Summary
我们修改了成年斑马鱼的Marmarou体重下降模型，以检查钝力创伤性脑损伤（TBI）后的病理范围以及随后神经元再生的机制。这种钝力 TBI 模型具有可扩展性，可诱发轻度、中度或重度 TBI，并概括在人类 TBI 中观察到的损伤异质性。
Abstract
钝力创伤性脑损伤（TBI）是最常见的头部创伤形式，其严重程度范围广泛，并导致复杂和异质的继发效应。虽然没有机制来替换或再生人类TBI后丢失的神经元，但斑马鱼具有在整个身体（包括大脑）中再生神经元的能力。为了检查斑马鱼在钝力TBI后表现出的病理学的广度，并研究随后的神经元再生反应背后的机制，我们修改了常用的啮齿动物Marmarou体重下降，以用于成年斑马鱼。我们的简单钝力TBI模型是可扩展的，可诱导轻度，中度或重度TBI，并概括了在人类TBI之后观察到的许多表型，例如接触性和创伤后癫痫发作，水肿，硬膜下和脑内血肿以及认知障碍，每种表型都以损伤严重程度依赖性的方式显示。TBI后遗症在受伤后几分钟内开始出现，在受伤后7天内消退并恢复到接近未受损的控制水平。再生过程早在损伤后48小时（hpi）就开始了，细胞增殖峰值在60 hpi处观察到。因此，我们的斑马鱼钝力TBI模型产生类似于人类TBI的特征性原发性和继发性损伤TBI病理，这允许研究疾病的发作和进展，以及斑马鱼独有的神经元再生机制。
Introduction
创伤性脑损伤（TBIs）是一场全球性健康危机，也是死亡和残疾的主要原因。在美国，每年约有 290 万人患有 TBI，在 2006-2014 年期间，TBI 或 TBI 后遗症导致的死亡率增加了 50% 以上1。然而，TBI 的病因、病理学和临床表现各不相同，这在很大程度上部分归因于损伤机制 （MOI），这也会影响治疗策略和预测预后2。虽然TBI可以由各种MOI引起，但它们主要是穿透性或钝力创伤的结果。穿透性创伤占TBI的一小部分，并产生严重的局灶性损伤，局限于直接和周围的刺穿脑区域3。相比之下，钝力TBI在一般人群中更常见，涵盖一系列严重程度（轻度、中度和重度），并产生累及多个脑区域的弥漫性、异质性和整体性损伤1，4，5。
斑马鱼 （Danio rerio） 已被用于检查跨越中枢神经系统（CNS）的各种神经损伤6，7，8，9。与哺乳动物不同，斑马鱼还具有先天而强大的再生反应，以修复中枢神经系统损伤10。目前的斑马鱼创伤模型使用各种伤害方法，包括穿透，切除，化学侮辱或压力波11，12，13，14，15，16。然而，这些方法中的每一种都利用了人群很少经历的MOI，不能在一系列损伤严重程度上扩展，并且不能解决钝性TBI后报告的异质性或严重程度依赖性TBI后遗症。这些因素限制了斑马鱼模型的使用，以了解与人群中最常见的TBI形式（轻度钝力损伤）相关的病理的潜在机制。
我们的目标是开发一种快速且可扩展的钝力TBI斑马鱼模型，为研究损伤病理学，TBI后遗症的进展以及先天再生反应提供途径。我们修改了常用的啮齿动物Marmarou17 重量下降，并将其应用于成年斑马鱼。该模型产生可重复的严重程度范围，从轻度，中度到重度。该模型还以严重程度依赖性的方式概括了人类TBI病理学的多个方面，包括癫痫发作，水肿，硬膜下和脑内血肿，神经元细胞死亡和认知缺陷，如学习和记忆障碍。受伤后几天，病理和缺陷消散，恢复到类似于未受损对照的水平。此外，该斑马鱼模型在损伤严重程度方面显示出整个神经轴的强健增殖和神经元再生反应。
在这里，我们详细介绍了钝力创伤的设置和诱导，创伤后癫痫发作的评分，血管损伤的评估，准备脑切片的说明，量化水肿的方法以及对损伤后增殖反应的见解。
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Protocol
斑马鱼在弗雷曼生命科学中心的圣母院斑马鱼设施中饲养和维护。本手稿中描述的方法得到了圣母大学动物护理和使用委员会的批准。
1. 创伤性脑损伤范式
- 将1 mL 2-苯氧乙醇加入1 L系统水中（60mg Instant Ocean在1L去离子RO水中）。
- 在室温下准备一个装有2L系统水的曝气回收罐。
- 选择滚珠轴承的所需重量以及钢/塑料管的所需长度和直径，并确定能量和冲击力。
注：卡套管的内径应允许滚珠轴承在不改变其路径或运动速度的情况下通过。- 确定撞击时的动能：
其中， KE = 动能， m = 质量（以千克为单位）， g = 重力， h = 从下落点到鱼的高度（以 m 为单位）。
注意：这提供了以 J 为单位的动能，将值乘以 1，000 以确定 mJ。 KE 基于加速物体，当滚珠轴承从静止位置掉落时，就会发生加速物体。 - 使用 7.62 cm 长的钢/塑料管（末端位于斑马鱼头骨板上方 1.5 cm 处）（总距离 9.1 cm）和 1.5 g（直径 6.4 mm）滚珠轴承，生成轻度 TBI （miTBI）。它们产生1.33 mJ的动能。根据经验，这种损伤等同于基于关键病理生理性TBI标志物的miTBI，例如血管损伤，硬膜下/脑内血肿形成，神经元细胞死亡和认知障碍，这些损伤在很大程度上概括了以严重程度依赖性方式在人群中报告的内容。
- 计算动能 miTBI =
- 使用 12.7 厘米长的钢/塑料管（末端为斑马鱼头骨上板上方 1.5 厘米）（总距离 14.2 厘米）和 1.5 克（直径 6.4 毫米）滚珠轴承（产生 2.08 mJ 的动能）生成中度 TBI （moTBI）。
- 计算动能 moTBI =
- 使用 7.62 厘米长的钢/塑料管（末端为斑马鱼头骨板上方 1.5 厘米）（总距离 9.1 厘米）和 3.3 克（直径 8.38 毫米）滚珠轴承（产生 2.94 mJ 的动能）生成严重的 TBI （sTBI）。
- 计算动能 sTBI =
- 确定撞击时的动能：
- 用建模粘土填充培养皿（图1，步骤1），并使用钝器（即一对镊子的背面）用额外的建模粘土创建一个凸起的平台（5 cm x 1.5 cm）。
- 使用剃须刀片将凸起的平台纵向分成两个大致相等的两半（图1，步骤3，红色虚线）。将两半形成一个通道，以适应成年鱼的长度（图1，步骤4）。使用额外的粘土来建造墙壁，这些墙壁将固定约2/3的鱼体，使头部暴露在外。
- 在垂直于墙壁的暴露头部区域中模制一个小支撑，以支撑头部，以避免受伤时头部旋转或反冲（图1，步骤4）。
注意：通道应足够深，以支撑鱼的背部向上位置，但仍应允许头部停留在周围粘土上方。此外，头部支撑应遵循鱼的自然曲率，支撑下颌骨和鳃。 - 确保掉落的重量不受通道侧面的阻碍（图1，步骤4）。
- 使用迷你打孔机和22克钢闪光创建直径为3 mm的钢盘。每个磁盘可以多次使用。
- 将一条鱼放入烧杯中，放入50-100毫升1：1000（1毫升/ 1升，0.1%）2-苯氧乙醇的烧杯中，直到它对尾部捏合无反应。
- 将鱼背侧朝上放置在通道内的粘土模具上，使主体固定在侧面，并在头部放置一个3 mm 22 g钢盘，以所需冲击点为中心（图1，步骤5）。
- 确保鱼尽可能垂直对齐，以避免头部向一侧倾斜，这可能会导致不均匀的撞击。
- 使用标准环形支架和臂夹固定钢/塑料管，使管的底部位于斑马鱼头部上方1.5厘米处（图1，步骤6）。确保油管是直的。
- 向下看管道，确保管道在钢板上方对齐。
- 将滚珠轴承（轻度和中度TBI为1.5 g，重度TBI为3.3 g）从预定高度（如步骤1.3.3-1.3.5中所述）下降到位于所需神经解剖学感兴趣区域（例如，小脑， 图1，步骤5）上方的钢板上，以产生钝力TBI以达到所需的损伤严重程度。将受伤的鱼放入恢复池中进行监测。
注意：根据损伤的严重程度，可能会发生死亡率或强直阵挛发作。如果鱼在TBI后长时间无反应，请使用转移移液器或镊子进行尾部捏并评估疼痛反应。
2. 成年斑马鱼TBI后癫痫发作评分
- 根据第1节中概述的伤害方案麻醉和伤害鱼，并将受伤的鱼放入2升系统水的充气恢复池中。
- 观察鱼是否有任何创伤后癫痫发作的迹象，在被放入恢复池后立即开始。设置观察时间（即1小时）并记录所有癫痫发作活动，包括癫痫发作评分（如下所述），每次癫痫发作的持续时间以及经历癫痫发作的鱼的百分比（图2A）。
注意：癫痫发作可在受伤后立即发生，也可能在 TBI 后数小时或数天发生。癫痫发作可以持续很长时间，一条鱼可以有多次癫痫发作。将观察时间设置为1小时或更长时间将很好地表示癫痫发作率的总体趋势。 - 使用 Mussulini18 指南对成年斑马鱼癫痫发作表型对鱼类进行评分。
注意：如果不使用跟踪软件，则很难公正地评估低于3的癫痫发作评分。因此，在没有软件的情况下进行评估时，只应记录癫痫发作评分为 3 或更高。
3. 脑部解剖
- 在1：500（2 mL / 1 L，0.2%）的2-苯氧乙醇溶液中对鱼实施安乐死，直到鳃运动停止，并且它们在所需的终点对鱼鳍夹没有反应。
- 用建模粘土填充培养皿，并创建一个小腔以在解剖过程中支撑身体。
- 将鱼背侧朝上放在粘土模具中。将一根解剖销穿过鱼体中间的中线，在鱼的底部后面放置第二根约5毫米的销。
- 在解剖光学显微镜下，用一对#5 Dumont镊子钝地切断视神经并取出眼睛（图2A）。
- 定位鱼的方向，使通过显微镜观察时喙端最远（图2B）。
注意：以下步骤适用于惯用右撇子的个人。左撇子可能更喜欢以镜像方向执行以下步骤。 - 使用#5镊子缓慢地将镊子的一端放在右顶板下，故意向喙端移动并取出右顶板和额板（图2C）。
- 将镊子保持在45°或更低的角度，以避免在解剖过程中穿透大脑。
- 将鱼顺时针旋转 90°。将#5镊子的一端放在左顶板下方，并使用相同的剪刀运动去除左顶板和额板，露出大脑的整个背侧（图2D，E）。
- 用 #5 镊子钝地横切上颌骨。保留嗅球，如果这是感兴趣的区域，不要损坏它们。
- 使用#5镊子卸下右摇臂、前片、互操作器和子片（图2F）。
- 使用#5镊子钝切除牙龈开口尾端的肌肉组织，暴露脊髓。
- 用#5镊子钝切脊髓。小心地将镊子放在大脑下方，轻轻地将大脑从髑髅地取出。
注意：切勿捏住大脑。使用镊子"摇篮"大脑或尾部切除，并利用暴露的脊髓作为夹点来操纵大脑。 - 将去除的脑在9份100%乙醇中固定在1份37%甲醛中，在摇臂平台上在4°C下过夜。
4. 斑马鱼大脑水肿研究
- 根据第1节中概述的伤害方案麻醉和伤害鱼类，并让鱼在恢复池中恢复，直到它们开始自由游泳。
- 将鱼放回受伤后的正常外壳条件下1天。
- 在时间流逝后，用1：500 2-苯氧乙醇对鱼实施安乐死。
- 根据第3节中概述的协议解剖整个大脑或感兴趣的区域，并立即将大脑放在一个小称重船上。
注意：转移大脑时要小心，使用细镊子轻轻地将其放在称重船上，而不会刺伤或刮伤大脑，这可能导致组织损失。 - 在秤上贴上标签（带有损伤组和脑部编号）并去皮除一个额外的小型干燥称重船。使用能够测量至少0.001 g的秤来获得准确的测量值。
- 将大脑转移到焦油干燥称重船上，并记录大脑的湿重。调整大脑的方向，使它们平放在称重船上，背侧朝上。
- 将干燥称重船和大脑置于设置为60°C的杂交烤箱中8小时。
- 干燥后，大脑可能会粘在干燥的称重船上，并且可能难以取出并转移到新的涂有皮的小称重船上。避免用镊子捏住大脑，因为这可能会导致大脑干燥受损和组织损失。相反，将细镊子捏在一起，从大脑的腹侧开始，向上舀起。
- 使用公式确定每个大脑的含水量（图4）：
5.标记整个神经轴的细胞增殖并制备固定组织。
- 在2毫升ddH2O中制备10mM 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。
- 在50-100 mL的1：1000（1 mL / 1 L，0.1%）2-苯氧基乙醇中一次麻醉3至4条鱼，直到鱼在受伤后的所需时间点对尾部捏无反应（使用第1节中概述的方案）。
- 在湿海绵上做一个部分切口，一次将一条鱼放在开口处，腹侧朝上。
- 使用30 G针头将约40μL的10 mM EdU注射到鱼体内。将鱼放回装满系统水的储水箱。
注意：可以在不同的时间点进行重复注射以标记更多数量的增殖细胞，如果需要大于1周的追逐期，则可能需要重复注射。 - 收集第3节中概述的大脑，并将其作为一组放入5 mL玻璃小瓶中，该小瓶含有2 mL的9份100%乙醇至1份37%甲醛。将大脑固定在4°C的摇臂平台上。
注意：摇杆或摇床平台禁止大脑在底部休息，并禁止整个大脑的端脑蜷缩。 - 在用于固定大脑的同一玻璃瓶中，在下降乙醇系列中洗涤75%，50%和25%，每次15分钟，然后在室温下在摇杆上用5%蔗糖/ PBS洗涤1.5小时。将大脑储存在玻璃小瓶中过夜，在摇臂平台上以30%蔗糖/ PBS在4°C的温度下。
- 从30%蔗糖/ PBS中取出大脑，并用镊子将其转移到12孔板（每孔一个处理组）中，孔中充满2：1溶液，由2份组织冷冻培养基和1份30%蔗糖/ PBS组成。在摇臂平台上将大脑在4°C下孵育过夜。
- 将大脑转移到12孔板内的下一排孔中，在4°C下将脑浸没在100%TFM中2-24小时。
- 使用低温恒温器卡盘将大脑嵌入TFM中，在干冰上以所需的方向嵌入。
- 执行冷冻切片（16μm厚切片）并在带正电荷的载玻片上收集切片。在玻片加热器上干燥载玻片1小时，然后储存在-80°C或继续免疫组化。
- 在组织切片周围的载玻片上准备疏水屏障，并在载玻片加热器上干燥20分钟。
- 在PBS中短暂洗涤载玻片5分钟，然后在PBS-吐温20（0.05%）中洗涤两次，每次10分钟。
- 使用 EdU 细胞增殖试剂盒和制造商的说明执行 EdU 检测。
- 分析载玻片并使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜定量荧光EdU标记的细胞。至少需要40倍的物镜才能清楚地区分单个细胞。
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Representative Results
准备损伤诱导装置可以快速而简单地向成年斑马鱼提供可扩展的钝力TBI。损伤模型的分级严重程度提供了几个易于识别的成功损伤指标，尽管血管损伤是最简单和最突出的病理之一（图3）。受伤期间使用的鱼品系可以使该指标更容易或更难识别。当使用野生型AB鱼（WTAB，图3A-D）时，很难区分miTBI或moTBI的血管损伤以及由于色素沉着而未受损的对照鱼（图3A-C）。受伤后，miTBI鱼表现出最小的表面擦伤（图3B），而moTBI表现出有限的脑出血（图3C）。虽然sTBI仍然具有挑战性，但损伤的程度通常很明显（图3D）。相反，当使用白化病（图3E-H）或鱼（图3I-L）时，很容易识别血管损伤。此外，冲击性癫痫发作通常在受伤后观察到，该组的癫痫发作率是损伤的另一个代表性指标（表 1）。受伤的鱼将显示强直阵挛发作（共济失调，ZBC 1.9，弯曲，ZBC 1.16，盘旋，ZBC 1.32和开瓶器游泳，ZBC 1.37）19，无论背景菌株如何，在受伤后都很容易观察到。癫痫发作的患病率与严重程度相关。受伤后，miTBI不会表现出癫痫样行为;然而，moTBI将显示癫痫发作行为（10.66%±1.37%，p <0.0001，表1），并且sTBI鱼的发病率进一步升高（19.93%±1.49%，p<0.0001，表1）。
成功切除大脑对于无数的进一步研究至关重要，例如水肿和评估细胞增殖。请非常小心地进行解剖，以避免损害大脑区域（最常见的是无意穿刺）并保存所有区域（嗅球很容易丢失）。在脑部解剖程序和示意图（第3节，图2A-F）之后，可以完全切除脑部（图2G，H）。研究人员应该考虑他们的分析是否需要整个大脑，或者特定大脑区域的集合是否适合他们的需求。根据损伤的严重程度和收集时间，大脑可能表现出附着的硬膜下出血，然而，这些出血通常粘附在颅骨的下侧并在解剖过程中丢失。大脑肿胀有时是显而易见的，但由于解剖学差异和一般大小的变化，水肿是评估肿胀的最佳方法。按照概述的协议（第4节），未受损的大脑表现出73.11%±0.80%的液体含量，而miTBI虽然略微升高，但在1，3或5 dpi时水肿没有显着增加（1 dpi：76.33%±1.32%，p = 0.36，3 dpi：75.33±1.37%，p = 0.84，5 dpi：74.14±1.50%，p>0.99，图4）。相比之下，moTBI和sTBI的水肿均为1 dpi（moTBI：80.55±0.94%，p <0.0001，sTBI：86%±1.05%，p <0.0001）和3 dpi（moTBI：78.11±0.93%，p <0.018，sTBI：77.77%±1.02%，p <0.036，图4）。然而，moTBI和sTBI的流体含量恢复到与5 dpi的未受损对照相似的水平（moTBI：74.42±1.25%，p>0.99，sTBI：73.85%±1.01%，p>0.99，图4）。
斑马鱼 TBI 之后的细胞增殖是对损伤程度的有力评估。虽然之前已经在斑马鱼的其他形式的脑损伤后研究了细胞增殖反应9，12，但在大多数情况下，研究仅限于损伤部位。这种钝力 TBI 导致横跨神经轴的强烈增殖反应。以严重程度依赖性方式（显示sTBI数据），相对于未受损的对照组，在前脑（端脑， 图5B）的心室和脑室下区域观察到EdU标记增加（图5A）。当部分尾部进入中脑（中脑和间脑）时，与未受损的鱼相比，受伤的大脑在脑室周围灰色地带（PGZ），视直肠叶（TeO）和下丘脑前部的各个方面显示出增加的EdU标记（分别为图5D 和 图5C）。在后脑中，未受损大脑中明显的神经源性区域（图5E，G）在sTBI后表现出细胞增殖增加（图5F，H）。
总而言之，应用于成年斑马鱼的改良Marmarou体重滴剂提供了可重复且可扩展的轻度，中度或重度钝力TBI。斑马鱼以严重程度依赖性的方式表现出各种病理，包括癫痫发作和血管损伤（即硬膜下和脑内血肿）。此外，受伤的鱼表现出恢复率下降（类似于意识丧失，学习和记忆问题形式的认知缺陷以及神经元细胞死亡（数据未显示）。观察到的病理学在4-7天内迅速恢复，与整个神经轴的强烈增殖事件相吻合。
图 1：设置可扩展的损伤装置。 可扩展TBI的设置，模型和向斑马鱼交付的图形表示。步骤1-4提供了形成支撑模具的步骤的指导性概述，该支撑模具在损坏期间固定鱼并暴露头部。步骤 5-7 提供了有关提供损伤的说明，并深入了解了对模型进行故障排除时要考虑的方面。该图是用 BioRender.com 创建的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：颅骨切除术进行脑部解剖。 简化斑马鱼头骨的示意图和逐步去除骨头（蓝色部分）以暴露成年斑马鱼的大脑。（A，B）眼睛被钝器切除，#5镊子切断视神经。（C）将镊子直接放入肌肉组织尾部至顶叶板（黑色箭头），以去除右顶骨，然后切除右额骨。（D，E）切除左顶骨和左额骨。（F）切除右眼睑，术前，互操作和副手术，提供侧向和背侧进入大脑。（G，H）未受损和STBI的大脑被切除。比例尺 = 500 μm. 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：不同程度不同程度的血管损伤。未受损和TBI野生型AB，白化病4和卡斯珀成年斑马鱼的背侧视图显示血管损伤。（A-D）成鱼野生型AB鱼色素沉着严重，miTBI（B）后的擦伤难以观察。与未受损的对照组（A）相比，moTBI（C）和sTBI（D）鱼的血管损伤更为明显。（E-H）白化鱼的色素较少，大脑的可视化更加明显。TBI后的血管损伤被清晰地观察到，并按严重程度进行区分。（I-L）casper fish为新手研究人员提供了最具适应性的背景，因为透明度允许轻松识别所需的神经解剖区域，并通过TBI严重程度清晰地观察和描绘血管损伤。比例尺 = 500 μm.请点击此处查看此图的放大版本。
图4：斑马鱼在TBI后经历受伤引起的水肿。 斑马鱼暴露于不同严重程度的TBI（未受损，miTBI，moTBI和sTBI），并在损伤后的不同日期评估液体含量百分比（水肿）。使用Browns-Forsythe和Welch方差分析进行统计分析，然后进行Dunnett's T3多重比较事后测试。n = 单条鱼的总数。所有统计分析均使用Prism（Graphpad 9.0）软件包进行。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：TBI诱导的神经轴增殖。 （A-H）在收集前12小时IP注射EdU的未受损和sTBI鱼的冠状和矢状脑切片的共聚焦图像。在前脑（A，B），中脑（C，D）和后脑（E-H）损伤后的多个神经源性生态位中观察到EdU掺入增加。小脑，CCe，颗粒层，GL，内侧瓣膜，Vam，分子层，ML，视构造，TeO，脑室周围灰色地带，PGZ，端脑和Tel。所有比例尺均为 200 μm。请单击此处查看此图的放大版本。
| 群 | N | n | 平均癫痫发作（占扫描电镜±百分比 | p |
| 乌达姆 | 10 | 74 | 0% | |
| 米特比 | 10 | 100 | 0% | >0.99 |
| 移动比 | 10 | 184 | 10.66% ± 1.37% | <0.0001 |
| 断续器 | 10 | 237 | 19.93% ± 1.49% | <0.0001 |
表 1.斑马鱼在TBI后表现出严重程度依赖性冲击发作。 在受伤后1小时内观察到的强直阵挛发作的定量，记录为实验性损伤组的百分比。使用单因子方差分析进行统计分析，然后进行Tukey事后测试。N = 实验组总数，n = 单条鱼的总数。使用Prism（Graphpad 9.0）软件包进行统计分析。
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Discussion
长期以来，神经创伤和相关后遗症的研究一直集中在传统的非再生啮齿动物模型20上。直到最近，研究才将各种形式的CNS损伤应用于再生模型9，11，13，14，21。虽然这些模型具有洞察力，但它们受到使用在人群中罕见的损伤方法（穿透性创伤，化学消融，爆炸）和/或损伤不可扩展的限制，因此不能完全解决在人群中观察到的严重程度依赖性病理的异质性22，23，24，25.在这里，我们提供了一种损伤范式，该范式应用了临床上最常见的相关头部创伤（钝力）4 形式，该形式产生了许多在人类诊断中建立的病理指标22，23，24，25。当应用于再生斑马鱼时，该模型提供了途径来研究不同严重程度的损伤诱导的病理的进展和恢复，例如水肿或创伤后癫痫发作，以及阐明先天再生恢复背后的机制。
我们的模型在斑马鱼中产生钝力TBI有两个关键特征。首先，我们的模型提供了一种廉价而简单的快速损伤范式，它允许对大量个体的连续损伤或对个体的重复损伤来研究钝力TBI的累积效应。其次，该模型易于扩展，以检查不同力冲击的影响。通过改变管子的长度（滚珠轴承掉落的高度）和滚珠轴承的重量，可以很容易地修改和计算传递到鱼头骨的能量和冲击力。损伤的这种可扩展性允许对严重程度依赖性TBI后遗症进展和CNS修复的再生机制进行多种研究途径。
由于有多种指标可以成功获得伤害申请，因此仍应仔细考虑要利用的鱼类的遗传背景。 Casper 或 白化 突变鱼将有利于新手研究人员可靠地将鱼放置在下降轴下，将钢盘放置在所需的神经解剖学撞击点上，并评估血管损伤。此外，通过 骨 骼和 白化 突变鱼中骨骼和大脑的视觉可及性，简化了大脑的小心去除。然而，可以使用有色素的野生型鱼，尽管识别地标和成功解剖可能需要显着的做法。此外，色素鱼可以在产生moTBI或sTBI损伤时使用，因为随后的病理学允许对损伤进行适当的表征。
研究钝力TBI对斑马鱼的影响的一个主要原因是检查损伤诱导的细胞增殖的来源和神经元再生的机制。在斑马鱼神经轴的神经源性生态位中已发现发育和基底的构成性增殖水平26，27，并且已经观察到成年斑马鱼损伤诱导的再生位于或邻近损伤部位8，12，15。然而，我们的钝力TBI模型表明，弥漫性损伤也会导致整个神经轴上的神经源性龛内发生严重程度依赖性细胞增殖事件。鉴定TBI后细胞增殖的来源和程度将允许应用单细胞RNA-Seq来鉴定增殖生态位中基因表达的变化，并通过应用特异性激动剂和拮抗剂来测试不同信号通路在调节这种再生反应中的作用。这种方法已被证明有助于阐明受损斑马鱼视网膜中神经元再生的潜在机制28 ，并且在TBI之后的大脑中应该同样有用。
总之，我们的模型提供了一种快速、简单且经济高效的损伤方法，以提供可扩展的钝力TBI。该模型将有助于进一步研究严重程度依赖性或反复钝力TBI的影响，以及阐明遗传调节的治疗靶点，改善神经元保护或诱导神经元再生，以促进成年脊椎动物的功能性认知恢复。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢海德实验室成员的深思熟虑的讨论，弗雷曼生命科学中心负责斑马鱼护理和饲养的技术人员，以及圣母大学光学显微镜核心/ NDIIF使用仪器及其服务。这项工作得到了圣母大学斑马鱼研究中心，圣母大学干细胞和再生医学中心的支持，以及NIH R01-EY018417国家眼科研究所（DRH），国家科学基金会研究生研究奖学金计划（JTH），LTC Neil Hyland圣母院奖学金（JTH）的资助， 自由哨兵奖学金（JTH）和Pat Tillman奖学金（JTH）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
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