som ska modelleras. Det vill säga genom att minska graden av funktionalisering kan en lägre styvhet uppnås37. Därför, på grund av mjukheten i mushjärnan38,39 och den direkta effekten av extracellulär matris (ECM) styvhet på cellbeteende40, föreslogs i detta protokoll en låg grad av gelatinfunktionalisering. I de tidigare verken rapporterades GelMA-hydrogelers förmåga att efterlikna CNS fysiska egenskaper, som visar hög lämplighet för odling av astrocyter, nervceller och neurala stamceller14,41,42.

Förutom GelMA har fibrinogen, en inbyggd biopolymer som bildar fibrinfibrer genom enzymatisk reaktion, också använts i stor utsträckning för att biofabricate neuralliknande vävnad, som visar hög specificitet och erbjuder en lämplig mikromiljö för neurala celler att fästa och växa30,43,44. Andra biomaterial, såsom alginat och chitosan, har använts för att bioprint neurala-liknande vävnader, blandade till gelatin, GelMA och/eller fibrinogen, i syfte att förbättra tryckbarheten och de fysiska egenskaperna hos 3D-ställningar14,30. I denna metod uppnåddes en optimal bioprintability, fysisk stabilitet och cell-specificitet med gelatin, GelMA och fibrinogen som komponenter i biobläck. För att öka astrocyternas erkännande till mikromiljön användes laminin-en komponent i hjärnan ECM-för att komplettera biobläcket.

I detta protokoll användes gelatin vid en koncentration av 4% (w/v), vilket tillät sol-gel övergången av bioink vid 25 °C inom cirka 10 min. En snabbare gelering kan uppnås genom att öka koncentrationen av gelatin. Sterilisering genom filtrering med 0,2 μm-filter kan dock äventyras. Biobläckfiltrering är ett kritiskt steg som verifierar att högre koncentrationer av gelatin (>5% w/v) kan förhindra filtrering. Ett alternativ för att uppnå en snabbare geleringspunkt under bioprintning är att lämna sprutan som innehåller biobläcket vid 4 °C i 2 minuter innan den ansluts till bioprinterns skrivhuvud. Efter bioprintning är det viktigt att bibehålla konstruktionen vid 25 °C för att undvika destabilisering av 3D-strukturen och bibehålla ett gelled tillstånd före UV-utläggning. I synnerhet bör konstruktionen vara solid när fibrinogen crosslinker-lösningen läggs till plattan. För GelMA-tvärbindning är det viktigt att vända provet (2 x 60 s på varje sida) för att säkerställa UV-utläggning under hela konstruktionen. För fibrinogen tvärbindning bör tvärlänkslösningen täcka konstruktionen helt. Därför, om du använder en större maträtt eller tallrik, bör volymen justeras. Efter tvärbindning bör hydrogelen se homogen ut under faskontrastmikroskopi och cellerna ska fördelas homogent i hela konstruktionen, med en rund morfologi.

Detta protokoll tillät gelatin/ GelMA / fibrinogen bioink att skriva ut strukturer av olika former, upprätthålla integriteten och 3D-formen på konstruktionerna. På grund av temperaturens begränsningar för att nå 25 °C inuti det laminära flödet utfördes bioprintingen i odlingsrummet utanför laminärt flöde. Bioprintningstiden var cirka 1 min för varje prov, och ingen förorening observerades under cellodling.

Cellintegriteten kan påverkas av bioprinting, på grund av skjuvningsstressen som orsakas i processen35. Detta kan styras genom att optimera utskriftsparametrar, till exempel utskriftshastighet. I detta arbete testades olika bioprintningshastigheter, 400, 600 och 800 mm/min, vilket observerade en betydande minskning av cellens livskraft när hastigheten ökade från 400 till 600 mm/min. Vid 400 mm/min förblev cirka 74% av cellerna livskraftiga efter bioprinting, och detta värde ökade betydligt efter 7 dagars inkubation (>80%). Därför användes inte lägre hastigheter för att undvika överdriven utläggning av celler till miljön. 2D-kulturen av astrocyter visade högre livskraft (~ 90%) jämfört med de bioprintade cellerna. Men som framgår av fluorescerande bilder påverkas morfologin av typen av kultur. Medan 2D-celler var platta, hade astrocyter i 3D-miljö en stjärnliknande form, som sammankopplades med varandra genom cellulära processer.

Särskilt var mimetic microenvironment gynnsamt för när astrocyter kultur, som cell livskraft ökade avsevärt efter 1 vecka, vilket tyder på cell spridning inom konstruktionen. Laminin, ett glykoprotein som finns i hjärnan ECM, lades till biobläcket som syftar till att uppnå en högre vidhäftning av astrocyterna till hydrogel14. Cytoskeleton F-aktin färgning visade att bioprinted astrocyter var i hög densitet inom konstruktionen, vilket indikerar att cellkoncentrationen som används i detta protokoll tillät astrocyter sammanlänkning. Immunohistochemistry för GFAP lokalisering, en markör korrelerad med astrocyter omfattande arborization och cell hypertrofi45, bekräftas av F-aktin färgning, visade att celler presenterade typisk astrocytisk morfologi, vilket indikerar att mimetic 3D-systemet var gynnsamt för celler att fästa och bete sig som i sin inhemska miljö.

Protokollet som presenteras här beskriver ett effektivt och reproducerbart förfarande för 3D bioprinting när astrocyter. På grund av vikten av astrocyter i neuroinflammation svar på skada, liksom att reglera neuronal funktionalitet, studier som involverar denna glia cell kan bidra till många aspekter i förståelsen av sjukdomar som påverkar CNS. Därför är 3D in vitro-modellen som presenteras här användbar i framtida applikationer som syftar till att studera astrocyt-neuron interaktioner, astrocyternas funktionalitet i hjärnpatologier och potentialen hos astrocyter som terapeutiska mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av São Paulo Research Foundation (FAPESP), bidragsnummer 2018/23039-3 och 2018/12605-8; Nationella rådet för vetenskaplig och teknisk utveckling (CNPq), bidragsnummer 465656/2014-5 och 309679/2018-4; samordning för förbättring av personal inom högre utbildning (CAPES), finansiell kod 001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6--30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05--02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002--04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Tags

Bioengineering nummer 173 astrocyter 3D-bioprinting biotillverkning vävnadsteknik neural vävnad centrala nervsystemet
3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes för engineering neural-liknande vävnad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M.,More

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter