Summary
31 P NMR은 폴리페놀의 구조적 용해를 위한 강력한 도구입니다. 리닌과 탄닌의 다양한 유형의 하이드록시, 페놀 및 카박스실 그룹의 정량화 및 분화를 허용하는 빠르고 쉽고 정밀하며 정량적이며 매우 재현 가능한 분석 절차가 이제 일상적인 분석 도구가 되었습니다.
Abstract
지속 가능한 바이오 정유 제품 개발은 리그닌과 탄닌 용맹화의 도전과 함께, 다른 사람의 사이에서 직면하고있다. 이러한 풍부하고 재생 가능한 방향족 생물 폴리머는 고유의 구조적 복잡성과 높은 수준의 가변성과 종의 다양성으로 인해 널리 악용되지 않았습니다. 이러한 폴리페놀에 대한 정의된 1차 구조의 부재는 처리 중에 유도된 복잡한 화학적 변경으로 더욱 복잡해지고, 결국 추가 활용 노력에 극한의 구조적 특징을 부여한다.
따라서 천연 폴리페놀에 존재하는 다양한 기능 집단의 신속하고 간단하며 명백한 식별 및 정량화를 위한 프로토콜은 이해를 위한 기본 전제 조건이며 그에 따라 반응성과 최종 유틸리티를 맞춤화합니다.
정량적 31P NMR은 리닌과 타닌의 대체되지 않은, o-모노 대체 및 o-di-대체 페놀, 알리팔성 OHs 및 카바실산 모니티를 광범위하게 적용 잠재력을 가진 전자 제품 입니다.
방법론은 적절한 31P 함유 프로브를 사용하여 시투 정량 리닌 또는 탄닌 라벨링 프로시저로 구성되며, 내부 표준이 있는 정량적 31P NMR 스펙트럼을 획득하는 것으로 구성된다. 31P 핵의 높은 자연 풍부는 소량의 샘플(~30 mg)과 짧은 NMR 획득 시간(~30-120분)을 허용하며, 잘 해결된 31P 신호는 표시된 OH 그룹의 주변 화학 환경에 크게 의존한다.
Introduction
최근 Nature Protocols1에 발표된 이 절차는 아카이브 문헌에서 3,000회 이상 인용되었으며 필수적이고 신속하고 재현 가능한 구조 정보를 제공하기 때문에 리그닌 및 탄닌 특성화를 위한 일상적인 측정이 되었습니다.
리닌과 타닌
폴 T. 아나스타스와 존 C. 베르너2,3에의해 녹색 화학이 도입되었을 때, 그것은 화학의 일반적인 개념을 크게 변화시켰습니다. 특히 석유, 석탄 등 화석 사료원료 대신 지속가능한 소재를 도입하는 것이 중요한2,3으로강조된다. 바이오매스의 다양한 유형 중, 리그닌은 가장 풍부한 방향족 생물 폴리머이며 산업 상품 및 고부가가치 제품4의잠재적 원천으로 볼 수 있다.
리그닌은 두 번째로 풍부한 나무 성분입니다 (셀룰로오스가 1위, 헤미셀룰로오스 3위). 식물의 함량은 식물 유형에 따라 다릅니다 : 예를 들어 연작에 비해 리그닌의 양이 적은 나무 (20 % ± 4 % 대 28 % ± 4 %). 또한, 식물성 조직 내의 리그닌 분포는 균일하지 않다: 더 높은 리그닌 함량은 세포벽5,6에서발견될 수 있다. 리그닌은 종이/셀룰로오스 산업의 부산물로 산업적으로 수득된 폴리페놀소재(7)이다. 그것은 나무 칩이 주로OH의 존재에서 처리되는 나무 펄프 공정에서 회수된다 - 및 / 또는 OH- + HS- 이온 조건은 헤미셀룰로오스와 리그닌에서 셀룰로오스를 분리(소다및 / 또는 크래프트 프로세스) 8,9.
리그닌을 연구하는 첫 번째 시도는 각각 1838년과 1865년10년에페이엔과 슐츠에 의해 이루어졌다. 1977년, 애들러는 그 시간11의모든 관련 가능한 지식을 요약했다. 현재 리그닌 빌딩 블록은 p-coumaryl, coniferyl 및 시나필 알코올의 세 페닐 프로파노이드 단위임을 인식하고 있습니다. 이러한 단량체는, 자유 라디칼 중합 공정 덕분에, p-하이드록시페닐, 구아아실 및 시나필 유닛을 발생시키고 결국 리그닌(그림1)12를광범위하게 구성한다. 리그닌에 기본 구조의 부족은 구조적 특성에 대한 고유의 어려움을 의미한다. 이에 따라, 분자량의 분포에 대한 평가는 항상 다소 논란이 되고 있다. 밀링 우드 리그닌, 주로 protolignin10에근사치하는 온화한 조건하에서 분리된 리그닌은, 수분자 집계 과정을 통해 높게 상호 작용하는올리고머(13)로 구성된다14,15.
그림 1: 다른 유형의 채권이 강조 표시된 침엽수 리그닌의 대표 모델입니다.
리그닌은 일반적으로 에 따라 분류됩니다 : (a) 그들이 파생되는 나무의 종류 (예를 들어, 나무와 침엽수), (b) 그것을 분리하는 데 사용되는 과정. 가장 중요한 산업 리그닌 유형은 크래프트, 리그노술포네이트, 오르간솔브입니다.
리그닌의 구조는 그 기원과 처리 화학에 크게 의존한다. 보다 구체적으로 말하자면, 리그닌의 다소 복잡하고 불규칙한 구조가 자연적인 다양성과 복잡한 처리 화학으로 복합될 때, 극단적인 가변성, 다양성 및 이질성의 재료가 등장하여 저가치 응용분야(16)로의사용을 제한한다. 소프트우드 리그닌은 주로 과아실 유닛(G)을 함유하고 있지만, p-하이드록시페닐그룹(G lignin)의 무시할 수 있는 양을 가진 나무 리닌은 다양한 비율로 구아아실과 실리겔 서브유닛(GS lignin)으로 구성되며, 잔디 리닌은 구아악실, 실리링실, 및 겔시(ghenx)에 의해 구성된다. 절연에 사용되는 추출 접근법은 신흥리그닌(17)의구조에 극적으로 영향을 미친다. 도 2는 세 개의 리그닌 구조를 묘사하며, 사용되는 격리 접근 방식과 는 다릅니다. 추출 방법의 효과에 관한 몇 가지 고려 사항을 강조 할 수 있습니다. 첫째, 크래프트 리그닌은 수축, 고도로 단편화, 응축 된 리그닌이며, 오가노솔브 리그닌은 밀링 우드 리그닌 (Bjorkman 접근 법을 사용하여 격리)18,19,20과유사한 구조를 갖는다. 마지막으로, 리그노술포네이트는 추출 황화 공정의 강도 및 조건에 따라 높은 수준의 황황을 특징으로 한다.
그림 2: 기술 리그닌을 위한 대표적인 구조. 이 그림에서, 리그닌의 다른 모형 간의 다름을 볼 수 있습니다. (A)소프트우드 크래프트 리그닌은 응축되어 있으며,(B)리그노술포네이트는 포화 탄소에 설포닉 군을 특징으로 하며,(C)오가노솔브 리그닌은 밀드 우드 리그닌 과 유사한 구조를 갖는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
리그닌과 유사, 탄닌은 식물에서 발견 되는 폴리 페놀 화합물. 탄닌의 추출 접근 방식과 응용 프로그램에 대한 최근 업데이트 된 리뷰는 최근 Das 외21에의해 발표되었습니다. 일상 생활에서 탄닌의 중요성은 두 가지 예를 고려하여 강조 될 수있다 : 그들은 와인 에 맛과 색상을 부여22; 또한 폴리 페놀 구조는 항산화 특성을 제공하며 선탠산업(23)에적용하기에 이상적입니다. 탄닌은 가수 분해 가능하고 가수분해성이 없는 두 가지 클래스로 나뉩니다. 가수 분해성 탄닌은 갈릭, 디갈릭 및 엘라그산 에스테르의 중합체로 간주될 수있다(도 3). 이 에스테르는 설탕 분자를 가진 페놀산의 에스테르화에서 유래합니다 (예를 들면, 포도당, rhamnose 및 아라비노스).
그림 3: 전형적인 가수 분해 성 탄닌 : 탄닌산, vescalgin.
응축 된 탄닌이라고도 하는 비 가수분해성 탄닌은 플라반-3-올에서 파생되는 폴리머와 올리고머입니다. 플라반-3-올 중카테킨과 갈로신이 가장 빈번합니다. 무색 결정 화합물(도4)입니다. 중합은 헬리코이드 구조를 특징으로 하는 중합체를 생성한다. 방향족 하이드록시 그룹은 나선의 외관을 향하고, 피란 산소는 내부에 있습니다.
그림 4: 프로안토시아니딘 구조: R =H, OH, OCH3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NMR을 사용하여 리그닌과 탄닌의 특성화
리닌 또는 탄닌 특성화에서 두 가지 유형의 정보가 중요합니다: (예를 들어, 하이드록시 그룹 함량, 자연 및 단위 연계 빈도) 및 (b) 분자량 및 다분산성. lignin에 초기 연구 이후, 다른 기술은 이러한 목표를 달성 하기 위해 사용 되었습니다., 그리고 방법의 두 종류 등장: 화학 및 물리적 방법.
리그닌 화학에서 알칼리니트로벤젠 산화, 유도등의 화학적 방법, 환원골 분열, 영망가산 산화 및 티오산성리시스에 이어 역사적으로 널리 사용되어 왔다24,25,26,27,28, 29. 그러나 분석 프로토콜이 구현되고 최적화되었음에도 불구하고 시간 까다롭고 힘들며 광범위한 실험기술(30)이필요합니다. 대안적으로, 기악 분석의 시작부터, 물리적 방법은 리그닌 및 탄닌특성화(31)를수행하는 데 사용되어 왔다. 이러한 기술은 리그닌 구조를 쉽게 특성화 할 수 있도록 고전 방법의 문제를 극복 할 수 있습니다.
핵 자기 공명 (NMR)은 기악 기술 중 리그닌 구조 및 화학 조성에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 특히, 정량적 단차원 1HNMR 스펙트럼 및 정량적 13C NMR 스펙트럼으로부터의 데이터는 리그닌 간 결합32,33,34,35의다양한 유형에 대한 정보를 제공할 수 있다. 안타깝게도 단차원 스펙트럼은 신호 중복으로 인해 신호 통합 노력을 심각하게 저해할 수 있습니다. HSQC(이종핵 단일 양자 일관성), Q-HSQC(정량적 - 이종핵 단일 양자 일관성)의 정량적 버전은 리그닌 구조를 더 잘 이해하는 데 사용되어 내부 연계에 대한 유용한 정보를 제공합니다. 그러나, 다양한 건물 단위를 결정하기 위해 완전히 활용 될 수 없다13,36,37 정량적으로.
모노 및 2차원 NMR과 관련된 문제를 극복하기 위해 기판 유도제가 고려되고 있다. 이 접근법의 장점 중특정 라벨은 복잡한 거대 분자 내에서 도입될 수 있고 표지된 기판이 용해되는 용매로부터 스펙트럼 간섭 결과가없음이다. Verkade는 인 유도체, 석탄 유도체 및 관련 화합물38의 31P NMR 분석을 수행하여 이 분야의 선구자였습니다. 그 간행물에서, 다른 인 함유 시약의 검열 (인)를 수행하고, 다른 라벨 화합물의 화학 적 변화가 기록되었다. Argyropoulos팀은 1991년 리그닌에서 하이드록시 그룹의 정량적 및 질적 분석을 위한 파생을 처음도입했습니다. 인 함유 시약을 사용하여 리그닌 모델 화합물의 파생을 연구한 후, 그의 그룹은 리그닌 화학에서 가장 매일 사용되는 기술 중 하나인 39,40,41,42,43을위한 길을 열었다. 조사된 상이한 인광 중, 아가이로풀로스는 2-클로로-4,4,5,5-테트라메틸-1,3-2-디옥사포스포레인(TMDP)을 사용하여 리그닌분석(44)을수행하기에 가장 적합한 것으로 보고 도착했다. TMDP는 특정 31P NMR 화학적 시프트(그림5)를특징으로 하는 인 함유 유도체의 정량적 형성을 일으키는 하이드록시 그룹과 선택적으로 반응한다.
그림 5: 리닌 및 탄닌 인산 화학. 라벨링 리그닌 및 타닌 음순 H 그룹은 시투 반응에서 수행됩니다. 표지된 폴리페놀은 다양한 유형의 하이드록시 그룹에 대응하는 특정 31P NMR 밴드를 특징으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시료 유도는 피리딘/클로로폼(1.6:1) 혼합물에서 수행되는; 이 선택은 정확한 평가에서 발생합니다. 피리딘은 두 가지 장점이 있습니다. 먼저, 약 22.1MPa1/2의 힐데브란트 파라미터를 특징으로 하는 용매를 선택하면 리그닌용용화(45)가단순화되고 증폭한다. 따라서 힐데브란트 매개 변수가 21.7과 동일한 용매로 피리딘을 첨가하는 것이 최적입니다. 둘째, 수산화군을 갖는 TMDP의 반응은 리닌-인스포레인 유도체의 촉진 형성에 대한 수반되는 부정적인 영향을 갖는 부산물로 염산(HCl)의 형성을 수반한다. 이러한 이유로 결과 HCl은 중화되어야 합니다. 상당한 초과에 존재하는 경우, TMDP에 비해 피리딘의 기본성은 HCl의 중화 (피리딘 염산염형성을 통해)를 허용합니다.
권장 피리딘/증식 클로로폼 바이너리 용매 시스템의 사용은 세 가지 이유를 기반으로 합니다. 첫째, 샘플 용해를 선호합니다. 둘째, 피리딘 염산염은 클로로포름에서 용해되기 때문에 최종 스펙트럼의 강수및 열화를 방지할 수 있습니다. 셋째, 유족 클로로폼은 고유한 단일 신호로 선택되어 인수 과정에서 NMR 분광계를 잠글 수 있습니다. 샘플 유도는 내부 표준이 있는 상황에서 수행됩니다. 이러한 방식으로, 시료와 표준이 도출될 때, 시료의 피크의 일체형과 표준의 비교는 존재하는 각 유형의 하이드록시 그룹에 대한 양을 정량화할 수 있게 한다. 다양한 화합물은 내부 표준으로 간주되었습니다. 이러한 화합물은 분자당 단일 하이드록시 군을 특징으로 하며, 유도후 31P NMR 스펙트럼에서 단일 날카로운 신호를 제공한다. 표준의 선택은 신중하게 이루어져야 합니다. 그 신호는 파생 된 샘플의 신호와 겹치지 않아야합니다. 콜레스테롤은 초기에 널리 사용되었습니다. 그러나, 알리팔성 하이드록시 그룹에서 발생하는 신호와 부분 중복은 사용을 제한한다. 일상적인 분석을 위해 N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르박스디미드(NHND)의 내부 표준 솔루션이 바람직하다. 그러나 NHND 불안정으로 인해 표준 솔루션은 며칠 동안만 저장할 수 있습니다46.
Protocol
다음 흐름도(도6)는리닌과 탄닌의 31P NMR 분석을 수행하기 위해 전체 실험 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
그림 6: 리닌과 탄닌의 31P NMR 분석을 위한 절차.
1. 샘플 전처리
- 40°C에서 설정된 진공 오븐에서 밤새 유리석(약 100 mg)의 알리아쿼트(리닌 또는 탄닌 샘플)를 건조시한다.
참고: 40°C 이상의 온도가 검사된 폴리페놀의 민감한 구조를 화학적으로 변화시킬 수 있기 때문에 온도 선택에 특히 주의가 필요합니다. - 건조 후, 시료를 실온에 도달할 때까지 무수성 칼슘 황산건조기로 신속하게 이송합니다. 이 단계는 환경으로부터 습도를 흡수하는 시료를 피하는 것이 의무적입니다.
2. 용매 용액 준비
- 무수성 피리딘과 중수소 엽록체를 1.6/1(v/v) 비율로 혼합하여 20mL 샘플 바이알에 피리딘/중음클로로폼 용매 혼합물을 준비한다.
주의: 피리딘과 중음엽소포를 조작하는 동안 주의를 기울이세요. 이 화합물은 인화성, 유해, 독성입니다. 적절한 장갑을 사용하여 통풍이 잘 되는 연기 후드에 솔루션을 준비하고 사용하십시오. - 잘 씻고 건조된 5A 분자 체5A를 3.2mm 펠릿에 추가하여 물 흔적을 제거합니다. 또한, 중격 캡의 사용은 용매 시스템의 공기 접촉 및 습기 오염을 방지하기 위해 적극 권장된다. 준비된 솔루션을 어둠 속에서 저장합니다.
3. 내부 표준 솔루션 (IS) 준비
- 2 mL Erlenmeyer 플라스크에서 이전에 제조된 용매 용액에서 크롬(III) 아세틸레스토네이트(약 10 mg) 및 내부 표준(NHND 약 35.8 mg 또는 콜레스테롤 77.3 mg)의 0.1 M 용액을 준비한다.
주의: 크롬 (III) 아세틸 레이스토네이트는 유해; 조작 하는 동안, 적절 한 장갑을 착용. - IS 솔루션에 추가된 IS의 정확한 중량을 기록합니다.
- 활성 분자 체(참조점 2.2)를 포함하는 밀봉된 캡이 장착된 유리병에 IS 용액을 옮기고 40°C에서 어둠 속에서 저장한다.
4. NMR 샘플 솔루션 준비
- 교반 바가 장착된 2mL 유리병에 30 mg의 시료를 정확하게 계량합니다. 바이알을 중격 캡으로 밀봉합니다.
- 용매 시스템 용액의 0.5mL을 샘플 바이알에 추가합니다.
- 마이크로피펫을 통해 시료 바이알에 IS 용액의 100 μL을 전송합니다. 모든 리그닌 또는 탄닌이 용해될 때까지 생성된 분산(500rpm)을 자기적으로 저어서 명확한 용액을 생성합니다.
참고: 완전한 샘플 용해화가 필수적이므로 이 단계는 최대 12h가 걸릴 수 있습니다. - TMDP의 0.1 mL을 샘플 솔루션으로 전송합니다. 샘플을 격렬한 자기 교반 아래에 놓습니다. 샘플 용액을 밀봉상태로 유지합니다. 적절한 장갑을 끼고 통풍이 잘 되는 연기 후드에 TMDP를 사용하십시오.
주의: TMDP와 증기는 부식성, 유해하며 물과 빠르게 상호 작용합니다.
참고: 노란 침전물의 형성은 시료 또는 피리딘/클로로폼 용액의 물 흔적 때문입니다. 이 경우 가능한 모든 수분 오염을 방지하여 절차를 반복해야 합니다. - 파스퇴르 파이펫을 사용하여 샘플 솔루션을 NMR 튜브로 전송합니다.
5. NMR 분석
- 튜브를 NMR 기기에 적재합니다. 이 분석을 수행하는 데 사용되는 분광계에는 광대역 프로브가 필요합니다.
- 표 1 1에표시된 설정에 따라 실험 매개 변수를수정합니다.
| 펄스 프로그램 | 역 게이트 분리 펄스 (zgig) |
| 핵성 | 31P |
| 스펙트럼 너비 | 100 p.p..m. |
| 취득 시간 | - 0.8 s |
| 이완 지연 | ≥ 10s |
| 스캔 번호 | 64 이상 |
| 스펙트럼 센터 | 140 p.p.p.m. |
표 1: 유도 리그닌 또는 탄닌의 31P NMR 스펙트럼을 기록하는 실험 매개 변수.
- 미지정 클로로폼의 공명 주파수를 사용하여 분광계 주파수를 설정하고 샘플을 심고 분광계를 조정합니다. 그런 다음 인수를 시작합니다.
6. 스펙트럼 처리 및 분석
- 다음 단계에 따라 적절한 표준 소프트웨어로 31P NMR 원시 데이터를 처리합니다.
- 푸리에 변환을 수행합니다.
- 수동 단계 보정에 의해 위상조정(처리 | 위상 보정 | 수동 보정).
- 베이스라인을 수동으로 수정하고 0점을 신중하게 설정합니다(처리| 기준 선 | 다중 점 기준 선변경).
- 신호 보정.
- 132.2 ppm의 화학적 시프트 값으로 인산수에 대한 신호를설정(분석 | 참조 | 참조).
참고 : 175 ppm에서 날카로운 31P 신호의 존재는 TMDP의 과잉에 기인한다. 그 존재는 샘플의 완전한 파생을 보장합니다. 이 피크가 없는 경우 철저한 시료와 용매 건조를 제공하고 TMDP를 추가하여 전체 절차를 다시 검토해야 합니다. 일단 이것이 보장되면 스펙트럼은 스펙트럼 범위(132~약 150 ppm)에서 확대된다(그림7).
- 132.2 ppm의 화학적 시프트 값으로 인산수에 대한 신호를설정(분석 | 참조 | 참조).
그림 7: TMDP의 과잉의 존재를 확인 : 그것은 볼 수 있다면, 샘플의 파생이 완료됩니다. 그런 다음 스펙트럼을 분석할 수 있습니다. 이렇게 하려면 155ppm에서 132 ppm 사이의 스펙트럼 범위를 확대합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 통합
- 내부 표준을 1.0으로 설정하여 통합을 정규화합니다(피크 | 클릭하십시오. 통합 | 편집 정규화: 1.00). 다음 표에 보고된 화학적 변화에 따라 스펙트럼 통합을 수행합니다. 테이블 2를 사용하여 리닌과 테이블 3용 타닌을 사용하십시오.
| 기능 그룹 | 화학 적 변화 (ppm) |
| 알리파틱 오 | 149.0-146.0 |
| 페놀오 오 | 144.0-137.4 |
| C5 대체 페놀 OH | 143.0-140.2 |
| 5-5' 페놀 OH | 141.7-140.2 |
| 시링실 오 | 143.2-142.7 |
| 4-O-5' OH | 142.8-141.7 |
| 과아실 오 | 140.2-138.8 |
| p-하이드록시페닐 OH | 138.8-137.4 |
| 쿠오 (COOH) | 136.0-133.6 |
| 트리신 () | 137.0-136.0 |
표 2: 리그닌 인지성 OH-그룹에 대한 31P NMR 화학 적 변화.
| 기능 그룹 | 화학 적 변화 (ppm) |
| 링 A | |
| o-대체 페놀 | 137.9–137.4 |
| o-대체 페놀릭 | 138.8–137.9 |
| 링 B | |
| 카테콜 OH | 140.2–138.8 |
| 피로살롤 OH | 144.0–140.2 |
| 링 C | |
| 알리하티C OH | 146.0–145.0 |
표 3: 탄닌 인광 OH-그룹에 대한 31P NMR 화학 적 변화.
참고: 표준 스펙트럼 처리 소프트웨어를 사용하여 화학 적 시프트의 미리 정의된 영역을 통합하도록 설정할 수 있습니다. 이 기회는 여러 스펙트럼을 처리해야 할 때 유리합니다.
7. 기능그룹 정량화
- IS 솔루션의 농도를 계산합니다.
- 특정 신호의 동등한 양을 계산합니다.
Representative Results
설명된 프로토콜은 리그닌과 탄닌의 분석을 위해 모두 적용될 수 있다. 리그닌 화학에서, 이 방법은 다양한 유형의 하이드록시 그룹의 검출 및 정량화를 허용하기 때문에 기본이다. 도8A-D는 다른 주파수에서 작업하는 분광기로 획득한 리닌과 탄닌의 31P NMR 스펙트럼의 예를 보여줍니다. 도 8A에 표시된 스펙트럼은 300MHz NMR 분광계를 사용하여 기록되었으며, 도 8D는 700MHz NMR 계측기로 기록되었다.
그림 8: 정량 31P NMR 스펙트럼 (A) 침엽수 크래프트 리그닌 (스펙트럼은 리그닌 30.8 mg에 300 MHz 분광계로 기록), (B) 침엽수리뉴산 (스펙트럼은 30.1 mg의 30.1 mg에 300 MHz 분광계로 기록 리그노술포네이트를 리그노술포닉산으로 보존한 후, (C) 아카시아 타닌(스펙트럼은 30.3 mg 샘플에 300MHz 분광기로 기록됨) 및 (D) 침엽수크래프트 리그닌(스펙트럼은 700MHz 분광계로 기록됨). 7.2 리닌의 mg). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이러한 스펙트럼은 신중하게 기록되고 수동으로 처리되었습니다. 알리팔리아제(150-145 ppm), 방향족(145-137 ppm), 카박스실(136-134 ppm) 하이드록시 군수력제에 대한 일반적인 신호는 매우 잘 해결되고 쉽게 통합된다. 스펙트럼 창이 열리면 (95 ~ 190 ppm, 그림 8),세 가지 날카로운 강한 피크 (175, 144 및 132 ppm)가 명백합니다. 이는 TMDP, 내부 표준(콜레스테롤 또는 NHND) 및 하이드록시-TMDP(물 흔적에 의한)의 과잉 때문입니다.
크래프트와 오가노솔브 리그닌과는 달리, 리뇨술포네이트는 피리딘/클로로폼 혼합물에서 불용성이다. 신뢰할 수 있는 31P NMR 스펙트럼을 얻으려면 용해도가 필수적입니다. 이 문제를 극복하기 위해, 리그노술포네이트는 유도하기 전에 해당 리그노술포닉 산으로 변환될 수 있다. 강한 산(즉, 황산) 또는 산환수지(예를 들어, 다우엑스 1H, 강한 산 정온 교환기)를 가진 리노설포네이트 용액을 치료하면 모든 황산체의 산성 형태로 의 전환이 촉진된다. 생성된 제품은 이 프로토콜을 사용하여 분석된 분자량을 특징으로 하는 화합물을 분리하는 데 사용되는 선택적 흡착 수지(XAD-7, 극성 흡착제).m 를 사용하여 산성 용액에서 제거될 수 있다. 도 8B는 TMDP 의 정량31P NMR 스펙트럼을 나타내며, 이는 리그노설포닉산을 나타낸다. 이 경우에도 하이드록시 그룹의 다른 신호가 분명합니다. 도 8C는 TMDP를 사용하여 파생된 탄닌 샘플의 전형적인 정량적 31PNMR 스펙트럼을 나타낸다. 상이한 알리팔리파틱 OH(링 C), 피로갈롤, 링 B의 카테콜 유닛, 링 A의 유닛으로부터의 특징적인 신호가 잘 드러난다.
Discussion
상기 방법은 Argyropoulos37,38,39,40,41,42에의해 개발된 리그닌의 질적 및 정량적 특성화를 목표로 하는 분석 프로토콜의 구현 및최적화를나타낸다. 리그닌 구조 용해에 사용할 수있는 다른 많은 기술에 비해, 방법은 널리 가장 촉진 중으로 받아 들여지고있다, 신속, 그리고 재현. 습식 화학적 방법의 유효성(예를 들어, 니트로벤젠, 영망가산 산화 등)은 작업자의 좋은 실험 기술에 의존하여 제한된 작업자에게 효과적으로 제한하는 방법을 제한합니다. 또한, 젖은 화학 적 방법에 대한 문헌의 교정 요인을 발생하는 것은 드문 일이 아니다 몇 가지 단점을 고려. 설명된 31P NMR 프로토콜은 고급 실험 기술이 필요하지 않아 쉽게 적용 가능하고 사용자 친화적이며 널리 사용할 수 있습니다. 다른 기악 분석 방법에 비해, 31P NMR은 lignins에서 다른 하이드록시 그룹을 정확하게 검출하고 정량화할 수 있는 유일한 기술입니다. 예를 들어, FTIR는 1H NMR과 같은 다양한 하이드록시 그룹을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 두 기술 모두 광범위한 신호 중복 문제로 인해 신뢰할 수 있는 정량데이터를 제공할 수 없기 때문에 어려움을 겪습니다. 또 다른 널리 사용되는 기술은 UV-비스 분광법, 먼저 Goldschmid에 의해보고. 그러나 이 접근법은 알리팔, 방향족 및 카복실릭OHs(47)를효과적으로 구별할 수 없기 때문에 하이드록시 그룹의 일반적인 전반적인 결정으로 제한됩니다.
경제적인 관점에서 볼 때 31PNMR 기법의 유일한 한계는 상대적으로 비싼 시약인 TMDP의 가격입니다. 그것은 그램 당 약 190 USD 비용; 따라서 분석 비용이 TMDP의 가격에만 근사될 경우, 피리딘/클로로폼 혼합물과 작업자 시간에서 파생된 것을 제외하면 분석당 약 24USD에 달할 것입니다. 이 문제를 해결하기 위해 많은 실험실이 TMDP를 합성하여 시약 비용을 절감하는 데 의존합니다. 이를 위해 피나콜과 인트리글로라이드는 트리에틸라민(44)의 존재에서반응한다. 기술적으로, 이 반응은 상대적으로 쉽습니다; 그러나, 인 트리클로라이드의 사용과 잘 통제 된 진공 증류를 포함한 작업 업에주의가 필요합니다. TMDP의 합성에 대한 자세한 내용은 요청 시 제공 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 용이성, 재현성 및 정밀도 면에서 최고중이지만 몇 가지 중요한 점을 강조해야 합니다. 첫째, 샘플은 확인된 피리딘/클로로폼 혼합물에서 완전히 용해되어야 합니다. 이러한 고려사항은 하이드록실 군의 정량적 인산화 반응이 완전히 균일한 조건하에서 수행되어야 하기 때문에 근본적입니다. 샘플의 일부만 용해화되면 결과 분석이 부정확합니다. 둘째, 이러한 변수가 분석의 정밀도와 전반적인 성공에 해로운 영향을 미치기 때문에 검사해야 하는 시료는 습기 및 용매가 없어야 합니다. 습도의 흔적은 2-하이드록시-4,4'-5'-테트라메틸-1,3,2-디옥사포스포레인을 주는 TMDP와 반응할 것이다. 이 화합물은 옅은 노란색 floculatating 소금, 피리딘 /클로로폼 용매 혼합물에 용해, 부적 절한 NMR 신호 수집을 일으키는. 시료의 작은 무게(~30 mg)만 필요하기 때문에 분석 전에 정확하게 알 수 있도록 정확한 중량에 대한 휘발성이 없어야 합니다.
때로는 시료 용해를 돕는 소량의 공동 용매(즉, 디메틸포르마미드)를 추가하여 (특히 고도로 산화된 시료의 경우) 시료 용해 문제를 촉진할 수 있습니다. 원칙적으로 TMDP와 상호 작용하지 않는 모든 용매를 사용하여 샘플 용해를 도울 수 있습니다. 공동 용매의 선출은 시약과 반응하기 때문에 음순 하이드록시 또는 아미노 그룹을 포함하는 공동 용매를 포함 할 수 없으므로 오해의 소지가있는 최종 스펙트럼을 유발합니다. 특히 디메틸설프리산화물도 TMDP와 협력하여 공동 용매로 사용하는 것을 배제하고 있다. 피리딘 계 이온 성 액체, 1-알렐-3-부틸피리디늄 염화물과 같은, 용해도 문제가 발생할 때 사용할 수 있습니다; 그러나 이온 액체는 다시 한 번 건조해야48. 리뇨술포네이트(높은 황후 정도를 특징으로 하는 리그닌 타입)를 용해시키기 위해 중화군의 산성 형태로의 전환과 관련된 전처리가 도움이 되는 것으로 입증되었다. 리뇨술포네이트는 수성 매체에서 산성 교환 수지를 사용하여 산성 상태로 편리하게 변환할 수 있습니다. 생성된 리노술포닉 산은 특정 수지(예를 들어, XAD-7)에 대한 흡착 및 에탄올의 탈착에 의해 용액으로부터 분리된다. 40°C에서 감압을 통해 에탄올릭 솔루션의 증발은 리뇨술포닉 산의 분리를 허용한다. 이러한 리그닌은 프로토콜에 의해 제안된 피리딘/클로로폼 혼합물에서 용해되기 때문에 31P NMR을 특징으로 할 수 있다.
온화한 온도에서 장기간 진공 건조는 효과적으로 각 샘플의 수분 과 기타 휘발성의 양을 감소시킨다. 특히 TMDP가 과도하게 추가되므로 소량의 물이 최종 스펙트럼에 영향을 미치지 않습니다. 또한, 경우에 따라 소량의 2-하이드록시-4,4'-5'-테트라메틸-1,3,2-디옥사포스포레인은 NMR 튜브 또는 시료 바이알에 존재하는 습도에서 발생할 수 있다. 이러한 경우, 교반은 형성된 침전물의 양을 완전히 용해시키기에 충분하다. 2-하이드록시-4,4'-5,5't-테트라메틸-1,3,2-디옥사포스포레인의 높은 양이 형성되면, 시료 준비를 반복하여 건조 처리를 개선하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 사용하기 전에 모든 유리 제품을 열총으로 간략하게 가열할 수 있습니다.
