Summary

Tredimensjonal kollagen matrise stillas implantasjon som en lever regenerering strategi

Published: June 29, 2021
doi:

Summary

Leversykdommer er indusert av mange årsaker som fremmer fibrose eller skrumplever. Transplantasjon er det eneste alternativet for å gjenopprette helse. Men gitt knappheten på transplanterbare organer, må alternativer utforskes. Vår forskning foreslår implantasjon av kollagen stillaser i levervev fra en dyremodell.

Abstract

Leversykdommer er den ledende dødsårsaken over hele verden. Overdreven alkoholforbruk, et fettrikt kosthold og hepatitt C-virusinfeksjon fremmer fibrose, skrumplever og/eller hepatocellulært karsinom. Levertransplantasjon er den klinisk anbefalte prosedyren for å forbedre og forlenge levetiden til pasienter i avanserte sykdomsstadier. Imidlertid er bare 10% av transplantasjonene vellykkede, med organtilgjengelighet, presurgiske og postsurgiske prosedyrer, og forhøyede kostnader direkte korrelert med det resultatet. Ekstracellulære matriser (ECM) stillaser har dukket opp som et alternativ for vevsrestaurering. Biokompatibilitet og graft aksept er de viktigste fordelaktige egenskapene til disse biomaterialer. Selv om kapasiteten til å gjenopprette størrelsen og riktig funksjon av leveren har blitt evaluert i leveren hepatectomy modeller, bruk av stillaser eller en slags støtte for å erstatte volumet av ekstirpated levermasse er ikke vurdert.

Delvis hepatektomi ble utført i en rottelever med xenoimplantasjon av et kollagenmatrise stillas (CMS) fra en bovin kondyle. Venstre leverlobervev ble fjernet (ca. 40%), og en lik andel cms ble kirurgisk implantert. Leverfunksjonstester ble evaluert før og etter den kirurgiske prosedyren. Etter dag 3, 14 og 21 ble dyrene euthanized, og makroskopiske og histologiske evalueringer ble utført. På dag 3 og 14 ble fettvev observert rundt CMS, uten klinisk bevis på avvisning eller infeksjon, som det var kar neoformasjon og CMS-reabsorpsjon på dag 21. Det var histologiske bevis på en ubetydelig betennelsesprosess og migrasjon av tilstøtende celler til CMS, observert med hematoksylin og eosin (H&E) og Massons trichrome farging. CMS ble vist å fungere godt i levervev og kan være et nyttig alternativ for å studere vevregenerering og reparasjon i kroniske leversykdommer.

Introduction

Leveren er et av de viktigste organene som er involvert i å opprettholde homeostase og proteinproduksjon1. Dessverre er leversykdom den ledende dødsårsaken over hele verden. I avanserte stadier av leverskade, som inkluderer skrumplever og hepatocellulært karsinom, er levertransplantasjon den klinisk anbefalte prosedyren. På grunn av mangel på donorer og den lave frekvensen av vellykkede transplantasjoner, er det imidlertid utviklet nye teknikker innen vevsteknikk (TE) og regenerativ medisin (RM)2,3.

TE innebærer bruk av stamceller, stillaser og vekstfaktorer4 for å fremme gjenoppretting av betente, fibrotiske og edematøse organer og vev1,5,6. Biomaterialene som brukes i stillaser etterligner den innfødte ECM, og gir de fysiske, kjemiske og biologiske signalene for guidet cellulær ombygging7. Kollagen er et av de mest tallrike proteinene hentet fra dermis, sene, tarm og perikardium8,9. Videre kan kollagen oppnås som biopolymer for å produsere to- og tredimensjonale stillaser gjennom bioprinting eller elektrospinning10,11. Denne gruppen er den første som rapporterer bruk av kollagen fra en benkilde for regenerering av levervev. En annen studie rapporterer bruk av stillaser syntetisert fra bovint kollagen, som ble hentet fra huden, med homogene og nærtliggende porer, uten kommunikasjon mellom dem12.

Decellularisering bevarer den opprinnelige ECM, slik at etterfølgende inkorporering av celler med stamcellepotensial13,14. Denne prosedyren er imidlertid fortsatt i eksperimentell fase i leveren, hjertet, nyren, tynntarmen og urinblæren fra mus, rotter, kaniner, griser, sauer, storfe og hester3,14. For tiden er det resekterte levermassevolumet ikke erstattet i noen av dyrets hepatektomimodeller. Imidlertid kan bruk av ytterligere støtte eller nettverk (biomaterialer) som muliggjør celleproliferasjon og angiogenese være avgjørende for rask restaurering av leverparenchymale funksjoner. Dermed kan stillaser brukes som alternative tilnærminger for å regenerere eller reparere vev i kroniske leversykdommer, i sin tur eliminere begrensninger på grunn av donasjon og kliniske komplikasjoner ved levertransplantasjon.

Protocol

Den nåværende forskningen ble godkjent av etikkkomiteen ved School of Medicine (DI/115/2015) ved Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og etikkkomiteen for Hospital General de Mexico (CI/314/15). Institusjonen oppfyller alle tekniske spesifikasjoner for produksjon, pleie og bruk av forsøksdyr og er juridisk sertifisert av nasjonal lovgivning (NOM-062-ZOO-1999). Mannlige Wistar-rotter som veide 150-250 g (6-8 uker gamle) ble hentet fra Laboratory Animal Facility ved School of Medicine, UNAM, for denne studie…

Representative Results

Bendemineralisering påvirker cms mekaniske egenskaper uten å endre den opprinnelige formen eller sammenkoblingen av porene. CMS kan ha hvilken som helst form, og kan derfor justeres til størrelsen og formen på det valgte organet eller vevet19. I den nåværende protokollen brukte vi et trekantet CMS (Figur 1A-D). En rottemodell ble brukt til å evaluere den regenerative kapasiteten til CMS xenoimplant i leveren. …

Discussion

Organtransplantasjon er bærebjelken i behandlingen hos pasienter med leverfibrose eller skrumplever. Noen få pasienter drar nytte av denne prosedyren, noe som gjør det nødvendig å gi terapeutiske alternativer for pasienter på ventelisten. Vevsteknikk er en lovende strategi som bruker stillaser og celler med regenerativt potensial2,4,13. Fjerning av en del av leveren er et kritisk skritt i denne prosedyren på grunn av den …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke personellet til Laboratory Animal Facility of the Experimental Medicine Unit, Nurse Carolina Baños G. for teknisk og kirurgisk støtte, Marco E. Gudiño Z. for støtte i mikrofotografer, og Erick Apo for støtte i lever histologi. Nasjonalrådet støttet denne forskningen for vitenskap og teknologi (CONACyT), tilskuddsnummer SALUD-2016-272579 og PAPIIT-UNAM TA200515.

Materials

Anionic detergent Alconox Z273228
Biopsy cassettes Leica 3802453
Camera DMX Nikon DXM1200F
Centrifuge Eppendorf 5424
Chlorhexidine gluconate 4% BD 372412
Cover glasses 25 mm x 40 mm Corning 2980-224
Eosin Sigma-Aldrich 200-M CAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pure Sigma-Aldrich 459836 CAS 64-17-5
Flunixine meglumide MSD Q-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mm Corning 101081022
Hematoxylin Merck H9627 CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37% Merck 339253 CAS 7647-01-0
Ketamine Pisa agropecuaria Q-7833-028
Light microscopy Nikon Microphoto-FXA
Microtainer yellow cape Beckton Dickinson 365967
Microtome Leica RM2125
Model animal: Wistar rats Universidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon) Covidien 1750-41
Polypropylene 7-0 Atramat SE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solution Diafra SA de CV 1.37E+86
Scaning electronic microscopy Zeiss DSM-950
Sodium hydroxide, pellets J. T. Baker 3722-01 CAS 1310-73-2
Software ACT-1 Nikon Ver 2.70
Stereoscopy macroscopy Leica EZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100S Johnson and Johnson 99970
Surgipath paraplast Leica 39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) SensiMedical LAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette) Leica TP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) Sakura Finetek USA 5229
Trichrome stain kit Sigma-Aldrich HT15
Unicell DxC600 Analyzer Beckman Coulter BC 200-10
Xylazine Pisa agropecuaria Q-7833-099
Xylene Sigma-Aldrich 534056 CAS 1330-20-7

References

  1. Li, N., Hua, J. Immune cells in liver regeneration. Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).
  2. Langer, R., Vacanti, J. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  3. Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
  4. Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
  5. Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
  6. Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
  7. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  8. Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
  9. Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
  10. El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
  11. Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
  12. Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
  13. Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
  14. Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
  15. Gacek, G. Stereo microscope, neglected tool. Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).
  16. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
  17. The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. . Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , (2021).
  18. Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
  19. León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
  20. León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
  21. Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as “conducting cells” for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
  22. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
  23. Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , (2011).
  24. Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).

Play Video

Cite This Article
León-Mancilla, B., Martínez-Castillo, M., Medina-Avila, Z., Pérez-Torres, A., Garcia-Loya, J., Alfaro-Cruz, A., Piña-Barba, C., Gutierrez-Reyes, G. Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy. J. Vis. Exp. (172), e62697, doi:10.3791/62697 (2021).

View Video