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Neuroscience

वयस्क ज़ेबराफ़िश में ब्लंट-फोर्स चोट के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक स्केलेबल मॉडल

Published: May 31, 2021 doi: 10.3791/62709
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

Summary

हमने वयस्क ज़ेबराफ़िश के लिए मार्मारो वेट ड्रॉप मॉडल को संशोधित किया ताकि कुंद-बल दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) और बाद के न्यूरोनल पुनर्जनन के अंतर्निहित तंत्र के बाद विकृति की चौड़ाई की जांच की जा सके। यह कुंद-बल टीबीआई मॉडल स्केलेबल है, एक हल्के, मध्यम, या गंभीर टीबीआई को प्रेरित करता है, और मानव टीबीआई में देखी गई चोट की विषमता को दोहराता है।

Abstract

ब्लंट-फोर्स ट्रॉमेटिक ब्रेन इंजरी (टीबीआई) सिर के आघात का सबसे आम रूप है, जो कई प्रकार के विक्षिप्तताओं को फैलाता है और इसके परिणामस्वरूप जटिल और विषम माध्यमिक प्रभाव होते हैं। जबकि मनुष्यों में टीबीआई के बाद खोए हुए न्यूरॉन्स को बदलने या पुनर्जीवित करने के लिए कोई तंत्र नहीं है, ज़ेबराफ़िश के पास मस्तिष्क सहित उनके पूरे शरीर में न्यूरॉन्स को पुनर्जीवित करने की क्षमता है। एक कुंद-बल टीबीआई के बाद ज़ेब्राफ़िश में प्रदर्शित विकृति की चौड़ाई की जांच करने के लिए और बाद के न्यूरोनल पुनर्योजी प्रतिक्रिया के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हमने वयस्क ज़ेबराफ़िश में उपयोग के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कृंतक मार्मारो वजन ड्रॉप को संशोधित किया। हमारा सरल कुंद-बल टीबीआई मॉडल स्केलेबल है, जो एक हल्के, मध्यम, या गंभीर टीबीआई को प्रेरित करता है, और मानव टीबीआई के बाद देखे गए कई फेनोटाइप्स को दोहराता है, जैसे कि संपर्क- और पोस्ट-ट्रॉमेटिक दौरे, एडिमा, सबड्यूरल और इंट्रासेरेब्रल हेमेटोमा, और संज्ञानात्मक हानि, प्रत्येक एक चोट गंभीरता-निर्भर तरीके से प्रदर्शित होता है। टीबीआई सीक्वेल, जो चोट के कुछ ही मिनटों के भीतर दिखाई देना शुरू कर देता है, कम हो जाता है और चोट के बाद 7 दिनों के भीतर बिना किसी नुकसान वाले नियंत्रण स्तर पर वापस आ जाता है। पुनर्योजी प्रक्रिया 48 घंटे के बाद चोट (एचपीआई) के रूप में शुरू होती है, जिसमें पीक सेल प्रसार 60 एचपीआई द्वारा मनाया जाता है। इस प्रकार, हमारे ज़ेब्राफ़िश ब्लंट-फोर्स टीबीआई मॉडल मानव टीबीआई के समान विशेषता प्राथमिक और माध्यमिक चोट टीबीआई विकृति का उत्पादन करता है, जो बीमारी की शुरुआत और प्रगति की जांच करने की अनुमति देता है, साथ ही न्यूरोनल पुनर्जनन के तंत्र के साथ जो ज़ेब्राफ़िश के लिए अद्वितीय है।

Introduction

दर्दनाक मस्तिष्क की चोटें (टीबीआई) एक वैश्विक स्वास्थ्य संकट और मृत्यु और विकलांगता का एक प्रमुख कारण हैं। संयुक्त राज्य अमेरिका में, लगभग 2.9 मिलियन लोग हर साल टीबीआई का अनुभव करते हैं, और 2006-2014 के बीच टीबीआई या टीबीआई सीक्वेल के कारण मृत्यु दर में 50% से अधिक की वृद्धि हुई है। हालांकि, टीबीआई उनके एटियलजि, पैथोलॉजी और नैदानिक प्रस्तुति में काफी हद तक चोट (एमओआई) के तंत्र के कारण भिन्न होते हैं, जो उपचार रणनीतियों को भी प्रभावित करता है और पूर्वानुमान की भविष्यवाणी करता है। हालांकि टीबीआई विभिन्न एमओआई के परिणामस्वरूप हो सकते हैं, वे मुख्य रूप से या तो मर्मज्ञ या कुंद-बल आघात का परिणाम हैं। मर्मज्ञ आघात टीबीआई के एक छोटे से प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं और एक गंभीर और फोकल चोट उत्पन्न करते हैं जो तत्काल और आसपास के मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत है3। इसके विपरीत, कुंद-बल टीबीआई सामान्य आबादी में अधिक आम हैं, कई प्रकार के प्रकार (हल्के, मध्यम और गंभीर) को फैलाते हैं, और कई मस्तिष्क क्षेत्रों को प्रभावित करने वाले एक फैलाव, विषम और वैश्विक चोट का उत्पादन करते हैं1,4,5।

ज़ेब्राफ़िश (डैनियो रेरियो) का उपयोग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 6,7,8,9 में फैले न्यूरोलॉजिकल अपमान की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए किया गया है। Zebrafish भी स्तनधारियों के विपरीत, सीएनएस क्षति 10 की मरम्मत के लिए एक सहज और मजबूत पुनर्योजी प्रतिक्रिया के पास है। वर्तमान ज़ेब्राफ़िश आघात मॉडल विभिन्न चोट विधियों का उपयोग करते हैं, जिसमें प्रवेश, उच्छेदन, रासायनिक अपमान, या दबाव तरंगें 11,12,13,14,15,16 शामिल हैं। हालांकि, इन तरीकों में से प्रत्येक एक एमओआई का उपयोग करता है जो शायद ही कभी मानव आबादी द्वारा अनुभव किया जाता है, चोट की एक श्रृंखला में स्केलेबल नहीं है, और कुंद-बल टीबीआई के बाद रिपोर्ट की गई विषमता या गंभीरता-निर्भर टीबीआई सीक्वेला को संबोधित नहीं करता है। ये कारक मानव आबादी में टीबीआई के सबसे आम रूप (हल्के कुंद-बल की चोटों) से जुड़े विकृति के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए ज़ेब्राफ़िश मॉडल के उपयोग को सीमित करते हैं।

हमने एक तेजी से और स्केलेबल ब्लंट-फोर्स टीबीआई ज़ेब्राफ़िश मॉडल विकसित करने का लक्ष्य रखा है जो चोट पैथोलॉजी, टीबीआई सीक्वेल की प्रगति और जन्मजात पुनर्योजी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए रास्ते प्रदान करता है। हमने आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कृंतक Marmarou17 वजन ड्रॉप को संशोधित किया और इसे वयस्क ज़ेब्राफ़िश पर लागू किया। यह मॉडल हल्के, मध्यम से लेकर गंभीर तक के severities की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रेंज उत्पन्न करता है। यह मॉडल मानव टीबीआई पैथोलॉजी के कई पहलुओं को भी दोहराता है, एक गंभीरता-निर्भर तरीके से, जिसमें दौरे, एडिमा, सबड्यूरल और इंट्रासेरेब्रल हेमेटोमा, न्यूरोनल सेल मृत्यु, और संज्ञानात्मक घाटे, जैसे सीखने और स्मृति हानि शामिल हैं। चोट के बाद के दिन, विकृति और घाटे का क्षय हो जाता है, जो बिना किसी नुकसान वाले नियंत्रण के समान स्तरों पर लौटता है। इसके अतिरिक्त, यह ज़ेब्राफ़िश मॉडल चोट की गंभीरता से संबंधित न्यूरोएक्सिस में एक मजबूत प्रसार और न्यूरोनल पुनर्जनन प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है।

यहां, हम कुंद-बल आघात की स्थापना और प्रेरण की ओर विवरण प्रदान करते हैं, पोस्ट-ट्रॉमेटिक बरामदगी, संवहनी चोटों का आकलन, मस्तिष्क वर्गों को तैयार करने के निर्देश, एडिमा को मापने के लिए दृष्टिकोण, और चोट के बाद प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि।

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Protocol

Zebrafish को Freimann Life Sciences Center में Notre Dame Zebrafish सुविधा में उठाया और बनाए रखा गया था। इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों को नोट्रे डेम पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. दर्दनाक मस्तिष्क चोट प्रतिमान

  1. सिस्टम पानी के 1 एल में 2-फेनोक्सीएथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें (विआयनीकृत आरओ पानी के 1 एल में त्वरित महासागर के 60 मिलीग्राम)।
  2. कमरे के तापमान पर सिस्टम पानी के 2 एल युक्त एक वातित वसूली टैंक तैयार करें।
  3. गेंद असर और एक वांछित लंबाई और इस्पात / प्लास्टिक टयूबिंग के व्यास के वांछित वजन का चयन करें और ऊर्जा और प्रभाव बल निर्धारित करें।
    नोट: टयूबिंग में एक आंतरिक व्यास होना चाहिए जो गेंद असर को अपने पथ या आंदोलन की गति को बदलने के बिना पारित करने की अनुमति देता है।
    1. प्रभाव पर गतिज ऊर्जा निर्धारित करें:
      Equation 1
      जहां, KE = गतिज ऊर्जा, m = द्रव्यमान (किग्रा में), g = गुरुत्वाकर्षण बल, h = ऊंचाई (मीटर में) ड्रॉप पॉइंट से मछली तक।
      नोट: यह J में गतिज ऊर्जा प्रदान करता है mJ निर्धारित करने के लिए मान को 1,000 से गुणा करें। केई एक त्वरित वस्तु पर आधारित है, जो तब होता है जब गेंद असर को एक स्थिर स्थिति से गिरा दिया जाता है।
    2. 7.62 सेमी लंबे स्टील / प्लास्टिक ट्यूबिंग का उपयोग करके एक हल्का टीबीआई (miTBI) उत्पन्न करें जो ज़ेब्राफ़िश खोपड़ी (कुल दूरी 9.1 सेमी) और 1.5 ग्राम (6.4 मिमी व्यास) बॉल बेयरिंग पर प्लेट से 1.5 सेमी ऊपर समाप्त होता है। ये 1.33 mJ की गतिज ऊर्जा का उत्पादन करते हैं। इस क्षति को अनुभवजन्य रूप से प्रमुख pathophysiological TBI मार्करों के आधार पर एक miTBI के बराबर होने का फैसला किया गया था, जैसे कि संवहनी चोट, subdural / intracerebral hematoma गठन, न्यूरोनल सेल मृत्यु, और संज्ञानात्मक हानि जो काफी हद तक recapitulated जो मानव आबादी में गंभीरता-निर्भर तरीके से रिपोर्ट की गई थी।
    3. गतिज ऊर्जा miTBI की गणना करें = Equation 2
    4. 12.7 सेमी लंबे स्टील / प्लास्टिक टयूबिंग का उपयोग करके एक मध्यम टीबीआई (moTBI) उत्पन्न करें जो ज़ेब्राफ़िश खोपड़ी (कुल दूरी 14.2 सेमी) पर प्लेट से 1.5 सेमी ऊपर समाप्त होता है और एक 1.5 ग्राम (6.4 मिमी व्यास) बॉल बेयरिंग जो 2.08 mJ की गतिज ऊर्जा पैदा करता है।
    5. गतिज ऊर्जा moTBI की गणना करें = Equation 3
    6. 7.62 सेमी लंबे स्टील / प्लास्टिक टयूबिंग का उपयोग करके एक गंभीर टीबीआई (एसटीबीआई) उत्पन्न करें जो ज़ेब्राफ़िश खोपड़ी (कुल दूरी 9.1 सेमी) पर प्लेट से 1.5 सेमी ऊपर समाप्त होता है और एक 3.3 ग्राम (8.38 मिमी व्यास) बॉल बेयरिंग जो 2.94 एमजे की गतिज ऊर्जा पैदा करता है।
    7. गतिज ऊर्जा की गणना करें sTBI = Equation 4
  4. मॉडलिंग मिट्टी (चित्रा 1, चरण 1) के साथ एक पेट्री डिश भरें और अतिरिक्त मॉडलिंग मिट्टी (चित्रा 1, चरण 2) के साथ एक उठाए गए प्लेटफ़ॉर्म (5 सेमी x 1.5 सेमी) बनाने के लिए एक कुंद उपकरण (यानी, संदंश की एक जोड़ी के पीछे) का उपयोग करें।
    1. उठाए गए प्लेटफ़ॉर्म को दो लगभग बराबर हिस्सों में विभाजित करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें (चित्रा 1, चरण 3, लाल डैश्ड लाइन)। एक चैनल में दो हिस्सों का निर्माण करें जो एक वयस्क मछली की लंबाई को समायोजित करता है (चित्रा 1, चरण 4)। दीवारों का निर्माण करने के लिए अतिरिक्त मिट्टी का उपयोग करें जो मछली के शरीर के ~ 2/3 को सुरक्षित करेगा, जिससे सिर उजागर हो जाएगा।
    2. सिर को चोट लगने पर रोटेशन या सिर के पीछे हटने से बचने के लिए दीवारों के लंबवत उजागर सिर क्षेत्र में एक छोटा सा समर्थन मोल्ड करें (चित्रा 1, चरण 4)।
      नोट: चैनल को पृष्ठीय-अप स्थिति में मछली का समर्थन करने के लिए पर्याप्त गहरा होना चाहिए, लेकिन फिर भी सिर को आसपास की मिट्टी के ऊपर आराम करने की अनुमति देनी चाहिए। इसके अतिरिक्त, सिर के समर्थन को मछली की प्राकृतिक वक्रता का पालन करना चाहिए, जो निचले मैंडिबल और गिल्स का समर्थन करता है।
    3. सुनिश्चित करें कि गिरा हुआ वजन चैनल के पक्षों (चित्रा 1, चरण 4) द्वारा बाधित नहीं है।
  5. एक मिनी छेद पंच और 22 ग्राम स्टील चमकती का उपयोग कर एक 3 मिमी व्यास स्टील डिस्क बनाएँ। प्रत्येक डिस्क का उपयोग कई बार किया जा सकता है।
  6. 1: 1000 (1 एमएल / 1 एल, 0.1%) के 50-100 मिलीलीटर के साथ बीकर में रखकर एक मछली को एनेस्थेटिक करें, जब तक कि यह पूंछ चुटकी के लिए अनुत्तरदायी न हो।
  7. चैनल के भीतर मिट्टी के मोल्ड पर मछली, पृष्ठीय पक्ष को ऊपर रखें ताकि शरीर को पक्षों पर सुरक्षित किया जा सके और सिर पर 3 मिमी 22 ग्राम स्टील डिस्क रखें, जो वांछित प्रभाव बिंदु (चित्रा 1, चरण 5) पर केंद्रित हो।
    1. सुनिश्चित करें कि मछली को एक तरफ झुकाव से अपने सिर से बचने के लिए यथासंभव लंबवत रूप से संरेखित किया जाता है, जो एक असमान प्रभाव पैदा कर सकता है।
  8. स्टील / प्लास्टिक टयूबिंग को सुरक्षित करें, एक मानक रिंग स्टैंड और आर्म क्लैंप का उपयोग करके, इसलिए टयूबिंग का निचला हिस्सा ज़ेबराफ़िश के सिर से 1.5 सेमी ऊपर है (चित्रा 1, चरण 6)। सुनिश्चित करें कि टयूबिंग सीधी है।
    1. टयूबिंग को नीचे देखें और सुनिश्चित करें कि टयूबिंग स्टील प्लेट के ऊपर संरेखित है।
  9. गेंद असर (हल्के और मध्यम TBI के लिए 1.5 ग्राम, और गंभीर TBI के लिए 3.3 ग्राम) एक पूर्व निर्धारित ऊंचाई (चरण 1.3.3-1.3.5 में वर्णित) से नीचे छोड़ दें ब्याज के वांछित neuroanatomical क्षेत्र पर स्थित स्टील प्लेट पर टयूबिंग नीचे (जैसे, सेरिबैलम, चित्रा 1, चरण 5) चोट की वांछित गंभीरता के लिए कुंद बल TBI का उत्पादन करने के लिए। घायल मछली को एक रिकवरी टैंक में रखें, जिसकी निगरानी की जाए।
    नोट: चोट की गंभीरता के आधार पर, मृत्यु दर या टॉनिक-क्लोनिक दौरे हो सकते हैं। यदि टीबीआई के बाद मछली लंबे समय तक अनुत्तरदायी है, तो पूंछ-चुटकी का प्रशासन करने और दर्द की प्रतिक्रिया के लिए मूल्यांकन करने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट या संदंश का उपयोग करें।

2. वयस्क ज़ेब्राफ़िश में टीबीआई के बाद के दौरे स्कोरिंग

  1. धारा 1 में उल्लिखित चोट प्रोटोकॉल के अनुसार मछली को एनेस्थेटिक और घायल कर दें और घायल मछली को सिस्टम पानी के 2 एल के एक वातित वसूली टैंक में रखें।
  2. वसूली टैंक में रखे जाने के तुरंत बाद शुरू होने वाले पोस्ट-ट्रॉमैटिक दौरे के किसी भी संकेत के लिए मछली का निरीक्षण करें। एक अवलोकन समय (यानी, 1 ज) सेट करें और जब्ती स्कोर (नीचे वर्णित), प्रत्येक जब्ती की अवधि, और दौरे का अनुभव करने वाली मछली का प्रतिशत (चित्रा 2 ए) सहित सभी जब्ती गतिविधि को रिकॉर्ड करें।
    नोट: चोट लगने पर दौरे तुरंत हो सकते हैं, साथ ही साथ टीबीआई के बाद के घंटों या दिनों में भी हो सकते हैं। दौरे लंबे समय तक बने रह सकते हैं और एक मछली में कई दौरे पड़ सकते हैं। 1 ज या उससे अधिक का एक अवलोकन समय निर्धारित करने से जब्ती दरों की समग्र प्रवृत्ति का एक अच्छा प्रतिनिधित्व होगा।
  3. वयस्क ज़ेब्राफ़िश जब्ती फेनोटाइप के लिए Mussulini18 दिशानिर्देशों का उपयोग करके स्कोर मछली।
    नोट: ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग किए बिना, 3 से नीचे जब्ती स्कोर का निष्पक्ष रूप से आकलन करना मुश्किल है। इसलिए, केवल 3 या उससे अधिक के जब्ती स्कोर को रिकॉर्ड किया जाना चाहिए जब मूल्यांकन सॉफ़्टवेयर के बिना किया जा रहा हो।

3. मस्तिष्क विच्छेदन

  1. 1: 500 (2 एमएल / 1 एल, 0.2%) 2-फेनोक्सीथेनॉल के समाधान में मछली को यूथेनाइज़ करें, जब तक कि गिल आंदोलनों को बंद नहीं कर दिया जाता है, और वे वांछित समापन बिंदु पर चुटकी को पंख लगाने के लिए अक्रियाशील होते हैं।
  2. मॉडलिंग मिट्टी के साथ एक पेट्री डिश भरें और विच्छेदन के दौरान शरीर का समर्थन करने के लिए एक छोटी सी गुहा बनाएं।
  3. मिट्टी के मोल्ड में मछली, पृष्ठीय पक्ष ऊपर की ओर रखें। मछली के शरीर के नीचे आधे रास्ते में मिडलाइन के माध्यम से एक विच्छेदन पिन रखें और सिर के आधार के पीछे एक दूसरा पिन ~ 5 मिमी।
  4. एक विच्छेदन प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, # 5 ड्यूमोंट संदंश की एक जोड़ी के साथ ऑप्टिक तंत्रिका को स्पष्ट रूप से अलग करें और आंखों को हटा दें (चित्रा 2 ए)।
  5. मछली को उन्मुख करें ताकि माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 बी) के माध्यम से देखते समय रोस्ट्रल अंत सबसे दूर हो।
    नोट:: निम्न चरण दाएं हाथ के व्यक्तियों के लिए हैं। बाएं हाथ के व्यक्ति प्रतिबिंबित अभिविन्यास में निम्नलिखित चरणों को निष्पादित करना पसंद कर सकते हैं।
  6. सही पार्श्विका प्लेट के नीचे संदंश के एक छोर को धीरे-धीरे रखने के लिए # 5 संदंश का उपयोग करें, रोस्ट्रल छोर की ओर बढ़ने वाली एक जानबूझकर कैंची कार्रवाई करें और दाएं पार्श्विका और ललाट प्लेटों को हटा दें (चित्रा 2 सी)।
    1. विच्छेदन के दौरान मस्तिष्क को भेदने से बचने के लिए संदंश को 45 डिग्री या उससे कम के कोण पर रखें।
  7. मछली को 90° दक्षिणावर्त घुमाएं। बाएं पार्श्विका प्लेट के नीचे # 5 संदंश के एक छोर को रखें और मस्तिष्क के पूरे पृष्ठीय पहलू को उजागर करने वाले बाएं पार्श्विका और ललाट प्लेटों को हटाने के लिए एक ही कैंची गति का उपयोग करें (चित्रा 2 डी, ई)।
  8. स्पष्ट रूप से # 5 संदंश के साथ मैक्सिला ट्रांसेक्ट करें। घ्राण बल्बों को संरक्षित करें और उन्हें नुकसान न पहुंचाएं यदि यह ब्याज का क्षेत्र है।
  9. # 5 संदंश (चित्रा 2 एफ) के साथ सही ऑपरकल, प्रीऑपर्कल, इंटरऑपर्कल और सबऑपरकल को हटा दें।
  10. स्पष्ट रूप से # 5 संदंश का उपयोग करके कैल्वेरियम उद्घाटन के पुच्छल छोर पर मस्कुलचर को उच्छेदन करें, रीढ़ की हड्डी को उजागर करें।
  11. स्पष्ट रूप से # 5 संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी को ट्रांसेक्ट करें। ध्यान से मस्तिष्क के नीचे संदंश रखें और धीरे से मस्तिष्क को कैल्वेरियम से हटा दें।
    नोट: कभी भी मस्तिष्क को चुटकी न दें। मस्तिष्क को "पालना" करने के लिए संदंश का उपयोग करें या पुच्छल रूप से उच्छेदन करें और मस्तिष्क को पैंतरेबाज़ी करने के लिए एक चुटकी बिंदु के रूप में उजागर रीढ़ की हड्डी का उपयोग करें।
  12. 9 भागों में हटाए गए दिमाग को ठीक करें 100% इथेनॉल से 1 भाग 37% फॉर्मेल्डिहाइड एक रॉकर प्लेटफ़ॉर्म पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर।

4. जेब्राफ़िश मस्तिष्क में एडिमा अध्ययन

  1. धारा 1 में उल्लिखित चोट प्रोटोकॉल के अनुसार मछली को एनेस्थेटिक और घायल करना और मछली को एक रिकवरी टैंक में ठीक होने की अनुमति देना जब तक कि वे स्वतंत्र रूप से तैरना शुरू न करें।
  2. 1 दिन के लिए चोट के बाद सामान्य आवास की स्थिति में मछली को वापस रखें।
  3. 1:500 2-phenoxyethanol में मछली euthanize, समय बीत ने के बाद.
  4. खंड 3 में उल्लिखित प्रोटोकॉल के अनुसार पूरे मस्तिष्क या रुचि के क्षेत्र को विच्छेदित करें और मस्तिष्क को तुरंत एक छोटी वजन वाली नाव पर रखें।
    नोट: मस्तिष्क को स्थानांतरित करते समय सावधानी बरतें, ठीक संदंश का उपयोग करके धीरे-धीरे इसे मस्तिष्क को छुरा घोंपने या स्क्रैप किए बिना वजन नाव पर रखने के लिए उपयोग करें, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक का नुकसान हो सकता है।
  5. लेबल (चोट समूह और मस्तिष्क संख्या के साथ) और एक पैमाने पर एक अतिरिक्त छोटे सुखाने वजन नाव tare. एक सटीक माप प्राप्त करने के लिए न्यूनतम 0.001 ग्राम को मापने की क्षमता के साथ एक पैमाने का उपयोग करें।
  6. टार्ड सुखाने वजन नाव के लिए मस्तिष्क को स्थानांतरित करें और मस्तिष्क के गीले वजन को रिकॉर्ड करें। मस्तिष्क को उन्मुख करें ताकि वे पृष्ठीय पक्ष के साथ वजन नाव पर फ्लैट लेट जाएं।
  7. सुखाने वजन नाव और मस्तिष्क को संकरण ओवन में 8 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  8. सूखने के बाद, मस्तिष्क सूखने वाले वजन नाव से चिपक सकता है और एक नई टार्ड छोटी वजन नाव को हटाने और स्थानांतरित करना मुश्किल हो सकता है। संदंश के साथ मस्तिष्क को चुटकी लेने से बचें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सूखे मस्तिष्क को नुकसान और ऊतक का नुकसान हो सकता है। इसके बजाय, ठीक संदंश को एक साथ चुटकी लें और, मस्तिष्क के वेंट्रल पक्ष से शुरू होकर, ऊपर की ओर गति में स्कूप करें।
  9. सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक मस्तिष्क की पानी की सामग्री निर्धारित करें (चित्र4):
    Equation 5

5. neuroaxis भर में सेलुलर प्रसार लेबलिंग और निश्चित ऊतक तैयार.