스펙트럼을 기록하는 데 사용되는 스펙트럼 범위는 상이한 하이드록실 그룹에 관한 신호에 대한 관심 영역과 비교하여 광범위하다. 그러나 이는 시료 파생이 성공적으로 발생했는지 여부를 이해해야 합니다. 완전한 샘플 유도의 확인은 174 ppm 주위에 강한 신호의 존재에 의해 주어진다. 이 날카로운 피크는 반응하지 않은 TMDP에 기인하고, 그 존재는 시약이 과잉에 존재하고, 따라서, 모든 하이드록실 그룹이 파생되었습니다 보장한다. 이 피크가 없는 경우, 두 가지 가장 가능한 원인은 다음과 같습니다: (1) 사용되는 TMDP의 양은 샘플의 완전한 파생을 수행하기에 충분하지 않거나, (2) 샘플에 높은 양의 물이 존재한다. 첫 번째 경우, TMDP의 높은 금액을 사용하면 샘플의 완전한 파생을 보장할 수 있으며 174 ppm의 신호가 나타납니다. 두 번째 경우, 샘플은 더 광범위하게 건조되어야한다. 과도한 TMDP가 보장되면 피크 통합을 수행할 수 있습니다. 이 작업을 수행하기 전에 관심 신호를 제한하는 좁은 창(150~132ppm)으로 확대합니다.
위의 실험 프로토콜에 보고된 분석할 샘플(~30 mg)의 양은 300MHz NMR 분광계 이상에 대해 양질의 분광을 수집하도록 선택되었다. 그럼에도 불구하고, 500MHz 이상의 필드 자석이 사용되는 경우 시료 양을 줄일 수 있음을 관찰했습니다. 예를 들어, 도 8D에서,7.2 mg의 리그닌으로 제조된 샘플의 NMR 스펙트럼(700MHz 계측기에서 유래)이 도시된다. 이 스펙트럼의 신호 통합은 더 많은 양의 리그닌을 사용할 때 얻은 것과 동일한 결과를 제공합니다. 이 사실은 소량의 제품을 사용할 수있는 모든 연구에 대한이 프로토콜의 적용 가능성을 증폭시합니다.
전반적으로, 이러한 실험 프로토콜은 리그닌 및 탄닌에 존재하는 다양한 하이드록시 그룹의 기원과 운명을 이해할 때 많은 연구 개발 응용 프로그램에 적용될 수 있다. 특히 GPC 및 HSQC 데이터와 결합하면 결과 데이터는 리그닌 또는 탄닌의 구조를 더욱 정교하게 추측할 수 있는 기회를 제공합니다. 리그닌 또는 탄닌의 하이드록시 그룹에 화학적 변형이 적용되는 많은 경우, 정량적 31P NMR 분석은 이러한 수정이 발생했는지 여부와 어느 정도인지를 검출하는 데 매우 유용할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 9는 산화 전후에 동일한 리그닌의 두 개의 NMR 스펙트럼을 보여줍니다. 간단한 질적 평가는 산화 시 알리팔성 및 방향족 하이드록시 그룹의 감소를 보여 주므로 귀중한 정보와 지침을 제공합니다.
그림 9: TMDP(A)이전 및(B)를사용하여 파생된 동일한 오가노솔브 리그닌의 정량적 31P NMR 스펙트럼이 그 산화를 게시하였다. 분광은 300 NMR 분광계를 사용하여 기록되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
결론적으로, 이 기술은 폴리페놀, OH 베어링 리그닌, 탄닌(및 합성 폴리머)49,50,51을 다루는 문의가 생물학에서 중합체, 제약 응용 분야에 이르기까지 다양한 분야에서 이루어져야 할 때 가장 필수적이고 강력한 도구 중 하나라는 모든 특성을 가지고 있습니다.
Disclosures
클라우디아 크레스티니와 디미트리스 S 아가이로풀로스는 모든 저자(C.C., N.P., D.S.A.가 이해상충이 없도록 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 수년에 걸쳐 캐나다의 펄프 및 종이 연구소, 맥길 대학 몬트리올, 캐나다자연 과학 및 공학 연구 위원회, 국립 과학 재단 미국, 미국 농업학과 및 솔베이 회사와 같은 조직을 포함하는 다양한 금융 상을 지원해 왔습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 - 1000 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0866 | |
| 20 - 200 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0865 | |
| 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% | Sigma-Aldrich | 447536 | |
| Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) | Precisa | LX220 A | |
| Binder Vacuum Oven | Binder | VD53 | |
| Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 | Sigma-Aldrich | 29651-U | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| Cholesterol, Sigma-grade | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Molecular sieves, 4A | Sigma-Aldrich | 208604 | |
| N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% | Sigma-Aldrich | 226378 | |
| NMR spectrometer, 300 MHz | Bruker | ||
| Norell natural quartz 3 mm NMR tubes | Sigma-Aldrich | NORS33007 | |
| Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) | VWR | 613-0342 | |
| Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) | VWR | 613-0239 | |
| Pyridine, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| Stirring bars,micro, 3 mm lenght | VWR | 442-0360 | |
| Stirring bars,micro, 6 mm lenght | VWR | 442-0362 | |
| Triphenylphospine oxide, 97% | Sigma-Aldrich | T84603 | |
| Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL | DWK Life Sciences | WHEAW224609 | |
| Weighing paper, grade 531 | VWR | 516-0318P |
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