Presenteras här är ett protokoll för att generera konstruerade bindväv för en parallell kultur av 48 vävnader i en multi-well plate med dubbla poler, lämplig för mekanistiska studier, sjukdom modellering och screening applikationer. Protokollet är kompatibelt med fibroblaster från olika organ och arter och exemplifieras här med mänskliga primära hjärtfibblaster.
Fibroblaster är fenotypiskt mycket dynamiska celler, som snabbt transdifferentierar till myofibroblaster som svar på biokemiska och biomekaniska stimuli. Den nuvarande förståelsen av fibrotiska processer, inklusive hjärtfibros, är fortfarande dålig, vilket hämmar utvecklingen av nya antifibrosbehandlingar. Kontrollerbara och tillförlitliga mänskliga modellsystem är avgörande för en bättre förståelse av fibrospatologi. Detta är ett mycket reproducerbart och skalbart protokoll för att generera konstruerade bindväv (ECT) i en 48-väl gjutningsplatta för att underlätta studier av fibroblaster och patofysiologi av fibrotisk vävnad i en 3-dimensionell (3D) miljö. ECT genereras runt polerna med tunable styvhet, vilket möjliggör studier under en definierad biomekanisk belastning. Under de definierade belastningsförhållandena kan fenotypiska anpassningar som styrs av cellmatrisinteraktioner studeras. Parallell testning är möjlig i 48-brunnsformatet med möjlighet till tidsvägsanalys av flera parametrar, såsom vävnadskomprimering och sammandragning mot belastningen. Från dessa parametrar kan biomekaniska egenskaper som vävnadsstelhet och elasticitet studeras.
Ett stort hinder i studien av fibrotiska sjukdomar är bristen på representativa mänskliga 3D-vävnadsmodeller som ger insikt i fibroblasters beteende och deras patologiska derivat. För att studera fibrotiska processer är standard 2D-odlingssystem suboptimala eftersom isolerade fibroblaster snabbt omvandlas till α-smooth muscle actin (SMA) -uttrycka myofibroblaster när de odlas på icke-kompatibla 2D-substrat1,2,3. Fibroblaster i standard 2D-kulturen återspeglar således inte en regelbunden “hälsosam” vävnad fenotyp3,4,5,6. Kulturer på följsamma substrat har införts för att simulera icke-fibrotiska (10 kPa) och fibrotiska (35 kPa) vävnadsmiljöer7, men dessa saknar den tredje dimensionen, vilket är mycket viktigt med avseende på patofysiologi. Vävnadsteknik ger möjlighet att övervinna denna begränsning genom att tillåta fibroblastkultur i en definierad och experimentellt tunable extracellulär matris (ECM) -sammanhang, till exempel genom förändringar i celluläritet, ECM-sammansättning och ECM-koncentration, som alla kan bestämma vävnadsbiomekaniken.
Olika 3D-modeller har genererats med fibroblaster. Flytande skivor och mikrosfärer var bland de första och visar att kollagen är ombyggt och komprimerat på ett tidsberoende sätt. Fibroblaster utövar dragkrafter på kollagenfibriller, en process som kan underlättas genom tillsats av pro-fibrotiska medel som omvandling av tillväxtfaktor-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Fritt flytande kulturer medger dock inte den kontrollerade externa belastningen och utgör därför kontinuerligt krympande eller komprimerande modeller. Arkliknande konstruerade vävnader öppnade möjligheten att studera homeostatisk reglering av biomekaniska egenskaper hos vävnader, nämligen genom uni-, bi-, multiaxial- eller cyklisk stamtestning17,18,19,20. Dessa modeller har använts t.ex. för att visa cellnumrets inverkan på vävnadsstelheten, som visade sig korrelera positivt med cytoskelettintegritet och aktomyosin cytoskeletonkontraktilitet18,19. Det är dock viktigt att notera att omvandlingar från kraft till stam kompliceras av den ojämna vävnadsdeformationen runt klämpunkter för kraftgivare och ankarpunkter. Denna inneboende begränsning kan kringgås av hundben eller ringformade vävnader, vilket ger viss vävnadsövervakning vid ankarpunkter21,22,23. Ringformade vävnader kan beredas genom att distribuera en cell-kollagen hydrogel till ringformade formar. När hydrogelen komprimeras bildas en vävnad runt den okomprimerbara inre stången i formen, vilket ger motstånd för ytterligare vävnadskontraktion24,25,26,27. Efter inledande och typiskt maximal komprimering kan vävnader också överföras till justerbara distanser för att ytterligare begränsa cirkulär ECT vid en definierad vävnadslängd3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysiska egenskaper kan bedömas i horisontella eller vertikala belastningsanordningar med lämpliga belastningsceller under enkelriktad eller dynamisk belastning3. Eftersom vävnaderna har en i stort sett enhetlig cirkulär struktur och kan hållas på stänger/krokar (förankringspunkter och/eller kraftgivare), även om dessa fortfarande kan omsluta kompressionsområden runt laststängerna, möjliggör detta format en mer enhetlig belastningsvariation jämfört med fastspänning3. Dessutom framkallar förankrade vävnader en bipolär cellform, och celler anpassar sig till vävnadskrafterna genom förlängning längs kraftlinjer som främjar anisotrop dragkraft31,32,33,34,35,36. Vi har tidigare applicerat ringformad ECT från råtta och mänskliga hjärtfibblaster (CF) runt en enda styv pol i funktionella stress-stamexperiment och utfört vinst och förlust av funktionsstudier med hjälp av viralt transduced fibroblaster24,25,26 och farmakologiska studier37. Vidare skulle vi kunna identifiera könsskillnader i CF-medierad fibros i ECT-modellen27.
Följande protokoll för generering av mänsklig ECT, exemplifierat med primär mänsklig CF som erhållits som kryopreserverad CF från kommersiella leverantörer (se Tabell över material), kombinerar fördelarna med ringformade vävnader med ett enkelt och snabbt sätt att producera makroskopiska vävnader för en 48-väl plattform utformad för parallell testning med högt innehåll.
Viktigt är att ECT-modellen inte är begränsad till en specifik fibroblasttyp, med dokumenterad användning vid undersökning av andra fibroblaster, t.ex. hudfibblaster38,39. Dessutom fungerar fibroblaster från patientens tarmbiopsier lika bra, och valet av fibroblaster beror i slutändan på den vetenskapliga fråga som ska tas upp.
Plattformen som används för generering av ECT som beskrivs i detta protokoll är en kommersiellt tillgänglig 48-brunns 3D-cell/ vävnadsodlingsplatta (figur 1A). Metoderna för beredning, odling och övervakning av ECT-bildning och funktion under en definierad geometri och mekanisk belastning med hjälp av 48-brunnsplattan beskrivs. Den formade ECT hålls av integrerade flexibla poler och den mekaniska belastningen kan finjusteras enligt det slutliga syftet genom att använda poler med olika hårdhet (Shore A-värde 36-89), vilket påverkar deras böjstyvhet. Stolpar med en strand A-värde på 46 rekommenderas. Protokollet är dessutom kompatibelt med en tidigare beskriven anpassad cirkulär form, där ECT hålls runt en enda styv stång37. Dimensionerna på denna form anges i figur 1B.
Bild 1: Schematisk representation av gjutformar. A) Teknisk ritning och mått på en gjutform med två flexibla poler. Formen består av en inre omkrets avgränsad av en kort vägg som håller dubbla fäststolpar vid formens huvudkropp. De flexibla polerna har ett fritt horisontellt avstånd till varandra och är anslutna vid basen. Formen möjliggör 180 μL gjutvolym. Brunnen för varje form möjliggör en volymkapacitet på minst 600 μL kulturmedia. Olika materialkompositioner kan användas för att tillverka stolpar med specifika styvheter (t.ex. TM5MED-TM9MED). (B) Teknisk ritning och dimensioner av en ringformad form med en enda styv stång. Detta är en alternativ form med distinkt geometri och mekanisk miljö, som kan användas med ECT-gjutprotokollet37. Den ringformade mögelmonteringsmetoden anpassades från publicerade större format28,41. I korthet omfattar metoden (1) prägling av polytetrafluoretylen (PTFE) gjuter distanser (8 mm diameter) i polydimethylsiloxan (PDMS, silikon) hälls i glasfat (diameter 60 mm) och (2) fixering av en PDMS-polhållare (1,5 mm diameter) koncentriskt inuti den formade ihåliga håligheten, som tjänar till (3) hålla en avtagbar pol (4 mm diameter). Det ihåliga rymdresultatet möjliggör 180 μL gjutvolym. Varje glasfat kan comport flera präglade formar (exemplariskt visas med 5 formar) och har kapacitet för upp till 5 ml kulturmedium. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Det presenterade protokollet beskriver genereringen av ECT från primära mänskliga CF, vilket gör det möjligt att studera den mekaniska effekten av dessa celler på deras extracellulära matrismiljö och vice versa.
Fibroblaster måste utökas för att ge tillräckliga celler för de planerade ECT-experimenten (0,75 x 106 celler/ECT). För bästa reproducerbarhet rekommenderas att förkulturera frysta eller vävnadsbaserade fibroblaster i 2D-monoskiktskultur under en standardise…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det tyska hjärtsällskapet (DGK Research Fellowship for GLS) och av den tyska forskningsstiftelsen (DFG genom projektet IRTG 1816 för GLS och AD; DFG 417880571 och DFG TI 956/1-1 för MT; SFB 1002 TP C04 för MT och WHZ; SFB 1002 TP S01 för WHZ; och EXC 2067/1-390729940J för WHZ). WHZ stöds av det tyska federala ministeriet för vetenskap och utbildning (BMBF genom projektet IndiHEART) och Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ och SL stöds av german center for cardiovascular research (DZHK).
Cell culture reagents: | |||
Accutase Solution | Merk Millipore | SCR005 | |
Dissociation reagent – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose | Gibco | 12100061 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ | Gibco | 14190144 | |
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
FBM Fibroblast Growth Basal Medium | Lonza | CC-3131 | |
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4126 | |
Fibroblast Growth Medium 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
Fibroblast Basal Medium 3 | PromoCell | C-23230 | |
Growth Medium 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) | Gibco | 15140122 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
Cell sources: | |||
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC- 1041 | |
Collagen sourses: | |||
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl | LLC Collagen Solutions | FS22024 | 6-7 mg/mL |
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 mg/mL |
Drugs: | |||
Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
Plastic ware: | |||
Cell culture plastic ware | Sarstedt and Starlab | ||
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) | Falcon | 352340 | |
myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) | Corning | 07-200-619 | |
Specific instruments: | |||
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors | OptoEngineering | TCCR12096 | |
Area scan camera Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |