Summary
Presenteras här är ett protokoll för att generera konstruerade bindväv för en parallell kultur av 48 vävnader i en multi-well plate med dubbla poler, lämplig för mekanistiska studier, sjukdom modellering och screening applikationer. Protokollet är kompatibelt med fibroblaster från olika organ och arter och exemplifieras här med mänskliga primära hjärtfibblaster.
Abstract
Fibroblaster är fenotypiskt mycket dynamiska celler, som snabbt transdifferentierar till myofibroblaster som svar på biokemiska och biomekaniska stimuli. Den nuvarande förståelsen av fibrotiska processer, inklusive hjärtfibros, är fortfarande dålig, vilket hämmar utvecklingen av nya antifibrosbehandlingar. Kontrollerbara och tillförlitliga mänskliga modellsystem är avgörande för en bättre förståelse av fibrospatologi. Detta är ett mycket reproducerbart och skalbart protokoll för att generera konstruerade bindväv (ECT) i en 48-väl gjutningsplatta för att underlätta studier av fibroblaster och patofysiologi av fibrotisk vävnad i en 3-dimensionell (3D) miljö. ECT genereras runt polerna med tunable styvhet, vilket möjliggör studier under en definierad biomekanisk belastning. Under de definierade belastningsförhållandena kan fenotypiska anpassningar som styrs av cellmatrisinteraktioner studeras. Parallell testning är möjlig i 48-brunnsformatet med möjlighet till tidsvägsanalys av flera parametrar, såsom vävnadskomprimering och sammandragning mot belastningen. Från dessa parametrar kan biomekaniska egenskaper som vävnadsstelhet och elasticitet studeras.
Introduction
Ett stort hinder i studien av fibrotiska sjukdomar är bristen på representativa mänskliga 3D-vävnadsmodeller som ger insikt i fibroblasters beteende och deras patologiska derivat. För att studera fibrotiska processer är standard 2D-odlingssystem suboptimala eftersom isolerade fibroblaster snabbt omvandlas till α-smooth muscle actin (SMA) -uttrycka myofibroblaster när de odlas på icke-kompatibla 2D-substrat1,2,3. Fibroblaster i standard 2D-kulturen återspeglar således inte en regelbunden "hälsosam" vävnad fenotyp3,4,5,6. Kulturer på följsamma substrat har införts för att simulera icke-fibrotiska (10 kPa) och fibrotiska (35 kPa) vävnadsmiljöer7, men dessa saknar den tredje dimensionen, vilket är mycket viktigt med avseende på patofysiologi. Vävnadsteknik ger möjlighet att övervinna denna begränsning genom att tillåta fibroblastkultur i en definierad och experimentellt tunable extracellulär matris (ECM) -sammanhang, till exempel genom förändringar i celluläritet, ECM-sammansättning och ECM-koncentration, som alla kan bestämma vävnadsbiomekaniken.
Olika 3D-modeller har genererats med fibroblaster. Flytande skivor och mikrosfärer var bland de första och visar att kollagen är ombyggt och komprimerat på ett tidsberoende sätt. Fibroblaster utövar dragkrafter på kollagenfibriller, en process som kan underlättas genom tillsats av pro-fibrotiska medel som omvandling av tillväxtfaktor-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Fritt flytande kulturer medger dock inte den kontrollerade externa belastningen och utgör därför kontinuerligt krympande eller komprimerande modeller. Arkliknande konstruerade vävnader öppnade möjligheten att studera homeostatisk reglering av biomekaniska egenskaper hos vävnader, nämligen genom uni-, bi-, multiaxial- eller cyklisk stamtestning17,18,19,20. Dessa modeller har använts t.ex. för att visa cellnumrets inverkan på vävnadsstelheten, som visade sig korrelera positivt med cytoskelettintegritet och aktomyosin cytoskeletonkontraktilitet18,19. Det är dock viktigt att notera att omvandlingar från kraft till stam kompliceras av den ojämna vävnadsdeformationen runt klämpunkter för kraftgivare och ankarpunkter. Denna inneboende begränsning kan kringgås av hundben eller ringformade vävnader, vilket ger viss vävnadsövervakning vid ankarpunkter21,22,23. Ringformade vävnader kan beredas genom att distribuera en cell-kollagen hydrogel till ringformade formar. När hydrogelen komprimeras bildas en vävnad runt den okomprimerbara inre stången i formen, vilket ger motstånd för ytterligare vävnadskontraktion24,25,26,27. Efter inledande och typiskt maximal komprimering kan vävnader också överföras till justerbara distanser för att ytterligare begränsa cirkulär ECT vid en definierad vävnadslängd3,24,25,26,27,28,29,30. Biofysiska egenskaper kan bedömas i horisontella eller vertikala belastningsanordningar med lämpliga belastningsceller under enkelriktad eller dynamisk belastning3. Eftersom vävnaderna har en i stort sett enhetlig cirkulär struktur och kan hållas på stänger/krokar (förankringspunkter och/eller kraftgivare), även om dessa fortfarande kan omsluta kompressionsområden runt laststängerna, möjliggör detta format en mer enhetlig belastningsvariation jämfört med fastspänning3. Dessutom framkallar förankrade vävnader en bipolär cellform, och celler anpassar sig till vävnadskrafterna genom förlängning längs kraftlinjer som främjar anisotrop dragkraft31,32,33,34,35,36. Vi har tidigare applicerat ringformad ECT från råtta och mänskliga hjärtfibblaster (CF) runt en enda styv pol i funktionella stress-stamexperiment och utfört vinst och förlust av funktionsstudier med hjälp av viralt transduced fibroblaster24,25,26 och farmakologiska studier37. Vidare skulle vi kunna identifiera könsskillnader i CF-medierad fibros i ECT-modellen27.
Följande protokoll för generering av mänsklig ECT, exemplifierat med primär mänsklig CF som erhållits som kryopreserverad CF från kommersiella leverantörer (se Tabell över material), kombinerar fördelarna med ringformade vävnader med ett enkelt och snabbt sätt att producera makroskopiska vävnader för en 48-väl plattform utformad för parallell testning med högt innehåll.
Viktigt är att ECT-modellen inte är begränsad till en specifik fibroblasttyp, med dokumenterad användning vid undersökning av andra fibroblaster, t.ex. hudfibblaster38,39. Dessutom fungerar fibroblaster från patientens tarmbiopsier lika bra, och valet av fibroblaster beror i slutändan på den vetenskapliga fråga som ska tas upp.
Plattformen som används för generering av ECT som beskrivs i detta protokoll är en kommersiellt tillgänglig 48-brunns 3D-cell/ vävnadsodlingsplatta (figur 1A). Metoderna för beredning, odling och övervakning av ECT-bildning och funktion under en definierad geometri och mekanisk belastning med hjälp av 48-brunnsplattan beskrivs. Den formade ECT hålls av integrerade flexibla poler och den mekaniska belastningen kan finjusteras enligt det slutliga syftet genom att använda poler med olika hårdhet (Shore A-värde 36-89), vilket påverkar deras böjstyvhet. Stolpar med en strand A-värde på 46 rekommenderas. Protokollet är dessutom kompatibelt med en tidigare beskriven anpassad cirkulär form, där ECT hålls runt en enda styv stång37. Dimensionerna på denna form anges i figur 1B.
Bild 1: Schematisk representation av gjutformar. A) Teknisk ritning och mått på en gjutform med två flexibla poler. Formen består av en inre omkrets avgränsad av en kort vägg som håller dubbla fäststolpar vid formens huvudkropp. De flexibla polerna har ett fritt horisontellt avstånd till varandra och är anslutna vid basen. Formen möjliggör 180 μL gjutvolym. Brunnen för varje form möjliggör en volymkapacitet på minst 600 μL kulturmedia. Olika materialkompositioner kan användas för att tillverka stolpar med specifika styvheter (t.ex. TM5MED-TM9MED). (B) Teknisk ritning och dimensioner av en ringformad form med en enda styv stång. Detta är en alternativ form med distinkt geometri och mekanisk miljö, som kan användas med ECT-gjutprotokollet37. Den ringformade mögelmonteringsmetoden anpassades från publicerade större format28,41. I korthet omfattar metoden (1) prägling av polytetrafluoretylen (PTFE) gjuter distanser (8 mm diameter) i polydimethylsiloxan (PDMS, silikon) hälls i glasfat (diameter 60 mm) och (2) fixering av en PDMS-polhållare (1,5 mm diameter) koncentriskt inuti den formade ihåliga håligheten, som tjänar till (3) hålla en avtagbar pol (4 mm diameter). Det ihåliga rymdresultatet möjliggör 180 μL gjutvolym. Varje glasfat kan comport flera präglade formar (exemplariskt visas med 5 formar) och har kapacitet för upp till 5 ml kulturmedium. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla åtgärder skall vidtas i en klass II-kåpa som är installerad i laboratorier under inneslutningsnivå 1. Beroende på lokala föreskrifter och typ av manipuleringar som ska utföras, såsom virusmedierad genöverföring, måste inneslutningsnivån höjas till biosäkerhetsnivå 2 eller 3. Alla kulturer hålls vid 37 °C i en cellodlingsinkubator med en fuktad atmosfär på 5 % CO2 i luften. Observera att volymerna (steg 1 och 2) tillhandahålls för en T75-cellodlingskolv. Justera volymerna till olika kulturformat enligt standardrekommendationerna för cellkultur.
1. Upptining och förplätering av primärt hjärtfibblast (CF) för monoskiktskultur (5-12 dagar)
OBS: Som ett alternativ kan HFF-1-celler användas enligt standardunderkulturprotokollet enligt leverantörens råd.
- Förbered fibroblasttillväxtmediet enligt tillverkarens instruktioner. Alternativt, tillsätt antibiotika som 100 U / mL penicillin och 100 mg / mL streptomycin. Tillåt fullständig blandning av alla komponenter före användning. Förvara vid 4 °C i upp till 14 dagar.
- Varm kvinnlig könsstympning till 20-25 °C.
- Tina den kryopreserverade CF (helst innehållande 1 x 106 till 2 x 106/ml celler per kryovial) i ett vattenbad vid 37 °C i cirka 2 minuter, tills endast en liten mängd is finns kvar i injektionsflaskan.
- Använd en serologisk pipett på 2 ml och överför cellfjädringen droppvis till ett lämpligt sterilt centrifugrör som innehåller 10 ml kvinnlig könsstympning. För optimal cellhämtning, skölj kryovialen med 1 ml FGM och överför den till centrifugröret. Eftersom cellerna är mycket känsliga i detta skede, återanvänd med hjälp av en serologisk pipett med en borrspets för att minimera cellskador genom skjuvningsstress.
OBS: Om kryopreservationsmediet innehåller en hög andel DMSO, se till att DMSO-halten efter cellresuspension i kvinnlig könsstympning är mindre än 1 %. Alternativt kan du centrifugera de återanvända cellerna vid 300 x g i 5 min vid 20-25 °C för medelbörsen. Aspirera sedan supernatanten försiktigt, snurra röret för att lossa de pelleterade cellerna och återanvända dem i önskad volym av kvinnlig könsstympning för sådd. - Frö 0,5 x 106 celler i 12 ml kvinnlig könsstympning till en T75-cellodlingskolv. Om andra labware används justerar du cellnumret för att bibehålla en såddtäthet på 6,7 x 103/cm2.
- Byt ut kvinnlig könsstympning varannan dag i 5 dagar eller tills cellerna når 80 % sammanflöde.
OBS: Cellutbytet efter expansionen beror främst på cellstorleken och spridningshastigheten, som kan skilja sig mellan celldonatorer. Vanligtvis tillåter denna standardkulturprocedur hämtning av 4 x 106 till 5 x 106 CF från en T75-cellkulturkolv efter 5 dagars kultur.
2. Enzymatisk spridning av mänsklig CF (10-20 min)
OBS: Detta steg syftar till att upprätta en enda cell suspension av mänskliga CF för både sub-odling monolayer celler och beredning av ECT. Detta protokoll har optimerats för mänskliga CF monolayer kulturer i passager 3-4. För optimal standardisering rekommenderas subodling CF i monolayer, minst en gång före ECT-beredning. Detta protokoll måste optimeras för fibroblaster som härrör från olika givare och leverantörer. Alternativa lösgöringsprotokoll kan innebära att rekombinant serinproteasbaserade dissociationsreagenser ersättas med t.ex.
- Varm kvinnlig könsstympning, PBS (Ca2+/Mg2+-fri) och cell dissociation reagens till 20-25 °C.
- Aspirera mediet från de odlade cellerna.
- Tvätta celler med 6 ml PBS och aspirat.
- Tillsätt 6 ml av cellavskiljningsreagenset i cellerna och inkubera i 3 min vid 20-25 °C tills cellerna börjar lossna synligt.
OBS: Beroende på CF-källan kan detta ta flera minuter längre tid. Alternativt, om cellerna inte lossnar vid rumstemperatur, inkubera vid 37 °C för att förbättra enzymernas aktivitet. För att säkerställa optimal cellviabilitet, övervaka cellavlossning under mikroskopet. - Neutralisera enzymatisk aktivitet genom att tillsätta 6-12 ml kvinnlig könsstympning till de rubbade cellerna i reagenset för cell dissociation. Rör försiktigt upp och ner 4-8 gånger med en 10 ml serologisk pipett för att säkerställa en enda cellfjädring och överför celler till ett nytt 50 ml uppsamlingsrör. Kontrollera utbytet med hjälp av ett mikroskop och en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare enligt tillverkarens instruktioner.
- Centrifugera cellfjädringen vid 300 x g i 5 min vid 20-25 °C.
OBS: För att uppnå ett utbyte av celler som är tillräckliga för generering av önskad mängd ECT kan celler underkultureras i en utspädning på upp till 1:6 för ytterligare expansion. Låt cellerna växa tills 80% sammanflöde uppnås (cirka 5-6 dagar), med medieförändring varannan dag. Upprepa sedan den enzymatiska dispersionen och fortsätt med steg 2.7. att fortsätta med ECT-förberedelsen. - Aspirera supernatanten och snärta röret för att lossa pelleten. Återanvänd cellerna i kvinnlig könsstympning vid 20–25 °C för att få en cellavstängning på ≥ 15 x 106/ml (cirka 40 % fler celler än vad som krävs för steg 3.3). Detta förklarar cellförlusten på grund av påfrestningar i följande steg.
- Sila cellupphängningen genom en 40 μm mesh cell sil.
VARNING: Cellagglomerat är skadliga för den optimala bildandet av ECT. Vid användning av enzymatisk spridning av human CF-protokoll för direktgjutning av ECT, säkerställer stamning av cellupphängningen frånvaron av större cellklumpar som stör homogen vävnadsbildning. Heterogeniteter kommer att äventyra tillförlitliga stress-ansträngande analyser. - Räkna om cellantalet och utvärdera cellens livskraft för att säkerställa ett tillförlitligt cellnummer i en suspension med ≥80 % viabilitet för att fortsätta med ECT-preparat.
- Använd en automatiserad cellräknare för att bedöma cellnummer och livskraft genom uteslutning av elektrisk ström.
- Alternativt kan du använda trypan blå (cancerframkallande, fara kategori 2 - vidta försiktighetsåtgärder) färg uteslutningstest, med hjälp av ett mikroskop och en hemocytometer för direkt identifiering och uppräkning av levande (intakta cellmembran som utesluter färgämnet) och döda (komprometterade cellmembran som möjliggör bindning av färgämnet till intracellulära proteiner) celler.
- Reservera uppsamlingsröret med cellfjädring vid 20-25 °C och fortsätt omedelbart med steg 3.
3. ECT-preparat (1 h)
Schematisk översikt över ECT-generering beskrivs i figur 2.
Bild 2: Schematisk översikt över ECT-generering. Fibroblaster utökas i 2D-odling före användning i ECT-generationen. Efter 5-10 dagar sprids cellerna enzymatiskt och cell suspensionen rekonstitueras i en buffrad blandning som innehåller bovint kollagen typ 1. Cell-kollagen hydrogelblandningen pipetteras i enskilda brunnar i en 48-brunnsplatta för 3D-konstruerad vävnadskultur, utformad som gjutformar med två flexibla poler för att möjliggöra ECT-fjädring vid en definierad längd och belastning. ECT odlas vanligtvis i 1 till 20 dagar före mätningar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Förbered en 10x DMEM-stamlösning genom att lösa upp DMEM-pulver i ddH2O (134 mg/ml för den formulering som anges i materialregistret) under en konstant rotation vid 37 °C för 1 h. Sterilisera genom filtrering. Beståndet är stabilt i upp till 14 dagar vid 4 °C eller -20 °C i upp till 12 månader.
- Nyberöm 2x DMEM genom att späda ut en 10x DMEM-stamlösning och genom att tillsätta 20 % (v/v) FCS i steril ddH2O. Använd eventuellt antibiotika som 200 U/mL penicillin och 200 mg/ml streptomycin. Se tabell 1 för pipetteringsvolymer. Beståndet är stabilt i upp till 14 dagar vid 4 °C.
OBS: Utför steg 3.1. och 3.2. innan enzymatisk spridning av celler (steg 2) börjar för beredning av ECT.
| Reagens | Slutlig koncentration | Volym (mL) |
| 10× DMEM | n/a | 2 |
| FCS | 20 % (v/v) | 2 |
| Penicillin | 200 U/mL | 0.2 |
| Streptomycin | 200 mg/ml | 0.2 |
| ddH2O | n/a | 5.6 |
| Total | n/a | 10 |
Tabell 1: Sammansättning av 2x DMEM.
VARNING: Alla komponenter till cell-kollagen hydrogelblandningen och centrifugrören måste förvaras på is före användning. Detta kommer att bidra till att förhindra att kollagen självmontering sker innan cell-kollagen hydrogelblandningen distribueras i hela gjutformarna.
- Justera cellupphängningen till en densitet av 8,88 x 106 celler/ml genom att tillsätta kvinnlig könsstympning vid 20–25 °C i cellupphängningen från steg 2.10. Flytta sedan uppsamlingsröret med cellfjädring till is.
- För att förbereda ECT-hydrogelblandningen, förkyla ett 50 ml centrifugrör på is och lägg till de olika komponenterna som anges i tabell 2 i följande ordning, så att luftbubbla bildas.
OBS: Det maximala antalet ECT som ska beredas beror på det totala cellantalet som bestäms i steg 2.9. Använd 0,3 mg kollagen per ECT, erhållen från en stamlösning som innehåller 6-7 mg/ml. Koncentrationen av kollagenbuljonglösningen bestämmer den volym som behövs för att få ett optimalt ECT-kollageninnehåll. Volymerna av de andra ECT-hydrogelkomponenterna måste anpassas i enlighet med detta. Se tabell 2 för justerade volymer enligt en kollagenbuljonglösning på 6,49 mg/ml. De volymer som beskrivs i tabell 2 används i detta protokoll som en föredömlig riktlinje.- Pipettera den syralösliga kollagen typ 1 hydrogelen med en serologisk pipett med en bred borrspets.
- Justera salthalten i kollagenlösningen genom att tillsätta 2x DMEM samtidigt som du försiktigt blandar genom att virvla röret.
- Neutralisera pH genom att tillsätta 0,2 M NaOH samtidigt som du försiktigt blandar genom att virvla runt röret. Fenol röd indikator kommer att vända från gul till röd.
OBS: NaOH-volymen måste titreras för varje enskild kollagensats för optimal pH-neutralisering. Neutralisering beror på faktorer som bufferttyp och preparat, liksom absolut kollagenkoncentration, och det påverkar kollagenmatrisens sammansättning och cellens livskraft23,40. När joninnehållet har ökat genom tillsats av DMEM och pH neutraliseras, följer kollagenets självmontering och får inte störas. Utför därför följande snabbt och utan pauser. - Tillsätt cellfjädringen (från steg 3.3) droppvis medan du försiktigt blandar genom att virvla röret.
| ECT-nummer: | 1 | 6 | 24 | 48 | |
| inklusive 10 % överskott | |||||
| Cell-kollagen hydrogel komponenter: | (μL) | (μL) | (μL) | (μL) | |
| Kollagenbuljong (6,49 mg/ml) | 46.2 | 305.1 | 1220.2 | 2440.4 | |
| 2× DMEM | 46.2 | 305.1 | 1220.2 | 2440.4 | |
| 0.2 M NaOH | 3.1 | 20.5 | 81.8 | 163.7 | |
| Cellblandning i kvinnlig könsstympning (8,88×106 cell/ml) | 84.5 | 557.4 | 2229.7 | 4459.5 | |
| Total volym (μL) | 180.0 | 1188.0 | 4752.0 | 9504.0 | |
| Detta är en exemplarisk tabell för att förbereda en gjutvolym på 180 μL per ECT, som innehåller totalt 750 000 celler och 0,3 mg kollagen per ECT. | |||||
Tabell 2: Beredning av ECT-hydrogel (inklusive ett överskott på 10 % för pipetteringsfel).
- Blanda hela suspensionen genom att försiktigt pipettera upp och ner endast en gång, med hjälp av en serologisk pipett med en bred borrspets för att undvika bubbelbildning och minimera skjuvspänning. Säkerställ fullständig blandning genom att försiktigt virvla röret 10 gånger och förvara 50 ml centrifugrör som innehåller ECT hydrogelblandning på is under hela gjutprocessen.
- Förte en 1 mL pipettspets med ECT hydrogelblandning och fördela 180 μL av den jämnt i varje form av 48-brunnsgjutningsplattan, vilket undviker överdrivna skjuvkrafter som kan påverka kollagenmatrisenhetens integritet och se till att hela plattan görs på 15-20 min.
OBS: Den rekommenderade gjutvolymen är 180 μL, men den kan förlängas till 200 μL38. När så önskas kan därför volymerna i tabell 2 anpassas till 200 μL på ett sätt som håller samma koncentrationer och förhållande mellan celler och kollagen.- Se till att en komplett slinga bildas i formen (figur 3A). Om ECT-hydrogelblandningen appliceras kontinuerligt förhindras en fullständig ECT-ringbildning (figur 3B).
- Undvik pipettering i den inre brunnen (figur 3C) och bildandet av bubblor under pipettering (figur 3D), för att säkerställa en homogen och funktionell vävnadsbildning.
Bild 3: Gjutning, hydrogelbildning och ECT-kondens i flerbrunnformat. De övre panelerna exemplifierar utseendet på ECT direkt efter gjutning. De mellersta panelerna exemplifierar utseendet på ECT efter inkubation i 20 minuter vid 37 °C. De nedre panelerna exemplifierar komprimeringstillståndet för ECT 24 h efter beredning, borttagen från polerna. A) Korrekt ECT-formation mellan två poler under de första 24 h. (B-D) Exempel på pipetteringsfel som förhindrar korrekt ECT-bildning. De vita och svarta pilarna pekar på strukturella defekter hos ECT på grund av felaktig gjutning. Skalstreck: 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Placera försiktigt 48-brunnsgjutningsplattan inuti cellodlingsinkubatorn och låt ECT hydrogelblandningen rekonstrueras i 15-30 min. Efter inkubation kommer det att verka gelliknande och ogenomskinligt (figur 3, mittpanel).
- Tillsätt 600 μL 37 °C varm kvinnlig könsstympning per brunn, utan att leda odlingsmediet direkt på den formande ECT eftersom detta kan leda till vävnadsstörningar. Tillsätt försiktigt odlingsmediet längs brunnsväggen, eftersom ECT vid denna punkt inte heller får lossna från botten (figur 4).
Figur 4: Korrekt och felaktig tillsats av odlingsmedium till den nygjutna ECT. (A) Vid tillsats av odlingsmediet efter den första ECT-stelningen (20 min efter gjutning) måste den kondenserande ECT lämnas ostört i botten av brunnen. Under de kommande 24 h kommer celldriven matriskomprimering att få ECT att glida upp rampen. Den slutliga ECT-positionen styrs av konkava håligheter vid en definierad polhöjd; Detta säkerställer att alla ECT sätter sig i samma position för att möjliggöra en jämförelse av polbockningsaktivitet i parallell ECT-kultur. B) Att bilda ECT lossna från botten samtidigt som odlingsmediet tillsätts för snabbt. Flytande ECT komprimeras på den övre kulturens medelnivå. Pole entreprenadkrafter kommer inte att vara direkt jämförbara om ECT bosätter sig på olika positioner. Skalstreck: 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Inkubera i 24 timmar.
- Byt ut mediet varje dag därefter, med 500 μL kvinnlig könsstympning tills analysen.
OBS: Efter den inledande fasen av celloberoende gelering börjar den mänskliga CF ytterligare komprimera ECT-hydrogelblandningen. Inom 24 timmar bör ECT vara särskilt komprimerat och upphöjt till den nivå där det hålls på de flexibla polerna (figur 3 och figur 4A).
4. Bedömning av ECT-komprimering genom mätning av tvärsnittsarea (CSA) (5 min per ECT).
OBS: Vävnadskomprimering börjar omedelbart efter kollagenenheten och är särskilt betydelsefull under de första timmarna. Komprimering beskriver förändringar som främst utlöses av celldriven komprimering av matrisen vinkelrätt mot vävnadens långa axel. Denna parameter bedöms genom att ECT:s tvärsnittsarea (CSA) fastställs.
- Vid önskade tidpunkter använder du ett stereomikroskop för att spela in makroskopiska bilder av ECT:s övre och sidovyer (bild 5C).
OBS: ECT kan avbildas inuti odlingsbrunnarna på 48-brunnsgjutningsplattan. Alternativt kan du överföra ECT till en klar botten multi-well plate för avbildning. Det rekommenderas att avbilda ECT på polerna som avlägsnande av dessa leder till förlust av förbelastning, och följaktligen, inom en kort period, vävnaden kan ytterligare dra ihop sig med eventuell torsion på grund av spänningsfrisättning, vilket kan hämma korrekt avbildning för dimensioners analyser. - Använd ett bildbehandlingsprogram för att utföra en linjesökningsanalys. Ställ in en skala och använd verktyget Straight Line för att spåra och mäta ECT-diametrar till minst 6 positioner per arm i varje bildplan (figur 5B,C).
- Beräkna medelvärdesdiametern från plan över- och sidovyer och beräkna CSA enligt en elliptisk områdesekvation:
Figur 5: Övervakning av ECT-komprimering över tid efter analys av tvärsnittsarea (CSA). ECT genererades med hjälp av human CF och kollagen typ I och odlade runt två flexibla poler i 5 dagar. (A) Representativa bilder av kontroll ECT placeras i flexibla formar under en tid av 5 dagar presenteras. Skalstång = 5 mm. Sådana ljusfältsbilder kan också användas för att bestämma polavböjningsvariation för att uppskatta vävnadskontraktion. B) Schematisk representation av tvärsnittsområdet för en ECT (övre siktdiameter i grönt och sidovydiameter i rosa). C) Makroskopiska bilder av topp- och sidovyer av en ect som erhållits med ett stereomikroskop och korrespondentexempel på linjeskanningsanalys av vävnadernas diametrar med hjälp av ett bildbehandlingsprogram. Skalstång = 2 mm. Genomsnittliga diametrar beräknas utifrån medelvärdet av alla linjelängder som mäts i varje vyplan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
5. Övervakning av ECT-sammandragning genom polavböjningsanalys (15 min per 48-brunnsgjutningsplatta).
OBS: ECT-kulturen utförs vanligtvis i 5 dagar, men den kan förlängas ytterligare minst upp till 20 dagar. Pole avböjning sker på grund av vävnadskontraktionen som drivs av cellkontraktionskraften i spänningsriktningen längs vävnadens långa axel. Bedömning av ECT sammandragning kan utföras genom avbildning vilken dag som helst under kultur.
- Föreställ dig 48-brunnsgjutningsplattan under en inspelningsenhet med en integrerad områdesskanningskamera placerad på ett fast avstånd, utrustad med en högupplöst (≥ 5 megapixlar) svartvit bildsensor.
- Använd en nära UV-ljuskälla (~390 nm) för att maximera kontrasten och därmed underlätta automatisk detektering av polernas spetsar eftersom de innehåller ett fluorescerande färgämne (figur 6A,C). Om det är tillgängligt rekommenderas telecentriska linser för avbildning eftersom de minimerar bildförvrängningar.
OBS: Alternativt kan makroskopiska ljusfältsbilder från enstaka brunnar eller av hela plattan tillsammans med en skalstång användas för analysen (figur 5A).
- Använd en nära UV-ljuskälla (~390 nm) för att maximera kontrasten och därmed underlätta automatisk detektering av polernas spetsar eftersom de innehåller ett fluorescerande färgämne (figur 6A,C). Om det är tillgängligt rekommenderas telecentriska linser för avbildning eftersom de minimerar bildförvrängningar.
- Mät avståndet mellan polerna från dagliga poster (bild 6C, D) med hjälp av ett bildbehandlingsprogram eller automatiserad analys genom att köra inspelade bilder på programvara som kan upptäcka ljusa pixlar med hög kontrast på en mörk bakgrund.
- Beräkna polavböjningen genom variationen av polernas avstånd jämfört med utgångsavståndet vid dag noll.
Figur 6: Schematisk översikt över bedömningen av vävnadskontraktion enligt pole avböjning. (A) Exemplarisk högupplöst registrering av fluorescerande poler i 48-brunnsgjutningsplattan under nära UV-ljus excitation. Denna metod föredras framför ljusfältsbilder för mer exakt polspets automatiserad spårning. (B) De schematiska ritningarna visar hur ECT-komprimering och sammandragning leder till polböjning. C) En exemplarisk rad med samma plåtrekord dag 0 och dag 5 efter gjutning. D. Närbild visar hur man mäter avståndet (rosa linje) mellan polerna med hjälp av ett bildbehandlingsprogram. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
OBS: Tänk på att polavböjning mätt med ljus spetsbild endast är en uppskattning av vävnadskontraktionen på grund av skillnaden i bildplan. Observera också att appliceringen av pro-fibrotiska ämnen som TGF-β1 under vävnadskulturen förbättrar ECT-komprimering och sammandragning och kan i slutändan leda till tidig vävnadsstörning.
6. Bedömning av ECT:s styvhet och andra biomekaniska egenskaper genom destruktiv draghållsmätning och stressbelastningsanalys (20 min per ect)
OBS: En optimal stressbelastningskurva kan visa tre regioner: tåregion, elastisk region och plastregion. Ett exempel på en ECT-stress-stam kurva visas i figur 7. Analysen av en stress-stamkurva gör det möjligt att extrahera viktiga biomekaniska parametrar i vävnaden såsom t.ex. styvhet, maximal styrka, elasticitet, plasticitet, utökningsbarhet, motståndskraft och seghet.
- Skörda ECT genom att först dra båren, inklusive ECT, ur brunnen med tång. Båren kan sedan hållas på basen, och ECT halkade över bårspetsarna med en fin krok eller pipettspets.
- Överför ECT till två krokar fastspända på den stationära armen och givarens arm på en förlängningsdynamisk mekanisk analys (DMA) rheometer utrustad med ett 37 °C härdat organbad (specialtillverkat) fyllt med PBS (figur 7A).
Figur 7: ECT destruktiv draghållfast mätningsanalys. A) Rheologisk destruktiv draghållsmätning på en förlängningsdynamisk mekanisk analys (DMA) rheometer. Övre högeffektsvy: ECT efter montering vid L0 i en miljökammare och ansluten till en övre och nedre pol för stressbelastningsanalyser. Botten hög effekt vy: ECT ansträngd med en konstant hastighet 0,03 mm/s fram till felpunkten vid ultimat belastning. Skalstänger = 5 mm. (B) Stress-stamdiagram för en ECT som visar de viktigaste uppmätta parametrarna. Den övre gränsen för den elastiska regionen motsvarar utbytespunkten och plastregionen består av mellan utbytespunkten och felpunkten (duktilitet). Lutningen av den linjära fasen av den elastiska regionen motsvarar Youngs modulus som återspeglar vävnadsstelhet. Den maximala styrkan motsvarar den maximala dragspänningen som en vävnad tål. På grund av fibermikrofractering minskar stressen tills vävnaden når felpunkten. Detta inträffar vid den ultimata stammen (utökningsbarhet) där en plötslig minskning av stress observeras på grund av vävnadens bristning. Motståndskraften motsvarar den energi (kJ/m3) som absorberas av vävnaden före permanent deformation (upp till avkastningspunkten) och ges av området under kurvan (AUC) fram till avkastningspunktens stam. Seghet motsvarar den totala energin (kJ/m3) vävnaden kan absorbera tills den spricker och ges av AUC upp till den ultimata stammen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Ställ in rheometern så att den applicerar en enaxiell spänning med en konstant linjär hastighet på cirka 1 % av det ursprungliga avståndet mellan krokarna per sekund. En konstant sträckhastighet på 0,03 mm/s kan användas med de typiska ECT-dimensionerna. Tara givaren, initiera sträckan och spela in tills punkten för ECT-bristning.
VARNING: Makroskopiska bilder av ECT (steg 4.1.) måste registreras före dragprovning, eftersom CSA krävs för datanormalisering.
OBS: Stress-stamanalysen, inklusive CSA-beräkning, kan bearbetas senare i tiden vid dragprovning. Använd ett kalkylbladsprogram och en statistisk analysprogramvara för att analysera data. - Normalisera uppmätta kraftvärden (mN) per ECT genom dess CSA (mm2) för att erhålla spänningsvärden (kPa).
- Rita spänningsvärden mot belastning (ett geometriskt mått på vävnadsdeformation som ges av det relativa avståndet mellan den övre och nedre kroken) på ett XY-diagram.
OBS: Vävnadens ursprungliga längd (avståndet mellan den övre och nedre kroken) omedelbart innan sträckan följer, L0, måste justeras manuellt och motsvarar början av tåregionen (tåregionen kan vara frånvarande beroende på vävnadsegenskaper). Varje stampunktsvärde skall beräknas enligt ekvationen, där Ltotal är det totala gapet vid varje mätpunkt:
När du ritar data använder du stressvärdet vid vald L0 för bakgrunds subtraktion. - Bestäm olika biomekaniska parametrar från stress-stamkurvan (använd figur 7B som exempel).
OBS: En stressbelastningskurva kan visa tre regioner: tå-, elastiska och plastregioner. Den övre gränsen för den elastiska regionen, innan vävnaden börjar mikrofracturing, motsvarar utbytespunkten, och dess stam är ett mått på vävnadselasticitet. Plastregionen består av mellan utbytespunkten och felpunkten. Den senare punkten motsvarar en plötslig minskning av stress på grund av vävnadens bristning, som definierar den ultimata fläcken, vilket är ett mått på vävnadsextensibility. Den tredje mätpunkten motsvarar den maximala styrkan, som definieras av den högsta stress som vävnaden kan bära utan att bryta under sträckan. Motståndskraften och segheten, som ges av området under kurvan, motsvarar den energi som absorberas av vävnaden upp till avkastningspunkten respektive felpunkten. För varje erhållen kurva motsvarar lutningen av den linjära delen av den elastiska regionen Youngs modulus, även känd som elastisk modulus, och är en mekanisk egenskap som mäter vävnadens styvhet.- Extrahera XY-värdena (belastning respektive stress) från varje kurva för avkastningspunkten, felpunkten och den maximala stresspunkten.
- Utvärdera Youngs modulus (styvhet i kPa = mN·mm-2) för varje ECT från lutningen av den linjära delen av den elastiska regionen genom att plotta en linjär regression av den regionen.
- Använd ett statistiskt program för att beräkna området under kurvan (AUC) för att bestämma både motståndskraft och seghet, upp till avkastningspunkten respektive felpunkten. Beräkna AUC med trapetsformad metod. Ställ in baslinjen på noll och tänk endast på topparna ovanför baslinjen, som är minst 10 % av avståndet från minimivärdet till det maximala värdet i Y-axeln.
OBS: Modulerna för motståndskraft och seghet ges av σ × ε, där σ är stress (kPa) och ε är stammen (L/ΔL, mm/mm). Motståndskraft och seghet är således energin i kJ/m3 (kPa = kN·m-2 = kN·m·m-3 = kJ/m·m·m-3 = kJ/m3) absorberad av vävnaden före permanent deformation respektive fram till bristning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ECT når cirka 95 % komprimering jämfört med den ursprungliga cell-kollagenhydrogelvolymen inom de första 24 h. Vävnadskomprimering och sammandragning under kontrollförhållanden och i närvaro av FCS följer några timmar efter gjutning och ökar särskilt fram till dag 5 (figur 5A). Pole avböjning kan öka ytterligare under de följande 15 dagarna (20 dagar var den längsta testade tiden). Storleken på polavböjningen beror på celltyp, celltillstånd och cell- och vävnadsodlingsförhållanden. Vanligtvis mäts biomekaniska egenskaper på dag 5 av kulturen, men vilken tidpunkt som helst kan väljas. Som ett exempel på ECT-modellens tillämplighet visas hur detta protokoll kan bidra till att studera effekten av aktin cytoskeletonintegritet på vävnadsfunktionen. ECT förbereddes i 48-brunnsgjutningsplattan och behandlades med aktinpolymeriseringshämmaren Latrunculin A (Lat-A, 7 ng/mL). Behandlingen minskade ECT-komprimeringen, vilket indikerades av den signifikanta ökningen av 1, 7 gånger i CSA jämfört med kontroll (figur 8A, B). Dessutom bedömdes sammandragningen av vävnaderna under de 5 dagarna av kultur. I avsaknad av läkemedlet ökade minskningen gradvis upp till dag 5 och nådde ~ 40% minskning. Lat-A-drabbade vävnadskontraktion, vilket endast resulterade i maximal sammandragning på ~20 % (figur 8A,C). Destruktiva enkelriktad stress-stam testning utfördes på dag 5. Från en typisk stress-stamkurva som de som erhålls för ECT (figur 7B) kan flera biomekaniska parametrar extraheras. Exemplariskt visas att hämning av aktinpolymerisering ledde till en signifikant minskning av vävnadsstelheten med ~50 % jämfört med kontrollen (figur 8D). Sammantaget visar de exemplariska uppgifterna att aktin cytoskeletal integritet är avgörande för ECT komprimering, sammandragning och förstyvning.
Figur 8: Hämning av aktinpolymerisationen påverkar ECT-komprimering, sammandragning och styvhet. ECT genereras med mänskliga CF och kollagen typ I odlades i 5 dagar runt två flexibla poler i närvaro eller frånvaro av 7 ng/mL Latrunculin-A (Lat-A). (A) Representativa bilder av den kontroll och behandlade ect som placeras i flexibla poler efter 5 dagar visas. Skalstreck = 2 mm. (B) Tvärsnittsområden (CSA) beräknades utifrån makroskopiska bilder (n = 22). C) Pole avböjning beräknades under en period av 5 dagar. Värden anges som medel±SEM (n = 22). Betydande förändringar bedömdes av 2-vägs ANOVA med Dunnetts (*p<0,05 vs. Control) post hoc-tester för flera jämförelser. (D) Vävnaderna utsattes för reologiska destruktiva draghållsmätningar och Youngs moduli hämtades från stress-stam analyserna (n = 16). (B och D) Rutorna anger den nedre och övre kvartilen. Horisontell linje i varje ruta representerar median-CSA respektive styvhet. Medlen för varje grupp anges med ett +. Lodräta linjer som sträcker sig från varje ruta representerar de lägsta och högsta värden som mäts. Betydande förändringar i B och D bedömdes genom oparat, tvåsidigt Students t-test (*p<0,05). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver genereringen av ECT från primära mänskliga CF, vilket gör det möjligt att studera den mekaniska effekten av dessa celler på deras extracellulära matrismiljö och vice versa.
Fibroblaster måste utökas för att ge tillräckliga celler för de planerade ECT-experimenten (0,75 x 106 celler/ECT). För bästa reproducerbarhet rekommenderas att förkulturera frysta eller vävnadsbaserade fibroblaster i 2D-monoskiktskultur under en standardiserad varaktighet på upp till 80 % sammanflöde inom varje passage och innan de används i ECT-generationen (protokollsteg 3). För odling av primära mänskliga CF-monolayers och -härledda ECT i synnerhet rekommenderas att använda kommersiellt medium och kosttillskott som är lämpliga för CF (se Tabell över material). Medium tillskott med serum är avgörande för att säkerställa expansionen av CF i standard 2D kulturer. Användning av serumfria eller låga serumförhållanden i 3D-kulturer, inklusive ECT-generering och ytterligare kultur, kan övervägas beroende på vald fibroblasttyp. Vid användning av CF för ECT-generering rekommenderas det dock att åtminstone inkludera serum i gjuthydrogelen för korrekt initial vävnadskomprimering.
En begränsning i förfarandet är associerad med CF-expansion i 2D-kultur som är nödvändig för ECT-generering, vilket vanligtvis leder till en omvandling av fibroblaster till myofibroblaster (indikeras av förbättrad SMA och tillhörande stressfiberbildning4). På grund av deras kontinuerliga transdifferentiation, tänk på att fibroblaster i olika passager kan ge olika resultat när de används för att generera ECT. I ECT-modellen måste två processer diskrimineras. Efter suspension i en kollagen hydrogel och ECT bildas, celler anpassa sig till sin 3D miljö och myofibroblast fenotyp kan åtminstone delvis vändas. I följande kulturfas kan cellerna sedan potentiellt genomgå en omkopplare igen i motsatt fenotypisk riktning, särskilt genom att använda poler med ökande styvhet eller genom tillsats av pro-fibrotiska faktorer (såsom TGF-β1). Möjligheten att finjustera den dynamiska fenotypiska anpassningen skapar möjlighet att dissekera de underliggande och biomekaniskt kontrollerade molekylära mekanismerna. Sådana studier kan i slutändan möjliggöra modellering av fibrotiska tillstånd och identifiering av farmakologiska eller genterapi interventioner inriktade på organfibros. Användning av fibroblaster av olika ursprung kan ytterligare möjliggöra undersökning av processer som ligger till grund för vävnadsspecifik fibros. Tillämpning av fibroblaster eller andra stromalceller, inte bara av olika ursprung utan även från olika arter, möjliggör studier mellan arter av mekanismer som ligger till grund för fibros eller cellmatrisinteraktioner. Det måste dock noteras att genom att använda primära celler från människor måste de inter-individuella skillnaderna mellan cellerna beaktas. Ett misslyckande i vävnadskontraktion (se även nedan) är inte nödvändigtvis en orsak till ett experimentellt fel men kan bero på den enskilda cellinjens inneboende kontraktila egenskaper. Därför är det alltid att föredra att använda celler från olika givare för att möjliggöra diskriminering av allmänna mekanismer och skillnader i donatorberoende. I likhet med variabiliteten hos de erhållna resultaten, som kan uppstå från cellens individuella biologi, är det viktigt att nämna att allt biologiskt material kan visa betydande variabilitet. Därför rekommenderas parallell testning av materialet från olika partier, åtminstone när det blir nödvändigt att ändra partiet.
Dessutom uppvisar vävnader som odlas på polparen "arm" och "pol" regioner som är strukturellt och biomekaniskt olika. Det återstår att avgöra hur mycket polregionen bidrar till stretchexperiment.
Vävnadsberedningsprocessen måste vara grundligt snabb för att undvika gelering vid rumstemperatur. Cell-kollagen hydrogelgelgelation drivs främst av kollagen självmontering, och till stor del celloberoende29. Det är det första steget under vävnadsbildning, och det bör inträffa under de första 15-30 minuterna en gång placerade i en kulturinkubator. Kollagen fibrillogenesis och gelering påverkas av t.ex. hydroxylering av proliner och lysin, och mycket beroende av kollagentyp, jonstyrka, pH och temperatur, vilket påverkar fiberbundling och porstorlek i kollagennätverket42. Det kan i slutändan påverka cellkomponenten och därefter vävnadernas struktur och mekaniska egenskaper. När du väljer kollagenkällor och den kemiska sammansättningen av naturligt härlett kollagen är det viktigt att identifiera en pålitlig högkvalitativ kollagenlösning för vävnadsteknik. Användning av kommersiellt syra-solubiliserat nötkreatur typ I kollagen rekommenderas vid en ungefärlig lagerkoncentration på 6-7 mg/ml. Icke desto mindre, andra kollagen lösningar med en koncentration av ≥ 4 mg/ml kan också vara kompatibla med detta. Flera andra faktorer som renhet, molekylär integritet, lösliga medel och hyllålder kan påverka inkubationstiden som krävs för rekonstitution (stelning) av ECT hydrogelblandningen, som under inga omständigheter bör överstiga 1 h för att undvika cellsededimentation. För optimalt resultat, förvara och hantera kollageninnehållande lösningar vid 4 ± 2 °C. Kollagenintegriteten kan störas om den fryses eller hanteras i rumstemperatur och därmed förhindra fibrillogenes och hydrogelgelgelering. Efter pH-neutralisering och cellrekonstitution i kollagenhydrogelen måste pipettering under gjutning vara skonsam eftersom starka skjuvkrafter kan påverka kollagenstrukturens och matrisenhetens integritet. Variabilitet mellan partier av kollagen eller olika leverantörer kan påverka ECT-bildandet. Det är lämpligt att testa kollagenhydrogel för att fastställa idealiska kondensationsegenskaper före användning i ECT-preparat. För att garantera lämplig pH-neutralisering måste dessutom NaOH-volymen titreras för varje enskild kollagensats. I allmänhet rekommenderas ytterligare kvalitetskontroller, t.ex. SDS-PAGE-analys för att undersöka kollagenintegritet och koncentration och skjuvreatologi för att bestämma kollagenlösningens trögflytande egenskaper.
Efter den inledande fasen av hydrogel stelning på grund av kollagen självmontering, cellkomponenten driver matriskomprimering ytterligare. Om ECT inte komprimeras synligt inom 24 timmar efter gjutningen kan detta vara relaterat till cellens livskraft. Minst 80 % av cellviabiliteten rekommenderas. Säkerställa korrekt cellviabilitet efter enzymatisk lösgöring av indataceller för att erhålla korrekt vävnadskomprimering och funktionalitet. I detta protokoll genereras ECT med 0,75 × 106 celler i en slutlig volym på 180 μL per vävnad, men olika cellnummer kan krävas beroende på cellkällan (t.ex. CF-givare, leverantörer). Därför rekommenderas att utföra ett cell titreringsexperiment i början. Vanligtvis kan ett cellområde från 150 000 till 750 000 testas för optimal bildning och komprimering av vävnaderna. I allmänhet använder detta protokoll 0,3 mg kollagen per ECT motsvarande 1,67 mg/ml kollagen i en slutlig volym på 180 μL. Justera vid behov förhållandet mellan cellnummer och kollagenkoncentration (kollagenkoncentration från 0,14 till 0,4 mg per vävnad kan testas). Dessutom säkerställa en korrekt neutralisering av ättiksyra-solubilized kollagen under hydrogel beredning som otillräcklig pH kan vara skadligt för cellens livskraft.
Som visas i figur 3 (nedre panelen) får ECT inte bildas enhetligt. Efter cellrekonstitution i den pH-neutraliserade kollagenhydrogelblandningen följer geleringsprocessen även vid 4 °C och accelereras vid rumstemperatur (en gång gjuten i formen). Se till att gjutproceduren är klar inom 15-20 min. För tidig gelering kommer att hindra korrekt pipettering av blandningen på grund av den ökade viskositeten. Vid gjutning av den trögflytande cell-kollagenhydrogelen, pre-wet pipette spets med hydrogel eller använd en låg retention pipette spets, och följ med samma spets för att gjuta flera ECT. Denna praxis kommer att minska variationen i hydrogelvolymen och bildandet av bubblor under utblåsning (figur 3D). Se till att slingan i formen slutförs så att den bildar en ringformad ECT (figur 3A-B). Se dessutom till att ingångscellsupphängningen är homogen och fri från aggregat i alla stadier av gjutning. Blanda ofta cell-kollagen väteblandningen genom att virvla röret medan du utför gjutproceduren i 48-brunnsgjutningsplattan. Slutligen bör geleringen under inkubation vid 37 °C ske maximalt inom 15-30 minuter. Om denna process tar längre tid ökar risken för cellsedimentation och producerar ojämnt befolkade vävnader.
Dessutom kan ojämnt befolkade vävnader och ojämn fördelning av cell-kollagen hydrogelen i formarna leda till oregelbunden morfologi av ECT, och ECT får inte dra ihop sig enhetligt i hela 48-brunnsgjutningsplattan. ECT-positionen på de flexibla polerna kan också påverka sammandragningsnivåerna och bidra till ett liknande fenomen. Om den formande ECT lossnar från botten samtidigt som den lägger till odlingsmedium, kan den flyta och komprimeras ovanför stolparnas förankringspunkt med en definierad böjkraft (figur 4). Detta kan leda till en överskattad polavböjning och inducera variabilitet mellan vävnader/experiment. För att undvika detta bör hydrogelen försiktigt överlagras med odlingsmediet via brunnsväggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GLS och SL skrev manuskriptet. Alla författare bidrog till protokollutvecklingen och redigerade manuskriptet. TM, MT och WHZ är vetenskapliga rådgivare till myriamed GmbH. WHZ är grundare och aktieägare i myriamed GmbH.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det tyska hjärtsällskapet (DGK Research Fellowship for GLS) och av den tyska forskningsstiftelsen (DFG genom projektet IRTG 1816 för GLS och AD; DFG 417880571 och DFG TI 956/1-1 för MT; SFB 1002 TP C04 för MT och WHZ; SFB 1002 TP S01 för WHZ; och EXC 2067/1-390729940J för WHZ). WHZ stöds av det tyska federala ministeriet för vetenskap och utbildning (BMBF genom projektet IndiHEART) och Fondation Leducq (20CVD04). MT, WHZ och SL stöds av german center for cardiovascular research (DZHK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents: | |||
| Accutase Solution | Merk Millipore | SCR005 | |
| Dissociation reagent – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose | Gibco | 12100061 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM Fibroblast Growth Basal Medium | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4126 | |
| Fibroblast Growth Medium 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
| Fibroblast Basal Medium 3 | PromoCell | C-23230 | |
| Growth Medium 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
| Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| Cell sources: | |||
| Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
| Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
| Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
| Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC- 1041 | |
| Collagen sourses: | |||
| Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl | LLC Collagen Solutions | FS22024 | 6-7 mg/mL |
| Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 mg/mL |
| Drugs: | |||
| Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| Plastic ware: | |||
| Cell culture plastic ware | Sarstedt and Starlab | ||
| Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) | Corning | 07-200-619 | |
| Specific instruments: | |||
| Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors | OptoEngineering | TCCR12096 | |
| Area scan camera Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |
References
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (16), 7540-7545 (2011).
- Elson, E. L., Genin, G. M. Tissue constructs: platforms for basic research and drug discovery. Interface Focus. 6 (1), 20150095 (2016).
- Cho, N., Razipour, S. E., McCain, M. L. TGF-beta1 dominates extracellular matrix rigidity for inducing differentiation of human cardiac fibroblasts to myofibroblasts. Experimental Biology and Medicine. 243 (7), Maywood. 601-612 (2018).
- Cucoranu, I., et al. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circulation Research. 97 (9), 900-907 (2005).
- Peng, H., Carretero, O. A., Peterson, E. L., Rhaleb, N. E. Ac-SDKP inhibits transforming growth factor-beta1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), 1357-1364 (2010).
- Ribeiro, A. J., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Tranquillo, R. T., Durrani, M. A., Moon, A. G. Tissue engineering science: consequences of cell traction force. Cytotechnology. 10 (3), 225-250 (1992).
- Barocas, V. H., Moon, A. G., Tranquillo, R. T. The fibroblast-populated collagen microsphere assay of cell traction force--Part 2: Measurement of the cell traction parameter. Journal of Biomechanical Engineering. 117 (2), 161-170 (1995).
- Lijnen, P., Petrov, V., Rumilla, K., Fagard, R. Stimulation of collagen gel contraction by angiotensin II and III in cardiac fibroblasts. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 3 (3), 160-166 (2002).
- Baxter, S. C., Morales, M. O., Goldsmith, E. C. Adaptive changes in cardiac fibroblast morphology and collagen organization as a result of mechanical environment. Cell Biochemistry and Biophysics. 51 (1), 33-44 (2008).
- Zhou, Y., et al. Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1096-1108 (2013).
- Lijnen, P., Petrov, V., Fagard, R. In vitro assay of collagen gel contraction by cardiac fibroblasts in serum-free conditions. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 23 (7), 377-382 (2001).
- Burgess, M. L., et al. Integrin-mediated collagen gel contraction by cardiac fibroblasts. Effects of angiotensin II. Circulation Research. 74 (2), 291-298 (1994).
- Nunohiro, T., Ashizawa, N., Graf, K., Hsueh, W. A., Yano, K. Angiotensin II promotes integrin-mediated collagen gel contraction by adult rat cardiac fibroblasts. Japanese Heart Journal. 40 (4), 461-469 (1999).
- Ngu, J. M., et al. Human cardiac fibroblast extracellular matrix remodeling: Dual effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Cardiovascular Pathology. 23 (6), 335-343 (2014).
- Knezevic, V., Sim, A. J., Borg, T. K., Holmes, J. W. Isotonic biaxial loading of fibroblast-populated collagen gels: a versatile, low-cost system for the study of mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 1 (1), 59-67 (2002).
- Delvoye, P., Wiliquet, P., Leveque, J. L., Nusgens, B. V., Lapiere, C. M. Measurement of mechanical forces generated by skin fibroblasts embedded in a three-dimensional collagen gel. Journal of Investigative Dermatology. 97 (5), 898-902 (1991).
- Kolodney, M. S., Elson, E. L. Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (32), 23850-23855 (1993).
- Bell, B. J., Nauman, E., Voytik-Harbin, S. L. Multiscale strain analysis of tissue equivalents using a custom-designed biaxial testing device. Biophysical Journal. 102 (6), 1303-1312 (2012).
- Wakatsuki, T., Kolodney, M. S., Zahalak, G. I., Elson, E. L. Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophysical Journal. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- Thomopoulos, S., et al. Fibrocartilage tissue engineering: The role of the stress environment on cell morphology and matrix expression. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 1039-1053 (2011).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (2), 214-222 (2002).
- Ongherth, A., et al. p63RhoGEF regulates auto- and paracrine signaling in cardiac fibroblasts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 88, 39-54 (2015).
- Vettel, C., et al. PDE2-mediated cAMP hydrolysis accelerates cardiac fibroblast to myofibroblast conversion and is antagonized by exogenous activation of cGMP signaling pathways. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (8), 1246-1252 (2014).
- Jatho, A., et al. RhoA Ambivalently Controls Prominent Myofibroblast Characteritics by Involving Distinct Signaling Routes. PLoS One. 10 (10), 0137519 (2015).
- Dworatzek, E., et al. Sex-specific regulation of collagen I and III expression by 17beta-Estradiol in cardiac fibroblasts: role of estrogen receptors. Cardiovascular Research. 115 (2), 315-327 (2019).
- Tiburcy, M., Meyer, T., Soong, P. L., Zimmermann, W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods in Molecular Biology. 1181, 167-176 (2014).
- Schlick, S. F., et al. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 51-60 (2019).
- Wille, J. J., Elson, E. L., Okamoto, R. J. Cellular and matrix mechanics of bioartificial tissues during continuous cyclic stretch. Annals of Biomedical Engineering. 34 (11), 1678-1690 (2006).
- Berry, C. C., Shelton, J. C., Bader, D. L., Lee, D. A. Influence of external uniaxial cyclic strain on oriented fibroblast-seeded collagen gels. Tissue Engineering. 9 (4), 613-624 (2003).
- Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Developmental Biology. 90 (2), 383-398 (1982).
- Bellows, C. G., Melcher, A. H., Aubin, J. E. Association between tension and orientation of periodontal ligament fibroblasts and exogenous collagen fibres in collagen gels in vitro. Journal of Cell Science. 58 (1), 125-138 (1982).
- Tranquillo, R. T. Self-organization of tissue-equivalents: the nature and role of contact guidance. Biochemical Society Symposia. 65, 27-42 (1999).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of Biomechanical Engineering. 119 (2), 137-145 (1997).
- Yip, A. K., et al. Anisotropic traction stresses and focal adhesion polarization mediates topography-induced cell elongation. Biomaterials. 181, 103-112 (2018).
- Santos, G. L., Hartmann, S., Zimmermann, W. H., Ridley, A., Lutz, S. Inhibition of Rho-associated kinases suppresses cardiac myofibroblast function in engineered connective and heart muscle tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 134, 13-28 (2019).
- Kittana, N., et al. Modulating the biomechanical properties of engineered connective tissues by chitosan-coated multiwall carbon nanotubes. International Journal of Nanomedicine. 16, 989-1000 (2021).
- Kittana, N., et al. Enhancement of wound healing by single-wall/multi-wall carbon nanotubes complexed with chitosan. International Journal of Nanomedicine. 13, 7195-7206 (2018).
- Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
- Holder, A. J., et al. Control of collagen gel mechanical properties through manipulation of gelation conditions near the sol-gel transition. Soft Matter. 14 (4), 574-580 (2018).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
