Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Published: August 20, 2021 doi: 10.3791/62700

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.

Abstract

Fibroblasten zijn fenotypisch zeer dynamische cellen, die snel transdifferentiëren in myofibroblasten als reactie op biochemische en biomechanische stimuli. Het huidige begrip van fibrotische processen, waaronder hartfibrose, blijft slecht, wat de ontwikkeling van nieuwe anti-fibrotische therapieën belemmert. Controleerbare en betrouwbare menselijke modelsystemen zijn cruciaal voor een beter begrip van fibrosepathologie. Dit is een zeer reproduceerbaar en schaalbaar protocol om gemanipuleerde bindweefsels (ECT) te genereren in een 48-well gietplaat om studies van fibroblasten en de pathofysiologie van fibrotisch weefsel in een 3-dimensionale (3D) omgeving te vergemakkelijken. ECT worden gegenereerd rond de polen met instelbare stijfheid, waardoor studies onder een gedefinieerde biomechanische belasting mogelijk zijn. Onder de gedefinieerde belastingsomstandigheden kunnen fenotypische aanpassingen gecontroleerd door cel-matrixinteracties worden bestudeerd. Parallel testen is mogelijk in het 48-well formaat met de mogelijkheid voor de tijdsverloopanalyse van meerdere parameters, zoals weefselverdichting en contractie tegen de belasting. Op basis van deze parameters kunnen biomechanische eigenschappen zoals weefselstijfheid en elasticiteit worden bestudeerd.

Introduction

Een groot obstakel in de studie van fibrotische ziekten is het ontbreken van representatieve menselijke 3D-weefselmodellen die inzicht geven in het gedrag van fibroblasten en hun pathologische derivaten. Om fibrotische processen te bestuderen, zijn standaard 2D-kweeksystemen suboptimaal, omdat geïsoleerde fibroblasten snel transdifferentiëren in α-gladde spier actine (SMA) -tot expressie brengende myofibroblasten wanneer gekweekt op niet-conforme 2D-substraten1,2,3. Fibroblasten in de standaard 2D-cultuur weerspiegelen dus geen regulier "gezond" weefselfenotype3,4,5,6. Culturen op buigzame substraten zijn geïntroduceerd om niet-fibrotische (10 kPa) en fibrotische (35 kPa) weefselomgevingen7 te simuleren, maar deze missen de derde dimensie, die erg belangrijk is met betrekking tot pathofysiologie. Tissue engineering biedt de mogelijkheid om deze beperking te overwinnen door fibroblastcultuur toe te staan in een gedefinieerde en experimenteel instelbare extracellulaire matrix (ECM)-context, bijvoorbeeld door veranderingen in de cellulariteit, ECM-samenstelling en ECM-concentratie, die allemaal de weefselbiomechanica kunnen bepalen.

Verschillende 3D-modellen zijn gegenereerd met behulp van fibroblasten. Zwevende schijven en microsferen behoorden tot de eerste en tonen aan dat collageen op een tijdsafhankelijke manier wordt geremodelleerd en verdicht. Fibroblasten oefenen tractiekrachten uit op collageenfibrillen, een proces dat kan worden vergemakkelijkt door de toevoeging van pro-fibrotische middelen zoals transformerende groeifactor-bèta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Vrij zwevende culturen laten echter geen gecontroleerde externe belasting toe en vormen daarom continu krimpende of verdichtende modellen. Sheet-like engineered tissues openden de mogelijkheid om homeostatische regulatie van biomechanische eigenschappen van weefsels te bestuderen, namelijk door middel van uni-, bi-, multiaxiale of cyclische stamtests17,18,19,20. Deze modellen zijn bijvoorbeeld gebruikt om de invloed van het celgetal op de weefselstijfheid aan te tonen, die positief bleek te correleren met cytoskeletintegriteit en actomyosine cytoskeletcontractiliteit18,19. Het is echter belangrijk op te merken dat kracht-naar-spanning conversies worden gecompliceerd door de niet-uniforme weefselvervorming rond klempunten van krachtopnemers en ankerpunten. Deze inherente beperking kan worden omzeild door hondenbot of ringvormige weefsels, waardoor enige weefselhandhaving op ankerpunten wordt geboden21,22,23. Ringvormige weefsels kunnen worden bereid door een celcollageenhydrogel in ringvormige mallen te verdelen. Naarmate de hydrogel compact wordt, vormt zich een weefsel rond de niet-samendrukbare binnenstaaf van de mal, die weerstand biedt voor verdere weefselcontractie24,25,26,27. Na initiële en typisch maximale verdichting kunnen weefsels ook worden overgebracht naar verstelbare afstandhouders om cirkelvormige ECT verder te beperken op een gedefinieerde weefsellengte3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysische eigenschappen kunnen worden beoordeeld in standaard horizontale of verticale spannings-apparaten met geschikte loadcellen onder unidirectionele of dynamische spanning3. Omdat de weefsels een grotendeels uniforme cirkelvormige structuur hebben en op staven/haken (verankeringspunten en/of krachtopnemers) kunnen worden gehouden, hoewel deze nog steeds compressiegebieden rond de laadstangen kunnen omsluiten, maakt dit formaat een meer uniforme spanningsvariatie mogelijk in vergelijking met klemmen3. Bovendien wekken verankerde weefsels een bipolaire celvorm op en passen cellen zich aan de weefselkrachten aan door verlenging langs krachtlijnen die anisotrope tractie bevorderen31,32,33,34,35,36. We hebben eerder ringvormige ECT toegepast van rat en humaan cardiale fibroblasten (CF) rond een enkele stijve pool in functionele stress-stamexperimenten en winst- en functieverliesstudies uitgevoerd met behulp van viraal getransduceerde fibroblasten24,25,26 en farmacologische studies37. Verder konden we sekseverschillen in CF-gemedieerde fibrose identificeren in het ECT-model27.

Het volgende protocol voor het genereren van menselijke ECT, geïllustreerd met primaire menselijke CF verkregen als gecryopreserveerde CF van commerciële leveranciers (zie Tabel met materialen), combineert de voordelen van ringvormige weefsels met een eenvoudige en snelle manier om macroscopische weefsels te produceren voor een 48-well platform dat is ontworpen voor parallelle testen met een hoog gehalte.

Belangrijk is dat het ECT-model niet beperkt is tot een specifiek fibroblasttype, met het gedocumenteerde gebruik in het onderzoek van andere fibroblasten, bijvoorbeeld huidfibroblasten38,39. Bovendien werken fibroblasten uit biopten van de patiënt even goed en hangt de keuze van fibroblasten uiteindelijk af van de wetenschappelijke vraag die moet worden aangepakt.

Het platform dat wordt gebruikt voor het genereren van ECT zoals beschreven in dit protocol is een in de handel verkrijgbare 48-well 3D-cel/weefselkweekplaat (figuur 1A). De methoden voor het bereiden, kweken en bewaken van ECT-vorming en -functie onder een gedefinieerde geometrie en mechanische belasting met behulp van de 48-putplaat worden beschreven. De gevormde ECT worden vastgehouden door geïntegreerde flexibele palen en de mechanische belasting kan worden afgestemd op het uiteindelijke doel door palen met verschillende hardheid te gebruiken (Shore A-waarde 36-89), waardoor hun buigstijfheid wordt beïnvloed. Palen met een oever A-waarde van 46 worden aanbevolen. Het protocol is bovendien compatibel met een eerder beschreven aangepaste cirkelvormige mal, waarbij de ECT rond een enkele stijve staaf wordt gehouden37. De afmetingen van deze mal zijn weergegeven in figuur 1B.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van gietmallen. (A) Technische tekening en afmetingen van een gietvorm met twee flexibele palen. De mal bestaat uit een binnenomtrek begrensd door een korte muur die dubbele keerpalen aan het hoofdlichaam van de mal vasthoudt. De flexibele palen hebben een vrije horizontale afstand tot elkaar en zijn aan de basis met elkaar verbonden. De mal zorgt voor een gietvolume van 180 μL. De put van elke mal maakt een volumecapaciteit van ten minste 600 μL kweekmedia mogelijk. Verschillende materiaalsamenstellingen kunnen worden gebruikt om palen met specifieke stijfheid te produceren (bijv. TM5MED-TM9MED). (B) Technische tekening en afmetingen van een ringvormige mal met een enkele stijve staaf. Dit is een alternatieve mal met een duidelijke geometrie en mechanische omgeving, die kan worden gebruikt met het ECT-gietprotocol37. De ringvormige matrijsassemblagemethode is aangepast van gepubliceerde grotere formaten28,41. Kortom, de methode omvat (1) het inprenten van polytetrafluorethyleen (PTFE) vormafstandhouders (8 mm diameter) in polydimethylsiloxaan (PDMS, siliconen) gegoten in glazen schalen (diameter 60 mm), en (2) het concentrisch bevestigen van een PDMS-paalhouder (1,5 mm diameter) concentrisch in de gevormde holle holte, die dient om (3) een verwijderbare paal (siliconenbuis met een diameter van 4 mm) vast te houden. De holle ruimte die hieruit voortvloeit, zorgt voor 180 μL gietvolume. Elke glazen schaal kan meerdere bedrukte mallen bevatten (voorbeeldig weergegeven met 5 mallen) en heeft de capaciteit voor maximaal 5 ml kweekmedium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskappen van klasse II die zijn geïnstalleerd in laboratoria onder inperkingsniveau 1. Afhankelijk van de lokale regelgeving en het type manipulaties dat moet worden uitgevoerd, zoals virale gemedieerde genoverdracht, moet het inperkingsniveau worden verhoogd tot het bioveiligheidsniveau 2 of 3. Alle culturen worden op 37 °C gehouden in een celkweekincubator met een bevochtigde atmosfeer van 5 % CO2 in de lucht. Merk op dat de volumes (stap 1 en 2) zijn voorzien voor een T75 celkweekkolf. Pas de volumes aan verschillende kweekformaten aan volgens de standaard celkweekaanbevelingen.

1. Ontdooien en pre-plating primaire cardiale fibroblast (CF) voor monolaagcultuur (5-12 dagen)

OPMERKING: Als alternatief kunnen HFF-1-cellen worden gebruikt volgens het standaard subkweekprotocol zoals geadviseerd door de leverancier.

  1. Bereid het fibroblastgroeimedium (VGV) voor volgens de instructies van de fabrikant. Voeg eventueel antibiotica toe zoals 100 E / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine. Zorg voor het volledig mengen van alle componenten voor gebruik. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 14 dagen.
  2. Warme VGV tot 20-25 °C.
  3. Ontdooi de gecryopreserveerde CF (idealiter bevattende 1 x 106 tot 2 x 106/ml cellen per cryoviaal) in een waterbad bij 37 °C gedurende ongeveer 2 minuten, totdat er slechts een kleine hoeveelheid ijs in de injectieflacon overblijft.
  4. Breng met behulp van een serologische pipet van 2 ml de celsuspensie druppelsgewijs over in een geschikte steriele centrifugebuis met 10 ml VGV. Voor een optimale celophaling spoelt u het cryoviaal met 1 ml VGV en brengt u het over naar de centrifugebuis. Omdat de cellen in dit stadium erg gevoelig zijn, resuspend met behulp van een serologische pipet met een boorpunt om celbeschadiging door schuifspanning te minimaliseren.
    OPMERKING: Als het cryopreservatiemedium een hoog percentage DMSO bevat, zorg er dan voor dat na celreuspensie bij VGV het DMSO-gehalte minder dan 1 % is. U kunt de geresuspendeerde cellen gedurende 5 minuten bij 20-25 °C bij 300 x g centrifugeren voor de mediumuitwisseling. Aspirateer vervolgens het supernatant voorzichtig, draai de buis om de gepelleteerde cellen los te maken en resuspend ze in het gewenste volume VGV voor zaaien.
  5. Zaai 0,5 x 106 cellen in 12 ml VGV in een T75-celkweekkolf. Als andere labware wordt gebruikt, past u het celnummer aan om een seedingdichtheid van 6,7 x 103/cm2 te behouden.
  6. Vervang VGV om de dag gedurende 5 dagen of totdat de cellen 80% confluentie bereiken.
    OPMERKING: De celopbrengst na de expansie hangt voornamelijk af van de celgrootte en proliferatiesnelheid, die kan verschillen tussen celdonoren. Typisch, deze standaard kweekprocedure maakt het mogelijk om 4 x 106 tot 5 x 106 CF uit een T75 celkweekkolf te halen na 5 dagen cultuur.

2. Enzymatische dispersie van menselijke CF (10-20 min)

OPMERKING: Deze stap is gericht op het vaststellen van een eencellige suspensie van menselijke CF voor zowel subkweekte monolaagcellen als de bereiding van ECT. Dit protocol is geoptimaliseerd voor menselijke CF monolaag culturen in passages 3-4. Voor optimale standaardisatie wordt het subkweken van CF in monolaag aanbevolen, ten minste eenmaal vóór ECT-voorbereiding. Dit protocol moet worden geoptimaliseerd voor fibroblasten afkomstig van verschillende donoren en leveranciers. Alternatieve loslatingsprotocollen kunnen inhouden dat recombinante op serineprotease gebaseerde dissociatiereagentia worden vervangen door bijvoorbeeld reteolytische en collagenolytische enzymen.

  1. Warm VGV, PBS (Ca2+/Mg2+-vrij) en celdissociatiereagens tot 20-25 °C.
  2. Zuig het medium op uit de gekweekte cellen.
  3. Was cellen met 6 ml PBS en aspiraat.
  4. Voeg 6 ml celdissociatiereagens toe aan de cellen en incubeer gedurende 3 minuten bij 20-25 °C totdat de cellen zichtbaar beginnen los te maken.
    OPMERKING: Afhankelijk van de CF-bron kan dit enkele minuten langer duren. Als de cellen niet loskomen bij kamertemperatuur, incubeer dan bij 37 °C om de activiteit van enzymen te verbeteren. Om optimale levensvatbaarheid van de cel te garanderen, controleert u de loslating van de cel onder de microscoop.
  5. Neutraliseer enzymatische activiteit door 6-12 ml VGV toe te voegen aan de losgeraakte cellen in het celdissociatiereagens. Pipetteer voorzichtig 4-8 keer op en neer met behulp van een serologische pipet van 10 ml om een suspensie met één cel te garanderen en breng cellen over in een verse opvangbuis van 50 ml. Controleer de opbrengst met behulp van een microscoop en een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 20-25 °C.
    OPMERKING: Om een celopbrengst te bereiken die voldoende is voor het genereren van de gewenste hoeveelheid ECT, kunnen cellen worden gesubkweekt in een verdunning tot 1:6 voor verdere expansie. Laat de cellen groeien totdat 80% confluentie is bereikt (ongeveer 5-6 dagen), waarbij het medium om de andere dag verandert. Herhaal vervolgens de enzymatische dispersie en ga verder met stap 2.7. om door te gaan met ECT-voorbereiding.
  7. Zuig het bovennatuurlijke middel aan en veeg aan de buis om de pellet los te maken. Resuspend de cellen in VGV bij 20-25 °C om een celsuspensie van ≥ 15 x 106/ml te verkrijgen (ongeveer 40 % meer cellen dan vereist voor stap 3.3.). Dit verklaart het celverlies als gevolg van overbelasting in de volgende stap.
  8. Zeef de celsuspensie door een 40 μm mesh celzeef.
    LET OP: Celagglomeraten zijn schadelijk voor de optimale vorming van ECT. Bij gebruik van de enzymatische dispersie van het menselijke CF-protocol voor het direct gieten van ECT, zorgt het belasten van de celsuspensie voor de afwezigheid van grote celklonten die de homogene weefselvorming verstoren. Heterogeniteiten zullen betrouwbare stress-spanningsanalyses in gevaar brengen.
  9. Hertel het celnummer en beoordeel de levensvatbaarheid van de cel om te zorgen voor een betrouwbaar celnummer in een suspensie met ≥ 80 % levensvatbaarheid om door te gaan met ECT-preparaat.
    1. Gebruik een geautomatiseerde celteller om het celnummer en de levensvatbaarheid te beoordelen door uitsluiting van elektrische stroom.
    2. Als alternatief kunt u de trypan blue (carcinogeen, gevarencategorie 2 - voorzorgsmaatregelen nemen) kleurstofuitsluitingstest gebruiken, met behulp van een microscoop en een hemocytometer voor de directe identificatie en opsomming van levende (intacte celmembranen die de kleurstof uitsluiten) en dode (aangetaste celmembranen die binding van de kleurstof aan intracellulaire eiwitten mogelijk maken) cellen.
  10. Reserveer de opvangbuis met celsuspensie bij 20-25 °C en ga onmiddellijk verder met stap 3.

3. ECT-bereiding (1 uur)

OPMERKING: Schematisch overzicht van ECT-generatie wordt beschreven in figuur 2.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch overzicht van ECT-generatie. Fibroblasten worden uitgebreid in 2D-cultuur voor gebruik bij ECT-generatie. Na 5-10 dagen worden cellen enzymatisch gedispergeerd en wordt de celsuspensie gereconstitueerd in een gebufferd mengsel dat rundercollageen type 1 bevat. Het cel-collageen hydrogelmengsel wordt in individuele putten gepipetteerd in een 48-putplaat voor 3D-gemanipuleerde weefselkweek, ontworpen als gietvormen met twee flexibele polen om ECT-suspensie mogelijk te maken bij een gedefinieerde lengte en belasting. ECT worden meestal gekweekt gedurende 1 tot 20 dagen voorafgaand aan de metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Bereid een 10x DMEM-stamoplossing door DMEM-poeder op te lossen in ddH2O (134 mg/ml voor de formulering gespecificeerd in de materiaaltabel) onder een constante rotatie bij 37 °C gedurende 1 uur. Steriliseren door filtratie. De voorraad is tot 14 dagen stabiel bij 4 °C of -20 °C gedurende maximaal 12 maanden.
  2. Bereid 2x DMEM vers door een 10x DMEM-stamoplossing te verdunnen en door 20 % (v/v) FCS toe te voegen in steriel ddH2O. Gebruik eventueel antibiotica zoals 200 E/ml penicilline en 200 mg/ml streptomycine. Raadpleeg tabel 1 voor pipetteervolumes. De voorraad is tot 14 dagen stabiel bij 4 °C.
    OPMERKING: Voer stap 3.1 uit. en 3.2. voordat wordt begonnen met enzymatische dispersie van cellen (stap 2.) voor de bereiding van ECT.
Reagens Eindconcentratie Volume (ml)
10× DMEM n.v.t 2
FCS 20 % (v/v) 2
Penicilline 200 U/ml 0.2
Streptomycine 200mg/ml 0.2
DDH2O n.v.t 5.6
Totaal n.v.t 10

Tabel 1: Samenstelling van 2x DMEM.

LET OP: Alle componenten voor het cel-collageen hydrogelmengsel en de centrifugebuizen moeten vóór het gebruik op ijs worden bewaard. Dit zal helpen voorkomen dat collageen zelfassemblage optreedt voordat het cel-collageen hydrogelmengsel door de gietvormen wordt verdeeld.

  1. Stel op basis van tabel 2 de celsuspensie aan tot een dichtheid van 8,88 x 106 cellen/ml door VGV bij 20-25 °C toe te voegen aan de celsuspensie vanaf stap 2.10. Verplaats vervolgens de opvangbuis met celsuspensie naar ijs.
  2. Om het ECT-hydrogelmengsel te bereiden, koelt u een centrifugebuis van 50 ml voor op ijs en voegt u de verschillende in tabel 2 vermelde componenten in de volgende volgorde toe, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
    OPMERKING: Het maximale aantal ect dat moet worden bereid, is afhankelijk van het totale celnummer dat is bepaald in stap 2.9. Gebruik 0,3 mg collageen per ECT, verkregen uit een standaardoplossing die 6-7 mg / ml bevat. De concentratie van de collageenvoorraadoplossing bepaalt het volume dat nodig is om een optimaal ECT-collageengehalte te verkrijgen. De volumes van de andere ECT-hydrogelcomponenten moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Zie tabel 2 voor aangepaste volumes volgens een collageenvoorraadoplossing van 6,49 mg/ml. De in tabel 2 beschreven volumes worden in dit protocol als voorbeeldige richtlijn gebruikt.
    1. Pipetteer de zuur oplosbare collageen type 1 hydrogel met behulp van een serologische pipet met een brede boring.
    2. Pas het zoutgehalte van de collageenoplossing aan door de 2x DMEM toe te voegen terwijl u voorzichtig mengt door de buis te draaien.
    3. Neutraliseer de pH door 0,2 M NaOH toe te voegen terwijl u voorzichtig mengt door de buis te draaien. Fenolrode indicator verandert van geel naar rood.
      OPMERKING: Het NaOH-volume moet worden getitreerd voor elke individuele collageenbatch voor de optimale pH-neutralisatie. Neutralisatie hangt af van factoren zoals buffertype en voorbereiding, evenals absolute collageenconcentratie, en het beïnvloedt de collageenmatrixassemblage en de levensvatbaarheid van cellen23,40. Zodra het ionische gehalte wordt verhoogd door de toevoeging van DMEM en de pH wordt geneutraliseerd, volgt de zelfassemblage van collageen en mag deze niet worden verstoord. Voer daarom het volgende snel en zonder pauzes uit.
    4. Voeg de celsuspensie (vanaf stap 3.3) druppelsgewijs toe terwijl u voorzichtig mengt door de buis te draaien.
ECT-nummer: 1 6 24 48
waarvan 10 % overschot
Cel-collageen hydrogel componenten: (μL) (μL) (μL) (μL)
Collageen voorraad (6,49 mg/ml) 46.2 305.1 1220.2 2440.4
2× DMEM 46.2 305.1 1220.2 2440.4
0,2 M NaOH 3.1 20.5 81.8 163.7
Celmix bij VGV (8,88×106 cel/ml) 84.5 557.4 2229.7 4459.5
Totaal volume (μL) 180.0 1188.0 4752.0 9504.0
Dit is een voorbeeldtabel om een gietvolume van 180 μL per ECT te bereiden, met in totaal 750.000 cellen en 0,3 mg collageen per ECT.

Tabel 2: Bereiding van ECT-hydrogel (met inbegrip van een overschot van 10 % dat rekening houdt met pipetteerfouten).

  1. Meng de hele suspensie door slechts één keer voorzichtig op en neer te pipetteren, met behulp van een serologische pipet met een brede boorpunt om bubbelvorming te voorkomen en schuifspanning te minimaliseren. Zorg voor een compleet mengsel door de buis 10 keer voorzichtig te draaien en houd de centrifugebuis van 50 ml met ECT-hydrogelmengsel tijdens het gietproces op ijs.
  2. Bevochtig een pipetpunt van 1 ml met ECT-hydrogelmengsel en verdeel 180 μL ervan gelijkmatig in elke mal van de 48-well gietplaat, vermijd overmatige schuifkrachten die de integriteit van de collageenmatrixassemblage kunnen beïnvloeden en zorg ervoor dat de hele plaat in 15-20 minuten wordt gedaan.
    OPMERKING: Het aanbevolen gietvolume is 180 μL, maar het kan worden uitgebreid tot 200 μL38. Daarom kunnen volumes in tabel 2 , indien gewenst, worden aangepast tot 200 μL op een manier die dezelfde concentraties en verhouding tussen cellen en collageen behoudt.
    1. Zorg ervoor dat er een volledige lus wordt gevormd in de mal (figuur 3A). Als het ECT-hydrogelmengsel continu wordt toegepast, wordt een volledige ECT-ringvorming voorkomen (figuur 3B).
    2. Vermijd pipetteren in de binnenput (figuur 3C) en de vorming van bellen tijdens het pipetteren (figuur 3D), om een homogene en functionele weefselvorming te garanderen.

