Summary
우리는 무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 및 후속 신경 재생의 기초 메커니즘에 따라 병리학의 폭을 검사하기 위해 성인 얼룩말 물고기에 대한 Marmarou 체중 드롭 모델을 수정했습니다. 이 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 인간의 TBI에서 관찰 부상 이질성을 다시 수상.
Abstract
무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 머리 외상의 가장 일반적인 형태, 이는 단절의 범위에 걸쳐 복잡 하 고 이종이 불 쌍이 이차 효과 결과. 인간에서 TBI다음 잃어버린 뉴런을 대체하거나 재생하는 메커니즘은 없지만, 제브라피쉬는 뇌를 포함하여 몸 전체에 뉴런을 재생하는 능력을 가지고 있습니다. 무딘 힘 TBI다음 얼룩말 피시에 전시 된 병리학의 폭을 검사하고 후속 뉴런 재생 반응의 기초 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 성인 얼룩말 피시에 사용하기 위해 일반적으로 사용되는 설치류 Marmarou 체중 방울을 수정했습니다. 우리의 간단한 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 그리고 접촉 과 외상 후 발작, 부종, 경막 및 추적 혈종 혈종, 인지 장애등 인간의 TBI 다음 관찰 표현형의 많은 재구성, 각각 부상 심각도 의존적 인 방식으로 표시. 부상 후 몇 분 이내에 나타나기 시작하는 TBI 후유한은 부상 후 7 일 이내에 거의 손상되지 않은 제어 수준으로 돌아갑니다. 재생 과정은 부상 후 48시간(hpi)부터 시작하며, 최고 세포 증식은 60마치에 의해 관찰됩니다. 따라서, 우리의 zebrafish 무딘 힘 TBI 모형은 제브라피시에 유일하게 신경 재생의 기계장치와 더불어 질병 개시 및 진행을 조사할 수 있는 인간 TBI와 유사한 특징적인 1 차 및 이차 상해 TBI 병리를 생성합니다.
Introduction
외상성 뇌 손상 (TbIs)은 글로벌 건강 위기와 사망과 장애의 주요 원인입니다. 미국에서는 매년 약 290만 명이 TBI를 경험하고, 2006-2014년 사이에 TBI 또는 TBI 후유로 인한 사망률은 50%1 이상 증가했습니다. 그러나, 결핵은 그들의 병인학, 병리학 및 임상 프리젠 테이션에서 주로 상해의 기계장치에 부분적으로 기인합니다 (MOI), 이는 또한 처리 전략 및 예측 예후2에 영향을 미칩니다. 비록 결핵은 다양 한 MOI에서 발생할 수 있습니다., 그들은 주로 관통 또는 무딘 힘 외상의 결과. 관통 외상은 결핵의 작은 비율을 나타내고 즉각적이고 주변 찔린 뇌 부위에 국한되는 심각하고 초점 상해를 생성3. 대조적으로, 무딘 힘 TBI는 일반 인구에서 일반적입니다, 단절의 범위에 걸쳐 (온화한, 보통, 심한), 여러 뇌 영역에 영향을 미치는 확산, 이질성, 글로벌 상해를 생산1,4,5.
Zebrafish (Danio rerio)는 중추 신경계 (CNS)6,7,8,9에 걸친 광범위한 신경 학적 모욕을 검사하는 데 활용되었습니다. Zebrafish는 또한 포유류와 달리 CNS 손상을 복구하기 위한 선천적이고 강력한 재생 반응을 가지고 있습니다10. 현재 zebrafish 외상 모델은 침투, 절제, 화학 적 모욕 또는 압력 파동을 포함한 다양한 부상 방법을 사용합니다11,12,13,14,15,16. 그러나, 이들 각각의 방법은 거의 인간 인구에 의해 경험되지 않는 MOI를 활용, 부상 단절의 범위에 걸쳐 확장 할 수 없습니다, 무딘 힘 TBI 후보고 이질성 또는 심각도 의존 TBI 후이를 해결하지 않습니다. 이러한 요인은 인간 인구에서 TBI의 일반적인 형태와 관련된 병리학의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 제브라피시 모델의 사용을 제한 (가벼운 무딘 힘 부상).
우리는 상해 병리학, TBI 후유증의 진행 및 타고난 재생 반응을 조사할 수 있는 방법을 제공하는 신속하고 확장 가능한 무딘 힘 TBI 제브라피시 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 일반적으로 사용되는 설치류 Marmarou17 체중 방울을 수정하고 성인 얼룩말 물고기에 적용했습니다. 이 모델은 온화하고 중간정도에서 중증에 이르는 다양한 절단 범위를 산출합니다. 이 모델은 또한 발작, 부종, 경막 및 추적 혈종, 신경 세포 죽음 및 학습 및 기억 장애와 같은 인지 적자를 포함하여 심각도 의존적 방식으로 인간 TBI 병리학의 여러 측면을 재구성합니다. 부상 후 며칠, 병리학 및 적자가 사라지고 손상되지 않은 컨트롤과 유사한 수준으로 돌아갑니다. 추가적으로, 이 제브라피쉬 모형은 상해 엄격에 관하여 신경축에 걸쳐 강력한 증식 및 신경 재생 반응을 표시합니다.
여기에서는 무딘 힘 외상의 설정 및 유도, 외상 후 발작 점수, 혈관 부상 평가, 뇌 섹션 준비 지침, 부종 정량화 에 대한 접근 및 부상 후 의 확산 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.
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Protocol
브라위피쉬는 프레이만 생명과학 센터의 노틀담 제브라피시 시설에서 자랐으며 유지되었습니다. 이 원고에 설명 된 방법은 노틀담 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다.
1. 외상성 뇌 손상 패러다임
- 시스템 물 1L에 2-페녹시에탄올 1mL를 추가하십시오(1L의 탈온화 된 RO 물에 인스턴트 오션 60 mg).
- 실온에서 2L의 시스템 물을 포함하는 배수 복구 탱크를 준비합니다.
- 원하는 볼 베어링 무게와 강철/플라스틱 튜브의 원하는 길이 와 직경을 선택하고 에너지와 충격력을 결정합니다.
참고: 튜브는 경로 나 이동 속도를 변경하지 않고 볼 베어링이 통과 할 수있는 내부 직경을 가져야합니다.- 충격에 따라 운동 에너지를 결정합니다.
여기서, KE = 운동 에너지, m = 질량(kg), g = 중력, h = 높이(m)가 드롭포인트에서 물고기까지.
참고: J. J. 에서 운동 에너지를 1,000으로 곱하여 mJ를 결정합니다. KE 는 볼 베어링이 고정 된 위치에서 떨어질 때 발생하는 가속 물체를 기반으로합니다. - 얼룩말 두개골 (총 거리 9.1cm)과 1.5g (6.4mm 직경) 볼 베어링의 플레이트 위 1.5cm를 끝내는 7.62cm 길이의 강철 / 플라스틱 튜브를 사용하여 온화한 TBI (miTBI)를 생성합니다. 이들은 1.33 mJ의 운동 에너지를 생성합니다. 이 손상은 경험적으로 혈관 상해, 경막막/무산혈 혈종 형성, 신경 세포 죽음 및 심각도 의존적인 방식으로 인간 인구에서 보고된 것을 크게 회수하는 인식 손상과 같은 주요 병리학TBI 마커에 근거를 둔 miTBI에 해당하기로 결정되었습니다.
- 운동 에너지 miTBI 계산 =
- 제브라피쉬 두개골(총 거리 14.2cm)과 2.08mJ의 운동 에너지를 생성하는 1.5g(직경 6.4mm) 볼 베어링의 플레이트 위로 1.5cm 를 끝내는 12.7cm 길이의 강철/플라스틱 튜브를 사용하여 적당한 TBI(moTBI)를 생성합니다.
- 운동 에너지 moTBI 계산 =
- 7.62cm 길이의 강철/플라스틱 튜브를 사용하여 심한 TBI(sTBI)를 생성하여 제브라피쉬 두개골(총 거리 9.1cm)과 3.3g(직경 8.38mm) 볼 베어링의 플레이트 위로 1.5cm 를 종료하여 2.94mJ의 운동 에너지를 생성합니다.
- 운동 에너지 sTBI 계산 =
- 충격에 따라 운동 에너지를 결정합니다.
- 페트리 접시에 모델링 점토(도 1, 1단계)를 채우고 무딘 악기(즉, 집게 의 뒷면)를 사용하여 추가 모델링 점토(그림 1, 2단계)가 있는 제기 플랫폼(5cm x 1.5cm)을 만듭니다.
- 면도날을 사용하여 제기된 플랫폼을 대략 2개의 동일한 반으로 세로로 나눕니다(그림 1, 3단계, 빨간색 파선). 두 반쪽을 성인 물고기의 길이를 수용 하는 채널로 형성 (그림 1, 단계 4). 추가 점토를 사용하여 물고기 몸의 ~ 2/3을 고정하여 머리를 노출시키는 벽을 구축하십시오.
- 부상 시 헤드의 회전이나 반동을 피하기 위해 헤드를 지지하기 위해 벽에 수직으로 노출된 헤드 부위에 작은 지지체를 성형한다(도 1, 4단계).
참고: 채널은 등쪽에서 물고기를 지원할 만큼 깊어야 하지만 여전히 머리가 주변 점토 위에 안주하도록 해야 합니다. 또한, 머리 지원은 낮은 하악골과 아가미를 지원하는 물고기의 자연적인 곡률을 따라야한다. - 떨어뜨린 중량이 채널의 측면에 의해 방해되지 않았는지 확인합니다(그림 1, 4단계).
- 미니 홀 펀치와 22g 스틸 깜박임으로 직경 3mm의 강철 디스크를 만듭니다. 각 디스크는 여러 번 사용될 수 있습니다.
- 1:1000(1mL/1 L, 0.1%) 2-페녹시에탄올이 꼬리 꼬집기까지 50-100mL의 비커에 배치하여 한 마리의 물고기를 마취시킵니다.
- 물고기, 등쪽 을 위로 배치, 몸이 측면에 고정되도록 채널 내의 점토 금형에 원하는 충격 점을 중심으로 머리에 3mm 22g 강철 디스크를 배치 (도 1, 단계 5).
- 물고기가 머리를 한쪽으로 기울지 않도록 가능한 한 수직으로 정렬되어 고르지 못한 영향을 줄 수 있습니다.
- 표준 링 스탠드와 암 클램프를 사용하여 강철/플라스틱 튜브를 고정하므로 튜브의 바닥은 제브라피시의 머리 위로 1.5cm 입니다(그림 1, 6단계). 튜브가 직선인지 확인하십시오.
- 튜브를 내려다보고 튜브가 강판 위에 정렬되었는지 확인합니다.
- 볼 베어링(경미하고 중간 정도의 TBI의 경우 1.5g, 중증 TBI의 경우 3.3g)를 소정의 높이(1.3.3-1.3.5단계설명)에서 원하는 신경해부학 적 영역 위에 위치한 강판에 튜브를 내려 놓아 원하는 신경해부학적 영역(예를 들어, 소뇌, 도 1, 5 단계 5)을 원하는 중증도에 대한 무딘 TBI 의 중증도를 생성한다. 부상당한 물고기를 복구 탱크에 배치하여 모니터링합니다.
참고: 부상의 심각도에 따라 사망률 또는 토닉 클로닉 발작이 발생할 수 있습니다. 물고기가 TBI 다음 시간의 장시간 동안 응답하지 않는 경우, 꼬리 핀치를 관리하고 통증 반응을 평가하기 위해 전송 파이펫 이나 집게를 사용합니다.
2. 성인 얼룩말피에서 TBI 후 발작 점수
- 섹션 1에 설명된 부상 프로토콜에 따라 물고기를 마취하고 다치게하고 부상당한 물고기를 시스템 물 2 L의 배수 복구 탱크에 놓습니다.
- 복구 탱크에 배치 된 직후시작 외상 후 발작의 흔적에 대한 물고기를 관찰. 관찰 시간(즉, 1h)을 설정하고 발작 점수(아래에 설명됨), 각 발작 의 지속 시간 및 발작을 경험한 물고기의 백분율을 포함한 모든 발작 활동을 기록합니다(그림 2A).
참고: 발작은 부상 시 즉시 발생할 수 있으며, TBI 이후의 시간 또는 일도 발생할 수 있습니다. 발작은 장기적으로 지속될 수 있고 단 하나 물고기는 다중 발작이 있을 수 있습니다. 1 시간 이상 관측 시간을 설정하면 발작 률의 전반적인 추세를 잘 나타낼 수 있습니다. - 성인 얼룩말 물고기 발작 표현형에 대한 Mussulini18 지침을 사용하여 물고기 점수.
참고: 추적 소프트웨어를 사용하지 않고는 발작 점수를 3 미만으로 평가하기가 어렵습니다. 따라서 소프트웨어 없이 평가가 수행될 때 3개 이상 발작 점수만 기록해야 합니다.
3. 뇌 해부
- 아가미 운동이 중단될 때까지 2-페녹시에탄올의 1:500(2mL/1 L, 0.2%) 용액으로 물고기를 안락사시키고 원하는 엔드포인트에서 핀 핀치에 반응하지 않습니다.
- 페트리 접시에 모델링 점토를 채우고 해부 중에 몸을 지탱할 수 있는 작은 캐비티를 만듭니다.
- 물고기, 등쪽을 점토 몰드에 올려 놓습니다. 물고기의 몸체 중간에 중간선을 통해 해부 핀 1개를 놓고 머리 의 밑면 뒤에 두 번째 핀 ~5mm를 놓습니다.
- 해부하는 빛 현미경에서, 무뚝뚝하게 #5 Dumont 집게의 쌍으로 시신경을 끊고 눈을 제거합니다 (그림 2A).
- 현미경을 통해 볼 때 장편 끝이 가장 멀리 되도록 물고기를 지향 (그림 2B).
참고: 다음 단계는 오른손잡이 개인을 위한 것입니다. 왼손잡이 개인은 미러 방향으로 다음 단계를 수행하는 것을 선호할 수 있습니다. - #5 집게를 사용하여 집안판의 한쪽 끝을 천천히 배치하여 고의적인 가위 동작이 로스트랄 끝으로 이동하고 오른쪽 정수리 및 정면 플레이트(그림 2C)를 제거합니다.
- 해부 동안 뇌를 관통하지 않도록 집게를 45° 이하의 각도로 유지하십시오.
- 물고기를 시계 방향으로 90° 회전시. 왼쪽 정수리 플레이트 아래에 #5 집게의 한쪽 끝을 놓고 동일한 가위 동작을 사용하여 뇌의 전체 등쪽 측면을 노출하는 왼쪽 정수리 및 전두엽 판을 제거합니다(그림 2D, E).
- #5 포셉으로 맥실라를 무뚝뚝하게 변형시합니다. 후각 전구를 보존하고 관심 영역인 경우 손상되지 않습니다.
- #5 포셉(그림 2F)으로 오른쪽 오퍼클, 프리오퍼클, 인터로퍼클 및 서브퍼클을 제거합니다.
- #5 포셉을 사용하여 칼바륨 개구부의 caudal 끝에 있는 근육을 무뚝뚝하게 절제하여 척수를 노출시십시오.
- #5 포셉으로 척수를 무뚝뚝하게 변질합니다. 조심스럽게 뇌 아래에 집게를 배치하고 부드럽게 칼바륨에서 뇌를 제거합니다.
참고 : 뇌를 꼬집어하지 마십시오. 집게를 사용하여 뇌를 "요람"하거나 caudally 절제하고 노출된 척수를 뇌를 기동하는 핀치 포인트로 활용하십시오. - 로커 플랫폼에서 4°C에서 하룻밤 사이에 9부 100% 에탄올에서 1부 37% 포름알데히드로 제거된 뇌를 수정합니다.
4. 제브라피쉬 뇌에 대한 부종 연구
- 섹션 1에 설명된 부상 프로토콜에 따라 물고기를 마취하고 다치게하고 물고기가 자유롭게 수영을 시작할 때까지 복구 탱크에서 회복 할 수 있도록합니다.
- 1 일 동안 정상적인 주택 조건에 다시 물고기를 배치합니다.
- 시간이 경과 한 후, 1:500 2-페녹시에탄올에서 물고기를 안락사.
- 섹션 3에 설명된 프로토콜에 따라 전체 뇌 또는 관심 영역을 해부하고 뇌를 작은 계량 보트에 즉시 배치합니다.
참고: 두뇌를 옮길 때주의를 기울여야 하며, 미세한 집게를 사용하여 뇌를 찌르거나 긁지 않고 계량 보트에 부드럽게 배치하여 조직의 손실을 초래할 수 있습니다. - 라벨 (부상 그룹과 뇌 수) 및 규모에 추가 작은 건조 계량 보트를 타고. 정확한 측정을 위해 최소 0.001g을 측정할 수 있는 스케일을 사용합니다.
- 타르 건조 계량 보트에 뇌를 전송하고 뇌의 젖은 무게를 기록합니다. 그들은 등쪽 측이 위를 향하고 무게 보트에 평평하게 누워 있도록 뇌를 오리엔팅.
- 건조 계량 보트와 뇌를 혼성화 오븐에 넣고 8시간 동안 60°C로 설정합니다.
- 건조 후, 뇌는 건조 계량 보트에 충실 할 수 있으며 제거하고 새로운 타르 작은 무게 보트로 전송하기 어려울 수 있습니다. 이 건조 한 두뇌에 손상 및 조직의 손실 귀 착될 수 있습니다, 집게와 두뇌를 꼬집어 하지 마십시오. 대신, 미세 한 집게를 함께 꼬집어, 뇌의 복부 측면에서 시작, 위쪽으로 움직임에 국자.
- 수식을 사용하여 각 뇌의 수분 함량을 결정합니다(그림 4):
5. 신경축을 가로 질러 세포 증식을 표시하고 고정 된 조직을 준비.
- ddH2O 의 2mL에서 10mM 5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU)을 준비한다.
- 1:1000mL(1mL/1 L, 0.1%) 2-페녹시에탄올에서 한 번에 3~4마리의 물고기를 마취하여 물고기가 꼬리 꼬집어 반응하지 않을 때까지(섹션 1에 설명된 프로토콜 사용).
- 젖은 스폰지에 부분 절개를하고 개구부, 복부 측면에 한 번에 하나의 물고기를 배치합니다.
- 30G 바늘을 사용하여 10mM EdU의 ~40 μL을 물고기의 몸에 주입하십시오. 물고기는 시스템 물로 채워진 지주 탱크로 돌아갑니다.
참고: 반복 주사는 다른 시점에서 수행될 수 있고 증식 세포의 더 많은 수를 레이블을 지정하고 1 주 이상의 추적 기간이 원하는 경우 필요할 수 있습니다. - 섹션 3에 설명된 대로 뇌를 수집하고 9부 100% 에탄올의 2mL를 포함하는 5mL 유리 바이알에 1부 37% 포름알데히드로 배치한다. 로커 플랫폼에서 4°C에서 뇌를 수정합니다.
참고: 로커 또는 셰이커 플랫폼은 뇌가 바닥에 쉬고 전체 뇌의 텔렌스팔론이 컬링되는 것을 금지합니다. - 뇌를 고치는 데 사용되는 유리 유리 바이알에서, 내림차순 에탄올 시리즈의 세척, 75%, 50%, 25%, 각각 15분, 실온에서 로커에 5%의 자당/PBS로 1.5h 세척이 뒤따랐다. 로커 플랫폼에 4° C에서 30% 자당/PBS에 밤새 유리 유리 병에 두뇌를 저장합니다.
- 30% 자당/PBS에서 뇌를 제거하고 12웰 플레이트(웰당 1개의 치료그룹)로 이송하고, 2부조직 동결배지와 1부 30%의 자당/PBS로 구성된 2:1 용액으로 채워진 웰을 이체한다. 로커 플랫폼에서 4°C에서 하룻밤 동안 뇌를 배양합니다.
- 4°C에서 2-24h에 대해 100% TFM에서 12웰 플레이트 내의 다음 웰행으로 뇌를 옮기는다.
- 냉동 척을 사용하여 TFM에 뇌를 건조 얼음의 원하는 방향으로 포함시킵니다.
- 저온 절제 (16 μm 두께 의 섹션)를 수행하고 양전하 슬라이드의 섹션을 수집합니다. 1 시간 동안 슬라이드 워머에 건조 슬라이드 다음 -80 ° C에 저장하거나 면역 작용으로 계속.
- 조직 섹션 주위 슬라이드에 소수성 장벽을 준비하고 20 분 동안 슬라이드 워머에 건조 할 수 있습니다.
- PBS에서 슬라이드를 5분 간 간 간략하게 씻어낸 다음 PBS-Tween 20(0.05%)에서 각각 10분 동안 두 번 세척합니다.
- EdU 세포 증식 키트 및 제조업체의 지침을 사용하여 EdU 탐지를 수행합니다.
- 슬라이드를 분석하고 형광 EdU 표지 된 세포를 상피 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 정량화합니다. 개별 셀을 명확하게 구분하려면 최소 40배의 목표가 필요합니다.
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Representative Results
부상 유도 장비를 준비하면 성인 얼룩말물고기에 확장 가능한 무딘 힘 TBI를 제공하는 빠르고 단순한 수단을 사용할 수 있습니다. 부상 모델의 등급 심각도는 혈관 부상이 가장 쉽고 눈에 띄는 병리학 중 하나이지만 성공적인 부상의 몇 가지 쉽게 식별 할 수있는 메트릭을 제공합니다 (그림 3). 부상 중에 사용되는 물고기의 변형은이 지표를 쉽게 또는 식별하기 어렵게 만들 수 있습니다. 야생형 AB어(WTAB, 도 3A-D)를 사용하는 경우, 혈관 손상의 식별은 착색으로 인한 miTBI 또는 moTBI 및 손상되지 않은 대조군 물고기를 구별하기 어려울 수 있다(도 3A-C). 부상 후, miTBI 물고기는 최소한의 표면 마모 (그림 3B)를 표시하고, moTBI는 제한된 뇌 출혈을 나타낸다 (그림 3C). sTBI는 여전히 어려울 수 있지만 부상 정도는 종종 명백합니다 (그림 3D). 대조적으로, 알비노(그림 3E-H) 또는 캐스퍼 물고기(도 3I-L)를 사용할 때, 혈관 손상은 쉽게 식별된다. 추가적으로, 충격 포착은 수시로 단 중 상해 및 포착 비율 에 따라 관찰됩니다 상해의 또 다른 대표적인 미터법입니다 (표 1). 부상당한 물고기는 토닉 클로닉 발작 (실조, ZBC 1.9, 굽힘, ZBC 1.16, 순환, ZBC 1.32 및 코르크 스크류 수영, ZBC 1.37)19를 표시합니다. 발작은 심각도와 관련하여 증가 보급으로 관찰될 것입니다. 부상 후, miTBI는 발작과 같은 행동을 표시하지 않습니다; 그러나, moTBI는 발작 행동(10.66% ± 1.37%, p < 0.0001, 표 1)을 표시하고 발생률은 sTBI 물고기(19.93% ± 1.49%, p < 0.0001, 표 1)에서 더욱 상승한다.
뇌의 성공적인 제거는 부종 및 세포 증식 평가와 같은 추가 조사의 무수한에 대 한 중요 한. 뇌 영역을 손상시키지 않도록 최선을 다하는 해부를 수행하고 (의도하지 않은 펑크에 의해) 모든 영역을 보존하십시오 (후각 전구를 쉽게 잃을 수 있음). 뇌 해부 절차 및 회로도 (섹션 3, 그림 2A-F)에 따라 완전한 뇌 제거를 허용 (그림 2G, H). 조사자는 그들의 분석이 전체 두뇌를 필요로 하는지 또는 특정 두뇌 지구의 집합이 그들의 필요에 적합할 수 있는지 여부를 고려해야 합니다. 부상의 심각성과 수집 시간에 따라 뇌는 부착 된 경막 출혈을 나타낼 수 있지만, 이들은 종종 두개골의 밑면에 부착되어 해부 중에 손실됩니다. 뇌의 붓기는 때때로 명백하지만 해부학적 차이와 일반적인 크기의 변화로 인해 부종은 붓기를 평가하는 가장 좋은 방법입니다. 설명된 프로토콜(섹션 4)에 따라 손상되지 않은 뇌는 0.80% ± 73.11%의 유체 함량을 나타내고, miTBI, 약간 상승했지만, 부종1, 3, 또는 5 dpi (1 dpi : 76.33 % ± 1.32 %, p = 0.36 %, 3 dpi : 75.33 ± 1.37 %, p = 0.84, 5 dpi : 74.14 ± 1.50 %, p > 0.99). 반면, moTBI와 sTBI 모두 에보1 dpi(moTBI: 80.55 ± 0.94%, p < 0.0001, sTBI: 86% ± 1.05%, p < 0.0001), 3dpi (moTBI: 78.11 ± 0.93%, p < 0.018, sTBI: 77.77% ± 1.02%, p < 0.036, 그림 4). 그러나, moTBI와 sTBI의 유체 함량은 손상되지 않은 대조군을 5dpi(moTBI: 74.42 ± 1.25%, p > 0.99%, sTBI: 73.85% ± 1.01%, p > 0.99, 도 4)로 회복하였다.
세포 증식은 제브라피시의 TBI에 이어 부상 정도에 대한 강력한 평가입니다. 세포 증식 반응은 다른 형태의 뇌 손상에 따라 제브라피시에서 이전에 연구되었지만9,12, 대부분의 경우, 조사는 부상 부위로 제한되었습니다. 이 무딘 힘 TBI신경축에 걸친 강력한 증식 반응을 초래합니다. 심각도 의존적 방식(sTBI 데이터 표시)에서, 손상되지 않은 컨트롤에 비해 전뇌의 심실 및 지하 영역에서 증가된 EdU 라벨링이 관찰된다(도 5A). 중간뇌(메세스팔론 과 디엔살론)로 소크로 이동한 부상당한 뇌는 대기심낭 회색 영역(PGZ)에서 에듀 라벨링이 증가하고, 전방 시상하부의 측면은 손상되지 않은 물고기(그림 5D 및 도 5C)에 비해 증가하였다. 뒤이어뇌에서 손상되지 않은 뇌에서 명백한 신경 발생 영역(도 5E, G)은 sTBI(도 5F, H)에 따라 세포 증식증가를 나타낸다.
요약하자면, 성인 얼룩말물고기에 적용된 수정된 Marmarou 체중 방울은 재현 가능한 부드럽고 확장 가능한 온화함, 보통 또는 심한 무딘 힘 TBI를 제공합니다. Zebrafish는 심각도에 의존하는 방식으로 발작 및 혈관 손상(즉, 경막및 무도성 혈종)을 포함한 다양한 병리를 표시합니다. 추가적으로, 부상당한 물고기 표시 감소 복구 속도 (의식의 손실에 유사, 학습 및 메모리 문제의 형태로 인지 적자, 신경 세포 죽음 (데이터 표시 되지 않음). 관찰 된 병리는 신경 축을 가로 질러 강력한 증식 사건과 일치하는 4-7 일 의 범위에 걸쳐 빠르게 회복됩니다.
그림 1: 확장 가능한 부상 장치 설정. 제브라피시에 확장 가능한 TBI의 설정, 모델 및 전달의 그래픽 표현. 1-4 단계는 물고기를 고정하고 손상 중에 머리를 노출하는 지원 금형을 형성하는 단계에 대한 교육 개요를 제공합니다. 5-7 단계는 모델을 해결할 때 고려해야 할 측면에 대한 통찰력을 가진 부상을 제공하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 그림은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 뇌 해부에 대한 두개골 제거. 단순화 된 제브라피시 두개골의 회로도와 뼈 (파란색 섹션)의 단계별 제거는 성인 얼룩말 피시 뇌를 노출합니다. (A,B) 눈은 시신경을 분리 #5 집게로 무딘 제거됩니다. (C) 집안판(Black arrow)에 직접 소살된 집안의 근육에 집안뼈를 제거한 다음 오른쪽 정면 골격을 제거한다. (D,E) 왼쪽 정수리 뼈와 왼쪽 정면 뼈가 제거됩니다. (F) 오른쪽 오퍼클, 서퍼클, 인터로퍼클 및 서브퍼클이 제거되어 뇌에 측면 및 등갈에 접근할 수 있습니다. (G,H) 손상되지 않은 sTBI 뇌가 제거되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 부상-단절에 걸쳐 다양 한 배경에 혈관 부상. 손상되지 않은 TBI 야생 형 AB, albinob4 및 혈관 손상을 나타내는 캐스퍼 성인 얼룩말fish의 도살 보기. (A-D) 성인 야생 형 AB 물고기는 심하게 색소화되고 miTBI (B)에 따라 찰과상은 시각화하기가 어렵습니다. 혈관 손상은 손상되지 않은 컨트롤 (A)에 비해 moTBI (C) 및 sTBI (D) 물고기에서 더 명백했다. (E-H) 알비노 물고기는 덜 색소되었고 뇌의 시각화는 더 뚜렷했습니다. TBI 에 따른 혈관 손상은 명확하게 관찰되고 단절을 통해 구별되었습니다. (I-L) 캐스퍼 물고기는 투명도가 원하는 신경 해부학 영역의 쉬운 식별과 TBI 심각도에 의해 혈관 손상의 명확한 관찰 및 묘사를 허용으로 초보자 조사자에게 가장 적응 가능한 배경을 제공했다. 스케일 바 = 500 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 4: 얼룩말물고기는 TBI 에 이어 부상으로 인한 부종을 경험합니다. Zebrafish는 TBI (손상되지 않은, miTBI, moTBI 및 sTBI)의 다른 단절에 노출되었으며 퍼센트 유체 함량 (부종)에 대한 손상 에 따라 다른 날에 평가되었습니다. 통계 분석은 브라운스 포시테와 웰치 아노바와 함께 수행되었으며, 그 다음으로 던넷의 T3 다중 비교 후 호크 테스트가 있었습니다. n = 개별 물고기의 총 수입니다. 모든 통계 분석은 프리즘(Graphpad 9.0) 소프트웨어 패키지로 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 신경축을 가로지르는 TBI 유도 증식. (A-H) 수집 하기 전에 EdU 12 h와 IP 주입 했다 손상 되지 않은 sTBI 물고기의 관상 및 처상 뇌 섹션의 공초점 이미지 12 시간. 증가 된 EdU 통합은 전뇌 (A, B), 중뇌 (C, D), 및 뒤뇌 (E-H)를 통해 부상 다음 여러 신경 질시장에서 관찰되었다. 소뇌, CCe, 과립 층, GL, 내측 발불라 세루밀리, Vam, 분자 층, ML, 광학 텍텀, 테오, 페리벤토리큘러 그레이 존, PGZ, 텔렌스팔론 및 텔. 모든 스케일 바는 200 μm입니다.
| 그룹 | N | n | 평균 발작 (%) ± SEM | p |
| 운담 (Undam) | 10 | 74 | 0% | |
| miTBI | 10 | 100 | 0% | >0.99 |
| moTBI | 10 | 184 | 10.66% ± 1.37% | <0.0001 |
| sTBI | 10 | 237 | 19.93% ± 1.49% | <0.0001 |
표 1. Zebrafish는 TBI 에 이어 심각도 의존충격 발작을 표시합니다. 실험적인 부상 군의 백분율로 기록된 강장제-클로닉 발작의 정량화는 1h 부상 후 에서 관찰되었다. 통계 분석은 양방향 ANOVA로 수행되었고 Tukey의 사후 테스트가 뒤따랐습니다. N = 실험 그룹의 총 수, n = 개별 물고기의 총 수입니다. 통계 분석은 프리즘(Graphpad 9.0) 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행하였다.
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Discussion
신경 외상 및 관련 후유증에 대한 조사는 오랫동안 기존의 비 재생 설치류 모델에 중점을 두어 왔습니다20. 최근에는 재생 모델에 다양한 형태의 CNS 손상을 적용한 연구9,11,13,14,21. 통찰력이 있지만, 이러한 모델은 인간 인구에서 흔히 볼 수 없는 부상 방법(관통 외상, 화학 절제, 폭발) 및/또는 부상이 확장가능하지 않으므로 인간 인구에서 관찰되는 심각도 의존병리학의 이질성을 완전히 해결하지 못하여 제한됩니다22,23,24,25 . 여기에서, 우리는 인간 진단에 설치된 많은 병리학적인 메트릭을 생성하는 임상적으로 관련있는 두부 외상 (무딘 힘)4의 일반적인 양식을 적용하는 손상 패러다임을 제공합니다22,23,24,25. 재생 제브라피시에 적용될 때, 이 모델은 부종 또는 외상 후 발작과 같은 단절에 걸쳐 상해 유발 병리학의 진행 및 회복을 조사하고 타고난 재생 회복의 뒤에 있는 기계장치를 해명할 수 있는 방법을 제공합니다.
제브라피시에서 무딘 힘 TBI를 생산하는 모델의 두 가지 주요 기능이 있습니다. 첫째, 우리의 모델은 빠른 저렴하고 간단한 부상 패러다임을 제공, 이는 무딘 힘 TBI의 누적 효과를 조사하기 위해 개인의 많은 수의 연속 부상이나 반복 부상을 허용. 둘째, 이 모델은 다른 힘 영향의 효과를 검사하기 위해 쉽게 확장 할 수 있습니다. 튜브의 길이(볼 베어링이 떨어지는 높이)와 볼 베어링의 무게를 변경하여 물고기의 두개골에 전달되는 에너지와 충격력을 쉽게 수정하고 계산할 수 있습니다. 부상의 이 확장성은 CNS 수리의 심각도 의존적인 TBI 후생 및 재생 메커니즘에 관한 여러 가지 조사 방법을 허용합니다.
성공적인 부상 응용 프로그램에 액세스하기 위해 여러 메트릭을 사용하면 여전히 활용해야 할 물고기의 유전 적 배경에 주의 깊은 고려가 주어져야합니다. 캐스퍼 또는 알비노 돌연변이 물고기는 초보 수사관이 원하는 신경 해부학 적 충격 점에 강철 디스크의 배치, 혈관 손상을 평가하는 데 유리할 것입니다. 또한, 뇌의 주의 깊은 제거는 캐스퍼 와 알비노 돌연변이 물고기에서 뼈와 뇌의 시각적 접근성에 의해 단순화된다. 그러나, 안료 야생 형 물고기는 랜드 마크의 식별 및 성공적인 해부를 주목할 만한 연습과 함께 올 수 있지만 사용할 수 있습니다. 또한, 색소된 물고기는 후속 병리로 인해 부상의 적절한 특성을 허용하므로 moTBI 또는 sTBI 모욕을 생성할 때 사용할 수 있습니다.
얼룩말 피시에 무딘 힘 TBI의 효과 연구 하는 한 가지 주요 이유는 부상 유도 된 세포 증식의 소스와 기본 신경 재생 메커니즘을 검사 하는 것입니다. 제브라피쉬 신경축26,27을 가로지르는 신경성 틈새에서 발달 및 기저증이 확인되었으며, 상해 유발 재생은 성인 제브라피시8,12,15의 부상 부위에 국소화되거나 인접한 것으로 관찰되었다. 그러나, 우리의 무딘 힘 TBI 모형은 확산 상해가 또한 신경축을 통해 신경성 틈새 내의 엄격 의존적인 세포 증식 사건에 초래된다는 것을 보여줍니다. TBI에 따른 세포 증식의 근원 및 범위의 식별은 단일 세포 RNA-Seq의 적용을 허용하여 증식 틈새 시장에서 유전자 발현의 변화를 식별하고, 특정 작용제 및 길항제의 적용을 통해, 이러한 재생 반응을 조절할 수 있다. 이 접근은 손상된 얼룩말 망막28에 있는 근본적인 신경 재생기기의 기초에 유용하고 TBI 다음 두뇌에 동등하게 유용해야 한다는 것을 입증했습니다.
결론적으로, 우리의 모델은 확장 가능한 무딘 힘 TBI를 제공하기 위해 신속하고 간단하며 비용 효율적인 부상 방법을 제공합니다. 이 모델은 심각도 의존성 또는 반복된 무딘 힘 TBI의 효과를 더 조사하고, 신경 보호를 개선하거나 성인 척추 동물의 기능적 인지 회복을 위한 신경 재생을 유도하는 유전 조절의 치료 목표를 설명하는 데 유용할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그들의 사려 깊은 토론에 대한 하이드 실험실 구성원을 감사하고 싶습니다, 제브라피시 관리 및 축산에 대한 프레이만 생명 과학 센터 기술자, 그리고 악기와 서비스의 사용에 대한 노틀담 광학 현미경 코어 / NDIIF 의 대학. 이 작품은 노틀담 대학의 제브라피시 연구 센터, 노틀담 대학의 줄기 세포 및 재생 의학 센터, NIH R01-EY018417 (DRH), 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램 (JTH), 노트르 담 (JTH)의 LTC 닐 하이랜드 펠로우십의 국립 안과 연구소에서 보조금을 지원받았습니다. 자유 펠로우십(JTH)과 팻 틸만 장학금(JTH)의 센티넬.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
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