  1. DDH2O के 2 mL में 10 mM 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) तैयार करें।
  2. 1: 1000 (1 mL / 1 L, 0.1%) के 50-100 mL में एक समय में 3 से 4 मछली को एनेस्थेटिकाइज़ करें 2-phenoxyethanol जब तक कि मछली पूंछ चुटकी के लिए अनुत्तरदायी न हो, चोट के बाद वांछित समय बिंदु पर (अनुभाग 1 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके)।
  3. एक गीले स्पंज पर एक आंशिक चीरा बनाएं और उद्घाटन में एक समय में एक मछली रखें, वेंट्रल साइड अप करें।
  4. मछली के शरीर में 10 mM EdU के ~ 40 μL इंजेक्ट करने के लिए एक 30 G सुई का उपयोग करें। मछली को सिस्टम के पानी से भरे एक होल्डिंग टैंक में वापस कर दें।
    नोट: बार-बार इंजेक्शन अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है ताकि अधिक संख्या में कोशिकाओं को लेबल किया जा सके और यदि 1 सप्ताह से अधिक की पीछा अवधि वांछित हो तो इसकी आवश्यकता हो सकती है।
  5. खंड 3 में उल्लिखित के रूप में दिमाग इकट्ठा करें और उन्हें 5 मिलीलीटर ग्लास शीशी में एक समूह के रूप में रखें जिसमें 9 भागों के 2 एमएल 100% इथेनॉल से 1 भाग 37% फॉर्मेल्डिहाइड शामिल हैं। एक रॉकर मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर दिमाग को ठीक करें।
    नोट: एक रॉकर या शेकर प्लेटफ़ॉर्म दिमाग को नीचे आराम करने से रोकता है और कर्लिंग से पूरे दिमाग के टेलेन्सेफलॉन को रोकता है।
  6. मस्तिष्क को ठीक करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही कांच की शीशी में, अवरोही इथेनॉल श्रृंखला के धोने में, 75%, 50%, और 25%, प्रत्येक 15 मिनट के लिए, इसके बाद कमरे के तापमान पर एक रॉकर पर 5% सुक्रोज / पीबीएस में 1.5 घंटे की धुलाई होती है। एक रॉकर प्लेटफ़ॉर्म पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज / पीबीएस में रात भर एक ग्लास शीशी में दिमाग को स्टोर करें।
  7. 30% सुक्रोज / पीबीएस से दिमाग को हटा दें और उन्हें संदंश के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट (प्रति अच्छी तरह से एक उपचार समूह) में स्थानांतरित करें, जिसमें 2: 1 समाधान से भरे कुओं के साथ 2 भागों ऊतक ठंड माध्यम और 1 भाग 30% सुक्रोज / पीबीएस शामिल हैं। एक रॉकर मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मस्तिष्क को इनक्यूबेट करें।
  8. 12-अच्छी तरह से प्लेट के भीतर कुओं की अगली पंक्ति में दिमाग को स्थानांतरित करें 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-24 घंटे के लिए 100% टीएफएम में दिमाग को डुबोएं।
  9. सूखी बर्फ पर वांछित अभिविन्यास में TFM में दिमाग एम्बेड करने के लिए एक क्रायोस्टैट चक का उपयोग करें।
  10. क्रायोसेक्शनिंग (16 μm मोटे वर्गों) का प्रदर्शन करें और सकारात्मक रूप से चार्ज की गई स्लाइड्स पर अनुभागों को इकट्ठा करें। 1 घंटे के लिए एक स्लाइड गर्म पर सूखी स्लाइड और फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ जारी रखें।
  11. ऊतक वर्गों के चारों ओर स्लाइड पर एक हाइड्रोफोबिक बाधा तैयार करें और 20 मिनट के लिए स्लाइड गर्म पर सूखने की अनुमति दें।
  12. संक्षेप में 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड को धोएं और फिर पीबीएस-ट्वीन 20 (0.05%) में दो बार 10 मिनट के लिए प्रत्येक।
  13. EdU सेल प्रसार किट और निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर EdU का पता लगाने प्रदर्शन करें।
  14. स्लाइड का विश्लेषण करें और या तो एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसेंट EdU-लेबल कोशिकाओं को मापें। व्यक्तिगत कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए न्यूनतम 40x उद्देश्य की आवश्यकता होगी।

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Representative Results

चोट-प्रेरण रिग तैयार करना वयस्क ज़ेबराफ़िश को स्केलेबल ब्लंट-फोर्स टीबीआई देने के तेजी से और सरलीकृत साधनों की अनुमति देता है। चोट मॉडल की श्रेणीबद्ध गंभीरता सफल चोट के कई आसानी से पहचाने जाने योग्य मीट्रिक प्रदान करती है, हालांकि संवहनी चोट सबसे आसान और सबसे प्रमुख विकृतियों में से एक है (चित्रा 3)। चोट के दौरान उपयोग की जाने वाली मछली का तनाव इस संकेतक को पहचानना आसान या कठिन बना सकता है। जंगली-प्रकार की एबी मछली (डब्ल्यूटीएबी, चित्रा 3 ए-डी) का उपयोग करते समय, संवहनी चोट की पहचान या तो miTBI या moTBI और रंजकता के कारण अक्षतिग्रस्त नियंत्रण मछली (चित्रा 3 ए-सी) के बीच अंतर करना मुश्किल हो सकता है। चोट के बाद, miTBI मछली न्यूनतम सतह abrasions (चित्रा 3B) प्रदर्शित करती है, जबकि moTBI सीमित सेरेब्रल हेमरेजिंग (चित्रा 3 C) प्रदर्शित करती है। जबकि एसटीबीआई अभी भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है, चोट की सीमा अक्सर स्पष्ट होती है (चित्रा 3 डी)। इसके विपरीत, अल्बिनो (चित्रा 3ई-एच) या कैस्पर मछली (चित्रा 3I-एल) का उपयोग करते समय, संवहनी चोट को आसानी से पहचाना जाता है। इसके अतिरिक्त, प्रभाव दौरे अक्सर चोट के बाद देखे जाते हैं और समूह के बीच जब्ती दर चोट का एक और प्रतिनिधि मीट्रिक है (तालिका 1)। घायल मछली टॉनिक-क्लोनिक दौरे (अटैक्सिया, जेडबीसी 1.9, झुकने, जेडबीसी 1.16, चक्कर, जेडबीसी 1.32, और कॉर्कस्क्रू तैराकी, जेडबीसी 1.37)19 प्रदर्शित करेगी जो पृष्ठभूमि तनाव की परवाह किए बिना चोट के बाद आसानी से देखी जाती हैं। गंभीरता के संबंध में बढ़ते प्रसार के साथ दौरे देखे जाएंगे। चोट के बाद, miTBI जब्ती जैसे व्यवहार प्रदर्शित नहीं करता है; हालांकि, moTBI जब्ती व्यवहार (10.66% ± 1.37%, पी < 0.0001, तालिका 1) प्रदर्शित करेगा और घटना को एसटीबीआई मछली (19.93% ± 1.49%, पी < 0.0001, तालिका 1) में और बढ़ाया गया है।

मस्तिष्क का सफल निष्कासन आगे की जांच के असंख्य के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि एडिमा और सेल प्रसार का आकलन करना। हानिकारक मस्तिष्क क्षेत्रों (अक्सर अनजाने पंचर द्वारा) से बचने के लिए और सभी क्षेत्रों को संरक्षित करने के लिए अत्यधिक सावधानी के साथ विच्छेदन करें (घ्राण बल्ब आसानी से खो सकते हैं)। मस्तिष्क विच्छेदन प्रक्रिया और योजनाबद्ध (अनुभाग 3, चित्रा 2 ए-एफ) के बाद एक पूर्ण मस्तिष्क हटाने के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2 जी, एच)। जांचकर्ताओं को इस बात पर विचार करना चाहिए कि क्या उनके विश्लेषण के लिए पूरे मस्तिष्क की आवश्यकता होती है या क्या विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों का संग्रह उनकी आवश्यकताओं के अनुरूप हो सकता है। चोट की गंभीरता और संग्रह के समय पर निर्भर करते हुए, मस्तिष्क संलग्न सबड्यूरल रक्तस्राव का प्रदर्शन कर सकते हैं, हालांकि, ये अक्सर खोपड़ी के नीचे का पालन करते हैं और विच्छेदन के दौरान खो जाते हैं। सेरेब्रम की सूजन कई बार स्पष्ट होती है, लेकिन शारीरिक अंतर और सामान्य आकार में भिन्नता के कारण, सूजन का आकलन करने के लिए एडिमा सबसे अच्छा तरीका है। उल्लिखित प्रोटोकॉल (धारा 4) का पालन करते हुए, अक्षतिग्रस्त मस्तिष्क 73.11% ± 0.80% की तरल पदार्थ सामग्री प्रदर्शित करते हैं, और miTBI, हालांकि थोड़ा ऊंचा है, 1, 3, या 5 dpi (1 dpi: 76.33% ± 1.32%, p = 0.36, 3 dpi: 75.33 ± 1.37%, p = 0.84, 5 dpi ± 1.84% ± 1.37%, p = 0.84, 5 dpi ± 0.84% पर एडिमा में महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित नहीं करता > है। इसके विपरीत, moTBI और sTBI दोनों में महत्वपूर्ण एडिमा 1 dpi (moTBI: 80.55 ± 0.94%, p < 0.0001, sTBI: 86% ± 1.05%, p < 0.0001), और 3 dpi (moTBI: 78.11 ± 0.93%, p < 0.018, sTBI: 77.77% < ± 0.018% ± 0.018% था। हालांकि, moTBI और sTBI दोनों की द्रव सामग्री 5 dpi (moTBI: 74.42 ± 1.25%, p > 0.99, sTBI: 73.85% ± 1.01%, p > 0.99, चित्रा 4) द्वारा अक्षतिग्रस्त नियंत्रण के समान स्तरों पर लौट आई।

सेल प्रसार, ज़ेब्राफ़िश में टीबीआई के बाद, चोट की सीमा का एक मजबूत आकलन है। जबकि मस्तिष्क की चोट 9,12 के अन्य रूपों के बाद ज़ेब्राफ़िश में सेल प्रसार प्रतिक्रिया का पहले अध्ययन किया गया है, ज्यादातर मामलों में, जांच चोट स्थल तक सीमित थी। इस कुंद बल TBI neuroaxis फैला एक मजबूत प्रसार प्रतिक्रिया में परिणाम. एक गंभीरता-निर्भर तरीके से (एसटीबीआई डेटा दिखाया गया है), बढ़ी हुई ईडीयू लेबलिंग को फोरब्रेन के वेंट्रिकुलर और सबवेंट्रिकुलर ज़ोन में मनाया जाता है (टेलेन्सेफेलन, चित्रा 5 बी) बिना किसी क्षतिग्रस्त नियंत्रण (चित्रा 5 ए) के सापेक्ष। जैसा कि वर्गों ने मिडब्रेन (mesencephalon और diencephalon) में cuडली स्थानांतरित कर दिया, घायल दिमाग ने पेरिवेंट्रिकुलर ग्रे ज़ोन (PGZ) ऑप्टिक टेक्टल लोब (TeO) में बढ़ी हुई EdU लेबलिंग प्रदर्शित की, और अक्षतिग्रस्त मछली की तुलना में पूर्वकाल हाइपोथैलेमस के पहलुओं (चित्रा 5 D और चित्रा 5C, क्रमशः)। हिंडब्रेन में, न्यूरोजेनिक क्षेत्र जो अक्षतिग्रस्त मस्तिष्क (चित्रा 5ई, जी) में स्पष्ट होते हैं, एसटीबीआई (चित्रा 5 एफ, एच) के बाद बढ़े हुए सेल प्रसार का प्रदर्शन करते हैं।

संक्षेप में, वयस्क ज़ेब्राफ़िश पर लागू एक संशोधित मार्मारो वजन ड्रॉप एक पुनरुत्पादक और स्केलेबल हल्के, मध्यम, या गंभीर कुंद-बल टीबीआई प्रदान करता है। ज़ेबराफ़िश, एक गंभीरता-निर्भर तरीके से, दौरे और संवहनी चोट (यानी, सबड्यूरल और इंट्रासेरेब्रल हेमेटोमा) सहित विभिन्न विकृतियों को प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, घायल मछली के प्रदर्शन ने वसूली दर में कमी की (चेतना के नुकसान, सीखने और स्मृति के मुद्दों के रूप में संज्ञानात्मक घाटे, और न्यूरोनल सेल मृत्यु (डेटा नहीं दिखाया गया है) के अनुरूप। विकृतियों को देखा गया, तेजी से 4-7 दिनों की अवधि में न्यूरोएक्सिस भर में मजबूत प्रोलिफेरेटिव घटनाओं के साथ मेल खाता है।

Figure 1
चित्रा 1: स्केलेबल चोट उपकरण की स्थापना। सेटअप का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व, मॉडल, और जेब्राफ़िश के लिए स्केलेबल टीबीआई की डिलीवरी। चरण 1-4 समर्थन मोल्ड बनाने के लिए चरणों का अनुदेशात्मक अवलोकन प्रदान करते हैं जो मछली को स्थिर करता है और क्षति के दौरान सिर को उजागर करता है। चरण 5-7 मॉडल समस्या निवारण करते समय विचार करने के लिए पहलुओं पर अंतर्दृष्टि के साथ चोट पहुंचाने के निर्देश प्रदान करते हैं। यह आंकड़ा BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मस्तिष्क विच्छेदन के लिए खोपड़ी हटाने. एक सरलीकृत ज़ेबराफ़िश खोपड़ी की योजनाबद्ध और वयस्क ज़ेबराफ़िश मस्तिष्क को उजागर करने के लिए हड्डी (नीले वर्गों) के चरण-दर-चरण हटाने। (A, B) आंखों को स्पष्ट रूप से # 5 संदंश के साथ हटा दिया जाता है जो ऑप्टिक नसों को अलग करता है। (सी) संदंश को दाहिने पार्श्विका हड्डी और फिर दाएं ललाट की हड्डी को हटाने के लिए पार्श्विका प्लेटों (काले तीर) को सीधे पुच्छल में रखा जाता है। (D,E) बाएं पार्श्विका हड्डी और बाएं ललाट की हड्डी को हटा दिया जाता है। (च) दाएँ ऑपरकल, प्रीऑपर्कल, इंटरऑपर्कल और सबऑपर्कल को हटा दिया जाता है, जो मस्तिष्क को पार्श्व और पृष्ठीय पहुंच प्रदान करता है। (G,H) Undamaged और एसटीबीआई दिमाग हटा दिया गया था। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: चोट-severities भर में विभिन्न पृष्ठभूमि में संवहनी चोट। अक्षतिग्रस्त और टीबीआई जंगली प्रकार एबी, अल्बिनोबी 4, और संवहनी चोट को प्रदर्शित करने वाले कैस्पर वयस्क ज़ेब्राफ़िश का पृष्ठीय दृश्य। (A-D) वयस्क जंगली-प्रकार की एबी मछली भारी पिगमेंटेड होती हैं और miTBI (बी) के बाद घर्षण की कल्पना करना मुश्किल होता है। संवहनी चोट moTBI (सी) और एसटीबीआई (डी) मछली में अप्रभावित नियंत्रण (ए) की तुलना में अधिक स्पष्ट थी। (E-H) अल्बिनो मछली कम पिगमेंटेड थी और मस्तिष्क का विज़ुअलाइज़ेशन अधिक अलग था। टीबीआई के बाद संवहनी चोट को स्पष्ट रूप से देखा गया था और विभिन्न प्रकार के विरोधाभासों में प्रतिष्ठित किया गया था। (I-L) कैस्पर मछली ने नौसिखिए जांचकर्ताओं के लिए सबसे अनुकूलनीय पृष्ठभूमि प्रदान की क्योंकि पारदर्शिता ने वांछित न्यूरोएनाटॉमिकल क्षेत्रों की आसान पहचान और टीबीआई-गंभीरता द्वारा संवहनी चोट के स्पष्ट अवलोकन और चित्रण के लिए अनुमति दी थी। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: जेब्राफ़िश टीबीआई के बाद चोट-प्रेरित एडिमा का अनुभव करता है। ज़ेब्राफ़िश को टीबीआई (अक्षतिग्रस्त, miTBI, moTBI, और sTBI) के विभिन्न severities के संपर्क में लाया गया था और प्रतिशत द्रव सामग्री (एडिमा) के लिए क्षति के बाद अलग-अलग दिनों में मूल्यांकन किया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण एक Browns-Forsythe और वेल्च एनोवा के साथ किया गया था, जिसके बाद Dunnett के T3 एकाधिक तुलना पोस्ट-हॉक परीक्षण किया गया था। n = व्यक्तिगत मछली की कुल संख्या। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण प्रिज्म (Graphpad 9.0) सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: न्यूरोएक्सिस में टीबीआई-प्रेरित प्रसार। (A-H) कोरोनल और sagittal मस्तिष्क वर्गों के confocal छवियों undamaged और sTBI मछली है कि आईपी के साथ इंजेक्शन थे EdU 12 ज संग्रह से पहले. बढ़ी हुई ईडीयू निगमन को फोरब्रेन (ए, बी), मिडब्रेन (सी, डी), और हिंडब्रेन (ई-एच) में चोट के बाद कई न्यूरोजेनिक niches में देखा गया था। सेरिबैलम, सीसीई, ग्रेन्युल लेयर, जीएल, औसत दर्जे का वाल्वुला सेरेबेली, वाम, आणविक परत, एमएल, ऑप्टिक टेक्टम, टीईओ, पेरिवेंट्रिकुलर ग्रे जोन, पीजीजेड, टेलेन्सेफेलन, और टेल। सभी स्केल पट्टियाँ 200 μm हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समूह N n औसत दौरे (%) ± SEM p
Undam 10 74 0%
miTBI 10 100 0% >0.99
moTBI 10 184 10.66% ± 1.37% <.0001
sTBI 10 237 19.93% ± 1.49% <.0001

तालिका 1. Zebrafish टीबीआई के बाद गंभीरता-निर्भर प्रभाव दौरे प्रदर्शित करता है। टॉनिक-क्लोनिक बरामदगी का परिमाणीकरण, जिसे एक प्रयोगात्मक घायल समूह के प्रतिशत के रूप में दर्ज किया गया था, जो चोट के बाद 1 घंटे के भीतर देखा गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण एक तरफा एनोवा के साथ किया गया था, जिसके बाद टुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण का पालन किया गया था। N = प्रयोगात्मक समूहों की कुल संख्या, n = व्यक्तिगत मछलियों की कुल संख्या। प्रिज्म (Graphpad 9.0) सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे।

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Discussion

न्यूरोट्रॉमा और संबंधित sequelae की जांच लंबे समय से पारंपरिक गैर-पुनर्योजी कृंतक मॉडल 20 पर केंद्रित है। केवल हाल ही में अध्ययनों ने पुनर्योजी मॉडल 9,11,13,14,21 के लिए सीएनएस क्षति के विभिन्न रूपों को लागू किया है। हालांकि व्यावहारिक, इन मॉडलों को या तो मानव आबादी (मर्मज्ञ आघात, रासायनिक एब्लेशन, विस्फोट) और / या चोट में असामान्य रूप से देखी जाने वाली चोट विधि के उनके उपयोग से सीमित किया जाता है, और / या चोट स्केलेबल नहीं है और इसलिए मानव आबादी में देखी गई गंभीरता-निर्भर विकृति की विषमता को पूरी तरह से संबोधित नहीं करता है22,23,24,25 . यहां, हम एक क्षति प्रतिमान प्रदान करते हैं जो नैदानिक रूप से प्रासंगिक सिर आघात (कुंद-बल) 4 के सबसे आम रूप को लागू करता है जो मानव निदान 22,23,24,25 में स्थापित कई पैथोलॉजिकल मैट्रिक्स का उत्पादन करता है। जब पुनर्योजी ज़ेब्राफ़िश पर लागू किया जाता है, तो मॉडल चोट-प्रेरित विकृतियों की प्रगति और वसूली की जांच करने के लिए रास्ते प्रदान करता है, जैसे कि एडिमा या पोस्ट-ट्रॉमेटिक दौरे, साथ ही साथ जन्मजात पुनर्योजी वसूली के पीछे तंत्र को स्पष्ट करना।

ज़ेब्राफ़िश में एक कुंद-बल टीबीआई के उत्पादन में हमारे मॉडल की दो प्रमुख विशेषताएं हैं। सबसे पहले, हमारा मॉडल एक सस्ती और सरल चोट प्रतिमान प्रदान करता है जो तेजी से होता है, जो बड़ी संख्या में व्यक्तियों को लगातार चोट या कुंद-बल टीबीआई के संचयी प्रभाव की जांच करने के लिए किसी व्यक्ति को बार-बार चोट लगाने की अनुमति देता है। दूसरा, यह मॉडल विभिन्न बल प्रभावों के प्रभावों की जांच करने के लिए आसानी से स्केलेबल है। ट्यूब की लंबाई को बदलकर (वह ऊंचाई जहां से गेंद असर गिरा दिया जाता है) और गेंद असर का वजन, मछली की खोपड़ी को दी गई ऊर्जा, और प्रभाव बल को आसानी से संशोधित और गणना की जा सकती है। चोट की यह स्केलेबिलिटी गंभीरता-निर्भर टीबीआई सीक्वेल प्रगति और सीएनएस मरम्मत के पुनर्योजी तंत्र के संबंध में जांच के कई मार्गों के लिए अनुमति देती है।

सफल चोट आवेदन तक पहुंचने के लिए कई मीट्रिक के साथ, सावधानीपूर्वक विचार अभी भी मछली की आनुवंशिक पृष्ठभूमि का उपयोग करने के लिए दिया जाना चाहिए। कैस्पर या अल्बिनो उत्परिवर्ती मछली नौसिखिए जांचकर्ताओं के लिए ड्रॉप शाफ्ट के नीचे मछली को मज़बूती से रखने के लिए अनुकूल होगी, वांछित न्यूरोएनाटॉमिकल प्रभाव बिंदु पर स्टील डिस्क का प्लेसमेंट, और संवहनी चोट का आकलन करना। इसके अलावा, मस्तिष्क के सावधानीपूर्वक हटाने को कैस्पर और अल्बिनो उत्परिवर्ती मछली में हड्डियों और मस्तिष्क की दृश्य पहुंच द्वारा सरलीकृत किया जाता है। हालांकि, पिगमेंटेड जंगली-प्रकार की मछली का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि स्थलों की पहचान और सफल विच्छेदन उल्लेखनीय अभ्यास के साथ आ सकता है। इसके अलावा, पिगमेंटेड मछली का उपयोग या तो एक moTBI या एसटीबीआई अपमान का उत्पादन करते समय किया जा सकता है, क्योंकि बाद की विकृतियां चोट के उचित लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं।

ज़ेब्राफ़िश में कुंद-बल टीबीआई के प्रभावों का अध्ययन करने का एक प्रमुख कारण चोट-प्रेरित सेल प्रसार के स्रोत और न्यूरोनल पुनर्जनन के अंतर्निहित तंत्र की जांच करना है। जेब्राफ़िश न्यूरोएक्सिस 26,27 में न्यूरोजेनिक niches में संरचनात्मक प्रसार के विकासात्मक और बेसल स्तरों की पहचान की गई है, और चोट-प्रेरित पुनर्जनन को वयस्क ज़ेब्राफ़िश 8,12,15 में चोट साइट के आस-पास स्थानीयकृत या आसन्न देखा गया है। हालांकि, हमारे कुंद-बल टीबीआई मॉडल से पता चलता है कि फैलाव की चोट के परिणामस्वरूप न्यूरोएक्सिस में न्यूरोजेनिक niches के भीतर एक गंभीरता-निर्भर सेल प्रसार घटना भी होती है। टीबीआई के बाद सेल प्रसार के स्रोत और सीमा की पहचान एकल-सेल आरएनए-सेक के आवेदन की अनुमति देगी ताकि प्रोलिफेरेटिव आला में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान की जा सके और इस पुनर्जनन प्रतिक्रिया को विनियमित करने में विशिष्ट एगोनिस्ट और विरोधी के आवेदन के माध्यम से विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों की भूमिका का परीक्षण किया जा सके। यह दृष्टिकोण क्षतिग्रस्त ज़ेब्राफ़िश रेटिना 28 में न्यूरोनल पुनर्जनन के अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने में उपयोगी साबित हुआ है और टीबीआई के बाद मस्तिष्क में समान रूप से उपयोगी होना चाहिए।

अंत में, हमारा मॉडल एक स्केलेबल ब्लंट-फोर्स टीबीआई देने के लिए एक तेजी से, सरल और लागत प्रभावी चोट विधि प्रदान करता है। यह मॉडल गंभीरता-निर्भर या दोहराए गए कुंद-बल टीबीआई के प्रभावों की जांच करने के लिए उपयोगी होगा, साथ ही साथ आनुवंशिक विनियमन के चिकित्सीय लक्ष्यों को स्पष्ट करने से न्यूरोनल संरक्षण में सुधार होगा या वयस्क कशेरुकियों में कार्यात्मक संज्ञानात्मक वसूली के लिए न्यूरोनल पुनर्जनन को प्रेरित किया जाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को उनके विचारशील चर्चाओं के लिए हाइड लैब के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, ज़ेब्राफ़िश देखभाल और पशुपालन के लिए फ्रीमैन लाइफ साइंसेज सेंटर तकनीशियन, और उपकरणों और उनकी सेवाओं के उपयोग के लिए नोट्रे डेम ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी कोर / एनडीआईआईएफ विश्वविद्यालय। इस काम को नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में ज़ेब्राफ़िश रिसर्च के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था, नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए केंद्र, और एनआईएच R01-EY018417 (DRH) के राष्ट्रीय नेत्र संस्थान से अनुदान, नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम (जेटीएच), नोट्रे डेम के एलटीसी नील हाइलैंड फैलोशिप (जेटीएच), स्वतंत्रता फैलोशिप (जेटीएच) के प्रहरी, और पैट टिलमैन छात्रवृत्ति (जेटीएच)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-phenoxyethanol Sigma Alderich 77699
#00 buckshot Remington RMS23770 3.3g weight for sTBI
#3 buckshot Remington RMS23776 1.5g weight for miTBI/moTBI
#5 Dumont forceps WPI 14098
5-ethynyl-2’-deoxyuridine Life Technologies A10044 EdU
5ml glass vial VWR 66011-063
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit Life Technologies C10340
CytoOne 12-well plate USA Scientific CC7682-7512
Instant Ocean Instant Ocean SS15-10
Super frost postiviely charged slides VWR 48311-703
Super PAP Pen Liquid Blocker Ted Pella 22309
Tissue freezing medium VWR 15148-031

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा 171 ज़ेब्राफ़िश पुनर्जनन दर्दनाक मस्तिष्क की चोट कुंद बल आघात ज़ेबराफ़िश मस्तिष्क जब्ती एडिमा प्रसार
वयस्क ज़ेबराफ़िश में ब्लंट-फोर्स चोट के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक स्केलेबल मॉडल
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Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e62709, doi:10.3791/62709 (2021).

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