Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Kvantitativ 31P NMR-analys av ligniner och tanniner

Published: August 2, 2021 doi: 10.3791/62696

Summary

31 (31) P NMR är ett kraftfullt verktyg för strukturell belysning av polyfenoler. Detta snabba, enkla, exakta, kvantitativa och mycket reproducerbara analytiska förfarande, som möjliggör kvantifiering och differentiering av de olika typerna av hydroxy-, fenol- och karboxylgrupper i ligniner och tanniner har nu blivit ett rutinmässigt analysverktyg.

Abstract

Utvecklingen av hållbara bioraffinaderiprodukter står bland annat inför utmaningen med lignin- och tanninvalorisering. Dessa rikliga, förnybara aromatiska biopolymerer har inte utnyttjats i stor utsträckning på grund av deras inneboende strukturella komplexitet och höga grad av variation och artmångfald. Bristen på en definierad primär struktur för dessa polyfenoler förvärras ytterligare med komplexa kemiska förändringar induceras under bearbetning, så småningom förmedla en stor mängd strukturella funktioner av extrem betydelse för ytterligare utnyttjande ansträngningar.

Följaktligen är ett protokoll för snabb, enkel och otvetydig identifiering och kvantifiering av de olika funktionella grupper som finns i naturliga polyfenoler en grundläggande förutsättning för förståelse och därmed skräddarsy deras reaktivitet och eventuella nytta.

Kvantitativa 31P NMR ger möjlighet att snabbt och tillförlitligt identifiera oubstituerade, o-mono substituerade och o-disubstituerade fenoler, alifatiska OH och karboxylsyra moieties i ligniner och tanniner med bred appliceringspotential.

Metoden består av ett kvantitativt lignin- eller tanninmärkningsförfarande på plats med hjälp av ett lämpligt 31P innehållande sond, följt av förvärv av ett kvantitativt 31P NMR-spektrum i närvaro av en intern standard. Det höga naturliga överflöd av 31P-kärnan möjliggör små mängder av provet (~ 30 mg) och korta NMR-förvärvstider (~ 30-120 min) med väl lösta 31P-signaler som är mycket beroende av den omgivande kemiska miljön hos de märkta OH-grupperna.

Introduction

Detta förfarande, som nyligen publicerades i Nature Protocols1, har citerats över 3 000 gånger i arkivlitteraturen och har blivit en rutinmätning för lignin- och tanninkarakterisering eftersom det ger viktig, snabb och reproducerbar strukturell information.

Lignin och tanniner
När grön kemi introducerades av Paul T. Anastas och John C. Werner2,3, förändrade det drastiskt den allmänna uppfattningen om kemi. I synnerhet betonas vikten av att använda hållbara material i stället för fossila råvaror, såsom olja och kol, som utgångspunkt som en avgörande aspekt2,3. Bland de olika typerna av biomassa är lignin den vanligaste aromatiska biopolymeren och kan ses som en potentiell källa för industriråvaror och produkter med högt mervärde4.

Lignin är den näst mest rikliga träbeståndsdelen (med cellulosa som första och hemicellulosa tredje). Dess innehåll i växter varierar beroende på växttyp: till exempel lövträ som kännetecknas av en lägre mängd lignin jämfört med barrved (20% ± 4% jämfört med 28% ± 4%). Dessutom är ligninfördelningen inom vegetabilisk vävnad inte homogen: den högre ligninhalten finns i cellväggen5,6. Lignin är ett polyfenolic material som industriellt erhålls som biprodukt från pappers-/cellulosaindustrin7. Det återvinns från trämassaprocessen, där träflis huvudsakligen bearbetas i närvaro av OH- och / eller OH- + HS- jonförhållanden för att separera cellulosa från hemicellulosa och lignin (Soda och / eller Kraft-processer)8,9.

De första försöken att studera lignin gjordes av Payen respektive Schultze 1838 respektive 186510. År 1977 sammanfattade Adler all relevant tillgänglig kunskap om den tiden11. Det är för närvarande erkänt att lignin byggstenar är tre fenylpropanoid enheter: p-coumaryl, barrträd och sinapyl alkoholer. Dessa monomerer, tack vare en fri radikal polymerisationsprocess, ger upphov till p-hydroxyfenyl-, guaiacyl- och sinapylenheter som så småningom i stort sett utgör lignin (Figur 1) 12. Bristen på en primär struktur i ligniner innebär en inneboende svårighet för dess strukturella karakterisering. Följaktligen har utvärderingen av fördelningen av molekylvikt alltid varit något kontroversiell. Fräst trä lignin, lignin isolerat under milda förhållanden som approximerar mestadels protolignin10, består av oligomer13 som mycket interagerar via supramolecular aggregeringsprocesser14,15.

Figure 1
Bild 1: En representativ modellav barrträ lignin där de olika typerna av obligationer är markerade.

Ligniner klassificeras vanligen beroende på a) den typ av trä från vilken de härrör (t.ex. lövträ och barrved), b) den process som används för att isolera det. De viktigaste industriella lignintyperna är Kraft, Lignosulfonates och Organosolv.

Strukturen av lignin är mycket beroende av dess ursprung och bearbetning kemi. Mer specifikt, när den ganska komplexa och oregelbundna strukturen hos lignin förvärras med dess naturliga mångfald och de komplexa bearbetningskemierna, framträder ett material med extrem variabilitet, mångfald och heterogenitet, vilket begränsar dess användning till lågvärdesapplikationer16. Medan barrvedsligniner huvudsakligen innehåller guaiacylenheter (G) med försumbara mängder p-hydroxyfenylgrupper (G lignin), består ligniner av guaiacyl- och syringylunderenheter (GS lignin) i olika förhållanden och gräs ligniner består av guaiacyl, syringyl och p-hydroxyfenyl(GSH lignin) underenheter. Det extraktiva tillvägagångssättet som används för isolering påverkar dramatiskt strukturen hos den framväxande lignin17. Figur 2 visar tre ligninstrukturer som skiljer sig åt beroende på den isoleringsstrategi som används. Vissa överväganden om effekten av extraktionsmetoden kan markeras. För det första är Kraft lignin en dealkylerad, mycket fragmenterad och kondenserad lignin, medan Organosolv lignin har en struktur som liknar fräst trä lignin (isolerat med Björkman tillvägagångssätt)18,19,20. Slutligen kännetecknas lignosulfonater av en hög grad av sulfonation, beroende på intensiteten och villkoren för den extraktiva sulfonationsprocessen.

Figure 2
Figur 2: Representativa strukturer för tekniska ligniner. I denna siffra kan skillnaderna mellan de olika typerna av lignin ses. ( A) Barrträ Kraft lignin är mycket kondenserat, (B) lignosulfonat kännetecknas av sulfoniska grupper på mättade kol, och (C) organosolv lignin har en struktur som liknar den av slipat trä lignin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

I likhet med ligniner är tanniner polyfenoliska föreningar som finns i växter. En nyligen genomförd och uppdaterad granskning av tanniners extraktiva metoder och applikationer släpptes nyligen av Das et al.21. Tanniners betydelse i vardagen kan lyftas fram med tanke på två exempel: de ger smak och färg till viner22; dessutom erbjuder deras polyfenolstruktur antioxidantegenskaper och gör dem idealiska för applicering i garvningsindustrin23. Tanniner är indelade i två klasser: hydrolyserbara och icke-hydrolyserbara. Hydrolyserbara tanniner kan betraktas som en polymer av galliska, di-galliska och ellagiska surstretrar (figur 3). Dessa estrar är resultatet av förestring av fenolsyrorna med sockermolekyler (t.ex. glukos, rhamnose och arabinose).

Figure 3
Bild 3: Typiska hydrolyserbara tanniner: garvsyra, vescalgin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Icke-hydrolyserbara tanniner, även kända som kondenserade tanniner, är polymerer och oligomerer som härrör från flavan-3-ols. Bland flavan-3-ols är katekiner och gallokakin de vanligaste. De är färglösa kristallina föreningar (figur 4). Polymerisationen skapar en polymer som kännetecknas av en helicoidal struktur. De aromatiska hydroxigrupperna riktas på utsidan av spiralen, medan pyransyren finns i inredningen.

Figure 4
Figur 4: Proantocyanidinstrukturer: R =H, OH, OCH3. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Karakterisering av ligniner och tanniner med NMR
Två typer av information är avgörande för lignin- eller tanninkarakterisering: a) kemisk struktur (t.ex. hydroxygruppsinnehåll, natur och frekvens av interunitlänkage) och b) molekylvikt och polydispersitet. Sedan de tidiga studierna på lignin har olika tekniker använts för att uppnå dessa mål, och två klasser av metoder har dykt upp: kemiska och fysiska metoder.

I ligninkemi har kemiska metoder, såsom alkalisk nitrobensoxidation, härledning följt av reduktiv klyvning, permanganatoxidation och tioakidolys, historiskt använts24 , 25,26,27,28,29. Men även om analysprotokollen har implementerats och optimerats är de tidskrävande, mödosamma och kräver omfattande experimentella färdigheter30. Alternativt, från början av den instrumentala analysen, fysiska metoder har använts för att utföra lignin och tannin karakteriseringar31. Dessa tekniker gör det möjligt att övervinna problemen med klassiska metoder som gör det enkelt att karakterisera ligninstrukturen.

Kärnmagnetisk resonans (NMR) gör det möjligt att få information om ligninstruktur och kemisk sammansättning bland de instrumentella teknikerna. I synnerhet kan data från kvantitativa monodimensionella 1H NMR-spektra och kvantitativa 13C NMR-spektra ge information om olika typer av lignin interunitbindningar32,33,34,35. Tyvärr lider monodimensionella spektra av signal överlappning, vilket allvarligt kan undergräva signalintegrationsinsatser. Kvantitativa versioner av HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative - Heteronuclear Single Quantum Coherence), har använts för att bättre förstå ligninstrukturen och ge användbar information om interna kopplingar. De kan dock inte utnyttjas fullt ut för att bestämma de olika byggnadernaenheterna 13,36,37 kvantitativt.

För att övervinna de problem som är förknippade med mono- och tvådimensionell NMR har substrat derivatization övervägts. Bland fördelarna med detta tillvägagångssätt är att specifika etiketter kan införas inom den komplexa makromolekylen och ingen spektral interferens beror på lösningsmedlet där de märkta substraten lösesupp 1. Verkade var pionjär inom detta område och utförde 31P NMR-analys av fosforderivat, kolderivat och relaterade föreningar38. I publikationen utfördes en screening av olika fosforhaltiga reagenser (fosfolaner) och den kemiska förskjutningen av andra märkta föreningar registrerades. Argyropoulos team införde först derivatisering för kvantitativ och kvalitativ analys av hydroxygrupper i lignin 1991. Efter att ha studerat derivatiseringen av ligninmodellföreningar med fosforinnehållande reagenser banade hans grupp väg för en av de mest dagliga teknikerna i ligninkemi, 31P NMR-analys39,40,41,42,43. Bland de olika undersökta fosfolanerna kom Argyropoulos fram till användningen av 2-klor-4,4,5,5-tetrametyl-1,3-2-dioxaphospholane (TMDP) som den lämpligaste för att utföra ligninanalys44. TMDP reagerar selektivt med hydroxigrupper som orsakar kvantitativ bildning av fosforhaltiga derivat som kännetecknas av specifika kemiska förändringar på 31P NMR(figur 5).

Figure 5
Figur 5: Lignin- och tanninfosfytilationskemi. Märkning av lignin- och tanninlabila H-grupper uppnås genom in situ-reaktion. De märkta polyfenolerna kännetecknas av specifika 31P NMR-band som motsvarar den olika typen av hydroxygrupper. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Provderivatisering utförs i en blandning av pyridin/kloroform (1.6:1). detta val är resultatet av en korrekt utvärdering. Pyridin har två fördelar. För det första förenklar och förstärker och förstärker valet av ett lösningsmedel som kännetecknas av en Hildebrand-parameter på ca22,1 MPa 1/2 ligninlöslighet45. Följaktligen är tillsatsen av pyridin som lösningsmedel, vars Hildebrand-parameter är lika med 21,7, optimal. För det andra åtföljs reaktionen av TMDP med hydroxigrupper av bildandet av saltsyra (HCl) som biprodukt med samtidiga negativa konsekvenser för den enkla bildandet av lignin-fosfolanderivat. Av denna anledning måste den resulterande HCl neutraliseras. När det förekommer i betydande överskott möjliggör pyridinens grundhet, i förhållande till TMDP, neutralisering av HCl (via bildandet av pyridinhydroklorid).

Användningen av det rekommenderade pyridin/avuterated kloroform binära lösningsmedel systemet är baserat på tre skäl. För det första gynnar det provupplösning. För det andra, eftersom pyridinhydroklorid är lösligt i kloroform, kan det förhindra nederbörd och försämring av det slutliga spektrumet. För det tredje väljs deuterated kloroform för sin unika singlet-signal, vilket möjliggör låsning av NMR-spektrometern under förvärvsprocessen. Provderivatisering utförs i närvaro av en intern standard. På så sätt, när provet och standarden derivatiseras, gör jämförelsen av integralerna av provets toppar och standarden det möjligt att kvantifiera mängden för varje typ av hydroxygrupp som finns. Olika föreningar har betraktats som interna standarder. Dessa föreningar kännetecknas av en enda hydroxy grupp per molekyl, erbjuder en enda skarp signal i 31P NMR spektrumet efter derivatization. Valet av standard måste göras noggrant. Dess signal bör inte överlappa det derivatiserade provets. Kolesterol användes ofta under de tidiga dagarna. En partiell överlappning med signaler som härrör från alifatisk hydroxy grupp begränsar dock dess användning. För rutinanalys föredras interna standardlösningar av N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (NHND). Men på grund av NHND-instabilitet kan dess standardlösningar endast lagras i några dagar46.

Protocol

Följande flödesschema (figur 6) beskriver hela experimentprotokollet för att utföra en 31P NMR-analys av ligniner och tanniner.

Figure 6
Bild 6: Förfarande för 31P NMR-analys av ligniner och tanniner.

1. Provförbehandling

  1. Torka en alikvot (ca 100 mg) av analyten (lignin- eller tanninprovet) över natten i en vakuumugn inställd på 40 °C.
    OBS: Särskild uppmärksamhet behövs på temperaturvalet eftersom temperaturer över 40 °C kemiskt kan förändra den känsliga strukturen hos de undersökta polyfenolerna.
  2. Efter torkning, överför snabbt provet till en vattenfri kalciumsulfatdackator tills den når rumstemperatur. Detta steg är obligatoriskt för att undvika att provet absorberar fuktighet från miljön.

2. Lösningsberedning av lösningsmedel

  1. Bered en blandning av pyridin/avuterated kloroform lösningsmedel i en provflaska på 20 ml genom att blanda vattenfritt pyridin och avutererat kloroform i ett förhållande på 1,6/1 (v/v).
    VARNING: Var uppmärksam när du manipulerar pyridin och avuterated kloroform. Dessa föreningar är brandfarliga, skadliga och giftiga. Förbered och använd lösningen i en välventilerad rökhuv med lämpliga handskar.
  2. Tillsätt 5-8 g vältvättade och torkade aktiverade 5A molekylärsikten i 3,2 mm pellets för att avlägsna vattenspår. Dessutom rekommenderas användningen av ett septumlock starkt för att förhindra luftkontakt och fuktförorening av lösningsmedelssystemet. Förvara den beredda lösningen i mörkret.

3. Förberedelse av intern standardlösning (IS)

  1. I en 2 ml Erlenmeyerkolv bereder du en 0,1 M-lösning av krom (III) acetylacetonat (ca 10 mg) och intern standard (cirka 35, 8 mg NHND eller 77, 3 mg kolesterol) i lösningslösningen som tidigare framställts.
    VARNING: Krom (III) acetylacetonat är skadligt; under dess manipulering, använd lämpliga handskar.
  2. Registrera den exakta vikten av is som läggs till i IS-lösningen.
  3. Överför IS-lösningen i en flaska utrustad med ett förseglat lock som innehåller aktiverade molekylärsikten (se punkt 2.2) och förvara den i mörker vid 40 °C.

4. NMR provlösningsberedning

  1. Väg noggrant ~30 mg prov i en 2 ml injektionsflaska utrustad med en omrörningsstång. Försegla injektionsflaskan med ett septumlock.
  2. Tillsätt 0,5 ml lösningsmedelssystemlösning till provflaskan.
  3. Överför 100 μL IS-lösningen i provflaskan via en mikropipett. Rör magnetiskt om den resulterande dispersionen (500 rpm) tills allt lignin eller tannin löses upp, vilket resulterar i en klar lösning.
    OBS: Eftersom fullständig provlöslighet är absolut nödvändigt kan detta steg ta upp till 12 h.
  4. Överför 0,1 ml TMDP till provlösningen. Placera provet under kraftig magnetisk omrörning. Håll provlösningen förseglad. Använd TMDP i en välventilerad rökhuva medan du bär lämpliga handskar.
    VARNING: TMDP och dess ångor är frätande, skadliga och interagerar snabbt med vatten.
    OBS: Bildandet av ett gult fällning beror på vattenspår i provet eller pyridin/kloroformlösningen. I sådana fall måste förfarandet upprepas genom att säkerställa att all eventuell fuktförorening undviks.
  5. Överför provlösningen till ett NMR-rör med en Pasteur-pipett.

5. NMR-analys

  1. Ladda röret i NMR-instrumentet. Spektrometern som används för att utföra denna analys behöver en bredbandssond.
  2. Korrigera de experimentella parametrarna enligt inställningen i tabell 11.
PULSE-PROGRAMMET Omvänd gated frikopplingspuls (zgig)
NUKLEÖS 31P
SPEKTRALBREDD 22.00.m.
FÖRVÄRVSTID - 0,8 s
FÖRDRÖJNING AV AVKOPPLING ≥ 10 s
SKANNAR NUMMER 64 eller fler
SPEKTRUM CENTRUM 140.00.m.

Tabell 1: Experimentella parametrar för att registrera 31P NMR-spektra av derivatiserade ligniner eller tanniner.

  1. Ställ in spektrometerfrekvensen med resonansfrekvensen för avuterated kloroform, shim provet och finjustera spektrometern. Starta sedan förvärvet.

6. Spektrumbehandling och analys

  1. Bearbeta 31P NMR-rådata med en lämplig standardprogramvara enligt följande steg.
    1. Utför Fourier-förvandlingen.
    2. Justera fas för manuell faskorrigering (Bearbetning | Faskorrigering | Manuell korrigering).
    3. Korrigera baslinjen manuellt och ange försiktigt noll punkter(| Baslinje | Korrigering av baslinje för flera punkter).
  2. Signalkalibrering.
    1. Ställ in signalen för det fosfitetslaterade vattnet till det kemiska skiftvärdet 132,2 ppm (Analys | Referens | Referens).
      OBS: Närvaron av en skarp 31P-signal vid 175 ppm beror på överskottet av TMDP. Dess närvaro säkerställer fullständig derivatisering av provet. Om denna topp saknas måste man se över hela proceduren genom att tillhandahålla ett grundligt prov och lösningsmedelstorkning och lägga till mer TMDP. När detta är garanterat zoomas spektrumet i spektralområdet 132 till cirka 150 ppm (Bild 7).

Figure 7
Figur 7: Kontrollera förekomsten av ett överskott av TMDP: om det kan ses är derivatiseringen av provet klar. Spektrat kan sedan analyseras. För att göra den zoomen i spektralområdet mellan 155 och 132 ppm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

  1. Integration
    1. Normalisera integrationen genom att ställa in den interna standarden på 1,0 (klicka på | Redigera integral | Normaliserad: 1,00). Utför spektrumintegration enligt de kemiska förändringar som rapporteras i följande tabeller. Använd tabell 2 för ligniner och tabell 3 för tanniner.
FUNKTIONELL GRUPP KEMISKT SKIFTE (ppm)
Alifatisk OH 149.0-146.0
Fenolisk OH 144.0-137.4
C5 ersatt fenol OH 143.0-140.2
5-5' fenolisk OH 141.7-140.2
Syringyl OH 143.2-142.7
4-O-5' OH 142.8-141.7
Guaiacyl OH 140.2-138.8
p-hydroxifenyl OH 138.8-137.4
COOH (cooh) 136.0-133.6
Tricin (tricin) 137.0-136.0

Tabell 2: 31P NMR kemiska förskjutningar för ligninfosfenerade OH-grupper.

FUNKTIONELL GRUPP KEMISKT SKIFTE (ppm)
Ring A
o-unsubstituted fenol 137.9–137.4
o-ersatt FENOLISK 138.8–137.9
Ring B
Katekol OH 140.2–138.8
Pyrogallol OH 144.0–140.2
Ring C
AliphatiC OH 146.0–145.0

Tabell 3: 31P NMR kemisk förskjutning för tanninfosfitetsgrupper.

OBS: Med hjälp av standardspektrala bearbetningsprogram är det möjligt att ställa in fördefinierade regioner i kemikalieskiftet som ska integreras. Denna möjlighet är fördelaktig när flera spektra måste bearbetas.

7. Funktionell grupp kvantifiering

  1. Beräkna koncentrationen av IS-lösningen.
    Equation 1
  2. Beräkna motsvarande mängd av den specifika signalen:
    Equation 2
    Equation 3

Representative Results

Det beskrivna protokollet kan tillämpas både för analys av ligniner och tanniner. I ligninkemi är denna metod grundläggande eftersom den möjliggör detektion och kvantifiering av de olika typerna av hydroxygrupper. Figur 8A-D visar exempel på 31P NMR-spektra av ligniner och tanniner som förvärvats med spektrometrar som arbetar vid olika frekvenser. Det spektrum som visas i figur 8A registrerades med hjälp av en NMR-spektrometer på 300 MHz, medan figur 8D registrerades med ett NMR-instrument på 700 MHz.

Figure 8
Figur 8: Kvantitativt 31P NMR-spektrum av (A) barrvedskraft lignin (spektrum registrerat med en 300 MHz spektrometer på 30,8 mg lignin), (B) barrvedslignosulfonsyra (spektrum registrerat med en 300 MHz spektrometer på 30,1 mg lignin efter bevarande av lignosulfonat till lignosulfonsyra), (C) Acacia tannin (spektrum registrerat med en 300 MHz spektrometer på ett prov på 30,3 mg) och (D) barrved kraft lignin (spektrum registrerat med en 700 MHz spektrometer på 7,2 mg lignin). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Dessa spektra registrerades noggrant och bearbetades manuellt. De typiska signalerna för alifatiska (150-145 ppm), aromatiska (145-137 ppm) och karboxyl (136-134 ppm) hydroxy grupper är mycket väl lösta och som sådan lätt integrerade. Om spektralfönstret öppnas (från 95 till 190 ppm, figur 8), är tre skarpa, starka toppar (175, 144 och 132 ppm) uppenbara. Dessa beror på överskottet av TMDP, den interna standarden (kolesterol eller NHND) och hydroxylerad TMDP (orsakad av vattenspår), respektive.

Till skillnad från kraft och organosolv lignin är lignosulfonat olösliga i blandningen pyridin/kloroform. För att få ett tillförlitligt 31P NMR-spektrum är löslighet obligatorisk. För att övervinna denna fråga kan lignosulfonater omvandlas till motsvarande lignosulfonsyror före derivatisering. Behandling av lignosulfonatlösningar med starka syror (dvs. svavelsyra) eller sura utbytessnins (t.ex. Dowex 1H, en stark syrajonväxlare) driver omvandlingen av alla sulfonatgrupper i sura former. De resulterande produkterna kan avlägsnas från den sura lösningen med selektiva adsorpiva hartser (XAD-7, en polar adsorbent som används för att isolera föreningar som kännetecknas av molekylvikter upp till 60 000 u.m.a) analyserade med hjälp av detta protokoll. Figur 8B visar det kvantitativa 31P NMR-spektrumet av en TMDP-derivatiserad lignosulfonsyra. Även i det här fallet är de olika signalerna från hydroxygrupperna uppenbara. Figur 8C visar ett typiskt kvantitativt 31P NMR-spektrum av ett tanninprov som derivatiserats med TMDP. En karakteristisk signal från de olika alifatiska OH (Ring C), pyrogallol och katekolenheter i ring B och enheter i ring A är väl synliga.

Discussion

Den beskrivna metoden representerar implementering och optimering av analysprotokollet som syftar till kvalitativ och kvantitativ karakterisering av ligniner som utvecklats av Argyropoulos37,38,39,40,41,42. Jämfört med många andra tekniker som finns tillgängliga för lignin strukturell klargörande, metoden har allmänt accepterats som bland de mest underlättande, snabba och reproducerbara. Giltigheten av de våtkemiska metoderna (t.ex. nitrobensen, permanganatoxidationer osv.) bygger på verksamhetsutövarens goda experimentella färdigheter och begränsar effektivt metoden till begränsade aktörer. Dessutom är det inte ovanligt att stöta på korrigeringsfaktorer i litteraturen för våtkemiska metoder för att ta hänsyn till flera nackdelar. Det beskrivna 31P NMR-protokollet kräver inte avancerade experimentella färdigheter, vilket gör detta lätt tillämpligt, användarvänligt och allmänt tillgängligt. Jämfört med andra instrumentella analysmetoder är 31P NMR den enda tekniken som exakt kan upptäcka och kvantifiera de olika hydroxygrupperna i ligniner. Ftir kan till exempel användas för att identifiera olika hydroxygrupper som 1H NMR. Båda teknikerna lider dock eftersom de inte kan erbjuda tillförlitliga kvantitativa data på grund av omfattande problem med överlappning av signaler. En annan allmänt använd teknik är UV-Vis spektroskopi, först rapporterad av Goldschmid. Tillvägagångssättet är dock begränsat till en allmän övergripande bestämning av hydroxygrupper eftersom det inte effektivt kan skilja mellan alifatiska, aromatiska och karboxiska OHs47.

Ur ekonomisk synvinkel är den enda begränsningen av 31P NMR-tekniken priset på TMDP, som är ett relativt dyrt reagens. Det kostar cirka 190 USD per gram; Om analyskostnaderna endast skulle approximeras till priset på TMDP, med undantag för de som härrör från blandningen pyridin/kloroform och operatörens, skulle det följaktligen uppgå till cirka 24 US-dollar per analys. För att lösa detta problem tillgriper många laboratorier att syntetisera TMDP, vilket minskar reagenskostnaderna. För att göra detta reageras pinacol och fosfortriklorid i närvaro av trietylamin44. Tekniskt sett är denna reaktion relativt enkel; Det krävs dock försiktighet vid användning av fosfortriklorid och dess upp- och uppfyllelse, inklusive välkontrollerad vakuumdestillation. Mer information om syntesen av TMDP kan tillhandahållas på begäran.

Även om detta protokoll är bland de bästa när det gäller enkelhet, reproducerbarhet och precision, måste vissa kritiska punkter lyftas fram. För det första måste provet vara helt lösligt i den identifierade blandningen pyridin/kloroform. Detta övervägande är grundläggande eftersom hydroxylgruppernas kvantitativa fosfinyleringsreaktion måste ske under helt homogena förhållanden. Om endast en del av provet lösiseras skulle den resulterande analysen vara felaktig. För det andra måste det prov som ska undersökas vara fukt- och lösningsmedelsfritt, eftersom dessa variabler kommer att påverka analysens precision och övergripande framgång negativt. Spår av fuktighet kommer att reagera med TMDP som ger 2-hydroxy-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane. Denna förening är ett blekgult flocculating salt, olösligt i pyridin/kloroform lösningsmedel blandning, orsakar otillräcklig NMR signal förvärv. Eftersom endast en liten vikt (~ 30 mg) av ett prov krävs, måste det vara fritt från flyktiga ämnen för att dess exakta vikt ska vara exakt känd före analysen.

Ibland kan problem med provhyllor främjas (särskilt för mycket oxiderade prover) genom att tillsätta små mängder medlösningsmedel (dvs. dimetylformamid), vilket hjälper provupplösning. I princip kan varje lösningsmedel som inte interagerar med TMDP användas för att hjälpa provupplösning. Valet av ett lösningsmedel kan inte omfatta lösningsmedel som innehåller labilhydroxi eller aminogrupper eftersom de reagerar med reagenset, vilket orsakar vilseledande slutligt spektra. Särskilt dimetylsulfoxid reagerar också med TMDP som utesluter dess användning som medlösningsmedel. Pyridinbaserade jonvätskor, såsom 1-allyl-3-butylpyridiniumklorid, kan användas när löslighetsproblem uppstår; Jonvätskan bör dock återigen vara torr48. Att lösa upp lignosulfonater (en lignintyp som kännetecknas av en hög sulfonationsgrad), visade sig en förbehandling som innebär omvandling av neutraliserade grupper till deras sura form vara till hjälp. Lignosulfonater kan bekvämt omvandlas till sina sura förhållanden med sura utbytessnins i vattenhaltiga medier. De resulterande lignosulfonsyrorna isoleras från lösningen genom adsorption på specifika hartser (t.ex. XAD-7) och desorption i etanol. Avdunstning av etanollösningar över reducerat tryck vid 40 °C möjliggör isolering av lignosulfonsyror. Dessa ligniner kan sedan karakteriseras av 31P NMR eftersom de är lösliga i pyridin/kloroformblandningen som föreslås i protokollet.

Långvarig vakuumtorkning vid milda temperaturer minskar effektivt mängden fukt och andra flyktiga ämnen i varje prov. Särskilt små mängder vatten påverkar inte det slutliga spektrumet eftersom TMDP tillsätts i överskott. Dessutom kan i vissa fall en liten mängd 2-hydroxi-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane bero på den fuktighet som finns i NMR-röret eller provflaskan. I dessa fall är omrörning tillräcklig för att lösa upp mängden av den bildade fällningen helt. Om en hög mängd 2-hydroxi-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane bildas, föreslås att provberedningen upprepas, vilket förbättrar torkbehandlingen. Till exempel, före användning, kan alla glas kort värmas med en värmepistol.

Det spektralområde som används för att registrera spektrumet är brett jämfört med den region som är av intresse för signalen om de olika hydroxylgrupperna. Detta är dock obligatoriskt för att förstå om provderivatiseringen inträffade framgångsrikt. Bekräftelsen av fullständig provderivatisering ges genom närvaron av en stark signal runt 174 ppm. Denna skarpa topp beror på den oreagerade TMDP, och dess existens säkerställer att reagenset var närvarande i överskott, och därför har alla hydroxylgrupper derivatiserats. Om denna topp saknas är de två mest sannolika orsakerna: (1) mängden TMDP som används är otillräcklig för att utföra en fullständig derivatisering av provet, eller (2) en hög mängd vatten finns i provet. I det första fallet skulle användning av en högre mängd TMDP sannolikt säkerställa provet fullständig derivatisering, och signalen vid 174 ppm kommer att visas. I det andra fallet bör provet torkas mer omfattande. När ett överskott av TMDP har säkerställts kan toppintegration utföras. Innan den här åtgärden zoomar du till ett smalare fönster (150 till 132 ppm) som begränsar signalerna av intresse.

Mängden prov (~ 30 mg) som ska analyseras, rapporterad i ovanstående experimentella protokoll, har valts för att samla in spektra av god kvalitet för en 300 MHz NMR-spektrometer eller mer. Vi har dock observerat att det är möjligt att minska provmängden om en 500 MHz eller högre fältmagnet används. I figur 8Dvisas till exempel NMR-spektrumet (som härrör från ett instrument på 700 MHz) i ett prov som bereds med 7,2 mg lignin. Signalintegration av detta spektrum erbjuder samma resultat som de som erhålls vid användning av högre mängder lignin. Detta faktum förstärker tillämpligheten av detta protokoll för all forskning där små mängder produkter finns tillgängliga.

Sammantaget kan detta experimentella protokoll tillämpas på många forsknings- och utvecklingsapplikationer när man förstår ursprunget och ödet för de olika hydroxygrupper som finns i ligniner och tanniner krävs. I synnerhet, i kombination med GPC- och HSQC-data, erbjuder de resulterande uppgifterna möjlighet att ytterligare utveckla och spekulera om strukturen hos lignin eller ett tannin. I många fall där kemiska modifieringar tillämpas på hydroxygrupperna lignin eller tannin kan kvantitativa 31P NMR-analyser vara ytterst värdefulla för att upptäcka om dessa modifieringar inträffade och i vilken utsträckning. Figur 9 visar till exempel två NMR-spektra av samma lignin före och efter dess oxidation. En enkel kvalitativ utvärdering visar minskningen av både alifatiska och aromatiska hydroxy grupper vid oxidation, vilket ger värdefull information och vägledning.

Figure 9
Figur 9: Kvantitativa 31P NMR-spektra av samma Organosolv lignin som härledts med TMDP (A) Prior och (B) efter dess oxidation. Spektra registrerades med hjälp av en 300 NMR spektrometer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Sammanfattningsvis har denna teknik alla egenskaper av att vara bland de viktigaste och kraftfulla verktygen när förfrågningar som handlar om polyfenolic, OH-lager ligniner och tanniner (och till och med syntetiska polymerer)49,50,51 måste göras inom en mängd olika områden, allt från kemi till teknik, från biologi till polymer och farmaceutiska applikationer.

Disclosures

Claudia Crestini och Dimitris S Argyropoulos ser till att alla författare (C.C., N.P., och D.S.A.) inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete under åren har stötts av olika finansiella utmärkelser som inkluderade organisationer som Pulp and Paper Research Institute of Canada, McGill University Montreal, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, National Science Foundation USA, United States Department of Agriculture och Solvay Company.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 - 1000 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0866
20 - 200 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0865
2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% Sigma-Aldrich 447536
Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) Precisa LX220 A
Binder Vacuum Oven Binder VD53
Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 Sigma-Aldrich 29651-U
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151823
Cholesterol, Sigma-grade Sigma-Aldrich C8667
Molecular sieves, 4A Sigma-Aldrich 208604
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% Sigma-Aldrich 226378
NMR spectrometer, 300 MHz Bruker
Norell natural quartz 3 mm NMR tubes Sigma-Aldrich NORS33007
Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) VWR 613-0342
Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) VWR 613-0239
Pyridine, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich 270970
Stirring bars,micro, 3 mm lenght VWR 442-0360
Stirring bars,micro, 6 mm lenght VWR 442-0362
Triphenylphospine oxide, 97% Sigma-Aldrich T84603
Vials for environmental analysis, WHEATON,  20.00 mL DWK Life Sciences WHEAW224609
Weighing paper, grade 531 VWR 516-0318P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, X., et al. Determination of hydroxyl groups in biorefinery resources via quantitative 31 P NMR spectroscopy. Nature Protocols. 14 (9), 2627-2647 (2019).
  2. Anastas, P. T., Williamson, T. C. Green chemistry: An overview. Green Chemistry. 626, 1-17 (1996).
  3. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: Principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
  4. Collins, M. N., et al. Valorization of lignin in polymer and composite systems for advanced engineering applications - A review. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 828-849 (2019).
  5. De Gruyter. Biorefinery: From Biomass to Chemicals and Fuels. , (2012).
  6. Sannigrahi, P., Pu, Y., Ragauskas, A. Cellulosic biorefineries-unleashing lignin opportunities. Current Opinion in Environmental Sustainability. 2 (5), 383-393 (2010).
  7. Lange, H., Decina, S., Crestini, C. Oxidative upgrade of lignin - Recent routes reviewed. European Polymer Journal. 49 (6), 1151-1173 (2013).
  8. Glasser, W. G. Classification of lignin according to chemical and molecular structure. Lignin: Historical, Biological, and Materials Perspectives. 742, 216-238 (1999).
  9. Wiley. Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology, 2 Volume Set, 5th Edition. , Wiley. (2004).
  10. Lewis, N. G., Sarkanen, S. Preface. Lignin and Lignan Biosynthesis. 697, 9-11 (1998).
  11. Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11 (3), 169-218 (1977).
  12. Ragauskas, A. J., et al. Lignin valorization: Improving lignin processing in the biorefinery. Science. 344 (6185), (2014).
  13. Crestini, C., Melone, F., Sette, M., Saladino, R. Milled wood lignin: A linear oligomer. Biomacromolecules. 12 (11), 3928-3935 (2011).
  14. Guerra, A., et al. On the propensity of lignin to associate: A size exclusion chromatography study with lignin derivatives isolated from different plant species. Phytochemistry. 68 (20), 2570-2583 (2007).
  15. Contreras, S., Gaspar, A. R., Guerra, A., Lucia, L. A., Argyropoulos, D. S. Propensity of lignin to associate: Light scattering photometry study with native lignins. Biomacromolecules. 9 (12), 3362-3369 (2008).
  16. Gigli, M., Crestini, C. Fractionation of industrial lignins: opportunities and challenges. Green Chemistry. 22 (15), 4722-4746 (2020).
  17. Adler, E. Structural elements of lignin. Industrial & Engineering Chemistry. 49 (9), 1377-1383 (1957).
  18. Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 1. Extraction of lignin with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 477-485 (1956).
  19. Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 2. Extraction of lignin-carbohydrate compelexes with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 243-251 (1957).
  20. Bjorkman, A. Studied on finely divided wood. Part 5. The effect of milling. Svensk Pappersit. , 329-335 (1957).
  21. Das, A. K., Islam, N., Ashaduzzaman, F. O., Dungani, R. Review on tannins: Extraction processes, applications and possibilities. South African Journal of Botany. 135, 58-70 (2020).
  22. Laitila, J. E. Composition and evolution of oligomeric proanthocyanidin-malvidin glycoside adducts in commercial red wines. Food Chemistry. 340, 127905 (2021).
  23. Covington, A. D., Wise, W. R. Tanning Chemistry. , RSC Publishing. (2019).
  24. Tarabanko, V. E., Tarabanko, N. Catalytic oxidation of lignins into the aromatic aldehydes: General process trends and development prospects. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2421 (2017).
  25. Guerra, A., Mendonça, R., Ferraz, A., Lu, F., Ralph, J. Structural characterization of lignin during pinus taeda wood treatment with ceriporiopsis subvermispora. Applied and Environmental Microbiology. 70 (7), 4073-4078 (2004).
  26. Faix, O., Andersons, B., Zakis, G. Determination of carbonyl groups of six round robin lignins by modified oximation and FTIR spectroscopy. Holzforschung. 52 (3), 268-274 (1998).
  27. Santos, R. B., Capanema, E. A., Balakshin, M. Y., Chang, H., Jameel, H. Lignin structural variation in hardwood species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (19), 4923-4930 (2012).
  28. Bose, S. K., Wilson, K. L., Hausch, D. L., Francis, R. C. Lignin analysis by permanganate oxidation. II. Lignins in Acidic Organosolv Pulps. Holzforschung. 53 (6), 603-610 (1999).
  29. Harman-Ware, A. E., et al. A thioacidolysis method tailored for higher-throughput quantitative analysis of lignin monomers. Biotechnology Journal. 11 (10), 1268-1273 (2016).
  30. Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
  31. Lin, S. Y., Carlton, W. D. Methods in Lignin Chemistry. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1992).
  32. Lundquist, K. Proton (1H) NMR Spectroscopy. Methods in Lignin Chemistry. , 242-249 (1992).
  33. Robert, D. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry. Methods in Lignin Chemistry. , 250-273 (1992).
  34. Li, S., Lundquist, K. A new method for the analysis of phenolic groups in lignins by 1H NMR spectrometry. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 9 (3), 191-195 (1994).
  35. Hallac, B. B., Pu, Y., Ragauskas, A. J. Chemical transformations of buddleja davidii lignin during ethanol organosolv pretreatment. Energy & Fuels. 24 (4), 2723-2732 (2010).
  36. Sette, M., Wechselberger, R., Crestini, C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR. Chemistry - A European Journal. 17 (34), 9529-9535 (2011).
  37. Sette, M., Lange, H., Crestini, C. Quantitative HSQC analyses of lignin: A practcal comparison. Computational and Structural Biotechnology Journal. 6 (7), 201303016 (2013).
  38. Wroblewski, A. E., Lensink, C., Markuszewski, R., Verkade, J. G. Phosphorus-31 NMR spectroscopic analysis of coal pyrolysis condensates and extracts for heteroatom functionalities possessing labile hydrogen. Energy & Fuels. 2 (6), 765-774 (1988).
  39. Archipov, Y., Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part I. Model compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology. 11 (2), 137-157 (1991).
  40. Argyropoulos, D. S., Heitner, C., Morin, F. G. P. NMR spectroscopy in wood chemistry - Part III. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores in mechanical pulp. Holzforschung - International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of. 46 (3), 211-218 (2009).
  41. Argyropoulos, D. S., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part VI. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores and carboxylic acids present in mechanical pulps; a method for the quantitative determination of ortho-quinones. Holzforschung. 48 (1), 112-116 (1994).
  42. Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry part V. Qualitative analysis of lignin functional groups. Journal of Wood Chemistry and Technology. 13 (2), 187-212 (1993).
  43. Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part IV. Lignin models: Spin lattice relaxation times and solvent effects in 31P NMR. Holzforschung. 47 (1), 50-56 (1993).
  44. Granata, A., Argyropoulos, D. S. 2-Chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, a reagent for the accurate determination of the uncondensed and condensed phenolic moieties in lignins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 43 (6), 1538-1544 (1995).
  45. Duval, A., Vilaplana, F., Crestini, C., Lawoko, M. Solvent screening for the fractionation of industrial kraft lignin. Holzforschung. 70 (1), 11-20 (2016).
  46. Ben, H., Farrell, J. R. In-depth investigation on quantitative characterization of pyrolysis oil by 31P NMR. RSC Advances. 6 (21), 17567-17573 (2016).
  47. Goldschmid, O. Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet spectrophotometry. Analytical Chemistry. 26 (9), 1421-1423 (1954).
  48. Ben, H., et al. Characterization of whole biomasses in pyridine based ionic liquid at low temperature by 31P NMR: An approach to quantitatively measure hydroxyl groups in biomass as their original structures. Frontiers in Energy Research. 6, (2018).
  49. Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis of potentially biobased copolyesters based on adipic acid and butanediols: Kinetic study between 1,4- and 2,3-butanediol and their influence on crystallization and thermal properties. Polymer. 99, 204-213 (2016).
  50. Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis and characterization of biobased poly(butylene succinate-ran-butylene adipate). Analysis of the composition-dependent physicochemical properties. European Polymer Journal. 87, 84-98 (2017).
  51. Chan, K. P., Argyropoulos, D. S., White, D. M., Yeager, G. W., Hay, A. S. Facile quantitative analysis of hydroxyl end groups of Poly(2,6-dimethyl-1,4-phenylene oxide)s by 31P NMR spectroscopy. Macromolecules. 27 (22), 6371-6375 (1994).

Tags

Kemi nummer 174
Kvantitativ <sup>31</sup>P NMR-analys av ligniner och tanniner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Argyropoulos, D. S., Pajer, N.,More

Argyropoulos, D. S., Pajer, N., Crestini, C. Quantitative 31P NMR Analysis of Lignins and Tannins. J. Vis. Exp. (174), e62696, doi:10.3791/62696 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter