Summary

Fibroblast härledd mänsklig konstruerad bindväv för screeningapplikationer

Published: August 20, 2021
doi:

Summary

Presenteras här är ett protokoll för att generera konstruerade bindväv för en parallell kultur av 48 vävnader i en multi-well plate med dubbla poler, lämplig för mekanistiska studier, sjukdom modellering och screening applikationer. Protokollet är kompatibelt med fibroblaster från olika organ och arter och exemplifieras här med mänskliga primära hjärtfibblaster.

Abstract

Fibroblaster är fenotypiskt mycket dynamiska celler, som snabbt transdifferentierar till myofibroblaster som svar på biokemiska och biomekaniska stimuli. Den nuvarande förståelsen av fibrotiska processer, inklusive hjärtfibros, är fortfarande dålig, vilket hämmar utvecklingen av nya antifibrosbehandlingar. Kontrollerbara och tillförlitliga mänskliga modellsystem är avgörande för en bättre förståelse av fibrospatologi. Detta är ett mycket reproducerbart och skalbart protokoll för att generera konstruerade bindväv (ECT) i en 48-väl gjutningsplatta för att underlätta studier av fibroblaster och patofysiologi av fibrotisk vävnad i en 3-dimensionell (3D) miljö. ECT genereras runt polerna med tunable styvhet, vilket möjliggör studier under en definierad biomekanisk belastning. Under de definierade belastningsförhållandena kan fenotypiska anpassningar som styrs av cellmatrisinteraktioner studeras. Parallell testning är möjlig i 48-brunnsformatet med möjlighet till tidsvägsanalys av flera parametrar, såsom vävnadskomprimering och sammandragning mot belastningen. Från dessa parametrar kan biomekaniska egenskaper som vävnadsstelhet och elasticitet studeras.

Introduction

Ett stort hinder i studien av fibrotiska sjukdomar är bristen på representativa mänskliga 3D-vävnadsmodeller som ger insikt i fibroblasters beteende och deras patologiska derivat. För att studera fibrotiska processer är standard 2D-odlingssystem suboptimala eftersom isolerade fibroblaster snabbt omvandlas till α-smooth muscle actin (SMA) -uttrycka myofibroblaster när de odlas på icke-kompatibla 2D-substrat1,2,3. Fibroblaster i standard 2D-kulturen återspeglar således inte en regelbunden “hälsosam” vävnad fenotyp3,4,5,6. Kulturer på följsamma substrat har införts för att simulera icke-fibrotiska (10 kPa) och fibrotiska (35 kPa) vävnadsmiljöer7, men dessa saknar den tredje dimensionen, vilket är mycket viktigt med avseende på patofysiologi. Vävnadsteknik ger möjlighet att övervinna denna begränsning genom att tillåta fibroblastkultur i en definierad och experimentellt tunable extracellulär matris (ECM) -sammanhang, till exempel genom förändringar i celluläritet, ECM-sammansättning och ECM-koncentration, som alla kan bestämma vävnadsbiomekaniken.

Olika 3D-modeller har genererats med fibroblaster. Flytande skivor och mikrosfärer var bland de första och visar att kollagen är ombyggt och komprimerat på ett tidsberoende sätt. Fibroblaster utövar dragkrafter på kollagenfibriller, en process som kan underlättas genom tillsats av pro-fibrotiska medel som omvandling av tillväxtfaktor-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Fritt flytande kulturer medger dock inte den kontrollerade externa belastningen och utgör därför kontinuerligt krympande eller komprimerande modeller. Arkliknande konstruerade vävnader öppnade möjligheten att studera homeostatisk reglering av biomekaniska egenskaper hos vävnader, nämligen genom uni-, bi-, multiaxial- eller cyklisk stamtestning17,18,19,20. Dessa modeller har använts t.ex. för att visa cellnumrets inverkan på vävnadsstelheten, som visade sig korrelera positivt med cytoskelettintegritet och aktomyosin cytoskeletonkontraktilitet18,19. Det är dock viktigt att notera att omvandlingar från kraft till stam kompliceras av den ojämna vävnadsdeformationen runt klämpunkter för kraftgivare och ankarpunkter. Denna inneboende begränsning kan kringgås av hundben eller ringformade vävnader, vilket ger viss vävnadsövervakning vid ankarpunkter21,22,23. Ringformade vävnader kan beredas genom att distribuera en cell-kollagen hydrogel till ringformade formar. När hydrogelen komprimeras bildas en vävnad runt den okomprimerbara inre stången i formen, vilket ger motstånd för ytterligare vävnadskontraktion24,25,26,27. Efter inledande och typiskt maximal komprimering kan vävnader också överföras till justerbara distanser för att ytterligare begränsa cirkulär ECT vid en definierad vävnadslängd3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysiska egenskaper kan bedömas i horisontella eller vertikala belastningsanordningar med lämpliga belastningsceller under enkelriktad eller dynamisk belastning3. Eftersom vävnaderna har en i stort sett enhetlig cirkulär struktur och kan hållas på stänger/krokar (förankringspunkter och/eller kraftgivare), även om dessa fortfarande kan omsluta kompressionsområden runt laststängerna, möjliggör detta format en mer enhetlig belastningsvariation jämfört med fastspänning3. Dessutom framkallar förankrade vävnader en bipolär cellform, och celler anpassar sig till vävnadskrafterna genom förlängning längs kraftlinjer som främjar anisotrop dragkraft31,32,33,34,35,36. Vi har tidigare applicerat ringformad ECT från råtta och mänskliga hjärtfibblaster (CF) runt en enda styv pol i funktionella stress-stamexperiment och utfört vinst och förlust av funktionsstudier med hjälp av viralt transduced fibroblaster24,25,26 och farmakologiska studier37. Vidare skulle vi kunna identifiera könsskillnader i CF-medierad fibros i ECT-modellen27.

Följande protokoll för generering av mänsklig ECT, exemplifierat med primär mänsklig CF som erhållits som kryopreserverad CF från kommersiella leverantörer (se Tabell över material), kombinerar fördelarna med ringformade vävnader med ett enkelt och snabbt sätt att producera makroskopiska vävnader för en 48-väl plattform utformad för parallell testning med högt innehåll.

Viktigt är att ECT-modellen inte är begränsad till en specifik fibroblasttyp, med dokumenterad användning vid undersökning av andra fibroblaster, t.ex. hudfibblaster38,39. Dessutom fungerar fibroblaster från patientens tarmbiopsier lika bra, och valet av fibroblaster beror i slutändan på den vetenskapliga fråga som ska tas upp.

Plattformen som används för generering av ECT som beskrivs i detta protokoll är en kommersiellt tillgänglig 48-brunns 3D-cell/ vävnadsodlingsplatta (figur 1A). Metoderna för beredning, odling och övervakning av ECT-bildning och funktion under en definierad geometri och mekanisk belastning med hjälp av 48-brunnsplattan beskrivs. Den formade ECT hålls av integrerade flexibla poler och den mekaniska belastningen kan finjusteras enligt det slutliga syftet genom att använda poler med olika hårdhet (Shore A-värde 36-89), vilket påverkar deras böjstyvhet. Stolpar med en strand A-värde på 46 rekommenderas. Protokollet är dessutom kompatibelt med en tidigare beskriven anpassad cirkulär form, där ECT hålls runt en enda styv stång37. Dimensionerna på denna form anges i figur 1B.

Figure 1
Bild 1: Schematisk representation av gjutformar. A) Teknisk ritning och mått på en gjutform med två flexibla poler. Formen består av en inre omkrets avgränsad av en kort vägg som håller dubbla fäststolpar vid formens huvudkropp. De flexibla polerna har ett fritt horisontellt avstånd till varandra och är anslutna vid basen. Formen möjliggör 180 μL gjutvolym. Brunnen för varje form möjliggör en volymkapacitet på minst 600 μL kulturmedia. Olika materialkompositioner kan användas för att tillverka stolpar med specifika styvheter (t.ex. TM5MED-TM9MED). (B) Teknisk ritning och dimensioner av en ringformad form med en enda styv stång. Detta är en alternativ form med distinkt geometri och mekanisk miljö, som kan användas med ECT-gjutprotokollet37. Den ringformade mögelmonteringsmetoden anpassades från publicerade större format28,41. I korthet omfattar metoden (1) prägling av polytetrafluoretylen (PTFE) gjuter distanser (8 mm diameter) i polydimethylsiloxan (PDMS, silikon) hälls i glasfat (diameter 60 mm) och (2) fixering av en PDMS-polhållare (1,5 mm diameter) koncentriskt inuti den formade ihåliga håligheten, som tjänar till (3) hålla en avtagbar pol (4 mm diameter). Det ihåliga rymdresultatet möjliggör 180 μL gjutvolym. Varje glasfat kan comport flera präglade formar (exemplariskt visas med 5 formar) och har kapacitet för upp till 5 ml kulturmedium. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Protocol

Alla åtgärder skall vidtas i en klass II-kåpa som är installerad i laboratorier under inneslutningsnivå 1. Beroende på lokala föreskrifter och typ av manipuleringar som ska utföras, såsom virusmedierad genöverföring, måste inneslutningsnivån höjas till biosäkerhetsnivå 2 eller 3. Alla kulturer hålls vid 37 °C i en cellodlingsinkubator med en fuktad atmosfär på 5 % CO2 i luften. Observera att volymerna (steg 1 och 2) tillhandahålls för en T75-cellodlingskolv. Justera volymerna till olika k…

Representative Results

ECT når cirka 95 % komprimering jämfört med den ursprungliga cell-kollagenhydrogelvolymen inom de första 24 h. Vävnadskomprimering och sammandragning under kontrollförhållanden och i närvaro av FCS följer några timmar efter gjutning och ökar särskilt fram till dag 5 (figur 5A). Pole avböjning kan öka ytterligare under de följande 15 dagarna (20 dagar var den längsta testade tiden). Storleken på polavböjningen beror på celltyp, celltillstånd och cell- och vävnadsodlingsf?…

Discussion

Det presenterade protokollet beskriver genereringen av ECT från primära mänskliga CF, vilket gör det möjligt att studera den mekaniska effekten av dessa celler på deras extracellulära matrismiljö och vice versa.

Fibroblaster måste utökas för att ge tillräckliga celler för de planerade ECT-experimenten (0,75 x 106 celler/ECT). För bästa reproducerbarhet rekommenderas att förkulturera frysta eller vävnadsbaserade fibroblaster i 2D-monoskiktskultur under en standardise…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av det tyska hjärtsällskapet (DGK Research Fellowship for GLS) och av den tyska forskningsstiftelsen (DFG genom projektet IRTG 1816 för GLS och AD; DFG 417880571 och DFG TI 956/1-1 för MT; SFB 1002 TP C04 för MT och WHZ; SFB 1002 TP S01 för WHZ; och EXC 2067/1-390729940J för WHZ). WHZ stöds av det tyska federala ministeriet för vetenskap och utbildning (BMBF genom projektet IndiHEART) och Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ och SL stöds av german center for cardiovascular research (DZHK).

Materials

Cell culture reagents:
Accutase Solution Merk Millipore SCR005
Dissociation reagent – TrypLE Express Gibco 12604013
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose Gibco 12100061
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ Gibco 14190144
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3132
FBM Fibroblast Growth Basal Medium Lonza CC-3131
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors Lonza CC-4126
Fibroblast Growth Medium 3 KIT PromoCell C-23130
Fibroblast Basal Medium 3 PromoCell C-23230
Growth Medium 3 SupplementPack PromoCell C-39350
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) Gibco 15140122
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N Sigma-Aldrich S2770-100ML
Cell sources:
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) Lonza CC-2904
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) PromoCell C-12375
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) PromoCell C-12377
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) ATCC SCRC- 1041
Collagen sourses:
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl LLC Collagen Solutions FS22024 6-7 mg/mL
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl Corning 354236 ~4 mg/mL
Drugs:
Latrunculin-A (Lat-A) Enzo Life Sciences BML-T119-0100
Plastic ware:
Cell culture plastic ware Sarstedt and Starlab
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) Falcon 352340
myrPlate-uniform myriamed GmbH TM5 med
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) Corning 07-200-619
Specific instruments:
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors OptoEngineering TCCR12096
Area scan camera Basler ace acA4024 Basler 107404

