Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.
Abstract
Fibroblasten zijn fenotypisch zeer dynamische cellen, die snel transdifferentiëren in myofibroblasten als reactie op biochemische en biomechanische stimuli. Het huidige begrip van fibrotische processen, waaronder hartfibrose, blijft slecht, wat de ontwikkeling van nieuwe anti-fibrotische therapieën belemmert. Controleerbare en betrouwbare menselijke modelsystemen zijn cruciaal voor een beter begrip van fibrosepathologie. Dit is een zeer reproduceerbaar en schaalbaar protocol om gemanipuleerde bindweefsels (ECT) te genereren in een 48-well gietplaat om studies van fibroblasten en de pathofysiologie van fibrotisch weefsel in een 3-dimensionale (3D) omgeving te vergemakkelijken. ECT worden gegenereerd rond de polen met instelbare stijfheid, waardoor studies onder een gedefinieerde biomechanische belasting mogelijk zijn. Onder de gedefinieerde belastingsomstandigheden kunnen fenotypische aanpassingen gecontroleerd door cel-matrixinteracties worden bestudeerd. Parallel testen is mogelijk in het 48-well formaat met de mogelijkheid voor de tijdsverloopanalyse van meerdere parameters, zoals weefselverdichting en contractie tegen de belasting. Op basis van deze parameters kunnen biomechanische eigenschappen zoals weefselstijfheid en elasticiteit worden bestudeerd.
Introduction
Een groot obstakel in de studie van fibrotische ziekten is het ontbreken van representatieve menselijke 3D-weefselmodellen die inzicht geven in het gedrag van fibroblasten en hun pathologische derivaten. Om fibrotische processen te bestuderen, zijn standaard 2D-kweeksystemen suboptimaal, omdat geïsoleerde fibroblasten snel transdifferentiëren in α-gladde spier actine (SMA) -tot expressie brengende myofibroblasten wanneer gekweekt op niet-conforme 2D-substraten1,2,3. Fibroblasten in de standaard 2D-cultuur weerspiegelen dus geen regulier “gezond” weefselfenotype3,4,5,6. Culturen op buigzame substraten zijn geïntroduceerd om niet-fibrotische (10 kPa) en fibrotische (35 kPa) weefselomgevingen7 te simuleren, maar deze missen de derde dimensie, die erg belangrijk is met betrekking tot pathofysiologie. Tissue engineering biedt de mogelijkheid om deze beperking te overwinnen door fibroblastcultuur toe te staan in een gedefinieerde en experimenteel instelbare extracellulaire matrix (ECM)-context, bijvoorbeeld door veranderingen in de cellulariteit, ECM-samenstelling en ECM-concentratie, die allemaal de weefselbiomechanica kunnen bepalen.
Verschillende 3D-modellen zijn gegenereerd met behulp van fibroblasten. Zwevende schijven en microsferen behoorden tot de eerste en tonen aan dat collageen op een tijdsafhankelijke manier wordt geremodelleerd en verdicht. Fibroblasten oefenen tractiekrachten uit op collageenfibrillen, een proces dat kan worden vergemakkelijkt door de toevoeging van pro-fibrotische middelen zoals transformerende groeifactor-bèta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Vrij zwevende culturen laten echter geen gecontroleerde externe belasting toe en vormen daarom continu krimpende of verdichtende modellen. Sheet-like engineered tissues openden de mogelijkheid om homeostatische regulatie van biomechanische eigenschappen van weefsels te bestuderen, namelijk door middel van uni-, bi-, multiaxiale of cyclische stamtests17,18,19,20. Deze modellen zijn bijvoorbeeld gebruikt om de invloed van het celgetal op de weefselstijfheid aan te tonen, die positief bleek te correleren met cytoskeletintegriteit en actomyosine cytoskeletcontractiliteit18,19. Het is echter belangrijk op te merken dat kracht-naar-spanning conversies worden gecompliceerd door de niet-uniforme weefselvervorming rond klempunten van krachtopnemers en ankerpunten. Deze inherente beperking kan worden omzeild door hondenbot of ringvormige weefsels, waardoor enige weefselhandhaving op ankerpunten wordt geboden21,22,23. Ringvormige weefsels kunnen worden bereid door een celcollageenhydrogel in ringvormige mallen te verdelen. Naarmate de hydrogel compact wordt, vormt zich een weefsel rond de niet-samendrukbare binnenstaaf van de mal, die weerstand biedt voor verdere weefselcontractie24,25,26,27. Na initiële en typisch maximale verdichting kunnen weefsels ook worden overgebracht naar verstelbare afstandhouders om cirkelvormige ECT verder te beperken op een gedefinieerde weefsellengte3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysische eigenschappen kunnen worden beoordeeld in standaard horizontale of verticale spannings-apparaten met geschikte loadcellen onder unidirectionele of dynamische spanning3. Omdat de weefsels een grotendeels uniforme cirkelvormige structuur hebben en op staven/haken (verankeringspunten en/of krachtopnemers) kunnen worden gehouden, hoewel deze nog steeds compressiegebieden rond de laadstangen kunnen omsluiten, maakt dit formaat een meer uniforme spanningsvariatie mogelijk in vergelijking met klemmen3. Bovendien wekken verankerde weefsels een bipolaire celvorm op en passen cellen zich aan de weefselkrachten aan door verlenging langs krachtlijnen die anisotrope tractie bevorderen31,32,33,34,35,36. We hebben eerder ringvormige ECT toegepast van rat en humaan cardiale fibroblasten (CF) rond een enkele stijve pool in functionele stress-stamexperimenten en winst- en functieverliesstudies uitgevoerd met behulp van viraal getransduceerde fibroblasten24,25,26 en farmacologische studies37. Verder konden we sekseverschillen in CF-gemedieerde fibrose identificeren in het ECT-model27.
Het volgende protocol voor het genereren van menselijke ECT, geïllustreerd met primaire menselijke CF verkregen als gecryopreserveerde CF van commerciële leveranciers (zie Tabel met materialen), combineert de voordelen van ringvormige weefsels met een eenvoudige en snelle manier om macroscopische weefsels te produceren voor een 48-well platform dat is ontworpen voor parallelle testen met een hoog gehalte.
Belangrijk is dat het ECT-model niet beperkt is tot een specifiek fibroblasttype, met het gedocumenteerde gebruik in het onderzoek van andere fibroblasten, bijvoorbeeld huidfibroblasten38,39. Bovendien werken fibroblasten uit biopten van de patiënt even goed en hangt de keuze van fibroblasten uiteindelijk af van de wetenschappelijke vraag die moet worden aangepakt.
Het platform dat wordt gebruikt voor het genereren van ECT zoals beschreven in dit protocol is een in de handel verkrijgbare 48-well 3D-cel/weefselkweekplaat (figuur 1A). De methoden voor het bereiden, kweken en bewaken van ECT-vorming en -functie onder een gedefinieerde geometrie en mechanische belasting met behulp van de 48-putplaat worden beschreven. De gevormde ECT worden vastgehouden door geïntegreerde flexibele palen en de mechanische belasting kan worden afgestemd op het uiteindelijke doel door palen met verschillende hardheid te gebruiken (Shore A-waarde 36-89), waardoor hun buigstijfheid wordt beïnvloed. Palen met een oever A-waarde van 46 worden aanbevolen. Het protocol is bovendien compatibel met een eerder beschreven aangepaste cirkelvormige mal, waarbij de ECT rond een enkele stijve staaf wordt gehouden37. De afmetingen van deze mal zijn weergegeven in figuur 1B.
Figuur 1: Schematische weergave van gietmallen. (A) Technische tekening en afmetingen van een gietvorm met twee flexibele palen. De mal bestaat uit een binnenomtrek begrensd door een korte muur die dubbele keerpalen aan het hoofdlichaam van de mal vasthoudt. De flexibele palen hebben een vrije horizontale afstand tot elkaar en zijn aan de basis met elkaar verbonden. De mal zorgt voor een gietvolume van 180 μL. De put van elke mal maakt een volumecapaciteit van ten minste 600 μL kweekmedia mogelijk. Verschillende materiaalsamenstellingen kunnen worden gebruikt om palen met specifieke stijfheid te produceren (bijv. TM5MED-TM9MED). (B) Technische tekening en afmetingen van een ringvormige mal met een enkele stijve staaf. Dit is een alternatieve mal met een duidelijke geometrie en mechanische omgeving, die kan worden gebruikt met het ECT-gietprotocol37. De ringvormige matrijsassemblagemethode is aangepast van gepubliceerde grotere formaten28,41. Kortom, de methode omvat (1) het inprenten van polytetrafluorethyleen (PTFE) vormafstandhouders (8 mm diameter) in polydimethylsiloxaan (PDMS, siliconen) gegoten in glazen schalen (diameter 60 mm), en (2) het concentrisch bevestigen van een PDMS-paalhouder (1,5 mm diameter) concentrisch in de gevormde holle holte, die dient om (3) een verwijderbare paal (siliconenbuis met een diameter van 4 mm) vast te houden. De holle ruimte die hieruit voortvloeit, zorgt voor 180 μL gietvolume. Elke glazen schaal kan meerdere bedrukte mallen bevatten (voorbeeldig weergegeven met 5 mallen) en heeft de capaciteit voor maximaal 5 ml kweekmedium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft de generatie van ECT uit primaire menselijke CF, die het mogelijk maakt om de mechanische impact van deze cellen op hun extracellulaire matrixomgeving te bestuderen en vice versa.
De fibroblasten moeten worden uitgebreid om voldoende cellen op te leveren voor de geplande ECT-experimenten (0,75 x 106 cellen/ECT). Voor de beste reproduceerbaarheid wordt geadviseerd om bevroren of weefsel-afgeleide fibroblasten voor te kweken in 2D monolaagcultuur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de German Cardiac Society (DGK Research Fellowship for GLS) en door de German Research Foundation (DFG via het project IRTG 1816 voor GLS en AD; DFG 417880571 en DFG TI 956/1-1 voor MT; SFB 1002 TP C04 voor MT en WHZ; SFB 1002 TP S01 voor WHZ; en EXC 2067/1-390729940J voor WHZ). WHZ wordt ondersteund door het Duitse federale ministerie van Wetenschap en Onderwijs (BMBF via het project IndiHEART) en de Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ en SL worden ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK).
Materials
| Cell culture reagents: | |||
| Accutase Solution | Merk Millipore | SCR005 | |
| Dissociation reagent – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose | Gibco | 12100061 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM Fibroblast Growth Basal Medium | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4126 | |
| Fibroblast Growth Medium 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
| Fibroblast Basal Medium 3 | PromoCell | C-23230 | |
| Growth Medium 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
| Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| Cell sources: | |||
| Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
| Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
| Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
| Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC- 1041 | |
| Collagen sourses: | |||
| Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl | LLC Collagen Solutions | FS22024 | 6-7 mg/mL |
| Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 mg/mL |
| Drugs: | |||
| Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| Plastic ware: | |||
| Cell culture plastic ware | Sarstedt and Starlab | ||
| Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) | Corning | 07-200-619 | |
| Specific instruments: | |||
| Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors | OptoEngineering | TCCR12096 | |
| Area scan camera Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |
References
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (16), 7540-7545 (2011).
- Elson, E. L., Genin, G. M. Tissue constructs: platforms for basic research and drug discovery. Interface Focus. 6 (1), 20150095 (2016).
- Cho, N., Razipour, S. E., McCain, M. L. TGF-beta1 dominates extracellular matrix rigidity for inducing differentiation of human cardiac fibroblasts to myofibroblasts. Experimental Biology and Medicine. 243 (7), 601-612 (2018).
- Cucoranu, I., et al. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circulation Research. 97 (9), 900-907 (2005).
- Peng, H., Carretero, O. A., Peterson, E. L., Rhaleb, N. E. Ac-SDKP inhibits transforming growth factor-beta1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), 1357-1364 (2010).
- Ribeiro, A. J., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Tranquillo, R. T., Durrani, M. A., Moon, A. G. Tissue engineering science: consequences of cell traction force. Cytotechnology. 10 (3), 225-250 (1992).
- Barocas, V. H., Moon, A. G., Tranquillo, R. T. The fibroblast-populated collagen microsphere assay of cell traction force–Part 2: Measurement of the cell traction parameter. Journal of Biomechanical Engineering. 117 (2), 161-170 (1995).
- Lijnen, P., Petrov, V., Rumilla, K., Fagard, R. Stimulation of collagen gel contraction by angiotensin II and III in cardiac fibroblasts. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 3 (3), 160-166 (2002).
- Baxter, S. C., Morales, M. O., Goldsmith, E. C. Adaptive changes in cardiac fibroblast morphology and collagen organization as a result of mechanical environment. Cell Biochemistry and Biophysics. 51 (1), 33-44 (2008).
- Zhou, Y., et al. Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1096-1108 (2013).
- Lijnen, P., Petrov, V., Fagard, R. In vitro assay of collagen gel contraction by cardiac fibroblasts in serum-free conditions. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 23 (7), 377-382 (2001).
- Burgess, M. L., et al. Integrin-mediated collagen gel contraction by cardiac fibroblasts. Effects of angiotensin II. Circulation Research. 74 (2), 291-298 (1994).
- Nunohiro, T., Ashizawa, N., Graf, K., Hsueh, W. A., Yano, K. Angiotensin II promotes integrin-mediated collagen gel contraction by adult rat cardiac fibroblasts. Japanese Heart Journal. 40 (4), 461-469 (1999).
- Ngu, J. M., et al. Human cardiac fibroblast extracellular matrix remodeling: Dual effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Cardiovascular Pathology. 23 (6), 335-343 (2014).
- Knezevic, V., Sim, A. J., Borg, T. K., Holmes, J. W. Isotonic biaxial loading of fibroblast-populated collagen gels: a versatile, low-cost system for the study of mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 1 (1), 59-67 (2002).
- Delvoye, P., Wiliquet, P., Leveque, J. L., Nusgens, B. V., Lapiere, C. M. Measurement of mechanical forces generated by skin fibroblasts embedded in a three-dimensional collagen gel. Journal of Investigative Dermatology. 97 (5), 898-902 (1991).
- Kolodney, M. S., Elson, E. L. Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (32), 23850-23855 (1993).
- Bell, B. J., Nauman, E., Voytik-Harbin, S. L. Multiscale strain analysis of tissue equivalents using a custom-designed biaxial testing device. Biophysical Journal. 102 (6), 1303-1312 (2012).
- Wakatsuki, T., Kolodney, M. S., Zahalak, G. I., Elson, E. L. Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophysical Journal. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- Thomopoulos, S., et al. Fibrocartilage tissue engineering: The role of the stress environment on cell morphology and matrix expression. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 1039-1053 (2011).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (2), 214-222 (2002).
- Ongherth, A., et al. p63RhoGEF regulates auto- and paracrine signaling in cardiac fibroblasts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 88, 39-54 (2015).
- Vettel, C., et al. PDE2-mediated cAMP hydrolysis accelerates cardiac fibroblast to myofibroblast conversion and is antagonized by exogenous activation of cGMP signaling pathways. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (8), 1246-1252 (2014).
- Jatho, A., et al. RhoA Ambivalently Controls Prominent Myofibroblast Characteritics by Involving Distinct Signaling Routes. PLoS One. 10 (10), 0137519 (2015).
- Dworatzek, E., et al. Sex-specific regulation of collagen I and III expression by 17beta-Estradiol in cardiac fibroblasts: role of estrogen receptors. Cardiovascular Research. 115 (2), 315-327 (2019).
- Tiburcy, M., Meyer, T., Soong, P. L., Zimmermann, W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods in Molecular Biology. 1181, 167-176 (2014).
- Schlick, S. F., et al. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 51-60 (2019).
- Wille, J. J., Elson, E. L., Okamoto, R. J. Cellular and matrix mechanics of bioartificial tissues during continuous cyclic stretch. Annals of Biomedical Engineering. 34 (11), 1678-1690 (2006).
- Berry, C. C., Shelton, J. C., Bader, D. L., Lee, D. A. Influence of external uniaxial cyclic strain on oriented fibroblast-seeded collagen gels. Tissue Engineering. 9 (4), 613-624 (2003).
- Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Developmental Biology. 90 (2), 383-398 (1982).
- Bellows, C. G., Melcher, A. H., Aubin, J. E. Association between tension and orientation of periodontal ligament fibroblasts and exogenous collagen fibres in collagen gels in vitro. Journal of Cell Science. 58 (1), 125-138 (1982).
- Tranquillo, R. T. Self-organization of tissue-equivalents: the nature and role of contact guidance. Biochemical Society Symposia. 65, 27-42 (1999).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of Biomechanical Engineering. 119 (2), 137-145 (1997).
- Yip, A. K., et al. Anisotropic traction stresses and focal adhesion polarization mediates topography-induced cell elongation. Biomaterials. 181, 103-112 (2018).
- Santos, G. L., Hartmann, S., Zimmermann, W. H., Ridley, A., Lutz, S. Inhibition of Rho-associated kinases suppresses cardiac myofibroblast function in engineered connective and heart muscle tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 134, 13-28 (2019).
- Kittana, N., et al. Modulating the biomechanical properties of engineered connective tissues by chitosan-coated multiwall carbon nanotubes. International Journal of Nanomedicine. 16, 989-1000 (2021).
- Kittana, N., et al. Enhancement of wound healing by single-wall/multi-wall carbon nanotubes complexed with chitosan. International Journal of Nanomedicine. 13, 7195-7206 (2018).
- Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
- Holder, A. J., et al. Control of collagen gel mechanical properties through manipulation of gelation conditions near the sol-gel transition. Soft Matter. 14 (4), 574-580 (2018).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
