Summary
Presentert her er en protokoll for å generere konstruert bindevev for en parallell kultur på 48 vev i en multi-brønn plate med doble poler, egnet for mekanistiske studier, sykdomsmodellering og screening applikasjoner. Protokollen er kompatibel med fibroblaster fra forskjellige organer og arter og eksemplifiseres her med humane primære hjertefibroblaster.
Abstract
Fibroblaster er fenotypisk svært dynamiske celler, som raskt transdifferenterer til myofibroblaster som svar på biokjemiske og biomekaniske stimuli. Den nåværende forståelsen av fibrotiske prosesser, inkludert hjertefibrose, forblir dårlig, noe som hemmer utviklingen av nye antifibrotiske terapier. Kontrollerbare og pålitelige menneskelige modellsystemer er avgjørende for en bedre forståelse av fibrosepatologi. Dette er en svært reproduserbar og skalerbar protokoll for å generere konstruert bindevev (ECT) i en 48-brønns støpeplate for å lette studier av fibroblaster og patofysiologien til fibrotisk vev i et 3-dimensjonalt (3D) miljø. ECT genereres rundt polene med justerbar stivhet, noe som muliggjør studier under en definert biomekanisk belastning. Under de definerte lasteforholdene kan fenotypiske tilpasninger kontrollert av cellematriseinteraksjoner studeres. Parallell testing er mulig i 48-brønnsformatet med mulighet for tidsforløpanalyse av flere parametere, for eksempel vevskomprimering og sammentrekning mot lasten. Fra disse parametrene kan biomekaniske egenskaper som vevstivhet og elastisitet studeres.
Introduction
Et stort hinder i studiet av fibrotiske sykdommer er mangelen på representative menneskelige 3D-vevsmodeller som gir innsikt i oppførselen til fibroblaster og deres patologiske derivater. For å studere fibrotiske prosesser er standard 2D-kultursystemer suboptimale siden isolerte fibroblaster transdifferentiate raskt til α-glatt muskel actin (SMA)-uttrykke myofibroblaster når dyrket på ikke-kompatible 2D-substrater1,2,3. Dermed gjenspeiler fibroblaster i standard 2D-kultur ikke en vanlig "sunn" vevsfenotype3,4,5,6. Kulturer på bøyelige substrater har blitt introdusert for å simulere ikke-fibrotiske (10 kPa) og fibrotiske (35 kPa) vevsmiljøer7, men disse mangler den tredje dimensjonen, noe som er svært viktig med hensyn til patofysiologi. Vevsteknikk gir muligheten til å overvinne denne begrensningen ved å tillate fibroblastkultur i en definert og eksperimentelt justerbar ekstracellulær matrise (ECM)-kontekst, for eksempel ved endringer i cellulæriteten, ECM-sammensetningen og ECM-konsentrasjonen, som alle kan bestemme vevbiomekanikken.
Ulike 3D-modeller har blitt generert ved hjelp av fibroblaster. Flytende plater og mikrosfærer var blant de første og viser at kollagen er ombygd og komprimert på en tidsavhengig måte. Fibroblaster utøver trekkraft krefter på kollagen fibrils, en prosess som kan lettes ved tilsetning av pro-fibrotiske midler som transformering vekstfaktor-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Fritt flytende kulturer tillater imidlertid ikke kontrollert ekstern lasting og utgjør derfor kontinuerlig krympende eller komprimerende modeller. Arklignende konstruert vev åpnet muligheten for å studere homeostatisk regulering av biomekaniske egenskaper av vev, nemlig gjennom uni, bi, multiaxial eller syklisk belastningstesting17,18,19,20. Disse modellene har blitt brukt, for eksempel for å demonstrere påvirkning av cellenummeret på vevsstivheten, som ble funnet å korrelere positivt med cytoskjelettintegritet og actomyosin cytoskeleton-kontraktilitet.18,19. Det er imidlertid viktig å merke seg at kraft-til-belastning-konverteringer er komplisert av den ikke-ensartede vevsdeformasjonen rundt klemmepunkter av krafttransdusere og ankerpunkter. Denne iboende begrensningen kan omgås av hundeben eller ringformet vev, noe som gir litt vevshåndhevelse ved ankerpunkter21,22,23. Ringformet vev kan tilberedes ved å distribuere en celle-kollagen hydrogel i ringformede former. Når hydrogelen komprimeres, dannes et vev rundt den ukomprimerbare indre stangen i formen, noe som gir motstand for ytterligere vevskontraksjon.24,25,26,27. Etter innledende og typisk maksimal komprimering kan vev også overføres til justerbare avstandsstykker for ytterligere å begrense sirkulær ECT ved en definert vevslengde3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysiske egenskaper kan vurderes i standard horisontale eller vertikale belastningsspenningsenheter med passende veieceller under enveis eller dynamisk stamme3. Siden vevet i stor grad har en jevn sirkulær struktur og kan holdes på stenger/kroker (forankringspunkter og/eller krafttransdusere), selv om disse fortsatt kan omslutte kompresjonsområder rundt lastestengene, gir dette formatet en mer jevn belastningsvariasjon sammenlignet med klemming.3. Videre fremkaller forankret vev en bipolar celleform, og cellene tilpasser seg vevskreftene ved forlengelse langs kraftlinjer som fremmer anisotrop trekkraft.31,32,33,34,35,36. Vi har tidligere brukt ringformet ECT fra rotte og humane hjertefibroblaster (CF) rundt en enkelt stiv pol i funksjonelle stressstammeforsøk og utført gevinst og tap av funksjonsstudier ved å bruke viralt transduced fibroblaster24,25,26 farmakologiske studier37. Videre kunne vi identifisere kjønnsforskjeller i CF-mediert fibrose i ECT-modellen27.
Følgende protokoll for generering av menneskelig ECT, eksemplifisert med primær menneskelig CF oppnådd som kryopreservert CF fra kommersielle leverandører (se Tabell over materialer), kombinerer fordelene med ringformet vev med en enkel og rask måte å produsere makroskopisk vev for en 48-brønns plattform designet for parallell testing av høyt innhold.
Det er viktig at ECT-modellen ikke er begrenset til en bestemt fibroblasttype, med dokumentert bruk i utredning av andre fibroblaster, for eksempel hudfibroblaster38,39. Videre fungerer fibroblaster fra pasientens biopsier like bra, og valget av fibroblaster avhenger til slutt av det vitenskapelige spørsmålet som skal tas opp.
Plattformen som brukes til generering av ECT beskrevet i denne protokollen er en kommersielt tilgjengelig 48-brønns 3D-celle/ vevskulturplate (figur 1A). Metodene for fremstilling, dyrking og overvåking av ECT-dannelse og funksjon under en definert geometri og mekanisk belastning ved hjelp av 48-brønnsplaten er beskrevet. Den dannede ECT holdes av integrerte fleksible poler, og den mekaniske belastningen kan finjusteres i henhold til det endelige formålet ved å bruke poler med forskjellig hardhet (Shore A-verdi 36-89), som påvirker bøyestivhetene. Poler med en landVerdi på 46 anbefales. Protokollen er i tillegg kompatibel med en tidligere beskrevet tilpasset sirkulær form, hvor ECT holdes rundt en enkelt stiv stang37. Dimensjonene til denne formen er gitt i figur 1B.
Figur 1: Skjematisk representasjon av støpeformer. (A) Teknisk tegning og dimensjoner av en støpeform med to fleksible poler. Formen består av en indre omkrets avgrenset av en kort vegg som holder doble holdestenger på formens hoveddel. De fleksible polene har fri horisontal avstand til hverandre og er koblet til basen. Formen gir mulighet for 180 μL støpevolum. Brønnen til hver form tillater en volumkapasitet på minst 600 μL kulturmedier. Ulike materialsammensetninger kan brukes til å produsere poler med spesifikke stivheter (f.eks. TM5MED-TM9MED). (B) Teknisk tegning og dimensjoner av en ringformet form med en enkelt stiv stang. Dette er en alternativ form med distinkt geometri og mekanisk miljø, som kan brukes med ECT støpeprotokoll37. Den ringformede muggmonteringsmetoden ble tilpasset fra publiserte større formater28,41. Kort sagt inkluderer metoden (1) avtrykk av polytetrafluoretylen (PTFE) støpeavstandsstykker (8 mm diameter) i polydimetylsiloksan (PDMS, silikon) helles i glassretter (diameter 60 mm), og (2) fester en PDMS-stangholder (1,5 mm diameter) konsentrisk innsiden av det dannede hule hulrommet, som tjener til å (3) holde en avtagbar pol (4 mm diameter silikonrør). Den hule plass resulterende tillater 180 μL av støpevolum. Hver glassfat kan komportere flere trykte former (eksemplarisk vist med 5 former) og har kapasitet til opptil 5 ml kulturmedium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trinn må utføres i en klasse II biosikkerhets hetter installert i laboratorier under inneslutningsnivå 1. Avhengig av lokale forskrifter og type manipulasjoner som skal utføres, for eksempel viralmediert genoverføring, må inneslutningsnivået økes til biosikkerhetsnivå 2 eller 3. Alle kulturer opprettholdes ved 37 °C i en cellekulturinkubator med en fuktet atmosfære på 5 % CO2 i luften. Vær oppmerksom på at volumene (trinn 1 og 2) er gitt for en T75 cellekulturflaske. Juster volumene til forskjellige kulturformater i henhold til standard anbefalinger for cellekultur.
1. Tining og pre-plating primær hjertefibroblast (CF) for monolayerkultur (5-12 dager)
MERK: Som et alternativ kan HFF-1-celler brukes etter standard underkulturprotokoll som anbefalt av leverandøren.
- Forbered fibroblastvekstmediet (FGM) i henhold til produsentens instruksjoner. Legg eventuelt til antibiotika som 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin. La hele blandingen av alle komponentene bli fullstendig blandet før bruk. Oppbevars ved 4 °C i opptil 14 dager.
- Varm FGM til 20-25 °C.
- Tine kryopreserverte CF (helst inneholder 1 x 106 til 2 x 106 /ml celler per kryotale) i et vannbad ved 37 °C i ca. 2 minutter, til bare en liten mengde is er igjen i hetteglasset.
- Bruk en 2 ml serologisk pipette, overfør cellefjæringen dråpevis til et passende sterilt sentrifugerør som inneholder 10 ml FGM. For optimal celleuthenting, skyll kryonalen med 1 ml FGM og overfør den til sentrifugerøret. Siden cellene er svært følsomme på dette stadiet, resuspend ved hjelp av en serologisk pipette med en borespiss for å minimere celleskader ved skjærstress.
MERK: Hvis kryopreserveringsmediet inneholder en høy prosentandel DMSO, må du kontrollere at DMSO-innholdet er mindre enn 1 %etter cellerepensering i FGM. Alternativt kan du sentrifugere de resuspenderte cellene ved 300 x g i 5 minutter ved 20-25 °C for middels utveksling. Deretter aspirerer du supernatanten forsiktig, virvler røret for å løsne pelletedcellene, og resuspenderer dem i ønsket volum av FGM for såing. - Frø 0,5 x 106 celler i 12 ml FGM i en T75 cellekulturflaske. Hvis det brukes annet labware, justerer du cellenummeret for å opprettholde en såddtetthet på 6,7 x 103/cm2.
- Erstatt FGM annenhver dag i 5 dager eller til cellene når 80 % samløp.
MERK: Celleutbyttet etter utvidelsen avhenger hovedsakelig av cellestørrelsen og spredningsraten, som kan variere mellom celledonorer. Vanligvis tillater denne standardkulturprosedyren gjenfinning av 4 x 106 til 5 x 106 CF fra en T75 cellekulturflaske etter 5 dager med kultur.
2. Enzymatisk spredning av human CF (10-20 min)
MERK: Dette trinnet tar sikte på å etablere en enkelt celle suspensjon av menneskelig CF for både sub-culturing monolayer celler og forberedelse av ECT. Denne protokollen er optimalisert for humane CF monolayer kulturer i passasjer 3-4. For optimal standardisering anbefales sub-culturing CF i monolayer, minst en gang før ECT-forberedelse. Denne protokollen må optimaliseres for fibroblaster som stammer fra forskjellige givere og leverandører. Alternative avløsningsprotokoller kan innebære å erstatte rekombinante serinske proteasebaserte dissosiasjonsreagenser med for eksempel de som inneholder proteolytiske og collagenolytiske enzymer.
- Varm FGM, PBS (Ca2+/Mg2+-fri) og celledissosiasjonsreagens til 20-25 °C.
- Aspirer mediet fra de dyrkede cellene.
- Vask celler med 6 ml PBS og aspirer.
- Tilsett 6 ml av celledissosiasjonsreagenset til cellene og inkuber i 3 min ved 20-25 °C til cellene begynner å løsne synlig.
MERK: Avhengig av CF-kilden kan dette ta flere minutter lenger tid. Alternativt, hvis celler ikke løsner ved romtemperatur, inkuber ved 37 °C for å forbedre enzymers aktivitet. For å sikre optimal celle levedyktighet, overvåk celleavløsning under mikroskopet. - Nøytraliser enzymatisk aktivitet ved å legge til 6-12 ml FGM til de løsnede cellene i celledissosiasjonsreagensen. Pipette forsiktig opp og ned 4-8 ganger ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette for å sikre en enkelt celleoppheng og overføre celler til et friskt 50 ml oppsamlingsrør. Kontroller utbyttet ved hjelp av et mikroskop og et hemocytometer eller en automatisert celleteller i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 300 x g i 5 minutter ved 20-25 °C.
MERK: For å nå et utbytte av celler som er tilstrekkelig for generering av ønsket mengde ECT, kan celler underkultureres i en opptil 1:6 fortynning for videre ekspansjon. La cellene vokse til 80 % samløp er nådd (ca. 5-6 dager), med middels endring annenhver dag. Gjenta deretter den enzymatiske dispersjonen og fortsett med trinn 2.7. for å fortsette med ECT-forberedelse. - Aspirer supernatanten og flikk røret for å løsne pelletsen. Resuspend cellene i FGM ved 20-25 °C for å oppnå en celle suspensjon på ≥ 15 x 106/ml (ca. 40 % flere celler enn nødvendig for trinn 3.3.). Dette står for celletapet på grunn av anstrengelse i følgende trinn.
- Sil celleopphenget gjennom en 40 μm nettingcellesil.
FORSIKTIG: Celleagglomerater er skadelige for optimal dannelse av ECT. Ved bruk av enzymatisk dispersjon av menneskelig CF-protokoll for direkte støping av ECT, sikrer anstrengelse av cellefjæringen fraværet av store celleklumper som forstyrrer homogen vevsdannelse. Heterogeniteter vil kompromittere pålitelige stressbelastningsanalyser. - Tell cellenummer og vurder celle levedyktighet for å sikre et pålitelig cellenummer i en suspensjon med ≥80 % levedyktighet til å fortsette med ECT-forberedelse.
- Bruk en automatisert celleteller til å vurdere cellenummer og levedyktighet ved elektrisk strømekskludering.
- Alternativt kan du bruke trypanblå (kreftfremkallende, farekategori 2 - ta forholdsregler) fargeeksklusjonstest, ved hjelp av et mikroskop og et hemocytometer for direkte identifisering og opplisting av levende (intakte cellemembraner som utelukker fargestoffet) og døde (kompromitterte cellemembraner som tillater binding av fargestoffet til intracellulære proteiner) celler.
- Reserver oppsamlingsrøret med cellefjæring ved 20-25 °C og fortsett umiddelbart med trinn 3.
3. ECT-tilberedning (1 t)
MERK: Skjematisk oversikt over ECT-generering er beskrevet i figur 2.
Figur 2: Skjematisk oversikt over ECT-generering. Fibroblaster utvides i 2D-kultur før bruk i ECT-generasjonen. Etter 5-10 dager spres celler enzymatisk og celleoppheng rekonstitueres i en bufret blanding som inneholder bovin kollagen type 1. Celle-kollagen hydrogelblandingen pipetteres inn i individuelle brønner i en 48-brønnsplate for 3D-konstruert vevskultur, designet som støpeformer med to fleksible poler for å muliggjøre ECT-suspensjon i en definert lengde og belastning. ECT dyrkes vanligvis i 1 til 20 dager før målinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Forbered en 10x DMEM lagerløsning ved å oppløse DMEM pulver i ddH2O (134 mg / ml for formuleringen som er angitt i materialtabellen) under en konstant rotasjon ved 37 °C i 1 time. Steriliser ved filtrering. Bestanden er stabil i opptil 14 dager ved 4 °C eller -20 °C i opptil 12 måneder.
- Forbered 2x DMEM på nytt ved å fortynne en 10x DMEM lagerløsning og ved å tilsette 20 % (v/v) FCS i steril ddH2O. Bruk eventuelt antibiotika som 200 U/ml penicillin og 200 mg/ml streptomycin. Se tabell 1 for pipetteringsvolumer. Lageret er stabilt i opptil 14 dager ved 4 °C.
MERK: Utfør trinn 3.1. og 3.2. før du begynner enzymatisk dispersjon av celler (trinn 2.) for fremstilling av ECT.
| Reagent | Endelig konsentrasjon | Volum (ml) |
| 10× DMEM | N/a | 2 |
| FCS | 20 % (v/v) | 2 |
| Penicillin | 200 U/ml | 0.2 |
| Streptomycin | 200 mg/ml | 0.2 |
| ddH2O | N/a | 5.6 |
| Total | N/a | 10 |
Tabell 1: Sammensetning av 2x DMEM.
FORSIKTIG: Alle komponenter til celle-kollagenhydrgelblandingen og sentrifugerørene må oppbevares på is før bruk. Dette vil bidra til å forhindre at kollagen selvmontering oppstår før du distribuerer celle-kollagen hydrogelblandingen gjennom støpeformene.
- Basert på tabell 2 justerer du celleopphenget til en tetthet på 8,88 x 106 celler/ml ved å legge FGM ved 20-25 °C til celleopphenget fra trinn 2.10. Flytt deretter oppsamlingsrøret med cellefjæring til is.
- For å forberede ECT hydrogelblandingen, forkjøl et 50 ml sentrifugerør på is og legg til de forskjellige komponentene som er oppført i tabell 2 i følgende rekkefølge, og unngå luftbobledannelse.
MERK: Maksimalt antall ECT som skal utarbeides, avhenger av det totale cellenummeret som ble bestemt i trinn 2.9. Bruk 0,3 mg kollagen per ECT, hentet fra en lageroppløsning som inneholder 6-7 mg/ml. Konsentrasjonen av kollagen lagerløsningen bestemmer volumet som trengs for å oppnå et optimalt ECT kollageninnhold. Volumer av de andre ECT hydrogelkomponentene må tilpasses tilsvarende. Se tabell 2 for justerte volumer i henhold til en kollagenbestandsløsning på 6,49 mg/ml. Volumene som er beskrevet i tabell 2 , brukes i denne protokollen som en eksemplarisk retningslinje.- Pipette den syreløselige kollagen type 1 hydrogel ved hjelp av en serologisk pipette med en bred borespiss.
- Juster saltinnholdet i kollagenoppløsningen ved å tilsette 2x DMEM mens du forsiktig blander ved å virvle røret.
- Nøytraliser pH ved å tilsette 0,2 M NaOH mens du forsiktig blander ved å virvle røret. Fenol rød indikator vil dreie fra gul til rød.
MERK: NaOH-volumet må titreres for hver enkelt kollagenparti for optimal pH-nøytralisering. Nøytralisering avhenger av faktorer som buffertype og forberedelse, samt absolutt kollagenkonsentrasjon, og det påvirker kollagenmatrisemontering og celle levedyktighet23,40. Når det ioniske innholdet er økt ved tilsetning av DMEM og pH er nøytralisert, følger selvmonteringen av kollagen og må ikke forstyrres. Utfør derfor følgende raskt og uten pauser. - Tilsett cellefjæringen (fra trinn 3.3) dråpevis mens du forsiktig blander ved å virvle røret.
| ECT-nummer: | 1 | 6 | 24 | 48 | |
| inkludert 10 % overskudd | |||||
| Cell-kollagen hydrogel komponenter: | (μL) | (μL) | (μL) | (μL) | |
| Kollagen lager (6,49 mg/ml) | 46.2 | 305.1 | 1220.2 | 2440.4 | |
| 2× DMEM | 46.2 | 305.1 | 1220.2 | 2440.4 | |
| 0,2 M NaOH | 3.1 | 20.5 | 81.8 | 163.7 | |
| Celleblanding i FGM (8,88×106 celle/ml) | 84.5 | 557.4 | 2229.7 | 4459.5 | |
| Totalt volum (μL) | 180.0 | 1188.0 | 4752.0 | 9504.0 | |
| Dette er et eksemplarisk bord for å forberede et støpevolum på 180 μL per ECT, som inneholder totalt 750 000 celler og 0,3 mg kollagen per ECT. | |||||
Tabell 2: Tilberedning av ECT hydrogel (inkludert 10 % overskudd som står for pipetteringsfeil).
- Bland hele fjæringen ved å pipette forsiktig opp og ned bare en gang, ved hjelp av en serologisk pipette med en bred borespiss for å unngå bobledannelse og minimere skjærspenning. Sørg for fullstendig blanding ved å virvle røret forsiktig 10 ganger og hold det 50 ml sentrifugerøret som inneholder ECT hydrogelblanding på is gjennom støpeprosessen.
- For-våt en 1 ml pipettespiss med ECT hydrogelblanding og fordel 180 μL av den jevnt inn i hver form av 48-brønns støpeplaten, unngå overdreven skjærkrefter som kan påvirke integriteten til kollagenmatriseenheten og sikre at hele platen gjøres i 15-20 min.