References

  1. Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
  2. Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (16), 7540-7545 (2011).
  3. Elson, E. L., Genin, G. M. Tissue constructs: platforms for basic research and drug discovery. Interface Focus. 6 (1), 20150095 (2016).
  4. Cho, N., Razipour, S. E., McCain, M. L. TGF-beta1 dominates extracellular matrix rigidity for inducing differentiation of human cardiac fibroblasts to myofibroblasts. Experimental Biology and Medicine. 243 (7), 601-612 (2018).
  5. Cucoranu, I., et al. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circulation Research. 97 (9), 900-907 (2005).
  6. Peng, H., Carretero, O. A., Peterson, E. L., Rhaleb, N. E. Ac-SDKP inhibits transforming growth factor-beta1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), 1357-1364 (2010).
  7. Ribeiro, A. J., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  8. Tranquillo, R. T., Durrani, M. A., Moon, A. G. Tissue engineering science: consequences of cell traction force. Cytotechnology. 10 (3), 225-250 (1992).
  9. Barocas, V. H., Moon, A. G., Tranquillo, R. T. The fibroblast-populated collagen microsphere assay of cell traction force–Part 2: Measurement of the cell traction parameter. Journal of Biomechanical Engineering. 117 (2), 161-170 (1995).
  10. Lijnen, P., Petrov, V., Rumilla, K., Fagard, R. Stimulation of collagen gel contraction by angiotensin II and III in cardiac fibroblasts. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 3 (3), 160-166 (2002).
  11. Baxter, S. C., Morales, M. O., Goldsmith, E. C. Adaptive changes in cardiac fibroblast morphology and collagen organization as a result of mechanical environment. Cell Biochemistry and Biophysics. 51 (1), 33-44 (2008).
  12. Zhou, Y., et al. Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1096-1108 (2013).
  13. Lijnen, P., Petrov, V., Fagard, R. In vitro assay of collagen gel contraction by cardiac fibroblasts in serum-free conditions. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 23 (7), 377-382 (2001).
  14. Burgess, M. L., et al. Integrin-mediated collagen gel contraction by cardiac fibroblasts. Effects of angiotensin II. Circulation Research. 74 (2), 291-298 (1994).
  15. Nunohiro, T., Ashizawa, N., Graf, K., Hsueh, W. A., Yano, K. Angiotensin II promotes integrin-mediated collagen gel contraction by adult rat cardiac fibroblasts. Japanese Heart Journal. 40 (4), 461-469 (1999).
  16. Ngu, J. M., et al. Human cardiac fibroblast extracellular matrix remodeling: Dual effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Cardiovascular Pathology. 23 (6), 335-343 (2014).
  17. Knezevic, V., Sim, A. J., Borg, T. K., Holmes, J. W. Isotonic biaxial loading of fibroblast-populated collagen gels: a versatile, low-cost system for the study of mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 1 (1), 59-67 (2002).
  18. Delvoye, P., Wiliquet, P., Leveque, J. L., Nusgens, B. V., Lapiere, C. M. Measurement of mechanical forces generated by skin fibroblasts embedded in a three-dimensional collagen gel. Journal of Investigative Dermatology. 97 (5), 898-902 (1991).
  19. Kolodney, M. S., Elson, E. L. Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (32), 23850-23855 (1993).
  20. Bell, B. J., Nauman, E., Voytik-Harbin, S. L. Multiscale strain analysis of tissue equivalents using a custom-designed biaxial testing device. Biophysical Journal. 102 (6), 1303-1312 (2012).
  21. Wakatsuki, T., Kolodney, M. S., Zahalak, G. I., Elson, E. L. Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophysical Journal. 79 (5), 2353-2368 (2000).
  22. Thomopoulos, S., et al. Fibrocartilage tissue engineering: The role of the stress environment on cell morphology and matrix expression. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 1039-1053 (2011).
  23. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (2), 214-222 (2002).
  24. Ongherth, A., et al. p63RhoGEF regulates auto- and paracrine signaling in cardiac fibroblasts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 88, 39-54 (2015).
  25. Vettel, C., et al. PDE2-mediated cAMP hydrolysis accelerates cardiac fibroblast to myofibroblast conversion and is antagonized by exogenous activation of cGMP signaling pathways. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (8), 1246-1252 (2014).
  26. Jatho, A., et al. RhoA Ambivalently Controls Prominent Myofibroblast Characteritics by Involving Distinct Signaling Routes. PLoS One. 10 (10), 0137519 (2015).
  27. Dworatzek, E., et al. Sex-specific regulation of collagen I and III expression by 17beta-Estradiol in cardiac fibroblasts: role of estrogen receptors. Cardiovascular Research. 115 (2), 315-327 (2019).
  28. Tiburcy, M., Meyer, T., Soong, P. L., Zimmermann, W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods in Molecular Biology. 1181, 167-176 (2014).
  29. Schlick, S. F., et al. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 51-60 (2019).
  30. Wille, J. J., Elson, E. L., Okamoto, R. J. Cellular and matrix mechanics of bioartificial tissues during continuous cyclic stretch. Annals of Biomedical Engineering. 34 (11), 1678-1690 (2006).
  31. Berry, C. C., Shelton, J. C., Bader, D. L., Lee, D. A. Influence of external uniaxial cyclic strain on oriented fibroblast-seeded collagen gels. Tissue Engineering. 9 (4), 613-624 (2003).
  32. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Developmental Biology. 90 (2), 383-398 (1982).
  33. Bellows, C. G., Melcher, A. H., Aubin, J. E. Association between tension and orientation of periodontal ligament fibroblasts and exogenous collagen fibres in collagen gels in vitro. Journal of Cell Science. 58 (1), 125-138 (1982).
  34. Tranquillo, R. T. Self-organization of tissue-equivalents: the nature and role of contact guidance. Biochemical Society Symposia. 65, 27-42 (1999).
  35. Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of Biomechanical Engineering. 119 (2), 137-145 (1997).
  36. Yip, A. K., et al. Anisotropic traction stresses and focal adhesion polarization mediates topography-induced cell elongation. Biomaterials. 181, 103-112 (2018).
  37. Santos, G. L., Hartmann, S., Zimmermann, W. H., Ridley, A., Lutz, S. Inhibition of Rho-associated kinases suppresses cardiac myofibroblast function in engineered connective and heart muscle tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 134, 13-28 (2019).
  38. Kittana, N., et al. Modulating the biomechanical properties of engineered connective tissues by chitosan-coated multiwall carbon nanotubes. International Journal of Nanomedicine. 16, 989-1000 (2021).
  39. Kittana, N., et al. Enhancement of wound healing by single-wall/multi-wall carbon nanotubes complexed with chitosan. International Journal of Nanomedicine. 13, 7195-7206 (2018).
  40. Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
  41. Holder, A. J., et al. Control of collagen gel mechanical properties through manipulation of gelation conditions near the sol-gel transition. Soft Matter. 14 (4), 574-580 (2018).
  42. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).

Play Video

Cite This Article
Santos, G. L., Meyer, T., Tiburcy, M., DeGrave, A., Zimmermann, W., Lutz, S. Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications. J. Vis. Exp. (174), e62700, doi:10.3791/62700 (2021).

View Video