Figure 3
Figuur 3: Gieten, hydrogelvorming en ECT-condensatie in multi-well formaat. De bovenpanelen illustreren het uiterlijk van ECT direct na het gieten. De middelste panelen illustreren het uiterlijk van ECT na incubatie gedurende 20 minuten bij 37 °C. De onderste panelen illustreren de staat van verdichting van ECT 24 uur na voorbereiding, verwijderd van de palen. (A) Juiste ECT-vorming tussen twee polen gedurende de eerste 24 uur. (B-D) Voorbeelden van pipetteerfouten die een goede ECT-vorming verhinderen. De witte en zwarte pijlen wijzen op structurele defecten van ECT als gevolg van onjuist gieten. Schaalbalk: 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Plaats de 48-well gietplaat voorzichtig in de celkweekincubator en laat het ECT-hydrogelmengsel gedurende 15-30 minuten reconstitueren. Na incubatie ziet het er gelachtig en ondoorzichtig uit (figuur 3, middelste paneel).
  2. Voeg 600 μL van 37 °C warme VGV per put toe, zonder het kweekmedium rechtstreeks op de vormende ECT te pipetteren, omdat dit kan leiden tot weefselverstoring. Voeg voorzichtig het kweekmedium toe langs de putwand, want op dit punt mag de ECT ook niet van de bodem worden losgemaakt (figuur 4).

Figure 4
Figuur 4: Juiste en onjuiste toevoeging van kweekmedium aan de vers gegoten ECT. (A) Bij het toevoegen van het kweekmedium na de eerste ECT-stolling (20 minuten na het gieten) moet de condenserende ECT ongestoord op de bodem van de put worden gelaten. Gedurende de volgende 24 uur zal celgestuurde matrixverdichting ervoor zorgen dat de ECT de helling op schuift. De uiteindelijke ECT-positie wordt geregeld door holle holtes op een gedefinieerde poolhoogte; dit zorgt ervoor dat alle ECT zich op dezelfde positie nestelen om een vergelijking van de poolbuigactiviteit in parallelle ECT-cultuur mogelijk te maken. (B) Het vormen van ECT los van de bodem terwijl het kweekmedium te snel wordt toegevoegd. Zwevende ECT zal verdichten op het hoogste kweekmediumniveau. Poolkrachten zullen niet direct vergelijkbaar zijn als ECT zich op verschillende posities nestelt. Schaalbalk: 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Incubeer gedurende 24 uur.
  2. Vervang het medium daarna elke dag door 500 μL VGV tot de analyse.
    OPMERKING: Na de beginfase van celonafhankelijke gelation begint de menselijke CF het ECT-hydrogelmengsel verder te verdichten. Binnen 24 uur moet ECT er met name verdicht en verhoogd uitzien tot het niveau waarop het op de flexibele polen wordt gehouden (figuur 3 en figuur 4A).

4. Beoordeling van ECT-verdichting door het meten van cross-sectional area (CSA) (5 min per ECT).

OPMERKING: Weefselverdichting begint onmiddellijk na de collageenassemblage en is vooral belangrijk tijdens de eerste uren. Verdichting beschrijft veranderingen die voornamelijk worden veroorzaakt door celgestuurde compressie van de matrix loodrecht op de lange as van het weefsel. Deze parameter wordt beoordeeld door de cross-sectionele oppervlakte (CSA) van de ECT te bepalen.

  1. Gebruik op de gewenste tijdstippen een stereomicroscoop om macroscopische beelden van de boven- en zijaanzichten van de ECT op te nemen (figuur 5C).
    OPMERKING: ECT kan worden afgebeeld in de kweekputten van de 48-well gietplaat. U kunt de ECT ook overbrengen naar een heldere onderste multi-well plaat voor beeldvorming. Het wordt geadviseerd om de ECT op de polen in beeld te brengen, omdat het verwijderen daarvan leidt tot het verlies van voorspanning, en bijgevolg kan het weefsel binnen een korte periode verder samentrekken met eventuele torsie als gevolg van spanningsontspaning, wat een goede beeldvorming voor dimensieanalyses kan belemmeren.
  2. Gebruik een beeldverwerkingsprogramma om een lijnscananalyse uit te voeren. Stel een schaal in en gebruik het gereedschap Rechte lijn om de ECT-diameters te traceren en te meten op minimaal 6 posities per arm in elk beeldvlak (figuur 5B, C).
  3. Bereken de gemiddelde diameter vanaf de boven- en zijaanzichtvlakken en bereken CSA volgens een elliptische oppervlaktevergelijking:
    Equation 1

Figure 5
Figuur 5: Monitoring van ECT-verdichting in de loop van de tijd door middel van cross-sectionele gebiedsanalyse (CSA). ECT werden gegenereerd met behulp van menselijke CF en collageen type I en gekweekt rond twee flexibele polen gedurende 5 dagen. (A) Representatieve afbeeldingen van controle-ECT geplaatst in flexibele mallen gedurende een tijd van 5 dagen worden gepresenteerd. Schaalbalk = 5 mm. Dergelijke bright-field beelden kunnen ook worden gebruikt om poolafbuigingsvariatie te bepalen voor het schatten van weefselcontractie. (B) Schematische weergave van de doorsnede van een ECT (diameter bovenaanzicht in groen en diameter zijaanzicht in roze). (C) Macroscopische beelden van boven- en zijaanzichten van een ECT verkregen met een stereomicroscoop en corresponderend voorbeeld van lijnscananalyse van de diameters van de weefsels met behulp van een beeldverwerkingsprogramma. Schaalbalk = 2 mm. De gemiddelde diameters worden berekend op basis van het gemiddelde van alle lijnlengtes die op elk weergaveplan worden gemeten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Bewaking van ECT-contractie door poolafbuigingsanalyse (15 min per 48-well gietplaat).

OPMERKING: ECT-cultuur wordt meestal gedurende 5 dagen uitgevoerd, maar het kan ten minste tot 20 dagen verder worden verlengd. Poolafbuiging treedt op als gevolg van de weefselcontractie die wordt aangedreven door de celcontractiekracht in de richting van spanning langs de lange as van het weefsel. Beoordeling van ECT-contractie kan worden uitgevoerd door beeldvorming op elke dag tijdens de kweek.

  1. Beeld de 48-well gietplaat onder een opnameapparaat met een geïntegreerde gebiedsscancamera geplaatst op een vaste afstand, uitgerust met een hoge resolutie (≥ 5 megapixels) monochrome beeldsensor.
    1. Gebruik een bijna-UV (~ 390 nm) lichtbron om het contrast te maximaliseren en zo de geautomatiseerde detectie van de uiteinden van de polen te vergemakkelijken, omdat ze een fluorescerende kleurstof bevatten (figuur 6A, C). Indien beschikbaar, worden telecentrische lenzen aanbevolen voor beeldvorming omdat ze beeldvervormingen minimaliseren.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen macroscopische helderveldbeelden van enkele putten of van de volledige plaat vergezeld van een schaalbalk worden gebruikt voor de analyse (figuur 5A).
  2. Meet de afstand tussen de polen van dagelijkse records (figuur 6C, D) met behulp van een beeldverwerkingsprogramma of geautomatiseerde analyse door opgenomen beelden uit te voeren op software die heldere pixels met een hoog contrast op een donkere achtergrond kan detecteren.
  3. Bereken de poolafbuiging door de variatie van de afstand van de polen in vergelijking met de beginafstand op dag nul.

Figure 6
Figuur 6: Schematisch overzicht van de beoordeling van weefselcontractie volgens poolafbuiging. (A) Voorbeeldige hoge-resolutie registratie van fluorescentiepolen in de 48-well gietplaat onder bijna-UV-lichtexcitatie. Deze methode heeft de voorkeur boven afbeeldingen met een helder veld voor een nauwkeurigere geautomatiseerde tracering van de paalpunt. (B) De schematische tekeningen laten zien hoe ECT-verdichting en -samentrekking leidt tot poolbuiging. (C) Een voorbeeldige rij van dezelfde plaatrecords op dag 0 en dag 5 na het gieten. D. De close-up laat zien hoe je de afstand (roze lijn) tussen de polen meet met behulp van een beeldverwerkingsprogramma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Bedenk dat poolafbuiging gemeten door een helder tipbeeld slechts een schatting is van de weefselcontractie vanwege het verschil in beeldvormingsvlakken. Merk ook op dat de toepassing van pro-fibrotische stoffen zoals TGF-β1 tijdens weefselkweek ect-verdichting en -contractie verbetert en uiteindelijk kan leiden tot vroege weefselverstoring.

6. Beoordeling van stijfheid en andere biomechanische eigenschappen van ECT door destructieve trekmeting en spannings-rekanalyse (20 min per ECT)

OPMERKING: Een optimale spannings-rekcurve kan drie regio's weergeven: teengebied, elastisch gebied en plastic gebied. Een voorbeeld van een ECT-spanningscurve is weergegeven in figuur 7. De analyse van een spannings-rekcurve maakt het mogelijk om belangrijke biomechanische parameters van het weefsel te extraheren, zoals bijvoorbeeld stijfheid, maximale sterkte, elasticiteit, plasticiteit, uitrekbaarheid, veerkracht en taaiheid.

  1. Oogst ECT door eerst de brancard, inclusief ECT, met een tang uit de put te trekken. De brancard kan dan op de basis worden gehouden en de ECT gleed over de brancardpunten met behulp van een fijne haak of pipetpunt.
  2. Breng de ECT over op twee haken die aan de stationaire arm zijn geklemd en de transducerarm van een rheometer voor extensieve dynamische mechanische analyse (DMA) die is uitgerust met een gehard orgaanbad van 37 °C (op maat gemaakt) gevuld met PBS (figuur 7A).

Figure 7
Figuur 7: ECT destructieve trekmetingsanalyse. (A) Reologische destructieve trekmeting op een extensieve dynamische mechanische analyse (DMA) reometer. Bovenste hoogvermogenweergave: ECT na montage op L0 in een omgevingskamer en aangesloten op een boven- en onderpool voor spannings-rekanalyses. Weergave met hoog vermogen onderin: ECT gespannen met een constante snelheid van 0,03 mm/s tot het uitvalpunt bij de ultieme spanning. Schaalstaven = 5 mm. (B) Spannings-rekdiagram van een ECT met de belangrijkste gemeten parameters. De bovengrens van het elastische gebied komt overeen met het vloeipunt en het plastic gebied bestaat uit het vloeipunt en het faalpunt (ductiliteit). De helling van de lineaire fase van het elastische gebied komt overeen met de modulus van de Young die weefselstijfheid weerspiegelt. De maximale sterkte komt overeen met de maximale trekspanning die een weefsel kan weerstaan. Door vezelmicrofracturing neemt de stress af totdat het weefsel het faalpunt bereikt. Dit gebeurt bij de ultieme spanning (rekbaarheid) waarbij een plotselinge daling van de stress wordt waargenomen als gevolg van het scheuren van het weefsel. Veerkracht komt overeen met de energie (kJ/m3) die door het weefsel wordt geabsorbeerd vóór permanente vervorming (tot aan het vloeipunt) en wordt gegeven door het gebied onder de curve (AUC) tot aan de vloeipuntstam. Taaiheid komt overeen met de totale energie (kJ/m3) die het weefsel kan absorberen tot breuk en wordt door de AUC gegeven tot de uiteindelijke belasting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Stel de rheometer in om de uniaxiale spanning toe te passen met een constante lineaire snelheid van ongeveer 1 % van de initiële afstand tussen de haken per seconde. Een constante reksnelheid van 0,03 mm/s kan worden gebruikt met de typische ECT-afmetingen. Tarifeer de transducer, start de rek en noteer tot het punt van ECT-breuk.
    LET OP: Macroscopische foto's van ECT (stap 4.1.) moeten vóór trekproeven worden geregistreerd, omdat de CSA vereist is voor gegevensnormalisatie.
    OPMERKING: De spannings-spanningsanalyse, inclusief CSA-berekening, kan later in de tijd worden verwerkt bij trekproeven. Gebruik een spreadsheetsoftware en een statistische analysesoftware voor het analyseren van de gegevens.
  2. Normaliseer gemeten krachtwaarden (mN) per ECT door zijn CSA (mm2) om spanningswaarden (kPa) te verkrijgen.
  3. Zet spanningswaarden uit tegen spanning (een geometrische maat voor weefselvervorming gegeven door de relatieve afstand tussen de bovenste en onderste haak) op een XY-grafiek.
    OPMERKING: De initiële lengte van het weefsel (afstand tussen de bovenste en onderste haak) onmiddellijk voordat de rek volgt, L0, moet handmatig worden aangepast en komt overeen met het begin van het teengebied (teengebied kan afwezig zijn, afhankelijk van de weefseleigenschappen). Elke rekpuntwaarde moet worden berekend volgens de vergelijking, waarbij Ltotaal de totale kloof op elk meetpunt is:
    Equation 2
    Gebruik bij het plotten van de gegevens de spanningswaarde op geselecteerde L0 voor achtergrondaftrek.
  4. Bepaal verschillende biomechanische parameters uit de spannings-rekcurve (gebruik figuur 7B als voorbeeld).
    OPMERKING: Een spannings-rekcurve kan drie gebieden weergeven: teen-, elastische en plastic gebieden. De bovengrens van het elastische gebied, voordat het weefsel begint met microfracturing, komt overeen met het vloeipunt en de spanning ervan is een maat voor weefselelasticiteit. Het plastic gebied bevindt zich tussen het vloeipunt en het faalpunt. Het latere punt komt overeen met een plotselinge daling van de stress als gevolg van de breuk van het weefsel, waardoor de ultieme vlek wordt gedefinieerd, wat een maat is voor de uitrekbaarheid van het weefsel. Het derde meetpunt komt overeen met de maximale sterkte, die wordt gedefinieerd door de hoogste spanning die het weefsel kan dragen zonder te breken tijdens het uitrekken. De veerkracht en taaiheid, gegeven door het gebied onder de curve, komt overeen met de energie die door het weefsel wordt geabsorbeerd tot respectievelijk het vloeipunt en het faalpunt. Voor elke verkregen kromme komt de helling van het lineaire deel van het elastische gebied overeen met de Young's modulus, ook bekend als elastische modulus, en is een mechanische eigenschap die de stijfheid van het weefsel meet.
    1. Extraheer uit elke curve de XY-waarden (respectievelijk spanning en spanning) van het vloeipunt, het faalpunt en het maximale spanningspunt.
    2. Beoordeel de Young's modulus (stijfheid in kPa = mN·mm-2) van elke ECT vanaf de helling van het lineaire deel van het elastische gebied door een lineaire regressie van dat gebied uit te zetten.
    3. Gebruik een statistisch programma om het gebied onder de curve (AUC) te berekenen om zowel veerkracht als taaiheid te bepalen, tot respectievelijk het vloeipunt en het faalpunt. Bereken de AUC met behulp van de trapeziummethode. Stel de basislijn in op nul en houd alleen rekening met de pieken boven de basislijn, die ten minste 10 % bedragen van de afstand van de minimumwaarde tot de maximale waarde in de Y-as.
      OPMERKING: De moduli van veerkracht en taaiheid worden gegeven door σ × ε, waarbij σ spanning (kPa) is en ε de spanning (L/ ΔL, mm / mm). Veerkracht en taaiheid zijn dus de energie in kJ/m3 (kPa = kN·m-2 = kN·m·m-3 = kJ/m·m·m-3 = kJ/m3) die door het weefsel wordt geabsorbeerd vóór permanente vervorming en tot breuk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ECT bereikt ongeveer 95% verdichting in vergelijking met het initiële celcollageen hydrogelvolume binnen de eerste 24 uur. Weefselverdichting en contractie onder controleomstandigheden en in aanwezigheid van FCS volgt enkele uren na het gieten en neemt met name toe tot dag 5 (figuur 5A). De poolafbuiging kan verder toenemen gedurende de volgende 15 dagen (20 dagen was de langste testtijd). De grootte van de poolafbuiging hangt af van het celtype, de celtoestand en de cel- en weefselkweekomstandigheden. Meestal worden biomechanische eigenschappen gemeten op dag 5 van de cultuur, maar elk tijdstip kan worden geselecteerd. Als voorbeeld van de toepasbaarheid van het ECT-model wordt getoond hoe dit protocol kan helpen bij het bestuderen van de impact van actine cytoskelet integriteit op de weefselfunctie. ECT werden bereid in de 48-well gietplaat en behandeld met de actinepolymerisatieremmer Latrunculin A (Lat-A, 7 ng / ml). De behandeling verminderde de ECT-verdichting zoals aangegeven door de significante toename van 1,7-voudig in CSA in vergelijking met controle (figuur 8A,B). Bovendien werd de samentrekking van de weefsels beoordeeld tijdens de 5 dagen van de kweek. Bij afwezigheid van het medicijn nam de contractie geleidelijk toe tot dag 5 en bereikte ~ 40% contractie. Lat-A beïnvloedde weefselcontractie, wat resulteerde in slechts ~20% maximale contractie (figuur 8A,C). Destructieve unidirectionele stress-spanningstests werden uitgevoerd op dag 5. Uit een typische spannings-rekcurve zoals die voor ECT (figuur 7B) wordt verkregen, kunnen verschillende biomechanische parameters worden geëxtraheerd. Voorbeeldig is aangetoond dat remming van actinepolymerisatie leidde tot een significante vermindering van ~50% in weefselstijfheid ten opzichte van de controle (figuur 8D). Alles bij elkaar laten de voorbeeldgegevens zien dat de actinecytoskeletale integriteit essentieel is voor ECT-verdichting, contractie en verstijving.

Figure 8
Figuur 8: Remming van de actinepolymerisatie beïnvloedt ECT-verdichting, contractie en stijfheid. ECT gegenereerd met menselijke CF en collageen type I werden gedurende 5 dagen gekweekt rond twee flexibele polen in de aan- of afwezigheid van 7 ng / ml Latrunculin-A (Lat-A). (A) Representatieve beelden van de controle en behandelde ECT die na 5 dagen in flexibele palen zijn geplaatst, worden getoond. Schaalbalk = 2 mm. (B) Dwarsdoorsnedes (CSA) werden berekend op basis van macroscopische beelden (n = 22). (C) De poolafbuiging werd berekend over een periode van 5 dagen. Waarden worden gegeven als middel±SEM (n = 22). Significante veranderingen werden beoordeeld door 2-weg ANOVA met Dunnett's (*p<0.05 vs. Control) post hoc tests voor meerdere vergelijkingen. (D) Weefsels werden onderworpen aan reologische destructieve trekmetingen en de Moduli van de Young werden opgehaald uit de stress-stamanalyses (n = 16). (B en D) In de vakken wordt het onderste en bovenste kwartiel aangegeven. Horizontale lijn in elk vak vertegenwoordigt respectievelijk de mediane CSA en stijfheid. De middelen voor elke groep worden aangegeven met een +. Verticale lijnen die zich uitstrekken van elk vak vertegenwoordigen de gemeten minimum- en maximumwaarden. Significante veranderingen in B en D werden beoordeeld door middel van ongepaarde, tweezijdige Student's t-test (*p<0.05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gepresenteerde protocol beschrijft de generatie van ECT uit primaire menselijke CF, die het mogelijk maakt om de mechanische impact van deze cellen op hun extracellulaire matrixomgeving te bestuderen en vice versa.

De fibroblasten moeten worden uitgebreid om voldoende cellen op te leveren voor de geplande ECT-experimenten (0,75 x 106 cellen/ECT). Voor de beste reproduceerbaarheid wordt geadviseerd om bevroren of weefsel-afgeleide fibroblasten voor te kweken in 2D monolaagcultuur voor een gestandaardiseerde duur tot 80% confluentie binnen elke passage en voorafgaand aan hun gebruik bij ECT-generatie (Protocol stap 3). Voor het kweken van primaire menselijke CF-monolagen en -afgeleide ECT in het bijzonder, wordt geadviseerd om commercieel medium en supplementen te gebruiken die geschikt zijn voor CF (zie Tabel met materialen). Medium suppletie met serum is van cruciaal belang om de uitbreiding van CF in standaard 2D-culturen te garanderen. Het gebruik van serumvrije of lage serumcondities in 3D-culturen, inclusief ECT-generatie en verdere kweek, kan worden overwogen, afhankelijk van het geselecteerde fibroblasttype. Bij het gebruik van CF voor ECT-generatie wordt echter geadviseerd om ten minste serum in de giethydrogel op te nemen voor een goede initiële weefselverdichting.

Een beperking in de procedure is geassocieerd met CF-expansie in 2D-cultuur die nodig is voor ECT-generatie, wat meestal leidt tot een omzetting van fibroblasten in myofibroblasten (aangegeven door verbeterde SMA en bijbehorende stressvezelvorming4). Vanwege hun continue transdifferentiatie, bedenk dat fibroblasten in verschillende passages verschillende resultaten kunnen geven wanneer ze worden gebruikt om ECT te genereren. In het ECT-model moeten twee processen worden gediscrimineerd. Na suspensie in een collageenhydrogel en ECT-formatie passen cellen zich aan hun 3D-omgeving aan en kan het myofibroblastfenotype ten minste gedeeltelijk worden omgekeerd. In de volgende kweekfase kunnen de cellen dan mogelijk opnieuw een schakelaar ondergaan in de tegenovergestelde fenotypische richting, vooral door het gebruik van polen met toenemende stijfheid of door de toevoeging van pro-fibrotische factoren (zoals TGF-β1). De mogelijkheid om de dynamische fenotypische aanpassing af te stemmen creëert de mogelijkheid om de onderliggende en biomechanisch gestuurde moleculaire mechanismen te ontleden. Dergelijke studies kunnen uiteindelijk de modellering van fibrotische aandoeningen en de identificatie van farmacologische of gentherapie-interventies gericht op orgaanfibrose mogelijk maken. Het gebruik van fibroblasten van verschillende oorsprong kan verder het onderzoek naar processen die ten grondslag liggen aan weefselspecifieke fibrose mogelijk maken. Toepassing van fibroblasten of andere stromale cellen, niet alleen van verschillende oorsprong, maar ook van verschillende soorten, maakt het mogelijk om soortenoverschrijdende studies uit te voeren naar mechanismen die ten grondslag liggen aan fibrose of cel-matrixinteracties. Niettemin moet worden opgemerkt dat door het gebruik van primaire cellen van mensen, rekening moet worden gehouden met de interindividuele verschillen tussen de cellen. Een falen in weefselcontractie (zie ook hieronder) is niet noodzakelijkerwijs een oorzaak van een experimentele fout, maar kan het gevolg zijn van de intrinsieke contractiele eigenschappen van de individuele cellijn. Daarom wordt altijd de voorkeur gegeven aan het gebruik van cellen van verschillende donoren om de discriminatie van algemene mechanismen en donorafhankelijke verschillen mogelijk te maken. Net als bij de variabiliteit van de verkregen resultaten, die kunnen voortvloeien uit de individuele biologie van de cel, is het belangrijk om te vermelden dat al het biologische materiaal significante variabiliteit kan vertonen. Daarom wordt parallel testen van het materiaal van verschillende partijen aanbevolen, ten minste wanneer het nodig is om de partij te veranderen.

Bovendien vertonen weefsels die op de poolparen zijn gekweekt "arm" en "pool" -regio's die structureel en biomechanisch ongelijk zijn. Het moet nog worden bepaald hoeveel het poolgebied bijdraagt aan rekexperimenten.

Het weefselpreparatieproces moet grondig snel zijn om te voorkomen dat het bij kamertemperatuur wordt gesuikerd. Celcollageen hydrogel gelation wordt voornamelijk aangedreven door collageen zelfassemblage, en grotendeels celonafhankelijk29. Het is de eerste stap tijdens weefselvorming en het moet gebeuren tijdens de eerste 15-30 minuten eenmaal geplaatst in een kweekincubator. Collageenfibrapologenese en gelation worden beïnvloed door bijvoorbeeld hydroxylering van prolines en lysines, en sterk afhankelijk van collageentype, ionische sterkte, pH en temperatuur, wat de vezelbundeling en poriegrootte van het collageennetwerk beïnvloedt42. Dat zou uiteindelijk de celcomponent en vervolgens de structuur en mechanische eigenschappen van de weefsels kunnen beïnvloeden. Bij het kiezen van collageenbronnen en de chemische samenstelling van natuurlijk afgeleid collageen, is het belangrijk om een betrouwbare collageenoplossing van hoge kwaliteit voor weefselmanipulatie te identificeren. Het gebruik van commercieel zuur-opgelost rundertype I collageen wordt aanbevolen bij een geschatte voorraadconcentratie van 6-7 mg / ml. Niettemin kunnen andere collageenoplossingen met een concentratie van ≥ 4 mg / ml hier ook compatibel mee zijn. Verschillende andere factoren zoals zuiverheid, moleculaire integriteit, oplosmiddel en houdbaarheid kunnen de incubatietijd beïnvloeden die nodig is voor reconstitutie (stolling) van het ECT-hydrogelmengsel, dat in geen geval langer mag zijn dan 1 uur om celbezinking te voorkomen. Bewaar en hanteer collageenhoudende oplossingen bij 4 ± 2 °C voor een optimaal resultaat. Collageenintegriteit kan worden verstoord als het wordt ingevroren of bij kamertemperatuur wordt gehanteerd en bijgevolg fibrillogenese en hydrogelgelation voorkomen. Na pH-neutralisatie en celreconstitutie in de collageenhydrogel moet het pipetteren tijdens het gieten zacht zijn, omdat sterke schuifkrachten de integriteit van de collageenstructuur en matrixassemblage kunnen beïnvloeden. Variabiliteit tussen partijen collageen of verschillende leveranciers kan van invloed zijn op ect-vorming. Het is raadzaam om collageenhydrogel te testen om ideale condensatie-eigenschappen vast te stellen voor gebruik in ECT-preparaat. Bovendien, om een geschikte pH-neutralisatie te garanderen, moet het NaOH-volume voor elke afzonderlijke collageenbatch worden getitreerd. Over het algemeen worden aanvullende kwaliteitscontroles aanbevolen, bijvoorbeeld SDS-PAGE-analyse voor het onderzoeken van collageenintegriteit en -concentratie en schuifreologie om de viskeuze eigenschappen van de collageenoplossing te bepalen.

Na de beginfase van hydrogel-stolling door collageenzelfassemblage drijft de celcomponent de matrixverdichting verder aan. Als ECT niet zichtbaar compact wordt binnen 24 uur na het gieten, kan dit verband houden met de levensvatbaarheid van de cel. Een minimale levensvatbaarheid van 80 % van de cellen wordt aanbevolen. Zorg voor een goede levensvatbaarheid van de cel na enzymatische loslating van inputcellen om de juiste weefselverdichting en functionaliteit te verkrijgen. In dit protocol wordt ECT gegenereerd met 0,75 × 106 cellen in een eindvolume van 180 μL per weefsel, maar verschillende celnummers kunnen nodig zijn, afhankelijk van de bron van cellen (bijv. CF-donor, leveranciers). Daarom wordt aanbevolen om in het begin een celtitratie-experiment uit te voeren. Doorgaans kan een reeks cellen van 150.000 tot 750.000 worden getest op optimale vorming en verdichting van de weefsels. Over het algemeen gebruikt dit protocol 0,3 mg collageen per ECT, wat overeenkomt met 1,67 mg / ml collageen in een eindvolume van 180 μL. Pas indien nodig de verhouding tussen celnummer en collageenconcentratie aan (collageenconcentratie van 0,14 tot 0,4 mg per weefsel kan worden getest). Zorg bovendien voor een correcte neutralisatie van azijnzuur-opgelost collageen tijdens hydrogelbereiding, omdat onvoldoende pH schadelijk kan zijn voor de levensvatbaarheid van cellen.

Zoals weergegeven in figuur 3 (onderste paneel), mag ECT zich niet uniform vormen. Na celreconstructie in het pH-geneutraliseerde collageenhydrogelmengsel volgt het gelationproces zelfs bij 4 °C en wordt het versneld bij kamertemperatuur (eenmaal in de mal gegoten). Zorg ervoor dat de gietprocedure binnen 15-20 minuten is voltooid. Voortijdige gelation zal een goede pipettering van het mengsel belemmeren vanwege de verhoogde viscositeit. Bij het gieten van de viskeuze celcollageenhydrogel, pipetttlaat voorvochtig met hydrogel of gebruik een pipetpunt met lage retentie en volg dezelfde tip om meerdere ECT te gieten. Deze praktijk vermindert de variatie in hydrogelvolume en de vorming van bellen tijdens het uitblazen (figuur 3D). Zorg ervoor dat u de lus in de mal voltooit om een ringvormige ECT te vormen (figuur 3A-B). Zorg er bovendien voor dat de suspensie van de invoercel homogeen is en vrij van aggregaten in alle stadia van het gieten. Meng regelmatig het celcollageenwaterstofmengsel door de buis te draaien tijdens het uitvoeren van de gietprocedure in de 48-well gietplaat. Ten slotte moet de gelation tijdens incubatie bij 37 °C maximaal binnen 15-30 minuten plaatsvinden. Als dit proces langer duurt, neemt de kans op celbezinking toe, waardoor ongelijk bevolkte weefsels ontstaan.

Bovendien kunnen ongelijk bevolkte weefsels en ongelijke verdeling van de celcollageenhydrogel in de mallen leiden tot een onregelmatige morfologie van de ECT, en ECT kan niet uniform samentrekken in de 48-well gietplaat. De ECT-positie op de flexibele polen kan ook de contractieniveaus beïnvloeden en bijdragen aan een soortgelijk fenomeen. Als de vormende ECT van de bodem loskomt terwijl het kweekmedium wordt toegevoegd, kan het drijven en zal het met een gedefinieerde buigkracht boven het verankeringspunt van de palen verdichten (figuur 4). Dit kan leiden tot een overschatte poolafbuiging en variabiliteit tussen weefsels/experimenten induceren. Om dit te voorkomen, moet de hydrogel zorgvuldig via de putwand met het kweekmedium worden bedekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

GLS en SL stelden het manuscript op. Alle auteurs droegen bij aan de protocolontwikkeling en redigeerden het manuscript. TM, MT en WHZ zijn wetenschappelijke adviseurs van myriamed GmbH. WHZ is de oprichter en aandeelhouder van myriamed GmbH.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de German Cardiac Society (DGK Research Fellowship for GLS) en door de German Research Foundation (DFG via het project IRTG 1816 voor GLS en AD; DFG 417880571 en DFG TI 956/1-1 voor MT; SFB 1002 TP C04 voor MT en WHZ; SFB 1002 TP S01 voor WHZ; en EXC 2067/1-390729940J voor WHZ). WHZ wordt ondersteund door het Duitse federale ministerie van Wetenschap en Onderwijs (BMBF via het project IndiHEART) en de Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ en SL worden ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents:
Accutase Solution Merk Millipore SCR005
Dissociation reagent – TrypLE Express Gibco 12604013
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose Gibco 12100061
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ Gibco 14190144
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3132
FBM Fibroblast Growth Basal Medium Lonza CC-3131
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors Lonza CC-4126
Fibroblast Growth Medium 3 KIT PromoCell C-23130
Fibroblast Basal Medium 3 PromoCell C-23230
Growth Medium 3 SupplementPack PromoCell C-39350
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) Gibco 15140122
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N Sigma-Aldrich S2770-100ML
Cell sources:
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) Lonza CC-2904
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) PromoCell C-12375
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) PromoCell C-12377
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) ATCC SCRC- 1041
Collagen sourses:
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl LLC Collagen Solutions FS22024 6-7 mg/mL
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl Corning 354236 ~4 mg/mL
Drugs:
Latrunculin-A (Lat-A) Enzo Life Sciences BML-T119-0100
Plastic ware:
Cell culture plastic ware Sarstedt and Starlab
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) Falcon 352340
myrPlate-uniform myriamed GmbH TM5 med
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) Corning 07-200-619
Specific instruments:
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors OptoEngineering TCCR12096
Area scan camera Basler ace acA4024 Basler 107404

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
  2. Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (16), 7540-7545 (2011).
  3. Elson, E. L., Genin, G. M. Tissue constructs: platforms for basic research and drug discovery. Interface Focus. 6 (1), 20150095 (2016).
  4. Cho, N., Razipour, S. E., McCain, M. L. TGF-beta1 dominates extracellular matrix rigidity for inducing differentiation of human cardiac fibroblasts to myofibroblasts. Experimental Biology and Medicine. 243 (7), Maywood. 601-612 (2018).
  5. Cucoranu, I., et al. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circulation Research. 97 (9), 900-907 (2005).
  6. Peng, H., Carretero, O. A., Peterson, E. L., Rhaleb, N. E. Ac-SDKP inhibits transforming growth factor-beta1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), 1357-1364 (2010).
  7. Ribeiro, A. J., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  8. Tranquillo, R. T., Durrani, M. A., Moon, A. G. Tissue engineering science: consequences of cell traction force. Cytotechnology. 10 (3), 225-250 (1992).
  9. Barocas, V. H., Moon, A. G., Tranquillo, R. T. The fibroblast-populated collagen microsphere assay of cell traction force--Part 2: Measurement of the cell traction parameter. Journal of Biomechanical Engineering. 117 (2), 161-170 (1995).
  10. Lijnen, P., Petrov, V., Rumilla, K., Fagard, R. Stimulation of collagen gel contraction by angiotensin II and III in cardiac fibroblasts. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 3 (3), 160-166 (2002).
  11. Baxter, S. C., Morales, M. O., Goldsmith, E. C. Adaptive changes in cardiac fibroblast morphology and collagen organization as a result of mechanical environment. Cell Biochemistry and Biophysics. 51 (1), 33-44 (2008).
  12. Zhou, Y., et al. Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1096-1108 (2013).
  13. Lijnen, P., Petrov, V., Fagard, R. In vitro assay of collagen gel contraction by cardiac fibroblasts in serum-free conditions. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 23 (7), 377-382 (2001).
  14. Burgess, M. L., et al. Integrin-mediated collagen gel contraction by cardiac fibroblasts. Effects of angiotensin II. Circulation Research. 74 (2), 291-298 (1994).
  15. Nunohiro, T., Ashizawa, N., Graf, K., Hsueh, W. A., Yano, K. Angiotensin II promotes integrin-mediated collagen gel contraction by adult rat cardiac fibroblasts. Japanese Heart Journal. 40 (4), 461-469 (1999).
  16. Ngu, J. M., et al. Human cardiac fibroblast extracellular matrix remodeling: Dual effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Cardiovascular Pathology. 23 (6), 335-343 (2014).
  17. Knezevic, V., Sim, A. J., Borg, T. K., Holmes, J. W. Isotonic biaxial loading of fibroblast-populated collagen gels: a versatile, low-cost system for the study of mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 1 (1), 59-67 (2002).
  18. Delvoye, P., Wiliquet, P., Leveque, J. L., Nusgens, B. V., Lapiere, C. M. Measurement of mechanical forces generated by skin fibroblasts embedded in a three-dimensional collagen gel. Journal of Investigative Dermatology. 97 (5), 898-902 (1991).
  19. Kolodney, M. S., Elson, E. L. Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (32), 23850-23855 (1993).
  20. Bell, B. J., Nauman, E., Voytik-Harbin, S. L. Multiscale strain analysis of tissue equivalents using a custom-designed biaxial testing device. Biophysical Journal. 102 (6), 1303-1312 (2012).
  21. Wakatsuki, T., Kolodney, M. S., Zahalak, G. I., Elson, E. L. Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophysical Journal. 79 (5), 2353-2368 (2000).
  22. Thomopoulos, S., et al. Fibrocartilage tissue engineering: The role of the stress environment on cell morphology and matrix expression. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 1039-1053 (2011).
  23. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (2), 214-222 (2002).
  24. Ongherth, A., et al. p63RhoGEF regulates auto- and paracrine signaling in cardiac fibroblasts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 88, 39-54 (2015).
  25. Vettel, C., et al. PDE2-mediated cAMP hydrolysis accelerates cardiac fibroblast to myofibroblast conversion and is antagonized by exogenous activation of cGMP signaling pathways. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (8), 1246-1252 (2014).
  26. Jatho, A., et al. RhoA Ambivalently Controls Prominent Myofibroblast Characteritics by Involving Distinct Signaling Routes. PLoS One. 10 (10), 0137519 (2015).
  27. Dworatzek, E., et al. Sex-specific regulation of collagen I and III expression by 17beta-Estradiol in cardiac fibroblasts: role of estrogen receptors. Cardiovascular Research. 115 (2), 315-327 (2019).
  28. Tiburcy, M., Meyer, T., Soong, P. L., Zimmermann, W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods in Molecular Biology. 1181, 167-176 (2014).
  29. Schlick, S. F., et al. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 51-60 (2019).
  30. Wille, J. J., Elson, E. L., Okamoto, R. J. Cellular and matrix mechanics of bioartificial tissues during continuous cyclic stretch. Annals of Biomedical Engineering. 34 (11), 1678-1690 (2006).
  31. Berry, C. C., Shelton, J. C., Bader, D. L., Lee, D. A. Influence of external uniaxial cyclic strain on oriented fibroblast-seeded collagen gels. Tissue Engineering. 9 (4), 613-624 (2003).
  32. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Developmental Biology. 90 (2), 383-398 (1982).
  33. Bellows, C. G., Melcher, A. H., Aubin, J. E. Association between tension and orientation of periodontal ligament fibroblasts and exogenous collagen fibres in collagen gels in vitro. Journal of Cell Science. 58 (1), 125-138 (1982).
  34. Tranquillo, R. T. Self-organization of tissue-equivalents: the nature and role of contact guidance. Biochemical Society Symposia. 65, 27-42 (1999).
  35. Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of Biomechanical Engineering. 119 (2), 137-145 (1997).
  36. Yip, A. K., et al. Anisotropic traction stresses and focal adhesion polarization mediates topography-induced cell elongation. Biomaterials. 181, 103-112 (2018).
  37. Santos, G. L., Hartmann, S., Zimmermann, W. H., Ridley, A., Lutz, S. Inhibition of Rho-associated kinases suppresses cardiac myofibroblast function in engineered connective and heart muscle tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 134, 13-28 (2019).
  38. Kittana, N., et al. Modulating the biomechanical properties of engineered connective tissues by chitosan-coated multiwall carbon nanotubes. International Journal of Nanomedicine. 16, 989-1000 (2021).
  39. Kittana, N., et al. Enhancement of wound healing by single-wall/multi-wall carbon nanotubes complexed with chitosan. International Journal of Nanomedicine. 13, 7195-7206 (2018).
  40. Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
  41. Holder, A. J., et al. Control of collagen gel mechanical properties through manipulation of gelation conditions near the sol-gel transition. Soft Matter. 14 (4), 574-580 (2018).
  42. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).

Tags

Bio-engineering tissue engineering cardiale fibroblast collageenmatrix weefselstijfheid screening
Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santos, G. L., Meyer, T., Tiburcy,More

Santos, G. L., Meyer, T., Tiburcy, M., DeGrave, A., Zimmermann, W. H., Lutz, S. Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications. J. Vis. Exp. (174), e62700, doi:10.3791/62700 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter