Summary
连续块面扫描电子显微镜 （SBEM） 应用于图像和分析穆林海马体中的树突状脊柱。
Abstract
三维电子显微镜（3D EM）提供了分析具有纳米级分辨率的树突脊柱形态参数的可能性。此外，树突状脊柱的某些特征，如脊柱体积和突触后密度 （PSD） （表示突触的突触后部分）、突触前终端的存在以及光滑的内质视网膜或非典型形式的 PSD（例如多内侧脊柱），只能使用 3D EM 进行观察。通过使用串行块面扫描电子显微镜 （SBEM），可以比执行传统串行分割时更容易、更可重复的方式获得 3D EM 数据。在这里，我们展示如何准备小鼠海马样本进行SBEM分析，以及如何将此协议与树突状脊柱的免疫荧光研究相结合。轻度固定灌注使我们能够在大脑的一半进行轻度显微镜免疫荧光研究，而另一半则为SBEM做好准备。这种方法减少了用于研究的动物数量。
Introduction
中枢神经系统中的大部分兴奋突触位于树突状脊柱上 - 神经元膜的小突起。这些突起形成密闭生化隔间，控制细胞内信号转导。树突状脊柱和突触的结构可塑性与突触功效的功能变化密切相关，突触功效的变化是学习和记忆1、2等重要过程的基础。需要注意的是，电子显微镜 （EM） 是唯一能够确定树突状脊柱是否有突触前输入的技术。EM 分辨率还需要研究超结构细节，如后合成密度 （PSD） 的形状，代表突触的后合成部分，或树突脊柱的尺寸，以及轴突的大小和形状。此外，通过 EM，可以可视化突触及其周围环境。
由于成像和计算技术的进步，可以重建整个神经回路。体积电子显微镜技术，如串行节传输电子显微镜（sSTEM）、串行块面扫描电子显微镜（SBEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）等，常用于神经元电路重建3。
在我们的研究中，SBEM方法成功地用于研究小鼠海马和有机性脑切片4，5的样本中树突状脊柱和PSD的结构可塑性。SBEM基于扫描电子显微镜室6、7、8、9内安装微型超微缩微切除器。对样品块顶部进行成像，然后由超微切除器在指定深度切割样品，露出新的块面，再次成像，然后重复过程 8。因此，仅留下块面图像，而已切割的切片则丢失为碎屑。这就是为什么SBEM被称为破坏性技术，这意味着它不可能再次映像同一个地方。但是，破坏性块上方法的优点是它们不会遭受扭曲问题和部分丢失，这些问题和部分损失会显著影响数据质量和数据分析3。此外，SBEM还提供了在高分辨率3下成像一个相对较大的视场（>0.5毫米×0.5毫米）的可能性。
要使用 SBEM，由于用于获取图像的背散射电子探测器，因此必须按照专用的、高度对比的协议准备样品。我们在这里展示如何根据Dierinck10（国家显微镜和成像研究中心（NCMIR）方法开发的程序，使用20世纪80年代8、11年代开发的减少的硫化硫化物（rOTO）污渍来进行样品制备。此外，我们引入了两步固定方法，采用温和的固定灌注，允许使用相同的大脑进行轻显微镜和SBEM的免疫荧光研究。
在协议中，小鼠大脑主要用温和的固定剂固定，然后切成两半，一个半球固定后，准备免疫荧光（IF），而另一个半球用于EM研究（图1）。
图1。树突脊柱工作流程的示意图，为 SBEM 分析做准备。 老鼠被牺牲，并灌注了温和的原发性固定剂。大脑被切成两半，一个半球被免疫荧光（IF）专用固定，冷冻保护，使用低温统计器切片，并处理IF研究，而另一个半球被固定后与EM固定，切片与振动器和准备EM研究。用于SBEM研究的大脑切片进行了对比，平嵌在树脂中，然后海马的CA1区域被安装到针脚上，并用SBEM成像（图1）。视频中展示了黄色框中突出显示的协议部分。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Protocol
这项研究是根据Nencki研究所的指导方针和地方道德委员会的许可进行的。这些研究是根据欧洲共同体理事会1986年11月24日指令（86/609/EEC）、波兰《动物保护法》进行的，并得到了华沙第一个地方道德委员会的批准。尽了一切努力尽量减少使用的动物数量及其痛苦。
注意：以下所有程序必须在实验室烟雾罩中执行。由于使用的试剂具有危险性。需要采取个人安全措施，如手套、实验室外套、安全眼镜和面罩。
1. 准备灌注固定剂（2% wt/vol 副甲醛 （PFA） 和 0.5% vol/vol 谷胱甘肽 （GA） 在 0.1 M 磷酸盐缓冲 （PB）， pH 7.4）
注：在使用当天准备固定解决方案，并且不会将其存储超过 3 小时。在时间短缺的情况下，在前一天准备 0.1 M PB 中的 2% PFA，将其存储在 4 °C，并在灌注前不久添加新鲜 GA。
- 取 400 mL 无菌双蒸馏水（ddH2O），使用搅拌热板将其加热至 60 °C。然后添加 20 克 PFA。加入1M NaOH滴，直到PFA完全溶解，让混合物冷却。
- 添加 500 mL 的 0.2 M PB （pH 7.4）。
- 过滤溶液以移除任何沉积物，并将其冷却至 4 °C。
- 灌注前，在溶液中加入 20 mL 的 25% GA，然后用 ddH2O 到 1 L 充值体积。
2. 为 SBEM 准备灌注后固定剂（2% wt/vol PFA 和 2.5% Vol/vol GA，0.1 M PB，pH 7.4）
- 服用 50 mL 的固定剂进行灌注（2% PFA 和 0.5% GA 在 0.1 M PB 中）。
- 添加 5 mL 的 25% GA.
3. 为 IF 染色准备灌注后固定剂（磷酸盐缓冲盐水（PBS） 中的 4% PFA）
- 根据制造商说明，在纯化和去离子水中溶解 1x PBS （pH7.4）的片剂 （H 2 O）。
- 使用搅拌热板将溶液加热到 60 °C 并添加 40 克 PFA。
- 加入1M NaOH滴，直到PFA完全溶解，让混合物冷却。
- 将解决方案的 pH 值调整到 7.5 与 1 M HCl，然后用 H 2 O 到1L 充值体积。
- 过滤溶液以移除任何存款。
4. 动物的跨心灌注
注：所有PFA和GA废物必须按照当地法规收集和储存处理。麻醉和灌注应遵循当地法规。在描述的协议中，成年3个月大和20±1个月大的雌性Thy1-GFP（M）小鼠（Thy1-GFP +/-）12表达绿色荧光蛋白（GFP）在稀疏分布的谷胱甘肽神经元群中使用，但任何其他也可以使用。动物是作为异质动物在Nencki实验生物学研究所的动物之家中作为C57BL/6J背景繁殖的。
- 输液前，通过腹膜注射（27米针），通过注射氯胺酮/西拉津混合物（高达90毫克/千克体重氯胺酮和10毫克/千克体重的西拉津）来麻醉小鼠。
- 通过检查疼痛刺激（捏）和角膜反射（斜视）的反射，评估麻醉的深度是否足够。
- 20分钟后进行腹内注射（27度针头）五巴比妥钠（50毫克/千克体重）。
- 根据盖奇等人描述的灌注手术方案给老鼠灌注（见 第4点：图5-6）。使用灌注泵从 0.1 M 磷酸盐缓冲器开始，pH 7.4 （30 mL） 持续 3 分钟，在 0.1 M PB 中继续使用 2% PFA 和 0.5% GA，在 6 分钟（80 mL）中继续使用 pH 7.4。
- 轻轻地从头骨中解剖大脑，并把它分成两半（见图9-10在盖奇等人，2012年13）。将一块放入小瓶中，其中含有 SBEM 的固定剂，第二块放入小瓶中，4% PFA/PBS 用于 IF 染色。
- 将半球保持在 4 °C 的固定度中过夜。
5. 电子显微镜的大脑切片制备
- 选择振动器设置（刀片行驶速度：0.075 mm/s，切割频率：80 Hz）。
- 将切片室放入支架中，将其连接到振动器上，并用冰包围它。然后将剃须刀刀片放入振动刀片支架中。
- 使用勺子或类似的物体，将冰镇的大脑（面膜向上）放在坚硬的切割表面（例如，玻璃培养皿盖）。要准备海马的日冕片，在大脑半球和小脑之间用剃刀刀片或手术刀进行垂直切口，从而去除小脑。嗅觉灯泡也可以被移除。
- 在振动器的干燥平台上涂抹氰丙烯酸酯胶水。
- 用钳子拿起大脑，在滤纸上小心干燥。
- 将半球粘在靠近切割刀片的平台上，并向上倾斜。将平台连接到支架上，并立即用冰冷的 0.1 M PB、pH 7.4 填充平台。如果垂直切口制作得当，半球将直立，提供90°角，以作出包含海马的对称日冕切口。确保大脑被 PB 覆盖。
- 将振动刀片放置在半球前面，并将其降低到半球的日冕侧。将刀片进一步降低到 400 μm，并开始切片。继续切片，直到前两片完全脱离组织块。
- 收回刀片并再降低 100 μm，然后再次切片。
- 当海马变得可见（使用老鼠大脑地图集帕西诺斯和富兰克林，2004年14）收集切片与小画笔或扩大塑料巴斯德移液器。
- 将切片转移到一个充满冷 0.1 M PB、pH 7.4 的 12 井板中。
- 用剃须刀刀片或手术刀将海马切开，然后用相同的磷酸盐缓冲器将其放入玻璃瓶中。PB、pH 7.4。
注：用于长期存储的切片补充0.1 M PB与0.05%钠阿齐德（NaN3）。
6. 免疫染色的大脑样本制备
- 在烟雾罩中固定 4% PFA/PBS 溶液过夜后，将脑组织放入冷冻保存液中（PBS 中 30% 蔗糖，0.05% NaN3），并将其保持在 4 °C 下 2 天（直到沉没）。
- 准备防冻液（15% 蔗糖/30% 乙二醇/0.05% NaN3/PBS）。
- 将低温统计器的柜子温度设置为 -19 °C，并确保温度达到，然后再继续。在剖面过程中，确保机柜温度保持在 -18 °C 和 -20 °C 之间。
- 使用勺子或类似的物体，将冰镇的大脑（面膜向上）放在坚硬的切割表面（例如，玻璃培养皿盖）。要准备海马的日冕片，在大脑半球和小脑之间用剃刀刀片或手术刀进行垂直切口，从而去除小脑。
- 选择预冷却的标本盘，用介质盖住它，使其在释放的架子上结冰，并使用钳子将半球固定在圆盘上，并向上倾斜，等待标本完全冻结。将标本盘插入标本头。
- 在冷冻室内的刀片支架中安装刀片，切割 40 μm 厚的切片。
- 用小画笔将切片转移到装满冷防冻溶液的 96 井板上，然后轻轻展开部分（在每轮切片后收集切片，以防止它们丢失在切片室中）。
注：大脑或部分可以长时间存储在-20°C的防冻溶液中。
7. 脑片免疫染色
注：所有染色步骤均在平台摇床上的 24 井板中执行。
- 用 PBS 清洗切片三次，每次 6 分钟。
- 在 300 μL 的阻塞溶液（5% 普通驴血清 （NDS）/0.3% Triton X-100 中孵育切片 1 小时，旋转器上轻轻摇晃。
- 在 4 °C 下，用主要抗体对 PSD-95 进行原始抗体孵化切片，稀释 1：500 在 5% NDS/0.3% Triton X-100/PBS （每口井 300 μL） 过夜。 原体抗体的最终浓度为 2 微克/mL。
- 在室温 （RT） 下用 0.3% Triton X-100/PBS 清洗切片三次，每次 6 分钟。
- 用二级抗体在 300 μL 中稀释 1：500 的 0.3% Triton X-100/PBS 孵育切片 90 分钟。二级抗体的最终浓度为 4 μg /mL。
- 用 PBS 清洗切片三次，每次 6 分钟。
- 使用安装介质将切片安装在滑梯上，然后用盖片将其关闭。
- 使用共聚焦显微镜（63 ×油目标 NA 1.4、像素大小 0.13 μm × 0.13 μm）检查标本。
注意：用于长期存储：将样品保持在 4 °C，保护它们免受光线照射。
8. SBEM 样品制备
警告：由于试剂的危险性，使用以下所有程序必须在实验室烟雾罩中执行。在使用这些化学品之前，请仔细阅读制造商提供的材料安全数据表，并询问安全官员当地规则，以确保安全处理和废物处理。
- 示例对比
注意：切片清洗和室温孵化应进行轻度摇晃（例如，在平台摇床上）。使用了高压除气水。- 用冷0.1 M PB清洗切片，pH 7.4五次，每次3分钟。
- 准备 1：1 混合物 4% 水态四氧化二甲酸钠和 3% 铁氰化钾 （1：1 按 vol） 。最终产品将变成棕色。将样品浸入这种混合物中，放在冰上，从此阶段开始，保护样品免受光线照射非常重要。用轻轻的摇晃孵育它们1小时。
- 同时准备硫碳水化合物 （TCH） 解决方案。混合 10 mL 的双蒸馏 H2O （ddH2O） 和 0.1 克 TCH，将其放入 60 °C 的烤箱中 1 小时。不时旋转解决方案非常重要（例如，每 10 分钟一次）。准备好后，将其冷却至室温。
- 用 ddH2O 清洗切片五次，每次 3 分钟。
- 使用 0.22 μm 注射器过滤器过滤 TCH 溶液，并将样品浸入过滤溶液中。切片将变黑。在室温下孵育20分钟。
- 用 ddH2O 清洗样品五次，每次 3 分钟。
- 在室温下用 2% 的 OsO4 水溶液孵育样品 30 分钟。
- 用 ddH2O 清洗样品五次，每次 3 分钟。
- 将样品放入过滤的1%水性醋酸亚硝酸盐中，并在4°C下孵育过夜。使用 0.22 μm 注射器过滤器进行过滤。
- 将 0.4 克 L-阿斯酸和 80 mL ddH2O 混合，将 pH 调整到 3.8 以方便溶解，然后用水充值至 100 mL，从而准备 L-阿斯酸溶液。
- 第二天，从沃尔顿的领先优势开始，准备15 号。将 0.066 克硝酸铅与 10 mL L-阿斯酸溶液（点 8.1.10）混合预热至 60 °C，将 pH 值调整为 5.5（测量为 60 °C），1 M NaOH。用铅阿斯巴甜关闭小瓶，在60°C下在水浴中保持30分钟。解决方案应该清晰。如果变成多云，必须丢弃它，需要准备一个新的。
- 同时，用脱气的ddH2O清洗样品五次，每次3分钟。然后将它们放在 60 °C 的烤箱中 30 分钟。
- 将样品浸入新鲜制备的铅阿斯巴酸盐溶液中，在 60 °C 的烤箱中孵育 20 分钟。
- 用脱气的 ddH2O 清洗样品五次，每次 3 分钟。
- 脱水和树脂嵌入
- 准备环氧树脂。称量成分（33.3 克成分 A/M、33.3 克 B 组件和 1 克 D 组件），将树脂混合在一起（例如，在 15 mL 管中的旋转摇床上摇动）至少 30 分钟，然后加入 16 滴加速器 DMP 30。再搅拌10分钟。
注意：称量烟罩下的成分。这种成分量提供大约 60 mL 的树脂，对于 15 瓶样品来说已经足够了。您可以在 4 °C 的注射器中少准备或将其余树脂存储在注射器中，并在第二天使用。记得密封注射器的尖端。 - 准备小瓶与乙醇的分级稀释（30%，50%，70%，90%，100%，100%乙醇在水中和100%干燥的分子筛）。
- 将树脂与 100% 乙醇混合，比例为 1：1，获得 50% 树脂。混合好。
- 每次稀释乙醇时，从 30% 开始脱水 5 分钟，最后在分子筛上干燥 100% 无水乙醇。请记住，样品绝不能完全干燥。
- 先在 50% 树脂中渗透样品 30 分钟，然后在 100% 树脂中渗透一小时，然后在一夜之间再次在 100% 树脂中渗透。以持续缓慢的摇晃执行所有渗透步骤。
- 第二天，将样品放入新鲜的100%树脂中一小时，然后将它们嵌入氟聚合物嵌入片中。将嵌入片与乙醇的碎片分离，并平放将样品嵌入其中两层之间，使用两个玻璃幻灯片作为支撑。尽量避免在样品上或靠近样品的树脂中出现气泡。
- 在 70 °C 下将烤箱中的样品治疗至少 48 小时。
- 准备环氧树脂。称量成分（33.3 克成分 A/M、33.3 克 B 组件和 1 克 D 组件），将树脂混合在一起（例如，在 15 mL 管中的旋转摇床上摇动）至少 30 分钟，然后加入 16 滴加速器 DMP 30。再搅拌10分钟。
- 修剪和安装
- 单独嵌入纸张，用剃须刀刀片切割嵌入式样品（约 1 mm x 1 mm）的一部分。将其转移到副电影。这将最大限度地降低因静电而丢失样品的危险。
- 拿一个已经脱脂乙醇的铝针。混合导电环氧树脂井，并用少量环氧树脂将样品安装到销中。在 70 °C 下治疗导电环氧树脂 10 分钟。
- 用钻石刀修剪样品块的每一侧，然后擦亮块的表面，直到组织暴露。
注：在此步骤中，通过收集某些部分并执行甲苯蓝色染色16 或在电子显微镜下检查来确认感兴趣的区域的存在。 - 尽可能减少样品的大小。然后用导电漆将样品磨到针脚上并治愈（在室温下24小时或在烤箱中65°C下40分钟）。
- 为了尽量减少充电文物，溅溅涂上一层薄薄的黄金或黄金/铂金。
9. SBEM 成像
- 将带样品的引脚放入串行块面扫描电子显微镜的腔室中。将样品对齐到刀子上。关闭会议室并设置参数。
- 以所需的放大倍数、像素大小、切片厚度、加速电压 （EHT）、光圈、压力等收集一叠图像。
注：参数取决于样本和实验目标。材料表中包含典型的初始成像设置。
10.3D重建
注：对于下面提到的步骤，我们使用开放访问软件，例如斐济J 17（ImageJ版本1.49b）、显微镜图像浏览器（MIB）18和重建19，但可以使用各种其他软件。
- 将数字显微图 （dm） 文件转换为 TIFF 格式。首先导入图像序列（在斐济J： 文件>导入>图像序列>选择8位格式），然后保存为TIFF（在斐济： 文件>保存为>图像序列>选择蒂夫）。
- 调整图像堆栈的亮度和对比度（在斐济：图像>调整>亮度/对比度），并在必要时将其去名（使用 DenoisEM 插件为 FijJ20 ：插件>德诺塞姆> denoise）。
- 对齐堆栈（在斐济： 插件> StagReg 或 MIB：数据集>对齐工具）。
- 段状树突状脊柱和突触（在 MIB 或重建软件中，提供全面的教程（详情请参阅 材料表 ）。
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Representative Results
使用上述高对比度方法，可以获得小鼠脑组织的良好分辨率图像。SBEM 技术提供的大量视野有助于精确选择感兴趣的区域。海马CA1区域的大图像被采取测量地层径向（SR）的长度（图2A），并设置成像精确在中心（图2B）。接下来，获取了图像堆，并细分了感兴趣的对象，如树突、树突、突触的后合成密度（图2C，D）。
SBEM技术的使用使有可能分析相对较大的组织体积，并识别罕见的事件，如多内侧树突状脊柱（图2E）- 一种特定类型的突触，其特点是几个早产期终端接触相同的后突触脊柱21。
图2。小鼠海马CA1区域的树突脊椎。 小鼠海马 CA1 区域的代表图像。 地层拉迪亚图姆 （SR） 显示为白色箭头（A）。SR 中间的区域被选为成像（B）。用树突状脊柱重建一块树突（C）。在一卷组织（D）中重建树突状脊柱。重建多内侧树突脊柱（E）。显示两个接触相同后合成脊柱的早熟终端（以品红色和绿色表示）。 请单击此处查看此图的较大版本。
SBEM样品制备的介绍协议使我们能够获得具有高度对比膜的脑组织的高质量图像，从而更容易地分割和重建膜包围结构。PFA（图3B）浓度较高的标准固定和两步固定方法导致类似的组织形态（图3A）。
图3。形态细节。 使用这里介绍的协议，获得了高质量的图像，显示了突触囊泡、PSD和线粒体的形态。脑组织固定与两步法（A） 或标准固定（B）。缩放栏 2 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
结果是可重复的，这意味着每个使用这个协议准备的标本，不仅是脑组织，而且是培养细胞的单层，都进行了很好的对比。
使用温和的原位固定提供了机会，也使用组织免疫荧光研究涉及光显微镜。在PSD-95抗体的情况下，我们没有观察到用两步固定固定固定的样品（轻度初级和后继固定剂）和仅使用4%PFA的传统固定获得的样本（图4A 和 4B） 之间的免疫染色结果差异。
图4。与各种协议固定的样品中的PSD-95免疫荧光比较。 背海马CA1区 地层 半径膜层PSD-95免疫染色代表性微光谱仪。（A） 轻度初级固定后的焦图像，然后用标准固定剂固定后。（B） 标准后的焦图像，更强的固定性。刻度条：5 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
2010年10月，迪林克描述的主要NCMIR方法有许多变化。基本原则保持不变，但根据所研究的材料类型，将实施轻微更改。以前曾描述过，不同的树脂可用于嵌入标本的SBEM，例如在植物的情况下，Spurr的树脂是首选的，因为它的低粘度，允许更好地渗透通过细胞壁22，23。此外，各种缓冲可用于固定（例如，可可二甲酸酯缓冲液、HEPES 或磷酸盐缓冲器，以及不同浓度的谷胱甘肽（2-3%）和副甲醛（2-4%） 23、24、25、26、27、28）。使用丹酸来增强富含细胞外基质29或红铬的样品的染色，以改善植物材料的染色23，30是另一种可以使用的修正。就脱水而言，通常乙醇和/或丙酮推荐用于环氧树脂24，28。
此处描述的相同协议，或非常相似的协议，以前已被我们的团队和其他组4，5，24成功使用。根据此方法处理的样品与 TEM 成像31兼容。与 2010 年发布的原始 NCMIR 协议相比，我们引入了一些小的变化，例如在固定过程中更换有毒的可可硅酸盐缓冲器，以及用磷酸盐缓冲器在固定后步骤中更换镉。如上所述，EM 制备期间可以使用多种缓冲，根据我们的经验，无毒 PB 会产生令人满意的结果。
另一个变化是在脱水的最后一步用危害较小的乙醇代替丙酮。在嵌入过程中，乙醇也被用作树脂溶剂。此外，DMP-30被使用，而不是环氧树脂成分C，如在32，33之前发布。
由于需要使用相同的大脑进行免疫荧光研究，引入了两步固定方法。首先， 动物被灌注了含有较低浓度谷胱甘肽的缓冲剂（通过灌注与含有2%PFA和0.5%GA的缓冲剂进行轻度初级固定），之后只有一半的大脑致力于EM 进一步修复后，谷胱甘肽浓度较高（2%PFA和2.5%GA），而大脑的另一半被固定后，用标准固定剂进行免疫染色（4%PFA）。其他人和我们的第4、5、31、34组以前也发表过使用浓度较低的EM固定剂。这里提出的两步固定与传统的单步方法（图3和图4）一样充分。然而，由于我们建议大脑的每个半部分可以单独处理，我们的协议允许减少使用的动物数量。轻度原发性固定成功地保持了组织抗原性，使抗PSD-95蛋白的抗体能够进一步免疫荧光。然而，必须强调，我们方法的效用必须得到其他抗体的验证。
呈现的方法导致脑组织与清晰可见膜的高对比度图像。然而，值得一提的是，有相同的步骤容易失败，如任何其他SBEM样品制备方法，需要特别注意它们。组织形态本身的质量主要取决于灌注。这是一个关键步骤，因为只有成功的固定标本才能产生令人满意的结果。不幸的是，固定灌注受动物之间个体变异性的影响，因此图像的质量可能因动物而异。此外，在脱水期间，必须小心不要干燥标本：否则，样品将无法与树脂正确渗透。另一个重要方面是样品安装到引脚上。环氧树脂是非导电性的，因此它们在成像过程中积累电子，导致给伪影充电。为了降低 SBEM 中的充电效果，有必要小心地去除标本两侧的过量树脂，并使用银漆和溅射涂层准确接地。
目前的协议侧重于脑组织：然而，它可以适应细胞单层，有机细胞切片，或其他组织。与原始的 NCMIR 协议一样，此处介绍的样本具有高度对比性，不仅适合 SBEM，还适用于 FIB-SEM 和 ATUM-SEM 实验。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
SBEM成像、光显微镜成像和电子显微镜样品制备是利用作为Nencki实验生物学研究所成像核心设施的成像组织和功能实验室的设备进行的。
为了准备图1，使用了鼠标（Souris_02）和 https://smart.servier.com/ 小瓶的图像。
这项工作得到了国家科学中心（波兰）授予KR的赠款Opus（UMO-2018/31/B/NZ4/01603）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Fixatives: | |||
| Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
| Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade,  98%, pellets (anhydrous) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
| Perfusion: | |||
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
| Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
| Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
| Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
| Brain slices preparation for EM: | |||
| 12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
| Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
| Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
| Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
| Brain slices preparation for IF: | |||
| 96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
| Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
| Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
| Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
| Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
| Immunostaining: | |||
| 24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
| Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
| Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
| Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
| Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
| Electron microsocpy sample preparation | |||
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
| Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
| DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
| Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
| Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
| Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
| Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
| Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
| Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
| pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
| Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
| Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
| Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
| Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
| Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
| Specimen mounting for SBEM | |||
| 96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
| AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
| Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
| Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
| Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
| Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
| Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
| Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
| trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
| Software | webpage | tutorials | |
| FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
| Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| Animals | |||
| Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |
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