MERK: Anbefalt støpevolum er 180 μL, men det kan forlenges til 200 μL38. Derfor, når det foretrekkes, kan volumer i tabell 2 tilpasses 200 μL på en måte som holder de samme konsentrasjonene og forholdet mellom celler og kollagen.- Kontroller at det dannes en komplett sløyfe i formen (figur 3A). Hvis ECT hydrogelblandingen påføres seponert, vil en fullstendig ECT-ringdannelse forhindres (figur 3B).
- Unngå pipettering i den indre brønnen (figur 3C) og dannelse av bobler under pipettering (figur 3D), for å sikre en homogen og funksjonell vevsdannelse.
Figur 3: Støping, hydrogeldannelse og ECT-kondens i flerbrønnformat. Topppanelene eksemplifiserer utseendet til ECT direkte etter støping. De midterste panelene eksemplifiserer utseendet til ECT etter inkubasjon i 20 minutter ved 37 °C. Bunnpanelene eksemplifiserer komprimeringstilstanden på ECT 24 timer etter tilberedning, fjernet fra polene. (A) Riktig ECT-formasjon mellom to poler i løpet av de første 24 h. (B-D) Eksempler på pipetteringsfeil som forhindrer riktig ECT-dannelse. De hvite og svarte pilene peker på strukturelle feil ved ECT på grunn av feil støping. Skalastang: 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Plasser forsiktig den 48-brønns støpeplaten inne i cellekulturinkubatoren og la ECT hydrogelblandingen rekonstituere i 15-30 min. Etter inkubasjon vil det virke gellignende og ugjennomsiktig (figur 3, midtpanel).
- Tilsett 600 μL 37 °C varm FGM per brønn, uten å pipettere kulturmediet direkte på formingsekt, da dette kan føre til vevsforstyrrelser. Tilsett forsiktig kulturmediet langs brønnveggen, da ECT på dette tidspunktet heller ikke må løsnes fra bunnen (figur 4).
Figur 4: Riktig og feil tilsetning av kulturmedium til den nystøpte ECT. (A) Ved tilsetning av kulturmediet etter første ECT-størkning (20 min etter støping) må kondenserende ECT stå uforstyrret på bunnen av brønnen. I løpet av de neste 24 timer vil celledrevet matrisekomprimering få ECT til å gli opp rampen. Den endelige ECT-posisjonen styres av konkave hulrom i en definert stanghøyde; Dette sikrer at alle ECT bosetter seg i samme posisjon for å muliggjøre en sammenligning av stangbøyingsaktivitet i parallell ECT-kultur. (B) Danner ECT løsrevet fra bunnen mens du legger til kulturmediet for raskt. Flytende ECT vil komprimeres på det øvre kulturmediet. Pole contracting styrker vil ikke være direkte sammenlignbare hvis ECT bosette seg i forskjellige posisjoner. Skalastang: 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Inkuber i 24 timer.
- Bytt ut mediet hver dag deretter, med 500 μL FGM til analyse.
MERK: Etter den første fasen av celleuavhengig gelering begynner den menneskelige CF å komprimere ECT-hydrogelblandingen ytterligere. Innen 24 timer skal ECT fremstå som spesielt komprimert og hevet til det nivået der det holdes på de fleksible polene (figur 3 og figur 4A).
4. Vurdering av ECT-komprimering ved å måle tverrsnittsområde (CSA) (5 min per ECT).
MERK: Vevskomprimeringen starter umiddelbart etter kollagenenheten og er spesielt viktig i løpet av de første timene. Komprimering beskriver endringer som hovedsakelig utløses av celledrevet kompresjon av matrisen vinkelrett på vevets lange akse. Denne parameteren vurderes ved å bestemme krysset område (CSA) av ECT.
- På ønsket tidspunkt bruker du et stereomikroskop til å registrere makroskopiske bilder av ECT-visningene øverst og på siden (figur 5C).
MERK: ECT kan avbildes inne i de fortultende brønnene på 48-brønns støpeplaten. Alternativt kan du overføre ECT til en klar bunn multi-brønn plate for avbildning. Det anbefales å avbilde ECT på polene som å fjerne disse fører til tap av preload, og følgelig kan vevet i løpet av kort tid ytterligere trekke seg sammen med eventuell torsjon på grunn av spenningsfrigjøring, noe som kan hemme riktig bildebehandling for dimensjonenes analyser. - Bruk et bildebehandlingsprogram til å utføre en linjeskanningsanalyse. Angi en skala og bruk rett linje-verktøyet til å spore og måle ECT-diameteren med minst 6 posisjoner per arm i hvert bildeplan (figur 5B, C).
- Beregn gjennomsnittsdiameteren fra topp- og sidevisningsplan og beregn CSA i henhold til en elliptisk arealligning:
Figur 5: Overvåke ECT-komprimering over tid ved analyse av tverrsnittsområde (CSA). ECT ble generert ved hjelp av human CF og kollagen type I og dyrket rundt to fleksible poler i 5 dager. (A) Representative bilder av kontroll ECT plassert i fleksible former over en tid på 5 dager presenteres. Skalastang = 5 mm. Slike lysfeltbilder kan også brukes til å bestemme pole deflection variasjon for estimering av vev sammentrekning. (B) Skjematisk representasjon av tverrsnittsområdet til en ECT (toppvisningsdiameter i grønn og sidevisningsdiameter i rosa). (C) Makroskopiske bilder av topp- og sidevisninger av en ECT oppnådd med et stereomikroskop og korrespondenteksempel på linjeskanningsanalyse av vevets diametre ved hjelp av et bildebehandlingsprogram. Skalastang = 2 mm. Gjennomsnittlige diametre beregnes ut fra gjennomsnittet av alle linjelengder målt på hver visningsplan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Overvåking av ECT-sammentrekning ved pole deflection analyse (15 min per 48-brønns støpeplate).
MERK: ECT-kulturen utføres vanligvis i 5 dager, men den kan forlenges ytterligere i minst 20 dager. Stangavbøyning oppstår på grunn av vevssammentrekningen drevet av cellekontraksjonskraften i spenningsretningen langs vevets lange akse. Vurdering av ECT-sammentrekning kan utføres ved avbildning på hvilken som helst dag under kultur.
- Bilde den 48-brønns støpeplaten under en opptaksenhet med et integrert skannekamera plassert på en fast avstand, utstyrt med en høy oppløsning (≥ 5 megapiksler) monokrom bildesensor.
- Bruk en nær UV-lyskilde (~390 nm) for å maksimere kontrasten og dermed legge til rette for automatisert deteksjon av polenes spisser, da de inneholder et fluorescerende fargestoff (figur 6A, C). Hvis det er tilgjengelig, anbefales telesentriske linser for avbildning, da de minimerer bildeforvrengninger.
MERK: Alternativt kan makroskopiske lysfeltbilder fra enkeltbrønner eller av hele platen sammen med en skalastang brukes til analysen (figur 5A).
- Bruk en nær UV-lyskilde (~390 nm) for å maksimere kontrasten og dermed legge til rette for automatisert deteksjon av polenes spisser, da de inneholder et fluorescerende fargestoff (figur 6A, C). Hvis det er tilgjengelig, anbefales telesentriske linser for avbildning, da de minimerer bildeforvrengninger.
- Mål avstanden mellom polene fra daglige poster (figur 6C,D) ved hjelp av et bildebehandlingsprogram eller automatisert analyse ved å kjøre innspilte bilder på programvare som kan oppdage lyse piksler med høy kontrast på en mørk bakgrunn.
- Beregn stangavbøyningen gjennom variasjonen av stengenes avstand sammenlignet med startavstanden på dag null.
Figur 6: Skjematisk oversikt over vurderingen av vevskontraksjon i henhold til stangavbøyning. (A) Eksemplarisk høyoppløselig opptak av fluorescerende poler i støpeplaten med 48 brønner under nesten UV-lyseksitasjon. Denne metoden foretrekkes fremfor bilder med lyse felt for mer presis sporing av stangspisser. (B) De skjematiske tegningene viser hvordan ECT-komprimering og sammentrekning fører til stangbøying. (C) En eksemplarisk rad med samme plate registreres på dag 0 og dag 5 etter støping. D. Nærbildet viser hvordan du måler avstanden (rosa linje) mellom polene ved hjelp av et bildebehandlingsprogram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
MERK: Tenk på at stangavbøyning målt ved sterkt spissbilde bare er et estimat av vevssammentrekningen på grunn av forskjellen i bildeplan. Vær også oppmerksom på at anvendelsen av pro-fibrotiske stoffer som TGF-β1 under vevskultur forbedrer ECT-komprimering og sammentrekning og kan til slutt føre til tidlig vevsforstyrrelse.
6. Vurdering av stivhet og andre biomekaniske egenskaper ved ECT ved destruktiv strekkmåling og stressbelastningsanalyse (20 min per ECT)
MERK: En optimal spenningsspenningskurve kan vise tre regioner: tåregion, elastisk region og plastregion. Et eksempel på ECT-spenningsspenningskurve vises i figur 7. Analysen av en spenningsbelastningskurve gjør det mulig å trekke ut viktige biomekaniske parametere i vevet, for eksempel stivhet, maksimal styrke, elastisitet, plastisitet, utvidbarhet, motstandskraft og seighet.
- Høst ECT ved først å trekke båren, inkludert ECT, ut av brønnen ved hjelp av tang. Båren kan deretter holdes på basen, og ECT gled over bårespissene ved hjelp av en fin krok eller pipettespiss.
- Overfør ECT på to kroker klemt til den stasjonære armen og svingerarmen til et forlenget dynamisk mekanisk analyse (DMA) reometer utstyrt med et 37 °C herdet orgelbad (spesiallaget) fylt med PBS (figur 7A).
Figur 7: ECT destruktiv strekkmålingsanalyse. (A) Reologisk destruktiv strekkmåling på et forlengende dynamisk mekanisk analyse (DMA) reometer. Øvre høy effektvisning: ECT etter montering på L0 i et miljøkammer og koblet til en øvre og nedre pol for stress-belastningsanalyser. Nedre høy effektvisning: ECT anstrengt med en konstant hastighet 0,03 mm/s til feilpunktet ved maksimal belastning. Skalastenger = 5 mm. (B) Stressstammediagram over en ECT som viser de viktigste målte parametrene. Den øvre grensen for det elastiske området tilsvarer avkastningspunktet og plastområdet består mellom avkastningspunktet og feilpunktet (duktilitet). Skråningen av den lineære fasen av den elastiske regionen tilsvarer Youngs modulus reflekterende vevsstivhet. Maksimal styrke tilsvarer det maksimale strekkspenningen et vev tåler. På grunn av fibermikrofraktur reduseres stresset til vevet når feilpunktet. Dette skjer ved den ultimate belastningen (utvidbarhet) hvor en plutselig nedgang i stress observeres på grunn av vevets brudd. Motstandskraft tilsvarer energien (kJ/m3) som absorberes av vevet før permanent deformasjon (opp til avkastningspunktet) og gis av området under kurven (AUC) opp til utbyttepunktstammen. Seighet tilsvarer den totale energien (kJ/m3) vevet kan absorbere til brudd og er gitt av AUC opp til den ultimate stammen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Still inn reometeret for å påføre uniaxial spenning med en konstant lineær hastighet på ca. 1 % av den opprinnelige avstanden mellom krokene per sekund. En konstant strekkhastighet på 0,03 mm/s kan brukes med de typiske ECT-dimensjonene. Tjære svingeren, start strekningen og ta opp til punktet av ECT brudd.
FORSIKTIG: Makroskopiske bilder av ECT (trinn 4.1.) må registreres før strekktesting, da CSA er nødvendig for datanormalisering.
MERK: Stressbelastningsanalysen, inkludert CSA-beregning, kan behandles senere i tid ved strekktesting. Bruk en regnearkprogramvare og en statistisk analyseprogramvare for å analysere dataene. - Normaliser målte kraftverdier (mN) per ECT ved CSA (mm2) for å oppnå spenningsverdier (kPa).
- Plott stressverdier mot belastning (et geometrisk mål på vevsdeformasjon gitt av den relative avstanden mellom øvre og nedre krok) på en XY-graf.
MERK: Den første lengden på vevet (avstanden mellom øvre og nedre krok) rett før strekningen følger, L0, må justeres manuelt og tilsvarer begynnelsen av tåområdet (tåområdet kan være fraværende avhengig av vevsegenskaper). Hver strekkpunktverdi må beregnes i henhold til ligningen, der Ltotal er det totale gapet på hvert målepunkt:
Når du tegner inn dataene, bruker du stressverdien ved valgt L0 for bakgrunnsdeldetraksjon. - Bestem ulike biomekaniske parametere fra spenningsspenningskurven (bruk figur 7B som eksempel).
MERK: En spenningsspenningskurve kan vise tre områder: tå-, elastiske og plastiske områder. Den øvre grensen for den elastiske regionen, før vevet begynner mikrofraktur, tilsvarer utbyttepunktet, og belastningen er et mål på vevselastisitet. Plastområdet består av avkastningspunktet og feilpunktet. Det senere punktet tilsvarer en plutselig nedgang i stress på grunn av vevets brudd, og definerer den ultimate flekken, som er et mål på vevsutvisning. Det tredje målepunktet tilsvarer maksimal styrke, som er definert av det høyeste stresset som vevet kan bære uten å bryte under strekningen. Motstandskraften og seigheten, gitt av området under kurven, tilsvarer energien som absorberes av vevet opp til henholdsvis avkastningspunktet og til feilpunktet. For hver oppnådd kurve tilsvarer skråningen av den lineære delen av den elastiske regionen Youngs modulus, også kjent som elastisk modulus, og er en mekanisk egenskap som måler vevets stivhet.- Trekk ut XY-verdiene (henholdsvis belastning og stress) for avkastningspunktet, feilpunktet og det maksimale stresspunktet fra hver kurve.
- Vurder Youngs modulus (stivhet i kPa = mN·mm-2) av hver ECT fra skråningen av den lineære delen av den elastiske regionen ved å plotte en lineær regresjon av denne regionen.
- Bruk et statistisk program til å beregne området under kurven (AUC) for å bestemme henholdsvis motstandskraft og seighet, opp til avkastningspunktet og feilpunktet. Beregn AUC ved hjelp av trapesformet metode. Sett grunnlinjen til null, og vurder bare toppene over grunnlinjen, som er minst 10 % av avstanden fra minimum til maksimumsverdi i Y-aksen.
MERK: Motstandskraftens og seighetens moduli er gitt av σ × ε, der σ er stress (kPa) og ε er belastningen (L/ΔL, mm/mm). Dermed er motstandskraft og seighet energien i kJ/m3 (kPa = kN·m-2 = kN·m·m-3 = kJ/m·m·m-3 = kJ/m3) absorbert av vevet før permanent deformasjon og til brudd, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ECT når rundt 95 % komprimering sammenlignet med det første celle-kollagenhydrgelvolumet i løpet av de første 24 t. Vevskomprimering og sammentrekning under kontrollforhold og i nærvær av FCS følger noen timer etter støping og øker spesielt opp til dag 5 (figur 5A). Pole deflection kan ytterligere øke i løpet av de neste 15 dagene (20 dager var den lengste tiden testet). Størrelsen på stangavbøyning avhenger av celletype, celletilstand og celle- og vevskulturforhold. Vanligvis måles biomekaniske egenskaper på dag 5 av kulturen, men ethvert tidspunkt kan velges. Som et eksempel på anvendelsen av ECT-modellen, vises det hvordan denne protokollen kan hjelpe til med å studere virkningen av aktin cytoskjelettintegritet på vevsfunksjonen. ECT ble fremstilt i 48-brønns støpeplaten og behandlet med aktinpolymerisasjonshemmeren Latrunculin A (Lat-A, 7 ng/ml). Behandlingen reduserte ECT-komprimeringen som indikert ved den signifikante økningen på 1,7 ganger i CSA sammenlignet med kontroll (figur 8A,B). Videre ble sammentrekningen av vevet vurdert i løpet av de 5 dagene av kulturen. I fravær av stoffet økte sammentrekningen gradvis opp til dag 5, og nådde ~ 40% sammentrekning. Lat-A påvirket vevskontraksjon, noe som resulterer i bare ~ 20 % maksimal sammentrekning (figur 8A,C). Destruktiv enveis stressbelastningstesting ble utført på dag 5. Fra en typisk spenningsspenningskurve som de som er oppnådd for ECT (figur 7B), kan flere biomekaniske parametere ekstraheres. Eksemplarisk er det vist at hemming av aktinpolymerisering førte til en betydelig reduksjon på ~ 50% i vevsstivhet over kontrollen (figur 8D). Samlet viser de eksemplariske dataene at aktincytoskeletal integritet er avgjørende for ECT-komprimering, sammentrekning og stivning.
Figur 8: Hemming av aktinpolymeriseringen påvirker ECT-komprimering, sammentrekning og stivhet. ECT generert med menneskelig CF og kollagen type jeg ble dyrket i 5 dager rundt to fleksible poler i nærvær eller fravær av 7 ng / ml Latrunculin-A (Lat-A). (A) Representative bilder av kontrollen og behandlet ECT plassert i fleksible poler etter 5 dager vises. Skalalinje = 2 mm. (B) Tverrsnittsområder (CSA) ble beregnet fra makroskopiske bilder (n = 22). (C) Pole deflection ble beregnet over en periode på 5 dager. Verdier angis som middel±SEM (n = 22). Betydelige endringer ble vurdert av 2-veis ANOVA med Dunnetts (*p<0,05 vs. Control) post hoc-tester for flere sammenligninger. (D) Vev ble utsatt for reologiske destruktive strekkmålinger og Youngs moduli ble hentet fra stressstammeanalysene (n = 16). (B og D) Bokser angir nedre og øvre kvartil. Vannrett linje i hver boks representerer henholdsvis median CSA og stivhet. Midlene for hver gruppe angis med en +. Loddrette linjer som strekker seg fra hver boks, representerer minimums- og maksimumsverdiene som måles. Vesentlige endringer i B og D ble vurdert ved uparret, to-tailed Student t-test (*p<0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver genereringen av ECT fra primært menneskelig CF, som gjør det mulig å studere den mekaniske effekten av disse cellene på deres ekstracellulære matrisemiljø og omvendt.
Fibroblaster må utvides for å gi tilstrekkelige celler for de planlagte ECT-eksperimentene (0,75 x 106 celler / ECT). For best mulig reproduserbarhet anbefales det å pre-kultur frosne eller vevsavledede fibroblaster i 2D-monolayerkultur for en standardisert varighet opptil 80% samløp i hver passasje og før bruk i ECT-generasjon (Protokolltrinn 3). Spesielt for dyrking av primære menneskelige CF-monolayere og -avledede ECT anbefales det å bruke kommersielt medium og kosttilskudd som passer for CF (se Materialfortegnelse). Middels tilskudd med serum er avgjørende for å sikre utvidelse av CF i standard 2D-kulturer. Bruk av serumfrie eller lave serumforhold i 3D-kulturer, inkludert ECT-generasjon og videre kultur, kan vurderes avhengig av den valgte fibroblasttypen. Men når du bruker CF for ECT-generasjon, anbefales det å minst inkludere serum i støpehydrgelen for riktig innledende vevskomprimering.
En begrensning i prosedyren er forbundet med CF-utvidelse i 2D-kultur som er nødvendig for ECT-generasjonen, noe som vanligvis fører til konvertering av fibroblaster til myofibroblaster (indikert av forbedret SMA og tilhørende stressfiberdannelse4). På grunn av deres kontinuerlige transdifferensiering, bør du vurdere at fibroblaster i forskjellige passasjer kan gi forskjellige resultater når de brukes til å generere ECT. I ECT-modellen må to prosesser diskrimineres. Etter suspensjon i en kollagenhydrgel og ECT-formasjon, kan celler tilpasse seg 3D-miljøet, og myofibroblastfenotypen kan i det minste delvis reverseres. I den følgende kulturfasen kan cellene da potensielt gjennomgå en bryter igjen i motsatt fenotypisk retning, spesielt ved å bruke poler med økende stivhet eller ved tilsetning av pro-fibrotiske faktorer (for eksempel TGF-β1). Muligheten til å justere den dynamiske fenotypiske tilpasningen skaper muligheten til å dissekere de underliggende og biomekanisk kontrollerte molekylære mekanismene. Slike studier kan til slutt tillate modellering av fibrotiske forhold og identifisering av farmakologiske eller genterapiintervensjoner rettet mot organfibrose. Bruk av fibroblaster av forskjellig opprinnelse kan ytterligere tillate undersøkelse av prosesser som ligger til grunn for vevsspesifikk fibrose. Påføring av fibroblaster eller andre stromale celler, ikke bare av forskjellig opprinnelse, men også fra forskjellige arter tillater kryss-arter studier av mekanismer som ligger til grunn for fibrose eller cellematrise interaksjoner. Likevel må det bemerkes at ved å bruke primærceller fra mennesker, må de interpersonmessige forskjellene mellom cellene tas i betraktning. En svikt i vevskontraksjon (se også nedenfor) er ikke nødvendigvis en årsak til en eksperimentell feil, men kan skyldes de iboende kontraktile egenskapene til den enkelte cellelinjen. Derfor er det alltid å foretrekke å bruke celler fra forskjellige givere for å tillate diskriminering av generelle mekanismer og donoravhengige forskjeller. I likhet med variasjonen av de oppnådde resultatene, som kan oppstå fra cellens individuelle biologi, er det viktig å nevne at alt biologisk materiale kan vise betydelig variasjon. Derfor anbefales parallell testing av materialet fra forskjellige tomter, i hvert fall når det blir nødvendig å bytte tomt.
Videre viser vev som vokser på stangparene "arm" og "pole" regioner som er strukturelt og biomekanisk forskjellige. Det gjenstår å bestemme hvor mye polområdet bidrar til strekkeksperimenter.
Vevsforberedelsesprosessen må være grundig rask for å unngå gelering ved romtemperatur. Cell-kollagen hydrogel gelering er hovedsakelig drevet av kollagen selvmontering, og i stor grad celleuavhengig29. Det er det første trinnet under vevsdannelse, og det skal oppstå i løpet av de første 15-30 min en gang plassert i en kulturinkubator. Kollagenflimogenese og gelering påvirkes av for eksempel hydroksylering av proliner og lysiner, og svært avhengig av kollagentype, ionisk styrke, pH og temperatur, som påvirker fiberbunt og porestørrelse på kollagennettverket42. Det kan til slutt påvirke cellekomponenten, og derpå vevets struktur og mekaniske egenskaper. Når du velger kollagenkilder og kjemisk sammensetning av naturlig avledet kollagen, er det viktig å identifisere en pålitelig kollagenløsning av høy kvalitet for vevsteknikk. Bruk av kommersiell syre-solubilisert bovin type I kollagen anbefales ved en omtrentlig lagerkonsentrasjon på 6-7 mg / ml. Likevel kan andre kollagenløsninger med en konsentrasjon på ≥ 4 mg/ml også være kompatible med dette. Flere andre faktorer som renhet, molekylær integritet, solubiliseringsmiddel og hyllealder kan påvirke inkubasjonstiden som er nødvendig for rekonstituering (størkning) av ECT-hydrogelblandingen, som under ingen omstendigheter bør overstige 1 time for å unngå cellesedimentering. For optimale resultater, lagre og håndter kollagenholdige løsninger ved 4 ± 2 °C. Kollagenintegritet kan avbrytes hvis den fryses eller håndteres ved romtemperatur og dermed forhindre fibrillogenese og hydrogelgelering. Etter pH-nøytralisering og cellerekonstituering i kollagenhydrgelen må pipettering under støping være skånsom, da sterke skjærkrefter kan påvirke integriteten til kollagenstrukturen og matriseenheten. Variasjon mellom partier av kollagen eller forskjellige leverandører kan ha innvirkning på ECT-dannelsen. Det anbefales å teste kollagenhydrgel for å fastslå ideelle kondensegenskaper før bruk i ECT-preparatet. Videre, for å garantere passende pH-nøytralisering, må NaOH-volumet titreres for hver enkelt kollagenparti. Generelt anbefales ytterligere kvalitetskontroller, for eksempel SDS-PAGE-analyse for å undersøke kollagenintegritet og konsentrasjon og skjærreimologi for å bestemme de viskøse egenskapene til kollagenløsningen.
Etter den første fasen av hydrogel størkning på grunn av kollagen selvmontering, driver cellekomponenten matrisekomprimering ytterligere. Hvis ECT ikke komprimeres synlig innen 24 timer etter støping, kan dette være relatert til celle levedyktighet. Minimum 80 % celle levedyktighet anbefales. Sikre riktig celle levedyktighet etter enzymatisk løsrivelse av inngangsceller for å oppnå riktig vevskomprimering og funksjonalitet. I denne protokollen genereres ECT med 0,75 × 106 celler i et sluttvolum på 180 μL per vev, men forskjellige cellenumre kan være nødvendig avhengig av kilden til celler (f.eks. CF-donor, leverandører). Dermed anbefales det å utføre et celletitreringseksperiment i begynnelsen. Vanligvis kan et celleområde fra 150.000 til 750.000 testes for optimal dannelse og komprimering av vevet. Generelt bruker denne protokollen 0,3 mg kollagen per ECT tilsvarende 1,67 mg/ml kollagen i et endelig volum på 180 μL. Juster om nødvendig forholdet mellom cellenummer og kollagenkonsentrasjon (kollagenkonsentrasjon fra 0,14 til 0,4 mg per vev kan testes). Sørg også for riktig nøytralisering av eddiksyre-solubilisert kollagen under hydrogelpreparat, da utilstrekkelig pH kan være skadelig for celle levedyktighet.
Som vist i figur 3 (nederste panel), kan det hende at ECT ikke dannes jevnt. Etter cellerekonstituering i den pH-nøytraliserte kollagenhydrgelblandingen følger gelasjonsprosessen selv ved 4 °C og akselereres ved romtemperatur (når den er støpt i formen). Påse at støpeprosedyren er fullført innen 15-20 min. For tidlig gelering vil hindre riktig pipettering av blandingen på grunn av økt viskositet. Ved støping av viskøse celle-kollagenhydrgel, pre-våt pipettespiss med hydrogel eller bruk en pipettespiss med lav oppbevaring, og følg med samme spiss for å støpe flere ECT. Denne praksisen vil redusere variasjonen i hydrogelvolumet og dannelsen av bobler under utblåsning (figur 3D). Sørg for å fullføre løkken i formen for å danne en ringformet ECT (figur 3A-B). I tillegg må du sørge for at inngangscellefjæringen er homogen og fri for aggregater i alle stadier av støping. Bland ofte celle-kollagen hydrogenblandingen ved å virvle røret mens du utfører støpeprosedyren i støpeplaten med 48 brønner. Til slutt skal gelasjonen under inkubasjon ved 37 °C forekomme maksimalt innen 15-30 minutter. Hvis denne prosessen tar lengre tid, øker sjansen for cellesedimentering, og produserer ujevnt befolkede vev.
Videre kan ujevnt befolket vev og ujevn fordeling av celle-kollagenhydrgelen i formene føre til uregelmessig morfologi av ECT, og ECT kan ikke trekke seg jevnt gjennom hele 48-brønns støpeplaten. ECT-posisjonen på de fleksible polene kan også påvirke sammentrekningsnivåene og bidra til et lignende fenomen. Hvis den dannende ECT løsner fra bunnen mens du legger til kulturmedium, kan det flyte og komprimere over forankringspunktet på polene med en definert bøyekraft (figur 4). Dette kan føre til en overvurdert stangavbøyning og indusere variasjon mellom vev/eksperimenter. For å unngå dette bør hydrogelen forsiktig legges over kulturmediet via brønnveggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GLS og SL utarbeidet manuskriptet. Alle forfattere bidro til protokollutviklingen og redigerte manuskriptet. TM, MT og WHZ er vitenskapelige rådgivere for myriamed GmbH. WHZ er grunnlegger og aksjonær i myriamed GmbH.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Det tyske hjerteselskapet (DGK Research Fellowship for GLS) og av Den tyske forskningsstiftelsen (DFG gjennom prosjektet IRTG 1816 for GLS og AD; DFG 417880571 og DFG TI 956/1-1 for MT; SFB 1002 TP C04 for MT og WHZ; SFB 1002 TP S01 for WHZ; og EXC 2067/1-390729940J for WHZ). WHZ støttes av det tyske føderale departementet for vitenskap og utdanning (BMBF gjennom prosjektet IndiHEART), og Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ og SL støttes av det tyske senter for kardiovaskulær forskning (DZHK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents: | |||
| Accutase Solution | Merk Millipore | SCR005 | |
| Dissociation reagent – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose | Gibco | 12100061 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM Fibroblast Growth Basal Medium | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4126 | |
| Fibroblast Growth Medium 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
| Fibroblast Basal Medium 3 | PromoCell | C-23230 | |
| Growth Medium 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
| Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| Cell sources: | |||
| Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
| Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
| Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
| Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC- 1041 | |
| Collagen sourses: | |||
| Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl | LLC Collagen Solutions | FS22024 | 6-7 mg/mL |
| Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 mg/mL |
| Drugs: | |||
| Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| Plastic ware: | |||
| Cell culture plastic ware | Sarstedt and Starlab | ||
| Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) | Corning | 07-200-619 | |
| Specific instruments: | |||
| Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors | OptoEngineering | TCCR12096 | |
| Area scan camera Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |
References
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (16), 7540-7545 (2011).
