Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kvantitativ 31P NMR analyse av Lignins og Tannins

Published: August 2, 2021 doi: 10.3791/62696
Automatic Translation
2, 1, 1
1Department of Molecular Sciences and Nanosystems, Ca’ Foscari University of Venezia, 2Departments of Chemistry and Forest Biomaterials, North Carolina State University

Summary

31 P NMR er et kraftig verktøy for strukturell belysning av polyfenoler. Denne raske, enkle, presise, kvantitative og svært reproduserbare analytiske prosedyren, som muliggjør kvantifisering og differensiering av de forskjellige typer hydroksy, fenoliske og karboksyliske grupper i lignins og tanniner, har nå blitt et rutinemessig analytisk verktøy.

Abstract

Utviklingen av bærekraftige biorefinery produkter blir konfrontert, blant annet med utfordringen lignin og tannin valorisering. Disse rikelige, fornybare aromatiske biopolymerene har ikke blitt mye utnyttet på grunn av deres iboende strukturelle kompleksitet og høye grader av variasjon og artsmangfold. Mangelen på en definert primærstruktur for disse polyfenolene er ytterligere sammensatt med komplekse kjemiske endringer indusert under behandlingen, og til slutt gir et stort utvalg av strukturelle egenskaper av ekstrem betydning for videre utnyttelsesinnsats.

Følgelig er en protokoll for rask, enkel og utvetydig identifisering og kvantifisering av de ulike funksjonelle gruppene som finnes i naturlige polyfenoler, en grunnleggende forutsetning for forståelse og dermed skreddersy deres reaktivitet og til slutt nytte.

Kvantitativ 31P NMR gir mulighet til raskt og pålitelig å identifisere uutslettelige, o-mono erstattet, og o-disubstituerte fenoler, alifatiske OH-er og karboksylsyremoieties i lignins og tanniner med bredt applikasjonspotensial.

Metodikken består av en in situ kvantitativ lignin- eller tanninmerkingsprosedyre ved hjelp av en egnet 31P som inneholder sonde, etterfulgt av oppkjøpet av et kvantitativt 31P NMR-spektrum i nærvær av en intern standard. Den høye naturlige overfloden av 31P-kjernen gir mulighet for små mengder av prøven (~ 30 mg) og korte NMR-oppkjøpstider (~ 30-120 min) med godt løste 31P-signaler som er svært avhengige av det omkringliggende kjemiske miljøet til de merkede OH-gruppene.

Introduction

Denne prosedyren, som nylig ble publisert i Nature Protocols1, har blitt sitert over 3000 ganger i arkivlitteraturen og har blitt en rutinemessig måling for lignin- og tanninkarakterisering siden den gir viktig, rask og reproduserbar strukturell informasjon.

Lignin og tanniner
Da Grønn kjemi ble introdusert av Paul T. Anastas og John C. Werner2,3, endret det drastisk den generelle oppfatningen av kjemi. Spesielt er viktigheten av å bruke bærekraftige materialer i stedet for fossile råstoffer, som olje og kull, som utgangspunkt fremhevet som et avgjørende aspekt2,3. Blant de forskjellige typer biomasse er lignin den mest tallrike aromatiske biopolymeren og kan ses på som en potensiell kilde til industrielle råvarer og høyverdige verdiprodukter4.

Lignin er den nest mest tallrike trebestanddelen (med cellulose først og hemicellulose tredje). Innholdet i planter varierer avhengig av plantetype: for eksempel hardved preget av en lavere mengde lignin sammenlignet med myke tre (20% ± 4% vs. 28% ± 4%). I tillegg er ligninfordeling i vegetabilsk vev ikke homogen: det høyere lignininnholdet finnes i celleveggen5,6. Lignin er et polyfenolic materiale industrielt oppnådd som et biprodukt av papir / celluloseindustrien7. Det er gjenvunnet fra tremasseprosessen, hvor flis primært behandles i nærvær av OH- og / eller OH- + HS- ionforhold for å skille cellulose fra hemicellulose og lignin (Soda og / eller Kraft prosesser)8,9.

De første forsøkene på å studere lignin ble gjort av Henholdsvis Payen og Schultze i 1838 og 186510. I 1977 oppsummerte Adler all relevant tilgjengelig kunnskap om den tiden11. Det er for tiden anerkjent at lignin byggesteinene er tre fenylpropanoidenheter: p-coumaryl, nåletyl og sinapylalkoholer. Disse monomerene, takket være en fri radikal polymerisasjonsprosess, gir opphav til p-hydroksyfenyl-, guaiacyl- og sinapylenheter som til slutt i stor grad utgjør lignin (figur 1)12. Mangelen på en primærstruktur i lignins innebærer en iboende vanskelighet for sin strukturelle karakterisering. Følgelig har evalueringen av fordelingen av molekylvekt alltid vært noe kontroversiell. Freset tre lignin, lignin isolert under milde forhold som omtrentlig for det meste protolignin10, består av oligomerer13 som svært samhandler via supramolecular aggregeringsprosesser14,15.

Figure 1
Figur 1: En representativ modell av mykved lignin der de ulike typer obligasjoner er uthevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Lignins er ofte klassifisert avhengig av: (a) typen tre som de er avledet fra (f.eks. hardved og mykt tre), (b) prosessen som brukes til å isolere den. De mest avgjørende industrielle lignintypene er Kraft, Lignosulfonates og Organosolv.

Lignins struktur er svært avhengig av opprinnelsen og prosesseringskjemien. Mer spesifikt, når den ganske komplekse og uregelmessige strukturen til lignin er sammensatt med sitt naturlige mangfold og de komplekse prosesseringskjemiene, oppstår et materiale med ekstrem variasjon, mangfold og heterogenitet, noe som begrenser bruken til lavverdiapplikasjoner16. Mens softwood lignins inneholder hovedsakelig guaiacyl enheter (G) med ubetydelige mengder p-hydroksyfenyl grupper (G lignin), hardved lignins er sammensatt av guaiacyl og syringyl subenheter (GS lignin) i varierende forhold og gress lignins er sammensatt av guaiacyl, syringyl, og p-hydroxyphenyl (GSH lignin) subunits. Den ekstraktive tilnærmingen som brukes til isolasjon, påvirker strukturen til den fremvoksende lignin17dramatisk . Figur 2 viser tre ligninstrukturer, forskjellig fra isolasjonstilnærmingen som benyttes. Noen hensyn til effekten av utvinningsmetoden kan belyses. For det første er Kraft lignin en dealkylated, svært fragmentert og kondensert lignin, mens Organosolv lignin har en struktur som ligner malt tre lignin (isolert ved hjelp av Bjorkman-tilnærmingen)18,19,20. Til slutt er lignosulfonater preget av en høy grad av sulfonering, avhengig av intensiteten og betingelsene for den ekstraktive sulfonasjonsprosessen.

Figure 2
Figur 2: Representative strukturer for tekniske lignins. I denne figuren kan forskjellene mellom de forskjellige typer lignin ses. (A) Softwood Kraft lignin er svært kondensert, (B) lignosulfonater er preget av sulfoniske grupper på mettet karbon, og (C) organosolv lignin har en struktur som ligner på den av malt tre lignin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I likhet med lignins er tanniner polyfenolic forbindelser som finnes i planter. En nylig og oppdatert gjennomgang av tanniners ekstraktive tilnærminger og applikasjoner ble nylig utgitt av Das et al.21. Betydningen av tanniner i hverdagen kan fremheves med tanke på to eksempler: de gir smak og farge til viner22; Videre tilbyr deres poly-fenoliske struktur antioksidantegenskaper og gjør dem ideelle for påføring i solingsindustrien23. Tanniner er delt inn i to klasser: hydrolyzable og ikke-hydrolyzable. Hydrolysebare tanniner kan betraktes som en polymer av galliske, di-galliske og ellaginsyreestere (figur 3). Disse esterne skyldes esterifisering av fenolsyrene med sukkermolekyler (f.eks. glukose, rhamnose og arabinose).

Figure 3
Figur 3: Typiske hydrolysable tanniner: tannsyre, vescalgin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ikke-hydrolyserbare tanniner, også kjent som kondenserte tanniner, er polymerer og oligomerer som stammer fra flavan-3-ols. Blant flavan-3-ols er katekiner og gallocatechin de hyppigste. De er fargeløse krystallinske forbindelser (figur 4). Polymerisasjonen skaper en polymer preget av en helicoidal struktur. De aromatiske hydroksygruppene er rettet på utsiden av helixen, mens pyranske oksygener er i interiøret.

Figure 4
Figur 4: Proantocyanidinstrukturer: R =H, OH, OCH3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Karakterisering av ligniner og tanniner ved bruk av NMR
To typer informasjon er avgjørende i lignin- eller tanninkarakterisering: (a) kjemisk struktur (f.eks. hydroksygruppeinnhold, natur og frekvens av interenhetskoblinger) og (b) molekylvekt og polydispersitet. Siden de tidlige studiene på lignin har det blitt brukt forskjellige teknikker for å oppnå disse målene, og to klasser av metoder har dukket opp: kjemiske og fysiske metoder.

I ligninkjemi har kjemiske metoder, som alkalisk nitrobenzenoksidasjon, avledning etterfulgt av reduktiv spalting, permanganatoksidasjon og tioakidolyse, blitt historisk mye brukt24,25,26,27,28,29. Selv om de analytiske protokollene er implementert og optimalisert, er de imidlertid tidkrevende, arbeidskrevende og krever omfattende eksperimentelle ferdigheter30. Alternativt, fra begynnelsen av den instrumentelle analysen, har fysiske metoder blitt brukt til å utføre lignin- og tanninkarakteriseringer31. Disse teknikkene gjør det mulig å overvinne problemene med klassiske metoder som gjør det enkelt å karakterisere ligninstruktur.

Kjernemagnetisk resonans (NMR) gjør det mulig å innhente informasjon om ligninstruktur og kjemisk sammensetning blant instrumentelle teknikker. Spesielt kan data fra kvantitativ monodimensjonal 1 H NMR-spektraog kvantitativ 13C NMR-spektra gi informasjon om ulike typer lignin interenhetsbindinger32,33,34,35. Dessverre lider monodimensjonal spektra av signaloverlapping, noe som alvorlig kan undergrave signalintegrasjonsinnsatsen. Kvantitative versjoner av HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative - Heteronuclear Single Quantum Coherence), har blitt brukt til å forstå lignin struktur bedre, og gir nyttig informasjon om interne koblinger. De kan imidlertid ikke utnyttes fullt ut til å bestemme de ulike bygningsenhetene13,36,37 kvantitativt.

For å løse problemene knyttet til mono- og todimensjonal NMR, har substratavledning blitt vurdert. Blant fordelene med denne tilnærmingen er at spesifikke etiketter kan innføres i den komplekse makromolekylen og ingen spektral interferens skyldes løsningsmidlet der de merkede substratene oppløses1. Verkade var pioner på dette feltet, og utførte 31P NMR-analyse av fosforderivater, kullderivater og relaterte forbindelser38. I utgivelsen ble det utført en screening av forskjellige fosforholdige reagenser (fosforaner), og det kjemiske skiftet av andre merkede forbindelser ble registrert. Argyropoulos' team introduserte først avledning for kvantitativ og kvalitativ analyse av hydroksygrupper i lignin i 1991. Etter å ha studert avledningen av ligninmodellforbindelser ved hjelp av fosforholdige reagenser, banet gruppen hans vei for en av de mest daglige teknikkene i ligninkjemi, 31P NMR-analyse39,40,41,42,43. Blant de forskjellige fosfolanene som ble undersøkt, kom Argyropoulos ved bruk av 2-klor-4,4,5,5-tetrametyl-1,3-2-dioxaphospholane (TMDP) som den mest egnede til å utføre ligninanalyse44. TMDP reagerer selektivt med hydroksygrupper som forårsaker kvantitativ dannelse av fosforholdige derivater preget av spesifikke 31P NMR kjemiske skift (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Lignin- og tanninfosfytilasjonskjemi. Merking av lignin- og tannin labile H-grupper oppnås ved in situ-reaksjon. De merkede polyfenolene er preget av spesifikke 31P NMR-bånd som tilsvarer de forskjellige typene hydroksygrupper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Prøveavledning utføres i en pyridin/kloroformblanding (1,6:1). Dette valget er et resultat av en nøyaktig evaluering. Pyridin har to fordeler. For det første forenkler og forsterker valg av et løsningsmiddel preget av en Hildebrand-parameter på ca. 22,1 MPa1/2 lignin-solubilisering45. Derfor er tilsetningen av pyridin som et løsningsmiddel, hvis Hildebrand-parameter tilsvarer 21,7, dermed optimal. For det andre er reaksjonen av TMDP med hydroksygrupper ledsaget av dannelsen av saltsyre (HCl) som et biprodukt med samtidige negative implikasjoner mot facile-dannelsen av lignin-fosfolannderivater. Av denne grunn må den resulterende HCl nøytraliseres. Når den er tilstede i betydelig overskudd, tillater grunnleggende pyridin, i forhold til TMDP, nøytralisering av HCl (via dannelsen av pyridhydroklorid).

Bruken av anbefalt pyridin/deutert kloroform binært løsningsmiddelsystem er basert på tre årsaker. For det første favoriserer det prøveoppløsning. For det andre, da pyridhydroklorid er oppløselig i kloroform, kan det forhindre nedbør og forverring av det endelige spekteret. For det tredje er deutert kloroform valgt for sitt unike singlet-signal, slik at låsing av NMR-spektrometeret under anskaffelsesprosessen. Prøveavledning utføres i nærvær av en intern standard. På denne måten, når prøven og standarden er avledet, tillater sammenligningen av integralene til toppene i prøven og standarden kvantifisering av beløpet for hver type hydroksygruppe som er tilstede. Ulike forbindelser har blitt ansett som interne standarder. Disse forbindelsene er preget av en enkelt hydroksygruppe per molekyl, og tilbyr et enkelt skarpt signal i 31P NMR-spekteret etter avledning. Valget av standard må gjøres nøye. Signalet bør ikke overlappe med de avledede prøvene. Kolesterol ble mye brukt i de tidlige dager. En delvis overlapping med signaler som oppstår fra alifatisk hydroksygruppe begrenser imidlertid bruken. For rutinemessig analyse foretrekkes interne standardløsninger av N-hydroksy-5-norbornene-2,3-dikarboksimid (NHND). På grunn av NHND ustabilitet kan imidlertid standardløsningene bare lagres i noen dager46.

Protocol

Følgende flytskjema (figur 6) skisserer hele eksperimentell protokoll for å utføre en 31P NMR-analyse av ligniner og tanniner.

Figure 6
Figur 6: Prosedyre for 31P NMR analyse av lignins og tanniner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Prøveforbehandling

  1. Tørk en aliquot (rundt 100 mg) av analytten (lignin eller tanninprøve) over natten i en vakuumovn satt til 40 °C.
    MERK: Spesiell oppmerksomhet er nødvendig på temperaturvalget siden temperaturer over 40 °C kjemisk kan endre den følsomme strukturen til de undersøkte polyfenolene.
  2. Etter tørking, overfør prøven raskt til en vannfri kalsiumsulfatdesiccator til den når romtemperatur. Dette trinnet er obligatorisk for å unngå at prøven absorberer fuktighet fra miljøet.

2. Klargjøring av løsningsmiddelløsning

  1. Forbered en pyridin/deutert kloroform løsningsmiddelblanding i et 20 ml hetteglass ved å blande vannfri pyridin og deutert kloroform i forholdet 1,6/1 (v/v).
    FORSIKTIG: Vær oppmerksom mens du manipulerer pyridin og deutert kloroform. Disse forbindelsene er brannfarlige, skadelige og giftige. Forbered og bruk oppløsningen i en godt ventilert avtrekkshette ved hjelp av passende hansker.
  2. Tilsett 5-8 g godt vaskede og tørkede aktiverte 5A molekylære sikter i 3,2 mm pellets for å fjerne vannspor. I tillegg anbefales bruk av septumhette på det sterkeste for å forhindre luftkontakt og fuktforurensning av løsningsmiddelsystemet. Oppbevar den tilberedte løsningen i mørket.

3. Forberedelse av intern standardløsning (IS)

  1. I en 2 ml Erlenmeyer kolbe, lag en 0,1 M løsning av krom (III) acetylat (ca. 10 mg) og intern standard (rundt 35,8 mg NHND eller 77,3 mg kolesterol) i løsningsmiddeloppløsningen som tidligere ble tilberedt.
    FORSIKTIG: Krom (III) acetylat er skadelig; bruk passende hansker under manipulasjonen.
  2. Registrer den nøyaktige vekten til IS som er lagt til i IS-løsningen.
  3. Overfør IS-oppløsningen i et hetteglass utstyrt med en forseglet hette som inneholder aktiverte molekylære sikter (se punkt 2.2) og oppbevar den i mørket ved 40 °C.

4. NMR prøveløsningspreparering

  1. Vei nøyaktig ~ 30 mg prøve i et 2 ml hetteglass utstyrt med en rørestang. Forsegle hetteglasset med en septumhette.
  2. Tilsett 0,5 ml av løsningsmiddelsystemløsningen i prøveløyet.
  3. Overfør 100 μL av IS-oppløsningen i prøvetetten via en mikropipette. Rør den resulterende dispersjonen magnetisk (500 o/min) til all lignin eller tannin er oppløst, noe som resulterer i en klar løsning.
    MERK: Siden fullstendig prøve-solubilisering er viktig, kan dette trinnet ta opptil 12 timer.
  4. Overfør 0,1 ml TMDP til prøveløsningen. Plasser prøven under kraftig magnetisk omrøring. Hold prøveløsningen forseglet. Bruk TMDP i en godt ventilert avtrekkshette mens du bruker passende hansker.
    FORSIKTIG: TMDP og dampene er etsende, skadelige og samhandler raskt med vann.
    MERK: Dannelsen av et gult bunnfall skyldes vannspor i prøven eller pyridin/kloroformoppløsningen. I et slikt tilfelle må prosedyren gjentas ved å sikre at all mulig fuktighetsforurensning unngås.
  5. Overfør prøveløsningen til et NMR-rør ved hjelp av en Pasteur-pipette.

5. NMR-analyse

  1. Legg røret i NMR-instrumentet. Spektrometeret som brukes til å utføre denne analysen trenger en bredbåndssonde.
  2. Reparer de eksperimentelle parametrene i henhold til innstillingen som vises i tabell 11.
PULS-PROGRAMMET Omvendt inngjerdet frakoblingspuls (zgig)
NUKLEØS 31P
SPEKTRAL BREDDE 22.00.m.
ANSKAFFELSESTID - 0,8 s
AVSLAPNINGSFORSINKELSE ≥ 10 s
SKANNER NUMMER 64 eller flere
SPECTRUM-SENTERET 140.m.

Tabell 1: Eksperimentelle parametere for å registrere 31P NMR spektra av avledede ligniner eller tanniner.

  1. Still inn spektrometerfrekvensen ved hjelp av resonansfrekvensen for deutert kloroform, shim prøven og still inn spektrometeret. Start deretter oppkjøpet.

6. Spektrumbehandling og analyse

  1. Behandle 31P NMR-rådata med en passende standardprogramvare i henhold til følgende trinn.
    1. Utfør Fourier-transformasjon.
    2. Juster fase etter manuell fasekorrigering (Behandler | | for fasekorrigering Manuell rettelse).
    3. Korriger grunnlinjen manuelt, og angi nullpunkt nøye (Behandler | Planlagt | Korrigering av grunnlinje med flere punkt).
  2. Signalkalibrering.
    1. Still inn signalet for fosfatert vann til den kjemiske skiftverdien på 132,2 ppm (Analyse | Referanse | Referanse).
      MERK: Tilstedeværelsen av et skarpt 31P-signal ved 175 ppm skyldes overskudd av TMDP. Dens tilstedeværelse sikrer fullstendig avledning av prøven. Hvis denne toppen er fraværende, må man gå tilbake til hele prosedyren ved å gi en grundig prøve og løsningsmiddeltørking og legge til mer TMDP. Når dette er garantert, zoomes spekteret i spektralområdet 132 til rundt 150 ppm (Figur 7).

Figure 7
Figur 7: Kontroller tilstedeværelsen av et overskudd av TMDP: Hvis det kan ses, er avledningen av prøven fullført. Spektraet kan deretter analyseres. For å gjøre det zoome inn i spektralområdet mellom 155 og 132 ppm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Integrasjon
    1. Normaliser integrasjonen ved å sette den interne standarden til 1.0 (klikk på Peak | Rediger integrert | Normalisert: 1,00). Utfør spektrumintegrasjon i henhold til de kjemiske skiftene som er rapportert i følgende tabeller. Bruk tabell 2 for ligniner og tabell 3 for tanniner.
FUNKSJONELL GRUPPE KJEMISK SKIFT (ppm)
Alifatisk OH 149.0-146.0
Fenolisk OH 144.0-137.4
C5 erstattet fenolisk OH 143.0-140.2
5-5' fenolisk OH 141.7-140.2
Syringyl OH 143.2-142.7
4-O-5' Å 142.8-141.7
Guaiacyl OH 140.2-138.8
p-hydroksyfenyl OH 138.8-137.4
COOH 136.0-133.6
Tricin 137.0-136.0

Tabell 2: 31P NMR kjemiske skift for ligninfosfatitylaterte OH-grupper.

FUNKSJONELL GRUPPE KJEMISK SKIFT (ppm)
Ring A
o-unsubstituert fenolisk 137.9–137.4
o-erstattet PHENOLIC 138.8–137.9
Ring B
Katekol OH 140.2–138.8
Pyrogallol OH 144.0–140.2
Ring C
AliphatiC OH 146.0–145.0

Tabell 3: 31P NMR kjemisk skifte for tanninfosfatitylaterte OH-grupper.

MERK: Ved hjelp av standard spektralbehandlingsprogramvare er det mulig å angi forhåndsdefinerte regioner i det kjemiske skiftet som skal integreres. Denne muligheten er fordelaktig når flere spektra må behandles.

7. Tallantifisering av funksjonelle grupper

  1. Beregn konsentrasjonen av IS-løsningen.
    Equation 1
  2. Beregn tilsvarende mengde av det spesifikke signalet:
    Equation 2
    Equation 3

Representative Results

Den beskrevne protokollen kan brukes både for analyse av lignins og tanniner. I ligninkjemi er denne metoden grunnleggende fordi den tillater deteksjon og kvantifisering av de forskjellige typer hydroksygrupper. Figur 8A-D viser eksempler på 31P NMR-spektra av ligniner og tanniner anskaffet med spektrometre som arbeider ved forskjellige frekvenser. Spekteret vist i figur 8A ble registrert ved hjelp av et spektrometer på 300 MHz NMR, mens figur 8D ble registrert med et 700 MHz NMR-instrument.

Figure 8
Figur 8: Kvantitativt 31P NMR-spektrum av (A) softwood kraft lignin (spektrum registrert med et spektrometer på 30,8 mg lignin), (B) softwood lignosulfonsyre (spektrum registrert med et 300 MHz spektrometer på 30,1 mg lignin etter bevaring av lignosulfonat til lignosulfonsyre), (C) Acacia tannin (spektrum registrert med et spektrometer på 30,3 mg) og (D) softwood kraft lignin (spektrum registrert med et 700 MHz spektrometer på 7,2 mg lignin). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Disse spektraene ble nøye registrert og behandlet manuelt. De typiske signalene for alifatiske (150-145 ppm), aromatiske (145-137 ppm) og karboksyl (136-134 ppm) hydroksygrupper er veldig godt løst og som sådan lett integrert. Hvis spektralvinduet åpnes (fra 95 til 190 ppm, figur 8), er tre skarpe, sterke topper (175, 144 og 132 ppm) tydelige. Disse skyldes overskudd av TMDP, den interne standarden (kolesterol eller NHND), og hydroksylert-TMDP (forårsaket av vannspor), henholdsvis.

I motsetning til kraft og organosolv lignin er lignosulfonater uoppløselige i pyridin/kloroformblandingen. For å oppnå et pålitelig 31P NMR-spektrum er løselighet obligatorisk. For å overvinne dette problemet kan lignosulfonater konverteres til de tilsvarende lignosulfonsyrene før avledning. Behandling av lignosulfonatløsninger med sterke syrer (dvs. svovelsyre) eller syreutvekslingsrediner (f.eks. Dowex 1H, en sterk syrekationveksler) driver konverteringen av alle sulfonatgruppene i sine sure former. De resulterende produktene kan fjernes fra den sure løsningen ved hjelp av selektive adsorptive harpikser (XAD-7, en polar adsorbent som brukes til å isolere forbindelser preget av molekylvekter opptil 60 000 u.m.a) analysert ved hjelp av denne protokollen. Figur 8B viser det kvantitative 31P NMR-spekteret av en TMDP-derivatisert lignosulfonsyre. Selv i dette tilfellet er de forskjellige signalene fra hydroksygruppene tydelige. Figur 8C viser et typisk kvantitativt 31P NMR-spektrum av en tanninprøve som er avledet ved hjelp av TMDP. Et karakteristisk signal fra de forskjellige alifatiske OH (Ring C), pyrogallol- og katekolenhetene i ring B og enheter i ring A er godt synlige.

Discussion

Den beskrevne metoden representerer implementering og optimalisering av den analytiske protokollen rettet mot kvalitativ og kvantitativ karakterisering av ligniner som utviklet av Argyropoulos37,38,39,40,41,42. Sammenlignet med mange andre teknikker tilgjengelig for lignin strukturell belysning, har metoden blitt allment akseptert som å være blant de mest facile, raske og reproduserbare. Gyldigheten av de våte kjemiske metodene (f.eks. nitrobenzen, permanganatoksidasjoner, etc.) er avhengig av operatørens gode eksperimentelle ferdigheter, og begrenser effektivt metoden til begrensede operatører. Videre er det ikke uvanlig å møte korreksjonsfaktorer i litteraturen for våte kjemiske metoder for å gjøre rede for flere ulemper. Den beskrevne 31P NMR-protokollen krever ikke avanserte eksperimentelle ferdigheter, noe som gjør dette lett anvendelig, brukervennlig og allment tilgjengelig. Sammenlignet med andre instrumentelle analysemetoder, er 31P NMR den eneste teknikken som er i stand til å nøyaktig oppdage og kvantifisere de forskjellige hydroksygruppene i lignins. FTIR kan for eksempel brukes til å identifisere ulike hydroksygrupper som 1H NMR. Begge teknikkene lider imidlertid siden de ikke kan tilby pålitelige kvantitative data på grunn av omfattende signaloverlappingsproblemer. En annen mye brukt teknikk er UV-Vis spektroskopi, først rapportert av Goldschmid. Tilnærmingen er imidlertid begrenset til en generell generell bestemmelse av hydroksygrupper siden den ikke effektivt kan skille mellom alifatiske, aromatiske og karboksyliske OHs47.

Fra et økonomisk synspunkt er den eneste begrensningen i 31P NMR-teknikken prisen på TMDP, som er et relativt dyrt reagens. Det koster ca 1,000 NOK (190 USD) per gram; Følgelig, hvis kostnaden for analyse bare ville bli tilnærmet prisen på TMDP, unntatt de som stammer fra pyridin / kloroformblandingen og operatørtiden, vil det utgjøre ca 24 USD per analyse. For å løse dette problemet tyr mange laboratorier til å syntetisere TMDP, og dermed redusere reagenskostnadene. For å gjøre dette reagerer pinacol og fosfortriklorid i nærvær av trietylamin44. Teknisk sett er denne reaksjonen relativt enkel; Imidlertid er det nødvendig med omsorg ved bruk av fosfortriklorid og dets arbeid, inkludert velkontrollert vakuumdestillasjon. Flere detaljer om syntesen av TMDP kan leveres på forespørsel.

Selv om denne protokollen er blant de beste når det gjelder letthet, reproduserbarhet og presisjon, må noen kritiske punkter fremheves. For det første må prøven være helt løselig i den identifiserte pyridin / kloroformblandingen. Dette hensynet er grunnleggende fordi hydroksylgruppenes kvantitative fosfitylasjonsreaksjon må skje under helt homogene forhold. Hvis bare en del av prøven er solubilisert, vil den resulterende analysen være unøyaktig. For det andre må prøven som skal undersøkes være fukt- og løsningsmiddelfri, siden disse variablene vil påvirke presisjonen og den generelle suksessen til analysen på en skadelig måte. Spor av fuktighet vil reagere med TMDP som gir 2-hydroksy-4,4'-5,5'-tetrametyl-1,3,2-dioxaphospholane. Denne forbindelsen er et blekgult flocculating salt, uoppløselig i pyridin / kloroform løsningsmiddelblandingen, noe som forårsaker utilstrekkelig NMR-signalanskaffelse. Siden bare en liten vekt (~ 30 mg) av en prøve er nødvendig, må den være fri for volatiler for at den nøyaktige vekten skal være nøyaktig kjent før analysen.

Noen ganger kan prøveløseproblemer fremmes (spesielt for svært oksiderte prøver) ved å legge til små mengder koløsningsmiddel (dvs. dimetylformamid), noe som bidrar til prøveoppløsning. I prinsippet kan hvert løsningsmiddel som ikke samhandler med TMDP brukes til å prøve oppløsning. Valget av et co-løsningsmiddel kan ikke omfatte ko-løsemidler som inneholder labile hydroksy- eller aminogrupper siden de reagerer med reagenset, noe som forårsaker villedende sluttspektra. Spesielt reagerer dimetylsulfoksid også med TMDP som utelukker bruken som et ko-løsningsmiddel. Pyridinbaserte ioniske væsker, som 1-allyl-3-butylpyridiniumklorid, kan brukes når løselighetsproblemer oppstår; Den ioniske væsken skal imidlertid igjen være tørr48. For å oppløse lignosulfonater (en lignintype preget av en høy sulfonasjonsgrad), ble en forbehandling som involverte konvertering av nøytraliserte grupper til deres sure form vist seg å være nyttig. Lignosulfonater kan enkelt omdannes til sine sure forhold ved hjelp av sure utvekslingsrediner i vandige medier. De resulterende lignosulfonsyrene er isolert fra løsningen ved deres adsorpsjon på spesifikke harpikser (f.eks. XAD-7) og desorpsjon i etanol. Fordampning av etanolic løsninger over redusert trykk ved 40 °C tillater isolering av lignosulfonsyrer. Disse ligninene kan da karakteriseres av 31P NMR fordi de er oppløselige i pyridin / kloroformblandingen foreslått av protokollen.

Langvarig vakuumtørking ved milde temperaturer reduserer effektivt mengden fuktighet og andre volatiler i hver prøve. Spesielt påvirker små mengder vann ikke det endelige spekteret fordi TMDP tilsetts i overkant. I tillegg kan en liten mengde 2-hydroksy-4,4'-5,5'-tetrametyl-1,3,2-dioxaphospholane skyldes fuktigheten som er tilstede i NMR-røret eller prøveglasset. I disse tilfellene er omrøring tilstrekkelig til å oppløse mengden av det dannede bunnfallet helt. Hvis en høy mengde 2-hydroksy-4,4'-5,5'-tetrametyl-1,3,2-dioxaphospholane dannes, anbefales det å gjenta prøvepreparatet, forbedre tørkebehandlingen. For eksempel, før bruk, kan alt glasstøy kort oppvarmes med en varmepistol.

Spektralområdet som brukes til å registrere spekteret er bredt sammenlignet med interesseområdet for signalet om de ulike hydroksylgruppene. Dette er imidlertid obligatorisk for å forstå om prøveavledningen skjedde med hell. Bekreftelsen av fullstendig prøveavledning er gitt ved tilstedeværelse av et sterkt signal rundt 174 ppm. Denne skarpe toppen skyldes den uberørte TMDP, og dens eksistens sikrer at reagenset var til stede i overkant, og derfor har alle hydroksylgrupper blitt avledet. Hvis denne toppen er fraværende, er de to mest sannsynlige årsakene: (1) mengden TMDP som brukes er utilstrekkelig til å utføre fullstendig avledning av prøven, eller (2) en høy mengde vann er til stede i prøven. I det første tilfellet vil bruk av en høyere mengde TMDP sannsynligvis sikre at prøvens fullstendige avledning, og signalet ved 174 ppm vil vises. I andre tilfelle bør prøven tørkes mer omfattende. Når et overskudd av TMDP er sikret, kan toppintegrasjon utføres. Før denne operasjonen zoomer du til et smalere vindu (150 til 132 ppm) som begrenser signalene av interesse.

Mengden prøve (~ 30 mg) som skal analyseres, rapportert i ovennevnte eksperimentelle protokoll, er valgt for å samle spektra av god kvalitet for et spektrometer på 300 MHz NMR eller mer. Likevel har vi observert at det er mulig å redusere prøvemengden hvis en 500 MHz eller høyere feltmagnet brukes. I figur 8Dvises for eksempel NMR-spekteret (som følge av et 700 MHz-instrument) av en prøve fremstilt med 7,2 mg lignin. Signalintegrasjon av dette spekteret gir de samme resultatene som de som oppnås ved bruk av høyere mengder lignin. Dette faktum forsterker anvendelsen av denne protokollen for all forskning der små mengder produkter er tilgjengelige.

Samlet sett kan denne eksperimentelle protokollen brukes på mange forsknings- og utviklingsapplikasjoner når det er nødvendig å forstå opprinnelsen og skjebnen til de ulike hydroksygruppene som er tilstede i lignins og tanniner. Spesielt når de kombineres med GPC- og HSQC-data, gir de resulterende dataene muligheten til å utdype og spekulere ytterligere over strukturen til lignin eller en tannin. I mange tilfeller der kjemiske modifikasjoner påføres hydroksygruppene av lignin eller en tannin, kan kvantitative 31P NMR-analyser være ekstremt verdifulle for å oppdage om disse modifikasjonene skjedde og i hvilken grad. Figur 9 viser for eksempel to NMR-spektra av samme lignin før og etter oksidasjonen. En enkel kvalitativ evaluering viser reduksjonen av både alifatiske og aromatiske hydroksygrupper ved oksidasjon, og gir dermed verdifull informasjon og veiledning.

Figure 9
Figur 9: Kvantitativ 31 PNMR-spektra av samme Organosolv lignin derivatisert ved hjelp av TMDP (A) Prior og (B) legger ut oksidasjonen. Spektraet ble registrert med et 300 NMR spektrometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Til slutt har denne teknikken alle egenskapene til å være blant de mest essensielle og kraftige verktøyene når henvendelser som omhandler polyfenolic, OH peiling lignins og tanniner (og til og med syntetiske polymerer)49,50,51 må gjøres på en rekke felt, alt fra kjemi til ingeniørfag, fra biologi til polymer og farmasøytiske applikasjoner.

Disclosures

Claudia Crestini og Dimitris S Argyropoulos sørger for at alle forfattere (C.C., N.P., og D.S.A.) ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet gjennom årene har blitt støttet av ulike økonomiske priser som inkluderte organisasjoner som Pulp and Paper Research Institute of Canada, McGill University Montreal, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, National Science Foundation USA, United States Department of Agriculture og Solvay-selskapet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 - 1000 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0866
20 - 200 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0865
2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% Sigma-Aldrich 447536
Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) Precisa LX220 A
Binder Vacuum Oven Binder VD53
Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 Sigma-Aldrich 29651-U
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151823
Cholesterol, Sigma-grade Sigma-Aldrich C8667
Molecular sieves, 4A Sigma-Aldrich 208604
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% Sigma-Aldrich 226378
NMR spectrometer, 300 MHz Bruker
Norell natural quartz 3 mm NMR tubes Sigma-Aldrich NORS33007
Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) VWR 613-0342
Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) VWR 613-0239
Pyridine, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich 270970
Stirring bars,micro, 3 mm lenght VWR 442-0360
Stirring bars,micro, 6 mm lenght VWR 442-0362
Triphenylphospine oxide, 97% Sigma-Aldrich T84603
Vials for environmental analysis, WHEATON,  20.00 mL DWK Life Sciences WHEAW224609
Weighing paper, grade 531 VWR 516-0318P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, X., et al. Determination of hydroxyl groups in biorefinery resources via quantitative 31 P NMR spectroscopy. Nature Protocols. 14 (9), 2627-2647 (2019).
  2. Anastas, P. T., Williamson, T. C. Green chemistry: An overview. Green Chemistry. 626, 1-17 (1996).
  3. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: Principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
  4. Collins, M. N., et al. Valorization of lignin in polymer and composite systems for advanced engineering applications - A review. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 828-849 (2019).
  5. De Gruyter. Biorefinery: From Biomass to Chemicals and Fuels. , (2012).
  6. Sannigrahi, P., Pu, Y., Ragauskas, A. Cellulosic biorefineries-unleashing lignin opportunities. Current Opinion in Environmental Sustainability. 2 (5), 383-393 (2010).
  7. Lange, H., Decina, S., Crestini, C. Oxidative upgrade of lignin - Recent routes reviewed. European Polymer Journal. 49 (6), 1151-1173 (2013).
  8. Glasser, W. G. Classification of lignin according to chemical and molecular structure. Lignin: Historical, Biological, and Materials Perspectives. 742, 216-238 (1999).
  9. Wiley. Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology, 2 Volume Set, 5th Edition. , Wiley. (2004).
  10. Lewis, N. G., Sarkanen, S. Preface. Lignin and Lignan Biosynthesis. 697, 9-11 (1998).
  11. Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11 (3), 169-218 (1977).
  12. Ragauskas, A. J., et al. Lignin valorization: Improving lignin processing in the biorefinery. Science. 344 (6185), (2014).
  13. Crestini, C., Melone, F., Sette, M., Saladino, R. Milled wood lignin: A linear oligomer. Biomacromolecules. 12 (11), 3928-3935 (2011).
  14. Guerra, A., et al. On the propensity of lignin to associate: A size exclusion chromatography study with lignin derivatives isolated from different plant species. Phytochemistry. 68 (20), 2570-2583 (2007).
  15. Contreras, S., Gaspar, A. R., Guerra, A., Lucia, L. A., Argyropoulos, D. S. Propensity of lignin to associate: Light scattering photometry study with native lignins. Biomacromolecules. 9 (12), 3362-3369 (2008).
  16. Gigli, M., Crestini, C. Fractionation of industrial lignins: opportunities and challenges. Green Chemistry. 22 (15), 4722-4746 (2020).
  17. Adler, E. Structural elements of lignin. Industrial & Engineering Chemistry. 49 (9), 1377-1383 (1957).
  18. Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 1. Extraction of lignin with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 477-485 (1956).
  19. Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 2. Extraction of lignin-carbohydrate compelexes with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 243-251 (1957).
  20. Bjorkman, A. Studied on finely divided wood. Part 5. The effect of milling. Svensk Pappersit. , 329-335 (1957).
  21. Das, A. K., Islam, N., Ashaduzzaman, F. O., Dungani, R. Review on tannins: Extraction processes, applications and possibilities. South African Journal of Botany. 135, 58-70 (2020).
  22. Laitila, J. E. Composition and evolution of oligomeric proanthocyanidin-malvidin glycoside adducts in commercial red wines. Food Chemistry. 340, 127905 (2021).
  23. Covington, A. D., Wise, W. R. Tanning Chemistry. , RSC Publishing. (2019).
  24. Tarabanko, V. E., Tarabanko, N. Catalytic oxidation of lignins into the aromatic aldehydes: General process trends and development prospects. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2421 (2017).
  25. Guerra, A., Mendonça, R., Ferraz, A., Lu, F., Ralph, J. Structural characterization of lignin during pinus taeda wood treatment with ceriporiopsis subvermispora. Applied and Environmental Microbiology. 70 (7), 4073-4078 (2004).
  26. Faix, O., Andersons, B., Zakis, G. Determination of carbonyl groups of six round robin lignins by modified oximation and FTIR spectroscopy. Holzforschung. 52 (3), 268-274 (1998).
  27. Santos, R. B., Capanema, E. A., Balakshin, M. Y., Chang, H., Jameel, H. Lignin structural variation in hardwood species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (19), 4923-4930 (2012).
  28. Bose, S. K., Wilson, K. L., Hausch, D. L., Francis, R. C. Lignin analysis by permanganate oxidation. II. Lignins in Acidic Organosolv Pulps. Holzforschung. 53 (6), 603-610 (1999).
  29. Harman-Ware, A. E., et al. A thioacidolysis method tailored for higher-throughput quantitative analysis of lignin monomers. Biotechnology Journal. 11 (10), 1268-1273 (2016).
  30. Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
  31. Lin, S. Y., Carlton, W. D. Methods in Lignin Chemistry. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1992).
  32. Lundquist, K. Proton (1H) NMR Spectroscopy. Methods in Lignin Chemistry. , 242-249 (1992).
  33. Robert, D. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry. Methods in Lignin Chemistry. , 250-273 (1992).
  34. Li, S., Lundquist, K. A new method for the analysis of phenolic groups in lignins by 1H NMR spectrometry. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 9 (3), 191-195 (1994).
  35. Hallac, B. B., Pu, Y., Ragauskas, A. J. Chemical transformations of buddleja davidii lignin during ethanol organosolv pretreatment. Energy & Fuels. 24 (4), 2723-2732 (2010).
  36. Sette, M., Wechselberger, R., Crestini, C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR. Chemistry - A European Journal. 17 (34), 9529-9535 (2011).
  37. Sette, M., Lange, H., Crestini, C. Quantitative HSQC analyses of lignin: A practcal comparison. Computational and Structural Biotechnology Journal. 6 (7), 201303016 (2013).
  38. Wroblewski, A. E., Lensink, C., Markuszewski, R., Verkade, J. G. Phosphorus-31 NMR spectroscopic analysis of coal pyrolysis condensates and extracts for heteroatom functionalities possessing labile hydrogen. Energy & Fuels. 2 (6), 765-774 (1988).
  39. Archipov, Y., Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part I. Model compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology. 11 (2), 137-157 (1991).
  40. Argyropoulos, D. S., Heitner, C., Morin, F. G. P. NMR spectroscopy in wood chemistry - Part III. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores in mechanical pulp. Holzforschung - International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of. 46 (3), 211-218 (2009).
  41. Argyropoulos, D. S., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part VI. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores and carboxylic acids present in mechanical pulps; a method for the quantitative determination of ortho-quinones. Holzforschung. 48 (1), 112-116 (1994).
  42. Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry part V. Qualitative analysis of lignin functional groups. Journal of Wood Chemistry and Technology. 13 (2), 187-212 (1993).
  43. Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part IV. Lignin models: Spin lattice relaxation times and solvent effects in 31P NMR. Holzforschung. 47 (1), 50-56 (1993).
  44. Granata, A., Argyropoulos, D. S. 2-Chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, a reagent for the accurate determination of the uncondensed and condensed phenolic moieties in lignins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 43 (6), 1538-1544 (1995).
  45. Duval, A., Vilaplana, F., Crestini, C., Lawoko, M. Solvent screening for the fractionation of industrial kraft lignin. Holzforschung. 70 (1), 11-20 (2016).
  46. Ben, H., Farrell, J. R. In-depth investigation on quantitative characterization of pyrolysis oil by 31P NMR. RSC Advances. 6 (21), 17567-17573 (2016).
  47. Goldschmid, O. Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet spectrophotometry. Analytical Chemistry. 26 (9), 1421-1423 (1954).
  48. Ben, H., et al. Characterization of whole biomasses in pyridine based ionic liquid at low temperature by 31P NMR: An approach to quantitatively measure hydroxyl groups in biomass as their original structures. Frontiers in Energy Research. 6, (2018).
  49. Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis of potentially biobased copolyesters based on adipic acid and butanediols: Kinetic study between 1,4- and 2,3-butanediol and their influence on crystallization and thermal properties. Polymer. 99, 204-213 (2016).
  50. Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis and characterization of biobased poly(butylene succinate-ran-butylene adipate). Analysis of the composition-dependent physicochemical properties. European Polymer Journal. 87, 84-98 (2017).
  51. Chan, K. P., Argyropoulos, D. S., White, D. M., Yeager, G. W., Hay, A. S. Facile quantitative analysis of hydroxyl end groups of Poly(2,6-dimethyl-1,4-phenylene oxide)s by 31P NMR spectroscopy. Macromolecules. 27 (22), 6371-6375 (1994).

Tags

Kjemi utgave 174
Kvantitativ <sup>31</sup>P NMR analyse av Lignins og Tannins
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Argyropoulos, D. S., Pajer, N.,… More

Argyropoulos, D. S., Pajer, N., Crestini, C. Quantitative 31P NMR Analysis of Lignins and Tannins. J. Vis. Exp. (174), e62696, doi:10.3791/62696 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter