Summary
Wir modifizierten das Marmarou-Gewichtsabfallmodell für erwachsene Zebrafische, um eine Breite von Pathologien nach stumpfer traumatischer Hirnverletzung (TBI) und die Mechanismen, die der nachfolgenden neuronalen Regeneration zugrunde liegen, zu untersuchen. Dieses stumpfe TBI-Modell ist skalierbar, induziert ein leichtes, mittelschweres oder schweres SHT und rekapituliert die bei menschlichen TBI beobachtete Verletzungsheterogenität.
Abstract
Stumpfe Schädel-Hirn-Traumata (TBI) sind die häufigste Form des Kopftraumas, das sich über einen dicken Schweregrad erstreckt und zu komplexen und heterogenen Nebenwirkungen führt. Während es keinen Mechanismus gibt, um die verlorenen Neuronen nach einem TBI beim Menschen zu ersetzen oder zu regenerieren, besitzen Zebrafische die Fähigkeit, Neuronen in ihrem ganzen Körper, einschließlich des Gehirns, zu regenerieren. Um die Breite der Pathologien zu untersuchen, die bei Zebrafischen nach einem stumpfen TBI gezeigt werden, und um die Mechanismen zu untersuchen, die der nachfolgenden neuronalen regenerativen Reaktion zugrunde liegen, modifizierten wir den häufig verwendeten Nagetier-Marmarou-Gewichtsabfall für die Verwendung bei erwachsenen Zebrafischen. Unser einfaches Stumpfkraft-TBI-Modell ist skalierbar, induziert einen leichten, mittelschweren oder schweren TBI und rekapituliert viele der Phänotypen, die nach menschlichen TBI beobachtet wurden, wie Kontakt- und posttraumatische Anfälle, Ödeme, subdurale und intrazerebrale Hämatome und kognitive Beeinträchtigungen, die jeweils in Abhängigkeit von der Schwere der Verletzung auftreten. TBI-Folgeerscheinungen, die innerhalb von Minuten nach der Verletzung auftreten, klingen ab und kehren innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung auf nahezu unbeschädigte Kontrollniveaus zurück. Der regenerative Prozess beginnt bereits 48 Stunden nach der Verletzung (hpi), wobei die maximale Zellproliferation von 60 hpi beobachtet wird. So erzeugt unser Zebrafisch-Stumpfkraft-TBI-Modell charakteristische primäre und sekundäre Verletzungs-TBI-Pathologien, die dem menschlichen SHT ähneln, was die Untersuchung des Krankheitsbeginns und -fortschreitens sowie der Mechanismen der neuronalen Regeneration ermöglicht, die für Zebrafische einzigartig sind.
Introduction
Traumatische Hirnverletzungen (TBIs) sind eine globale Gesundheitskrise und eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung. In den Vereinigten Staaten erleben etwa 2,9 Millionen Menschen jedes Jahr einen TBI, und zwischen 2006 und 2014 stieg die Mortalität aufgrund von TBI oder TBI-Folgeerkrankungen um über 50%1. TBIs unterscheiden sich jedoch in ihrer Ätiologie, Pathologie und klinischen Präsentation, was zum großen Teil auf den Mechanismus der Verletzung (MOI) zurückzuführen ist, der auch die Behandlungsstrategien und die prognostizierte Prognose beeinflusst2. Obwohl TBIs aus verschiedenen MOI resultieren können, sind sie überwiegend das Ergebnis eines durchdringenden oder stumpfen Gewalttraumas. Penetrierende Traumata machen einen kleinen Prozentsatz der TBIs aus und erzeugen eine schwere und fokale Verletzung, die auf die unmittelbaren und umliegenden aufgespießten Hirnregionen lokalisiert ist3. Im Gegensatz dazu sind stumpfe TBIs häufiger in der Allgemeinbevölkerung, umfassen eine Reihe von Schweregraden (leicht, mittelschwer und schwer) und verursachen eine diffuse, heterogene und globale Verletzung, die mehrere Hirnregionen betrifft1,4,5.
Zebrafische (Danio rerio) wurden verwendet, um eine breite Palette von neurologischen Beleidigungen zu untersuchen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) umfassen.6,7,8,9. Zebrafische besitzen im Gegensatz zu Säugetieren auch eine angeborene und robuste regenerative Reaktion, um ZNS-Schäden zu reparieren10. Aktuelle Zebrafisch-Traumamodelle verwenden verschiedene Verletzungsmethoden, einschließlich Penetration, Exzision, chemische Beleidigung oder Druckwellen11,12,13,14,15,16. Jede dieser Methoden verwendet jedoch ein MOI, das von der menschlichen Bevölkerung selten erlebt wird, nicht über eine Reihe von Verletzungsschweregraden skalierbar ist und nicht auf die Heterogenität oder schweregradabhängige TBI-Folge zurückzuführen ist, die nach stumpfer TBI berichtet wurde. Diese Faktoren schränken die Verwendung des Zebrafischmodells ein, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathologien zu verstehen, die mit der häufigsten Form von SHT in der menschlichen Bevölkerung (leichte stumpfe Gewaltverletzungen) verbunden sind.
Unser Ziel war es, ein schnelles und skalierbares TBI-Zebrafischmodell mit stumpfer Kraft zu entwickeln, das Möglichkeiten zur Untersuchung der Verletzungspathologie, des Fortschreitens von TBI-Folgeerkrankungen und der angeborenen regenerativen Reaktion bietet. Wir modifizierten den häufig verwendeten Nagetier-Marmarou17-Gewichtstropfen und trugen ihn auf erwachsene Zebrafische auf. Dieses Modell ergibt einen reproduzierbaren Schweregradbereich von leicht, mittelschwer bis schwer. Dieses Modell rekapituliert auch mehrere Facetten der menschlichen TBI-Pathologie in einer schweregradabhängigen Weise, einschließlich Anfällen, Ödemen, subduralen und intrazerebralen Hämatomen, neuronalem Zelltod und kognitiven Defiziten wie Lern- und Gedächtnisstörungen. Tage nach der Verletzung lösen sich Pathologien und Defizite auf und kehren zu einem Niveau zurück, das unbeschädigten Kontrollen ähnelt. Darüber hinaus zeigt dieses Zebrafischmodell eine robuste Proliferations- und neuronale Regenerationsreaktion über die Neuroaxis in Bezug auf die Schwere der Verletzung.
Hier geben wir Details zur Einrichtung und Induktion eines stumpfen Gewalttraumas, zur Bewertung posttraumatischer Anfälle, zur Beurteilung von Gefäßverletzungen, Anweisungen zur Vorbereitung von Hirnschnitten, Ansätze zur Quantifizierung von Ödemen und Einblicke in die proliferative Reaktion nach einer Verletzung.
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Protocol
Zebrafische wurden in der Zebrafischanlage Notre Dame im Freimann Life Sciences Center gezüchtet und gepflegt. Die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Notre Dame genehmigt.
1. Paradigma der traumatischen Hirnverletzung
- 1 ml 2-Phenoxyethanol zu 1 l Systemwasser (60 mg Instant Ocean in 1 l entionisiertem RO-Wasser) geben.
- Bereiten Sie einen belüfteten Rückgewinnungstank mit 2 l Systemwasser bei Raumtemperatur vor.
- Wählen Sie das gewünschte Gewicht des Kugellagers und eine gewünschte Länge und durchmesser von Stahl-/Kunststoffrohren und bestimmen Sie die Energie und Schlagkraft.
HINWEIS: Der Schlauch sollte einen Innendurchmesser haben, der es dem Kugellager ermöglicht, durchzugehen, ohne seinen Weg oder seine Bewegungsgeschwindigkeit zu ändern.- Bestimmen Sie die kinetische Energie beim Aufprall:
Dabei gilt: KE = kinetische Energie, m = Masse (in kg), g = Gravitationskraft, h = Höhe (in m) vom Tropfenpunkt zum Fisch.
HINWEIS: Dies liefert kinetische Energie in J. Multiplizieren Sie den Wert mit 1.000, um mJ zu bestimmen. KE basiert auf einem beschleunigenden Objekt, das auftritt, wenn das Kugellager aus einer stationären Position fallen gelassen wird. - Erzeugen Sie ein mildes TBI (miTBI) aus einem 7,62 cm langen Stahl-/Kunststoffrohr, das 1,5 cm über der Platte auf dem Zebrafischschädel (Gesamtabstand 9,1 cm) endet, und einem Kugellager von 1,5 g (6,4 mm Durchmesser). Diese erzeugen eine kinetische Energie von 1,33 mJ. Dieser Schaden wurde empirisch als gleichwertig mit einem miTBI auf der Grundlage wichtiger pathophysiologischer TBI-Marker wie Gefäßverletzungen, subduraler/intrazerebraler Hämatombildung, neuronalem Zelltod und kognitiven Beeinträchtigungen entschieden, die weitgehend rekapitulierten, was in der menschlichen Bevölkerung in einer schweregradabhängigen Weise berichtet wurde.
- Kinetische Energie berechnen miTBI =
- Erzeugen Sie einen moderaten TBI (moTBI) mit einem 12,7 cm langen Stahl-/Kunststoffrohr, das 1,5 cm über der Platte auf dem Zebrafischschädel (Gesamtabstand 14,2 cm) endet, und einem Kugellager mit einem Durchmesser von 1,5 g (6,4 mm Durchmesser), das eine kinetische Energie von 2,08 mJ erzeugt.
- Kinetische Energie berechnen moTBI =
- Erzeugen Sie einen schweren TBI (sTBI) mit einem 7,62 cm langen Stahl-/Kunststoffrohr, das 1,5 cm über der Platte auf dem Zebrafischschädel (Gesamtabstand 9,1 cm) endet, und einem Kugellager von 3,3 g (8,38 mm Durchmesser), das eine kinetische Energie von 2,94 mJ erzeugt.
- Kinetische Energie berechnen sTBI =
- Bestimmen Sie die kinetische Energie beim Aufprall:
- Füllen Sie eine Petrischale mit Modelliermasse (Abbildung 1, Schritt 1) und verwenden Sie ein stumpfes Instrument (d. h. die Rückseite einer Pinzette), um eine erhöhte Plattform (5 cm x 1,5 cm) mit zusätzlicher Modelliermasse zu erstellen (Abbildung 1, Schritt 2).
- Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die erhöhte Plattform der Länge nach in zwei ungefähr gleiche Hälften zu teilen (Abbildung 1, Schritt 3, rote gestrichelte Linie). Formen Sie die beiden Hälften zu einem Kanal, der die Länge eines erwachsenen Fisches aufnimmt (Abbildung 1, Schritt 4). Verwenden Sie zusätzlichen Lehm, um Wände zu bauen, die ~ 2/3 des Fischkörpers sichern und den Kopf freilegen.
- Formen Sie eine kleine Stütze im freiliegenden Kopfbereich senkrecht zu den Wänden, um den Kopf zu stützen, um eine Rotation oder einen Rückstoß des Kopfes bei Verletzungen zu vermeiden (Abbildung 1, Schritt 4).
HINWEIS: Der Kanal sollte tief genug sein, um den Fisch in einer dorsalen Position zu stützen, aber dennoch sollte der Kopf über dem umgebenden Ton ruhen können. Darüber hinaus sollte die Kopfstütze der natürlichen Krümmung des Fisches folgen und den unteren Unterkiefer und die Kiemen stützen. - Stellen Sie sicher, dass das abfallende Gewicht nicht durch die Seiten des Kanals behindert wird (Abbildung 1, Schritt 4).
- Erstellen Sie eine Stahlscheibe mit einem Durchmesser von 3 mm mit einem Mini-Locher und 22 g Stahlblitzen. Jede Festplatte kann mehrmals verwendet werden.
- Betäuben Sie einen Fisch, indem Sie ihn in ein Becherglas mit 50-100 ml 1:1000 (1 ml / 1 l, 0,1%) 2-Phenoxyethanol geben, bis er nicht mehr auf Schwanzdrücken reagiert.
- Legen Sie den Fisch mit der Rückenseite nach oben auf die Tonform innerhalb des Kanals, so dass der Körper an den Seiten befestigt ist, und legen Sie eine 3 mm 22 g Stahlscheibe auf den Kopf, zentriert über den gewünschten Aufprallpunkt (Abbildung 1, Schritt 5).
- Stellen Sie sicher, dass der Fisch so senkrecht wie möglich ausgerichtet ist, um zu vermeiden, dass sein Kopf zur Seite kippt, was zu einem ungleichmäßigen Aufprall führen könnte.
- Befestigen Sie das Stahl-/Kunststoffrohr mit einem Standard-Ringständer und einer Armklemme, sodass sich der Boden des Rohrs 1,5 cm über dem Kopf des Zebrafisches befindet (Abbildung 1, Schritt 6). Stellen Sie sicher, dass der Schlauch gerade ist.
- Schauen Sie das Rohr nach unten und stellen Sie sicher, dass das Rohr über der Stahlplatte ausgerichtet ist.
- Lassen Sie das Kugellager (1,5 g für leichtes und moderates SHT und 3,3 g für schweres SHT) aus einer vorbestimmten Höhe (beschrieben in den Schritten 1.3.3-1.3.5) durch das Rohr auf die Stahlplatte fallen, die sich über dem gewünschten neuroanatomischen Bereich von Interesse befindet (z. B. Kleinhirn, Abbildung 1, Schritt 5), um den stumpfen TBI für die gewünschte Schwere der Verletzung zu erzeugen. Legen Sie die verletzten Fische in ein Aufwachbecken, um überwacht zu werden.
HINWEIS: Je nach Schwere der Verletzung können Mortalität oder tonisch-klonische Anfälle auftreten. Wenn die Fische nach dem TBI über einen längeren Zeitraum nicht ansprechbar sind, verwenden Sie eine Transferpipette oder eine Pinzette, um eine Schwanzzange zu verabreichen und eine Schmerzreaktion zu bewerten.
2. Scoring-Anfälle nach TBI beim erwachsenen Zebrafisch
- Betäuben und verletzen Sie den Fisch gemäß dem in Abschnitt 1 beschriebenen Verletzungsprotokoll und legen Sie den verletzten Fisch in ein belüftetes Aufwachbecken mit 2 l Systemwasser.
- Beobachten Sie den Fisch auf Anzeichen von posttraumatischen Anfällen, die unmittelbar nach dem Einsetzen in das Aufwachbecken beginnen. Legen Sie eine Beobachtungszeit fest (d. h. 1 h) und zeichnen Sie alle Anfallsaktivitäten auf, einschließlich des Anfalls-Scores (unten beschrieben), der Dauer jedes Anfalls und des Prozentsatzes der Fische, bei denen Anfälle aufgetreten sind (Abbildung 2A).
HINWEIS: Anfälle können sofort nach einer Verletzung sowie Stunden oder Tage nach TBI auftreten. Anfälle können langfristig bestehen bleiben und ein einzelner Fisch kann mehrere Anfälle haben. Die Festlegung einer Beobachtungszeit von 1 h oder mehr liefert eine gute Darstellung des Gesamttrends der Anfallsraten. - Bewerten Sie Fische anhand der Mussulini18-Richtlinien für adulte Zebrafisch-Anfallsphänotypen.
HINWEIS: Ohne die Verwendung der Tracking-Software ist es schwierig, Anfallswerte unter 3 unvoreingenommen zu beurteilen. Daher sollten nur Anfallswerte von 3 oder höher aufgezeichnet werden, wenn die Bewertung ohne Software durchgeführt wird.
3. Gehirndissektion
- Fische in einer 1:500 (2 ml/1 l, 0,2%) Lösung von 2-Phenoxyethanol einschläfern, bis die Kiemenbewegungen aufhören und sie am gewünschten Endpunkt nicht mehr auf Flossendrücken reagieren.
- Füllen Sie eine Petrischale mit Modelliermasse und schaffen Sie einen kleinen Hohlraum, um den Körper während der Dissektion zu unterstützen.
- Legen Sie den Fisch mit der Rückenseite nach oben in die Tonform. Platzieren Sie einen Sezierstift durch die Mittellinie auf halber Höhe des Fischkörpers und einen zweiten Stift ~ 5 mm hinter der Basis des Kopfes.
- Unter einem sezierenden Lichtmikroskop den Sehnerv stumpf mit einer Dumontzange Nr. 5 durchtrennen und die Augen entfernen (Abbildung 2A).
- Richten Sie den Fisch so aus, dass das rostrale Ende am weitesten entfernt ist, wenn Sie durch das Mikroskop schauen (Abbildung 2B).
HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten für Rechtshänder. Linkshänder können es vorziehen, die folgenden Schritte in einer gespiegelten Ausrichtung auszuführen. - Verwenden Sie die Pinzette Nr. 5, um langsam ein Ende der Pinzette unter die rechte Parietalplatte zu legen, indem Sie eine absichtliche Scherenbewegung in Richtung des Rostralendes ausführen und die rechten Parietal- und Frontalplatten entfernen (Abbildung 2C).
- Halten Sie die Pinzette in einem Winkel von 45 ° oder niedriger, um zu vermeiden, dass während der Dissektion in das Gehirn eingedrungen wird.
- Drehen Sie den Fisch um 90° im Uhrzeigersinn. Legen Sie ein Ende der Pinzette Nr. 5 unter die linke Parietalplatte und verwenden Sie die gleiche Scherenbewegung, um die linken Parietal- und Frontalplatten zu entfernen, die den gesamten dorsalen Aspekt des Gehirns freilegen (Abbildung 2D, E).
- Durchschneiden Sie den Oberkiefer stumpf mit einer Pinzette Nr. 5. Bewahren Sie die Riechkolben auf und beschädigen Sie sie nicht, wenn dies die Region von Interesse ist.
- Entfernen Sie den rechten Operkel, den Präoperkel, den Interoperkel und den Suboperkel mit der Pinzette Nr. 5 (Abbildung 2F).
- Resezieren Sie die Muskulatur stumpf am kaudalen Ende der Kalvarienbergöffnung mit einer Pinzette Nr. 5 und legen Sie das Rückenmark frei.
- Stumpf transektieren Sie das Rückenmark mit # 5 Pinzette. Legen Sie vorsichtig eine Pinzette unter das Gehirn und entfernen Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Kalvarienberg.
HINWEIS: Kneifen Sie niemals das Gehirn. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gehirn zu "wiegen" oder kaudal zu resezieren und das freiliegende Rückenmark als Kneifpunkt zu nutzen, um das Gehirn zu manövrieren. - Fixieren Sie die entfernten Gehirne in 9 Teilen 100% Ethanol auf 1 Teil 37% Formaldehyd über Nacht bei 4 ° C auf einer Wippplattform.
4. Ödemstudien im Zebrafischgehirn
- Betäuben und verletzen Sie Fische gemäß dem in Abschnitt 1 beschriebenen Verletzungsprotokoll und lassen Sie die Fische sich in einem Aufwachbecken erholen, bis sie frei schwimmen können.
- Legen Sie den Fisch nach der Verletzung für 1 Tag wieder unter die normalen Haltungsbedingungen.
- Den Fisch nach Ablauf der Zeit in 1:500 2-Phenoxyethanol einschläfern.
- Sezieren Sie das gesamte Gehirn oder die Region von Interesse gemäß dem in Abschnitt 3 beschriebenen Protokoll und legen Sie das Gehirn sofort auf ein kleines Wiegeboot.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Übertragen des Gehirns und verwenden Sie eine feine Pinzette, um es vorsichtig auf das Wiegeboot zu legen, ohne das Gehirn zu erstechen oder zu kratzen, was zum Verlust von Gewebe führen könnte. - Beschriften Sie (mit Verletzungsgruppe und Gehirnnummer) und taraieren Sie ein zusätzliches kleines Trocknungswiegeboot auf einer Waage. Verwenden Sie eine Waage mit der Fähigkeit, mindestens 0,001 g zu messen, um eine genaue Messung zu erhalten.
- Übertragen Sie das Gehirn auf das geteerte Trocknungswiegeboot und zeichnen Sie das nasse Gewicht des Gehirns auf. Richten Sie die Gehirne so aus, dass sie flach auf dem Wiegeboot mit der Rückenseite nach oben liegen.
- Stellen Sie das Trocknungswiegeboot und das Gehirn für 8 h in einen hybridisierten Ofen, der auf 60 °C eingestellt ist.
- Nach dem Trocknen kann das Gehirn an dem trocknenden Wiegeboot haften bleiben und kann schwierig zu entfernen und auf ein neues geteertes kleines Wiegeboot zu übertragen sein. Vermeiden Sie es, das Gehirn mit einer Pinzette zu kneifen, da dies zu einer Schädigung des trockenen Gehirns und zum Verlust von Gewebe führen kann. Kneifen Sie stattdessen die feine Pinzette zusammen und schöpfen Sie ab der ventralen Seite des Gehirns eine Aufwärtsbewegung ein.
- Bestimmen Sie den Wassergehalt jedes Gehirns mit der Formel (Abbildung 4):
5. Markierung der Zellproliferation über die Neuroaxis und Vorbereitung von fixiertem Gewebe.
- 10 mM 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) in 2 ml ddH2O herstellen.
- Anästhesieren Sie 3 bis 4 Fische gleichzeitig in 50-100 ml 1:1000 (1 ml/1 l, 0,1 %) 2-Phenoxyethanol, bis die Fische nicht mehr auf Schwanzdrücken reagieren, und zwar zum gewünschten Zeitpunkt nach der Verletzung (unter Verwendung des in Abschnitt 1 beschriebenen Protokolls).
- Machen Sie einen Teilschnitt auf einem nassen Schwamm und legen Sie einen Fisch nach dem anderen in die Öffnung, ventrale Seite nach oben.
- Verwenden Sie eine 30 G Nadel, um ~ 40 μL von 10 mM EdU in den Körper des Fisches zu injizieren. Bringen Sie den Fisch in einen mit Systemwasser gefüllten Fäkalientank zurück.
HINWEIS: Wiederholte Injektionen können zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt werden, um eine größere Anzahl von sich ausbreitenden Zellen zu markieren, und können erforderlich sein, wenn eine Verfolgungsdauer von mehr als 1 Woche gewünscht wird. - Sammeln Sie Gehirne wie in Abschnitt 3 beschrieben und legen Sie sie als Gruppe in eine 5 ml Glasfläschchen mit 2 ml 9 Teilen 100% Ethanol zu 1 Teil 37% Formaldehyd. Fixieren Sie die Gehirne bei 4 °C auf einer Wippplattform.
HINWEIS: Eine Wipp- oder Shaker-Plattform verbietet es dem Gehirn, unten zu ruhen, und dem Telencephalon des ganzen Gehirns, sich zu kräuseln. - Rehydrieren Sie Gehirne, in der gleichen Glasfläschchen, die zur Fixierung von Gehirnen verwendet wird, in Waschungen von absteigenden Ethanol-Serien, 75%, 50% und 25%, für jeweils 15 Minuten, gefolgt von einer 1,5-stündigen Wäsche in 5% Saccharose / PBS auf einer Wippe bei Raumtemperatur. Lagern Sie die Gehirne in einem Glasfläschchen über Nacht in 30% Saccharose/PBS bei 4° C auf einer Wippplattform.
- Entfernen Sie Gehirne aus 30% Saccharose / PBS und übertragen Sie sie mit einer Pinzette in eine 12-Well-Platte (eine Behandlungsgruppe pro Bohrung) mit Vertiefungen, die mit einer 2: 1-Lösung gefüllt sind, die aus 2 Teilen Gewebe-Gefriermedium und 1 Teil 30% Saccharose / PBS besteht. Inkubieren Sie die Gehirne über Nacht bei 4 °C auf einer Wippplattform.
- Übertragen Sie Gehirne für 2-24 h bei 4 ° C in die nächste Reihe von Vertiefungen innerhalb der 12-Well-Plattenplatten-Tauchgehirne in 100% TFM.
- Verwenden Sie ein Kryostatenfutter, um die Gehirne in TFM in der gewünschten Ausrichtung auf Trockeneis einzubetten.
- Führen Sie eine Kryosektion (16 μm dicke Abschnitte) durch und sammeln Sie die Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern. Objektträger 1 h auf einem Objektträgerwärmer trocknen und dann bei -80 °C lagern oder mit der Immunhistochemie fortfahren.
- Bereiten Sie eine hydrophobe Barriere auf dem Objektträger um die Gewebeabschnitte vor und lassen Sie sie 20 Minuten auf einem Objektträger trocknen.
- Waschen Sie die Objektträger kurz in PBS für 5 min und dann zweimal in PBS-Tween 20 (0,05%) für jeweils 10 min.
- Führen Sie die EdU-Erkennung mit dem EdU Cell Proliferation Kit und den Anweisungen des Herstellers durch.
- Analysieren Sie die Objektträger und quantifizieren Sie die fluoreszierenden EdU-markierten Zellen entweder mit einem Epifluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop. Mindestens ein 40-faches Objektiv ist erforderlich, um einzelne Zellen klar zu unterscheiden.
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Representative Results
Die Vorbereitung des Verletzungsinduktions-Rigs ermöglicht eine schnelle und vereinfachte Möglichkeit, erwachsenen Zebrafischen einen skalierbaren stumpfen TBI zu liefern. Der abgestufte Schweregrad des Verletzungsmodells liefert mehrere leicht identifizierbare Metriken für eine erfolgreiche Verletzung, obwohl die Gefäßverletzung eine der einfachsten und prominentesten Pathologien ist (Abbildung 3). Die Belastung der Fische, die während der Verletzung verwendet wurden, kann diesen Indikator leichter oder schwieriger zu identifizieren machen. Bei der Verwendung von Wildtyp-AB-Fischen (WTAB, Abbildung 3A-D) kann die Identifizierung von Gefäßverletzungen zwischen miTBI oder moTBI und unbeschädigten Kontrollfischen aufgrund der Pigmentierung schwierig sein (Abbildung 3A-C). Nach einer Verletzung weisen miTBI-Fische minimale Oberflächenabrieb auf (Abbildung 3B), während moTBI eine begrenzte Hirnblutung aufweist (Abbildung 3C). Während sTBI immer noch eine Herausforderung darstellen kann, ist das Ausmaß der Verletzung oft offensichtlich (Abbildung 3D). Im Gegensatz dazu ist bei der Verwendung von Albino (Abbildung 3E-H) oder Casperfisch (Abbildung 3I-L) eine Gefäßverletzung leicht zu erkennen. Darüber hinaus werden häufig Impaktanfälle beobachtet, nachdem die Verletzung und die Anfallsrate in der Gruppe eine weitere repräsentative Metrik der Verletzung ist (Tabelle 1). Verletzte Fische zeigen tonisch-klonische Anfälle (Ataxie, ZBC 1,9, Biegung, ZBC 1,16, Kreisen, ZBC 1,32 und Korkenzieherschwimmen, ZBC 1,37)19), die nach einer Verletzung unabhängig von der Hintergrundbelastung leicht zu beobachten sind. Anfälle werden mit zunehmender Prävalenz in Bezug auf den Schweregrad beobachtet. Nach einer Verletzung zeigen miTBI keine anfallsartigen Verhaltensweisen; moTBI zeigt jedoch ein Anfallsverhalten (10,66% ± 1,37%, p < 0,0001, Tabelle 1) und die Inzidenz ist bei sTBI-Fischen weiter erhöht (19,93% ± 1,49%, p < 0,0001, Tabelle 1).
Die erfolgreiche Entfernung des Gehirns ist entscheidend für eine Vielzahl weiterer Untersuchungen, wie ödeme und die Beurteilung der Zellproliferation. Führen Sie Dissektionen mit größter Sorgfalt durch, um eine Schädigung der Hirnregionen (meistens durch unbeabsichtigte Punktion) zu vermeiden und alle Regionen zu erhalten (die Riechkolben können leicht verloren gehen). Das Befolgen des Gehirndissektionsverfahrens und des Schemas (Abschnitt 3, Abbildung 2A-F) ermöglicht eine vollständige Entfernung des Gehirns (Abbildung 2G, H). Forscher sollten überlegen, ob ihre Analyse das gesamte Gehirn erfordert oder ob eine Sammlung spezifischer Hirnregionen ihren Bedürfnissen entsprechen kann. Abhängig von der Schwere der Verletzung und dem Zeitpunkt der Entnahme können die Gehirne angehängte subdurale Blutungen aufweisen, die jedoch oft an der Unterseite des Schädels haften und während der Dissektion verloren gehen. Schwellungen des Großhirns sind manchmal offensichtlich, aber aufgrund anatomischer Unterschiede und Variationen in der allgemeinen Größe ist Ödem die beste Methode, um Schwellungen zu beurteilen. Nach dem beschriebenen Protokoll (Abschnitt 4) weisen unbeschädigte Gehirne einen Flüssigkeitsgehalt von 73,11% ± 0,80% auf, und miTBI, obwohl leicht erhöht, zeigt keine signifikante Zunahme der Ödeme bei 1, 3 oder 5 dpi (1 dpi: 76,33% ± 1,32%, p = 0,36, 3 dpi: 75,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,14 ± 1,50%, p > 0,99, Abbildung 4). Im Gegensatz dazu wiesen sowohl moTBI als auch sTBI signifikante Ödeme 1 dpi (moTBI: 80,55 ± 0,94%, p < 0,0001, sTBI: 86% ± 1,05%, p < 0,0001) und 3 dpi (moTBI: 78,11 ± 0,93%, p < 0,018, sTBI: 77,77% ± 1,02%, p < 0,036, Abbildung 4) auf. Der Flüssigkeitsgehalt von moTBI und sTBI kehrte jedoch um 5 dpi zu einem Niveau zurück, das einer unbeschädigten Kontrolle ähnelte (moTBI: 74,42 ± 1,25%, p > 0,99, sTBI: 73,85% ± 1,01%, p > 0,99, Abbildung 4).
Die Zellproliferation nach TBI bei Zebrafischen ist eine robuste Beurteilung des Ausmaßes der Verletzung. Während die Zellproliferationsreaktion zuvor bei Zebrafischen nach anderen Formen der Hirnverletzung untersucht wurde9,12 war die Untersuchung in den meisten Fällen auf die Verletzungsstelle beschränkt. Diese stumpfe Kraft TBI führt zu einer robusten Proliferationsreaktion, die sich über die Neuroachsen erstreckt. In abhängigkeit vom Schweregrad (sTBI-Daten gezeigt) wird eine erhöhte EdU-Markierung in den ventrikulären und subventrikulären Zonen des Vorderhirns (Telencephalon, Abbildung 5B) relativ zu unbeschädigten Kontrollen beobachtet (Abbildung 5A). Als sich die Abschnitte kaudal in das Mittelhirn (Mesencephalon und Zwischenncephalon) bewegten, zeigten verletzte Gehirne eine erhöhte EdU-Markierung in der periventrikulären Grauzone (PGZ), den optischen Tektallappen (TeO) und Aspekten des vorderen Hypothalamus im Vergleich zu unbeschädigten Fischen (Abbildung 5D bzw. Abbildung 5C). Im Hinterhirn zeigen neurogene Regionen, die im unbeschädigten Gehirn sichtbar sind (Abbildung 5E,G), eine erhöhte Zellproliferation nach der sTBI (Abbildung 5F,H).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein modifizierter Marmarou-Gewichtsabfall, der auf erwachsene Zebrafische angewendet wird, einen reproduzierbaren und skalierbaren leichten, mittelschweren oder schweren stumpfen TBI bietet. Zebrafische zeigen in abhängigkeit vom Schweregrad verschiedene Pathologien, einschließlich Anfälle und Gefäßverletzungen (d. H. Subdurale und intrazerebrale Hämatome). Darüber hinaus zeigen verletzte Fische eine verminderte Erholungsrate (analog zu Bewusstlosigkeit, kognitiven Defiziten in Form von Lern- und Gedächtnisproblemen und neuronalem Zelltod (Daten nicht gezeigt). Die beobachteten Pathologien erholen sich schnell über einen Zeitraum von 4-7 Tagen, die mit robusten proliferativen Ereignissen in der Neuroaxie zusammenfallen.
Abbildung 1: Einrichten des skalierbaren Verletzungsgeräts. Grafische Darstellung des Setups, des Modells und der Bereitstellung skalierbarer TBIs an den Zebrafisch. Die Schritte 1-4 bieten einen Anleitungsüberblick über die Schritte zur Bildung der Stützform, die den Fisch immobilisiert und den Kopf während einer Beschädigung freilegt. Die Schritte 5-7 enthalten Anweisungen zur Behebung der Verletzung mit Einblicken in Aspekte, die bei der Fehlerbehebung des Modells zu berücksichtigen sind. Die Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schädelentfernung zur Hirndissektion. Schematische Darstellung eines vereinfachten Zebrafischschädels und der schrittweisen Entfernung von Knochen (blaue Schnitte), um das erwachsene Zebrafischgehirn freizulegen. (A,B) Die Augen werden stumpf entfernt, wobei # 5 Pinzette die Sehnerven durchtrennt. (C) Die Pinzette wird direkt kaudal in die Muskulatur zu den Parietalplatten (schwarzer Pfeil) gelegt, um den rechten Parietalknochen und dann den rechten Frontbein zu entfernen. (D,E) Der linke Parietalknochen und der linke Frontalknochen werden entfernt. (F) Das rechte Operkel, das Präoperkel, das Interoperkel und das Suboperkel werden entfernt, wodurch ein lateraler und dorsaler Zugang zum Gehirn möglich ist. (G,H) Unbeschädigte und sTBI-Gehirne wurden entfernt. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Gefäßverletzung in verschiedenen Hintergründen über Verletzungsschwere hinweg. Dorsale Ansicht von unbeschädigten und TBI Wildtyp AB, Albinob4 und Casper adult Zebrafisch mit Gefäßverletzung. (A-D) Erwachsene Wildtyp-AB-Fische sind stark pigmentiert und Abschürfungen nach miTBI (B) sind schwer zu visualisieren. Gefäßverletzungen waren bei moTBI(C)- und sTBI(D)-Fischen im Vergleich zu unbeschädigten Kontrollen (A) deutlicher. (E-H) Albino-Fische waren weniger pigmentiert und die Visualisierung des Gehirns war ausgeprägter. Gefäßverletzungen nach TBI wurden deutlich beobachtet und über schwereGrade hinweg unterschieden. (I-L) Casper Fish bot den anpassungsfähigsten Hintergrund für unerfahrene Forscher, da die Transparenz eine einfache Identifizierung der gewünschten neuroanatomischen Regionen und eine klare Beobachtung und Abgrenzung der Gefäßverletzung nach TBI-Schweregrad ermöglichte. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zebrafische erleben verletzungsbedingte Ödeme nach TBI. Zebrafische wurden verschiedenen Schweregraden von TBI (unbeschädigt, miTBI, moTBI und sTBI) ausgesetzt und an verschiedenen Tagen nach der Schädigung auf prozentualen Flüssigkeitsgehalt (Ödem) untersucht. Statistische Analysen wurden mit einem Browns-Forsythe und Welch ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Dunnett's T3 Multiple Comparison Post-hoc-Test. n = Gesamtzahl der einzelnen Fische. Alle statistischen Analysen wurden mit dem Softwarepaket Prism (Graphpad 9.0) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: TBI-induzierte Proliferation über die Neuroachsen. (A-H) Konfokale Bilder von koronalen und sagittalen Hirnschnitten von unbeschädigten und sTBI-Fischen, die 12 h vor der Entnahme ip-injiziert wurden. Eine erhöhte EdU-Inkorporation wurde in mehreren neurogenen Nischen nach Verletzungen im Vorderhirn (A, B), Mittelhirn (C, D) und Hinterhirn (E-H) beobachtet. Kleinhirn, CCe, Granulatschicht, GL, Mediale Valvula Cerebelli, Vam, Molekulare Schicht, ML, Optic Tectum, TeO, Periventrikuläre Grauzone, PGZ, Telencephalon und Tel. Alle Maßstabsbalken sind 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gruppe | N | n | Mittlere Anfälle (%) ± SEM | p |
| Freilassen | 10 | 74 | 0% | |
| miTBI | 10 | 100 | 0% | >0,99 |
| moTBI | 10 | 184 | 10,66% ± 1,37% | <0.0001 |
| sTBI | 10 | 237 | 19,93% ± 1,49% | <0.0001 |
Tabelle 1. Zebrafische zeigen schweregradabhängige Anfälle nach TBI. Quantifizierung von tonisch-klonischen Anfällen, die als Prozentsatz einer experimentellen verletzten Gruppe aufgezeichnet wurden, die innerhalb von 1 h nach der Verletzung beobachtet wurden. Statistische Analysen wurden mit einer Einweg-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. N = Gesamtzahl der Versuchsgruppen, n = Gesamtzahl der einzelnen Fische. Statistische Analysen wurden mit dem Softwarepaket Prism (Graphpad 9.0) durchgeführt.
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Discussion
Untersuchungen zu Neurotrauma und assoziierten Folgeerkrankungen konzentrieren sich seit langem auf traditionelle nicht-regenerative Nagetiermodelle20. Erst kürzlich haben Studien verschiedene Formen von ZNS-Schäden auf regenerative Modelle angewendet9,11,13,14,21. Obwohl aufschlussreich, sind diese Modelle entweder durch die Verwendung einer Verletzungsmethode begrenzt, die in der menschlichen Bevölkerung ungewöhnlich ist (durchdringende Traumata, chemische Ablation, Explosion) und/oder die Verletzung ist nicht skalierbar und berücksichtigt daher nicht vollständig die Heterogenität der schweregradabhängigen Pathologien, die in der menschlichen Bevölkerung beobachtet wurden22,23,24,25 . Hier stellen wir ein Schadensparadigma zur Verfügung, das die häufigste Form eines klinisch relevanten Kopftraumas (stumpfe Kraft)4 anwendet, das viele der pathologischen Metriken hervorbringt, die in der menschlichen Diagnose etabliert sind22,23,24,25. Wenn es auf den regenerativen Zebrafisch angewendet wird, bietet das Modell Möglichkeiten, das Fortschreiten und die Genesung von verletzungsinduzierten Pathologien über Schweregrade wie Ödeme oder posttraumatische Anfälle hinweg zu untersuchen und die Mechanismen hinter der angeborenen regenerativen Erholung aufzuklären.
Es gibt zwei Hauptmerkmale unseres Modells bei der Herstellung eines stumpfen TBI in Zebrafischen. Erstens liefert unser Modell ein kostengünstiges und einfaches Verletzungsparadigma, das schnell ist und die sukzessive Verletzung einer großen Anzahl von Personen oder eine wiederholte Verletzung einer Person ermöglicht, um die kumulative Wirkung von stumpfem TBI zu untersuchen. Zweitens ist dieses Modell leicht skalierbar, um die Auswirkungen verschiedener Krafteinwirkungen zu untersuchen. Durch Ändern der Länge des Rohres (der Höhe, aus der das Kugellager fällt) und des Gewichts des Kugellagers können die an den Schädel des Fisches abgegebene Energie und die Aufprallkraft leicht modifiziert und berechnet werden. Diese Skalierbarkeit der Verletzung ermöglicht mehrere Untersuchungsmöglichkeiten in Bezug auf die progression der schweregradabhängigen TBI-Folgeerkrankungen und die regenerativen Mechanismen der ZNS-Reparatur.
Mit mehreren Metriken, um auf eine erfolgreiche Verletzungsanwendung zuzugreifen, sollte der genetische Hintergrund der zu verwendenden Fische noch sorgfältig berücksichtigt werden. Der Casper - oder Albino-Mutantenfisch ist für unerfahrene Forscher günstig, um den Fisch zuverlässig unter den Tropfenschaft zu legen, die Stahlscheibe über dem gewünschten neuroanatomischen Aufprallpunkt zu platzieren und Gefäßverletzungen zu beurteilen. Darüber hinaus wird die sorgfältige Entfernung des Gehirns durch die visuelle Zugänglichkeit der Knochen und des Gehirns im Casper - und Albino-Mutantenfisch vereinfacht. Pigmentierte Wildtypfische können jedoch verwendet werden, obwohl die Identifizierung von Landmarken und eine erfolgreiche Dissektion mit bemerkenswerter Praxis einhergehen können. Darüber hinaus können pigmentierte Fische verwendet werden, wenn entweder eine moTBI- oder sTBI-Beleidigung erzeugt wird, da die nachfolgenden Pathologien eine ordnungsgemäße Charakterisierung der Verletzung ermöglichen.
Ein Hauptgrund, die Auswirkungen von Stumpfkraft-TBI bei Zebrafischen zu untersuchen, ist die Untersuchung der Quelle der verletzungsbedingten Zellproliferation und der Mechanismen, die der neuronalen Regeneration zugrunde liegen. Entwicklungs- und Basalspiegel der konstitutiven Proliferation wurden in neurogenen Nischen der Zebrafisch-Neuroaxis identifiziert26,27, und eine verletzungsinduzierte Regeneration wurde lokalisiert oder neben der Verletzungsstelle bei erwachsenen Zebrafischen beobachtet8,12,15. Unser stumpfes TBI-Modell zeigt jedoch, dass die diffuse Verletzung auch zu einem schweregradabhängigen Zellproliferationsereignis innerhalb der neurogenen Nischen über die Neuroaxis führt. Die Identifizierung der Quelle und des Ausmaßes der Zellproliferation nach TBI wird die Anwendung von einzelliger RNA-Seq ermöglichen, um die Veränderungen der Genexpression in der proliferativen Nische zu identifizieren und die Rolle verschiedener Signalwege durch die Anwendung spezifischer Agonisten und Antagonisten bei der Regulierung dieser Regenerationsreaktion zu testen. Dieser Ansatz hat sich bei der Aufklärung der Mechanismen, die der neuronalen Regeneration in der geschädigten Zebrafisch-Netzhaut zugrunde liegen28, als nützlich erwiesen und sollte nach TBI im Gehirn gleichermaßen nützlich sein.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Modell eine schnelle, einfache und kostengünstige Verletzungsmethode bietet, um einen skalierbaren stumpfen TBI zu liefern. Dieses Modell wird nützlich sein, um die Auswirkungen von schweregradabhängigen oder wiederholten stumpfen TBI weiter zu untersuchen und therapeutische Ziele der genetischen Regulation aufzuklären, die den neuronalen Schutz verbessern oder die neuronale Regeneration für die funktionelle kognitive Erholung bei erwachsenen Wirbeltieren induzieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Hyde-Labormitgliedern für ihre durchdachten Diskussionen, den Technikern des Freimann Life Sciences Center für die Pflege und Haltung von Zebrafischen und der University of Notre Dame Optical Microscopy Core/NDIIF für den Einsatz von Instrumenten und deren Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde vom Center for Zebrafish Research an der University of Notre Dame, dem Center for Stem Cells and Regenerative Medicine an der University of Notre Dame und Zuschüssen des National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), dem National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH) unterstützt. Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) und das Pat Tillman Scholarship (JTH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
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