- Elson, E. L., Genin, G. M. Tissue constructs: platforms for basic research and drug discovery. Interface Focus. 6 (1), 20150095 (2016).
- Cho, N., Razipour, S. E., McCain, M. L. TGF-beta1 dominates extracellular matrix rigidity for inducing differentiation of human cardiac fibroblasts to myofibroblasts. Experimental Biology and Medicine. 243 (7), Maywood. 601-612 (2018).
- Cucoranu, I., et al. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circulation Research. 97 (9), 900-907 (2005).
- Peng, H., Carretero, O. A., Peterson, E. L., Rhaleb, N. E. Ac-SDKP inhibits transforming growth factor-beta1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), 1357-1364 (2010).
- Ribeiro, A. J., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Tranquillo, R. T., Durrani, M. A., Moon, A. G. Tissue engineering science: consequences of cell traction force. Cytotechnology. 10 (3), 225-250 (1992).
- Barocas, V. H., Moon, A. G., Tranquillo, R. T. The fibroblast-populated collagen microsphere assay of cell traction force--Part 2: Measurement of the cell traction parameter. Journal of Biomechanical Engineering. 117 (2), 161-170 (1995).
- Lijnen, P., Petrov, V., Rumilla, K., Fagard, R. Stimulation of collagen gel contraction by angiotensin II and III in cardiac fibroblasts. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 3 (3), 160-166 (2002).
- Baxter, S. C., Morales, M. O., Goldsmith, E. C. Adaptive changes in cardiac fibroblast morphology and collagen organization as a result of mechanical environment. Cell Biochemistry and Biophysics. 51 (1), 33-44 (2008).
- Zhou, Y., et al. Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1096-1108 (2013).
- Lijnen, P., Petrov, V., Fagard, R. In vitro assay of collagen gel contraction by cardiac fibroblasts in serum-free conditions. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 23 (7), 377-382 (2001).
- Burgess, M. L., et al. Integrin-mediated collagen gel contraction by cardiac fibroblasts. Effects of angiotensin II. Circulation Research. 74 (2), 291-298 (1994).
- Nunohiro, T., Ashizawa, N., Graf, K., Hsueh, W. A., Yano, K. Angiotensin II promotes integrin-mediated collagen gel contraction by adult rat cardiac fibroblasts. Japanese Heart Journal. 40 (4), 461-469 (1999).
- Ngu, J. M., et al. Human cardiac fibroblast extracellular matrix remodeling: Dual effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Cardiovascular Pathology. 23 (6), 335-343 (2014).
- Knezevic, V., Sim, A. J., Borg, T. K., Holmes, J. W. Isotonic biaxial loading of fibroblast-populated collagen gels: a versatile, low-cost system for the study of mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 1 (1), 59-67 (2002).
- Delvoye, P., Wiliquet, P., Leveque, J. L., Nusgens, B. V., Lapiere, C. M. Measurement of mechanical forces generated by skin fibroblasts embedded in a three-dimensional collagen gel. Journal of Investigative Dermatology. 97 (5), 898-902 (1991).
- Kolodney, M. S., Elson, E. L. Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (32), 23850-23855 (1993).
- Bell, B. J., Nauman, E., Voytik-Harbin, S. L. Multiscale strain analysis of tissue equivalents using a custom-designed biaxial testing device. Biophysical Journal. 102 (6), 1303-1312 (2012).
- Wakatsuki, T., Kolodney, M. S., Zahalak, G. I., Elson, E. L. Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophysical Journal. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- Thomopoulos, S., et al. Fibrocartilage tissue engineering: The role of the stress environment on cell morphology and matrix expression. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 1039-1053 (2011).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (2), 214-222 (2002).
- Ongherth, A., et al. p63RhoGEF regulates auto- and paracrine signaling in cardiac fibroblasts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 88, 39-54 (2015).
- Vettel, C., et al. PDE2-mediated cAMP hydrolysis accelerates cardiac fibroblast to myofibroblast conversion and is antagonized by exogenous activation of cGMP signaling pathways. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (8), 1246-1252 (2014).
- Jatho, A., et al. RhoA Ambivalently Controls Prominent Myofibroblast Characteritics by Involving Distinct Signaling Routes. PLoS One. 10 (10), 0137519 (2015).
- Dworatzek, E., et al. Sex-specific regulation of collagen I and III expression by 17beta-Estradiol in cardiac fibroblasts: role of estrogen receptors. Cardiovascular Research. 115 (2), 315-327 (2019).
- Tiburcy, M., Meyer, T., Soong, P. L., Zimmermann, W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods in Molecular Biology. 1181, 167-176 (2014).
- Schlick, S. F., et al. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 51-60 (2019).
- Wille, J. J., Elson, E. L., Okamoto, R. J. Cellular and matrix mechanics of bioartificial tissues during continuous cyclic stretch. Annals of Biomedical Engineering. 34 (11), 1678-1690 (2006).
- Berry, C. C., Shelton, J. C., Bader, D. L., Lee, D. A. Influence of external uniaxial cyclic strain on oriented fibroblast-seeded collagen gels. Tissue Engineering. 9 (4), 613-624 (2003).
- Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Developmental Biology. 90 (2), 383-398 (1982).
- Bellows, C. G., Melcher, A. H., Aubin, J. E. Association between tension and orientation of periodontal ligament fibroblasts and exogenous collagen fibres in collagen gels in vitro. Journal of Cell Science. 58 (1), 125-138 (1982).
- Tranquillo, R. T. Self-organization of tissue-equivalents: the nature and role of contact guidance. Biochemical Society Symposia. 65, 27-42 (1999).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of Biomechanical Engineering. 119 (2), 137-145 (1997).
- Yip, A. K., et al. Anisotropic traction stresses and focal adhesion polarization mediates topography-induced cell elongation. Biomaterials. 181, 103-112 (2018).
- Santos, G. L., Hartmann, S., Zimmermann, W. H., Ridley, A., Lutz, S. Inhibition of Rho-associated kinases suppresses cardiac myofibroblast function in engineered connective and heart muscle tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 134, 13-28 (2019).
- Kittana, N., et al. Modulating the biomechanical properties of engineered connective tissues by chitosan-coated multiwall carbon nanotubes. International Journal of Nanomedicine. 16, 989-1000 (2021).
- Kittana, N., et al. Enhancement of wound healing by single-wall/multi-wall carbon nanotubes complexed with chitosan. International Journal of Nanomedicine. 13, 7195-7206 (2018).
- Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
- Holder, A. J., et al. Control of collagen gel mechanical properties through manipulation of gelation conditions near the sol-gel transition. Soft Matter. 14 (4), 574-580 (2018).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
