Summary
직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.
Abstract
3차원 전자 현미경 검사법(3D EM)은 나노 스케일 분해능을 사용하여 수지상 척추의 형태학적 파라미터를 분석할 수 있는 가능성을 제공합니다. 또한, 척추 및 시냅스 후 밀도(PSD)의 부피(시냅스 후 부분, 시냅스 후 부분), 프리시냅틱 단말의 존재, 부드러운 내시경 망상 또는 비정형 형태의 PSD(예를 들어, 다중 내압 스핀)와 같은 수지상 척추의 일부 특징은 EM3D로만 관찰될 수 있다. 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)를 채용함으로써 기존의 직렬 단면을 수행할 때보다 3D EM 데이터를 보다 쉽고 재현 가능한 방식으로 얻을 수 있다. 여기서 우리는 SBEM 분석을 위한 마우스 해마 견본을 준비하는 방법 및 이 프로토콜이 수지상 척추의 면역 형광 연구 결과와 어떻게 결합될 수 있는지 보여줍니다. 온화한 고정 관류는 우리가 두뇌의 반에 가벼운 현미경 검사법을 가진 면역 형광 연구를 능력을 발휘할 수 있게 하고, 나머지 반은 SBEM을 위해 준비되었습니다. 이 접근은 연구 결과에 사용될 동물의 수를 감소시킵니다.
Introduction
중추 신경계의 흥분 시냅스의 대부분은 수지상 척추에 위치합니다 - 신경 막의 작은 돌출. 이러한 돌출은 세포내 신호 변환을 제어하는 제한된 생화학 적 구획을 형성합니다. 수지상 척추 및 시냅스의 구조적 가소성은 학습 및 메모리1,2와 같은 중요한 과정의 기초가 되는 시냅스 효능의 기능적 변화와 밀접한 관련이있다. 전자 현미경 검사법(EM)은 수지상 척추에 사전 시냅스 입력이 있는지 확인할 수 있는 유일한 기술입니다. EM 해상도는 또한 시냅스의 포스트냅스 부분 또는 수지상 척추의 치수를 나타내는 포스트 냅스 밀도(PSD)의 모양과 같은 초구조적 세부 사항뿐만 아니라 축삭 부톤의 크기와 모양을 연구하는 데 필요합니다. 또한 EM을 사용하면 시냅스와 주변 환경을 시각화할 수 있습니다.
이미징 및 컴퓨팅 기술의 발전 덕분에 전체 신경 회로를 재구성할 수 있습니다. 직렬 단면 투과 전자 현미경 검사법(ssTEM), 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경검사(SBEM), 및 집중이온 빔 스캐닝 전자 현미경검사법(FIB-SEM)과 같은 부피 전자 현미경 기술은 일반적으로 뉴런 회로 재구성3에사용된다.
우리의 연구에서, SBEM 방법은 마우스 해마와 조직 뇌 슬라이스 4,5의샘플에서 수지상 척추와 PSDs의 구조적 가소성을 조사하기 위해 성공적으로 채택된다. SBEM은 스캐닝 전자 현미경 챔버6,7,8,9내부에 소형 초미세토메를 설치하는 것을 기반으로 한다. 샘플 블록의 상단은 이미지화되고, 샘플은 초미세토메에 의해 지정된 깊이로 절단되어 새로운 블록 면을 드러내며, 이는 다시이미지화된 다음 프로세스가 8반복된다. 그 결과, 절단된 슬라이스가 파편으로 손실되는 동안 블록 페이스의 이미지만 남게 됩니다. 그렇기 때문에 SBEM은 파괴적인 기술이라고 불리며, 이는 동일한 장소를 다시 이미지화할 수 없다는 것을 의미합니다. 그러나, 파괴적인 온블록 방법의 장점은 데이터 품질 및 데이터 분석3에크게 영향을 미칠 수 있는 뒤틀기 문제 및 절제손실로 인해 손해를 입지 않는다는 것이다. 또한, SBEM은 고해상도3에서상대적으로 넓은 시야(> 0.5mm × 0.5mm)를 이미지화할 수 있는 가능성을 제공한다.
SBEM을 사용하려면 이미지를 획득하는 데 사용되는 백산전자 검출기로 인해 전담적이고 대조적인 프로토콜에 따라 샘플을 준비해야 합니다. 1980년대8,11에서개발된 소슘-티오카르보히드라지데-오스뮴(rOTO) 얼룩을 사용하여 Deerinck10(국립 현미경 및 이미징 연구 센터(NCMIR) 방법에 의해 개발된 절차에 따라 시료 준비를 수행하는 방법을 여기에서 보여 준다. 또한 가벼운 현미경 검사법과 SBEM을 사용하여 면역 형광 연구에 동일한 뇌를 사용할 수있는 가벼운 고정 관류와 함께 2 단계 고정 접근 법을 소개합니다.
프로토콜에서 마우스 뇌는 주로 가벼운 고정제로 고정된 다음 반구로 절단한 다음, 한 반구는 면역 형광(IF)을 위해 포스트 고정 및 준비되고, 다른 하나는 EM 연구를 위한반면(그림 1).
그림 1. SBEM을 통해 분석을 위한 수지상 척추 준비에 대한 워크플로우의 회로도 표현. 마우스는 희생되고 온화한 1 차 고정으로 perfused되었습니다. 뇌는 반으로 절단되었고, 한 반구는 면역 형광 (IF)전용 고정, 냉동 보호, 극저온을 사용하여 슬라이스하고 IF 연구를 위해 처리되었으며, 다른 반구는 EM 고정으로 후징되고 진동체로 슬라이스되어 EM 연구를 준비했습니다. SBEM 연구를 위한 뇌 슬라이스는 대조되고, 수지에 평평한 내장, 해마의 CA1 부위가 핀에 장착되고, SBEM(도1)으로이미지되었다. 노란색 상자에 강조 표시된 프로토콜의 일부가 비디오에 등장했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
이 연구는 Nencki 연구소 지침 및 지역 윤리위원회의 허가에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 1986년 11월 24일 유럽 공동체 협의회 지침(86/609/EEC), 폴란드 동물 보호법 및 바르샤바 최초의 지역 윤리 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 사용된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
주의: 아래에 설명된 모든 절차는 실험실 연기 후드에서 수행해야 합니다. 사용 된 시약의 위험 특성으로 인해. 장갑, 실험실 코트, 안전 안경 및 얼굴 마스크와 같은 개인 안전 조치가 필요합니다.
1. 관류고정 제제 (2 % wt / vol para포름알데히드 (PFA) 및 0.5 % vol/vol 글루타랄데히드 (GA) 0.1 M 인산염 버퍼 (PB), pH 7.4)
참고: 고정 솔루션을 사용하는 것과 같은 날에 준비하고 3시간 이상 보관하지 않습니다. 시간 부족의 경우, 전날 0.1 M PB로 2 % PFA를 준비하고 4 ° C에 저장하고 관류 직전에 신선한 GA를 추가하십시오.
- 멸균 이중 증류수(ddH2O)의400mL를 넣고 교반 핫 플레이트를 사용하여 60°C로 가열합니다. 그런 다음 PFA 20g을 추가합니다. PFA가 완전히 용해될 때까지 1M NaOH방울을 넣고 혼합물을 식힙니다.
- 0.2M PB(pH 7.4)의 500mL를 추가합니다.
- 용액을 필터링하여 모든 보증금을 제거하고 4 °C로 냉각시하십시오.
- 관류 직전에 20mL의 25% GA를 솔루션에 추가한 다음 ddH2O ~ 1 L로 볼륨을 위로 합니다.
2. SBEM에 대한 사후 주입 고정 준비 (2 % wt / vol PFA 및 0.1 M PB, pH 7.4에서 2.5 % vol/vol GA)
- 관류에 대한 고정의 50 mL을 가져 가라 (2 % PFA 와 0.5 % GA 0.1 M PB).
- 25% GA의 5mL를 추가합니다.
3. IF 염색에 대한 사후 주입 고정 준비 (인산염 완충식염 (PBS)에서 4 % PFA)
- 제조업체 지침에 따라 정제 및 탈이온 수(H2O)에 1x PBS(pH 7.4)의 정제를 용해하십시오.
- 교반 핫 플레이트를 사용하여 용액을 60°C로 가열하고 PFA 40g을 추가합니다.
- PFA가 완전히 용해될 때까지 1M NaOH 방울을 추가하고 혼합물이 식힙니다.
- 솔루션의 pH를 1M HCl로 7.5로 조정한 다음 H2O에서 1L로 볼륨을 위로 합니다.
- 솔루션을 필터링하여 침전물을 제거합니다.
4. 동물의 카피얼 관류
참고: 모든 PFA 및 GA 폐기물은 현지 규정에 따라 폐기를 위해 수거및 보관해야 합니다. 마취와 관류는 현지 규정을 따라야합니다. 기술된 프로토콜에서 성인 3개월 및 20±1개월 된 여성 Thy1-GFP(M) 마우스(Thy1-GFP +/-)12개의 청색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 글루타미터기뉴뉴런의 드문 분산 된 집단에서 사용되었지만 다른 어떤 것도 사용할 수 있다. 동물은 실험 생물학의 Nencki 연구소의 동물 집에서 C57BL / 6J 배경과 이종고로 사육되었다.
- 관류 마취 전에 케타민/자일라진 혼합물(최대 90 mg/kg 체중 케타민 및 10 mg/kg 체중 자일라진)을 관류 주사(27게이지 바늘)를 통해 마우스를 투여하여 마우스를 마취한다.
- 통증 자극 (꼬집기)과 각막 반사 (가늘게 뜨는)에 반사를 확인하여 마취의 깊이가 충분한지 여부를 평가합니다.
- 20 분 후 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg 체중)의 관면 주사 (27 게이지 바늘)를 수행합니다.
- 게이지 외13에 의해 기술된 관류 수술 프로토콜에 따라 마우스를 퍼퓨즈(참조점 4; 그림 5-6). 관류 펌프를 사용하여 0.1 M 인산염 버퍼로 시작하여 3분 동안 pH 7.4(30mL)로 시작하여 0.1M PB에서 2% PFA 및 0.5% GA, 6분 동안 pH 7.4(80mL)로 계속된다.
- 두개골에서 뇌를 부드럽게 해부하고 반으로 나눕니다 (게이지 외, 201213에서그림 9-10 참조). 1피스를 SBEM용 고정제가 함유된 유리병에 넣고 두 번째 조각을 바이알에 4% PFA/PBS로 바이알에 넣고 IF 염색을 합니다.
- 하룻밤 사이에 4 °C에서 고정에 반구를 유지합니다.
5. 전자 현미경 검사에 대한 뇌 슬라이스 준비
- 진동 설정(블레이드 이동 속도: 0.075 mm/s, 절단 주파수: 80Hz)을 선택합니다.
- 슬라이스 챔버를 홀더에 넣고 진동에 부착하여 얼음으로 둘러싸습니다. 그런 다음 면도날을 진동 블레이드 홀더에 넣습니다.
- 숟가락, 또는 유사한 물체를 사용하고 단단한 절단 표면 (예 : 유리 페트리 접시 뚜껑)에 차가운 뇌 (등색 을 위로 올려 놓습니다). 해마의 관상 동맥 조각을 준비하려면 대뇌 반구와 면도날이나 메스로 소뇌 사이의 수직 절단을 하여 소뇌를 제거합니다. 후각 전구도 제거할 수 있습니다.
- 진동의 건조 플랫폼에 시아노아크라일트 접착제를 적용합니다.
- 집게로 뇌를 집어 들고 필터 용지에 조심스럽게 말리십시오.
- 반구를 커팅 블레이드 에 가까운 플랫폼에 접착하여 장밋빛 팁을 위쪽으로 감습니다. 플랫폼을 홀더에 부착하고 즉시 얼음 차가운 0.1 M PB, pH 7.4로 채웁니다. 수직 절단이 제대로 이루어지면 반구는 해마를 포함하는 대칭 코로나절단을 만드는 데 필요한 90° 각도를 똑바로 세게 됩니다. 뇌가 PB로 덮여 있는지 확인하십시오.
- 반구 앞에 진동 블레이드를 배치하고 반구의 관상 측으로 낮춥다. 칼날을 400 μm로 낮추고 슬라이스를 시작합니다. 처음 두 조각이 조직 블록에서 완전히 분리될 때까지 계속 슬라이스합니다.
- 블레이드를 철회하고 다른 100 μm을 낮추고 다시 슬라이스합니다.
- 해마가 보이면 (마우스 뇌 아틀라스 팍시노스와 프랭클린, 200414)을사용하여 작은 페인트 브러시 또는 확장 된 플라스틱 파스퇴 피펫으로 조각을 수집합니다.
- 차가운 0.1 M PB, pH 7.4로 채워진 12웰 플레이트로 슬라이스를 옮춥시다.
- 0.1 M PB로 채워진 유리 페트리 접시에 해마를 해부하고, 면도날이나 메스를 사용하여 pH 7.4를 하고, 동일한 인산염 버퍼가 있는 유리 바이알에 넣습니다.
참고: 슬라이스의 장기 보관을 위해 0.05%의 아지드 나트륨(NaN3)으로0.1 M PB를 보충합니다.
6. 면역 염색을위한 뇌 샘플 준비
- 연기 후드에 4% PFA/PBS 용액에 하룻밤 고정 후, 냉동 보존 용액에 뇌 조직을 넣어 (30% 0.05% NaN3PBS에서자당) 2 일 동안 4 °C에서 유지 (침몰 까지).
- 부동액용액(15% 자당/30% 에틸렌 글리콜/0.05%NaN 3/PBS)을 준비한다.
- -19°C에서 저온의 캐비닛 온도를 설정하고 더 진행하기 전에 온도에 도달했는지 확인합니다. 단면 동안 캐비닛 온도가 -18 °C와 -20 °C 사이에 남아 있는지 확인하십시오.
- 숟가락, 또는 유사한 물체를 사용하고 단단한 절단 표면 (예 : 유리 페트리 접시 뚜껑)에 차가운 뇌 (등색 을 위로 올려 놓습니다). 해마의 관상 동맥 조각을 준비하려면 대뇌 반구와 면도날이나 메스로 소뇌 사이의 수직 절단을 하여 소뇌를 제거합니다.
- 미리 냉각된 시편 디스크를 선택하고, 프리선반에서 동결을 위한 매체로 덮고, 집게를 사용하여 반구를 위로 로스트랄 팁으로 디스크에 고정하고 시편이 완전히 얼어 붙을 때까지 기다립니다. 표본 디스크를 시편 헤드에 삽입합니다.
- 냉동실 내부에 블레이드 홀더에 블레이드를 설치하고 40 μm 두께의 슬라이스를 잘라냅니다.
- 작은 페인트 브러시로 슬라이스를 차가운 동결 용액으로 채워진 96 웰 플레이트로 옮기고 섹션을 부드럽게 풀어 냅니다 (슬라이스 챔버에서 길을 잃지 않도록 슬라이스의 각 라운드 후 슬라이스를 수집하십시오).
참고: 뇌 또는 단면은 장시간 -20°C의 부동액용액에 보관할 수 있습니다.
7. 뇌 슬라이스의 면역 염색
참고: 모든 염색 단계는 플랫폼 셰이커의 24웰 플레이트에서 수행되었습니다.
- PBS로 슬라이스를 3회, 매번 6분간 세척합니다.
- 300μL의 블로킹 용액(일반 당나귀 혈청(NDS)/0.3% 트리톤 X-100)에서 1시간 동안 슬라이스를 배양하여 회전기에서 부드럽게 흔들어 보입니다.
- PSD-95에 대한 1차 항체로 슬라이스를 5% NDS/0.3% 트리톤 X-100/PBS(웰당 300 μL)에서 4°C에서 희석하였다. 1차 항체의 최종 농도는 2 μg/mL이다.
- 실온(RT)에서 0.3% 트리톤 X-100/PBS로 슬라이스를 3회, 6분간 세척합니다.
- 이차 항체를 가진 배양 한 슬라이스는 0.3 % Triton X-100 / PBS의 300 μL에서 90 분 동안 희석되었습니다. 이차 항체의 최종 농도는 4 μg/mL이다.
- PBS로 슬라이스를 3회, 매번 6분간 세척합니다.
- 마운팅 매체를 사용하여 슬라이드에 슬라이스를 장착한 다음 커버 슬라이드로 닫습니다.
- 공초점 현미경(63× 오일 목표, NA 1.4, 픽셀 크기 0.13 μm × 0.13 μm)를 사용하여 표본을 검사합니다.
참고: 장기 보관: 샘플을 4°C로 유지하여 빛으로부터 보호합니다.
8. SBEM 샘플 준비
주의: 아래 설명된 모든 절차를 사용한 시약의 위험성으로 인해 실험실 연기 후드에서 수행해야 합니다. 이러한 화학 물질을 사용하기 전에 제조업체가 제공하는 재료 안전 데이터 시트를 주의 깊게 읽고 안전 처리 및 폐기물 처리를 보장하기 위해 현지 규칙에 대해 안전 담당자에게 문의하십시오.
- 샘플 대비
참고: 슬라이스 세척 및 실온 배양은 가벼운 흔들림(예: 플랫폼 셰이커)으로 수행해야 합니다. 오토클레이브 탈가스물이 사용되었습니다.- 차가운 0.1 M PB, pH 7.4 5회, 매번 3분간 슬라이스를 씻으시다.
- 1:1 혼합물을 수성 오스뮴 테트산화물 4% 및 3% 칼륨 페로시아니드(1:1 바이 vol)를 준비한다. 최종 제품은 갈색으로 바뀝니다. 이 혼합물에 샘플을 담그고 얼음 위에 놓고, 이 단계에서부터 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 1 시간 동안 부드러운 흔들림으로 그들을 인큐베이션하십시오.
- 한편 티오카르보히드라지드(TCH) 용액을 준비한다. 10mL의 이중 증류H 2O(ddH2O)와0.1 g의 TCH를 넣고 1시간 동안 60°C로 설정된 오븐에 넣습니다. 수시로 솔루션을 소용돌이치는 것이 중요합니다(예: 10분마다). 준비가 되면 실온으로 식힙니다.
- 3 분 동안 매번 ddH2O 5 번 슬라이스를 씻으시면 됩니다.
- 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 TCH 용액을 필터링하고 여과 된 용액에 샘플을 담그면 됩니다. 슬라이스가 검은색으로 바뀝니다. 실온에서 20분 동안 배양하십시오.
- 샘플을 ddH2O 5회, 매번 3분간 세척합니다.
- 실온에서 30분 동안 OsO4의 2% 수성 용액으로 샘플을 배양합니다.
- 샘플을 ddH2O 5회, 매번 3분간 세척합니다.
- 샘플을 여과된 1% 수성 우란 아세테이트에 놓고 하룻밤 사이에 4°C에서 배양합니다. 여과에 0.22 μm 주사기 필터를 사용합니다.
- L-아스파르산 0.4g과 ddH2O80mL을 혼합하여 L-아스파르산 용액을 준비하고 pH를 3.8로 조정하여 용해한 다음 물을 100mL까지 위로 올려다보십시오.
- 다음 날, 월튼의 리드 인분으로 시작15 준비. 납 질산 10mL(점 8.1.10)를 60°C로 미리 데워지고 pH를 5.5(60°C로 측정)로 조정하여 1M NaOH로 조정합니다. 유리병을 납으로 닫고 수조에서 30 분 동안 60 °C로 둡니다. 해결책은 분명해야 합니다. 흐린 경우 폐기해야 하며 새 것을 준비해야 합니다.
- 그 동안, 3 분 동안 매번, 탈가스 ddH2O 5 번 샘플을 세척. 그런 다음 오븐에 60 °C로 30 분 동안 보관하십시오.
- 새로 준비된 납 아스파트에 이액에 샘플을 담그고 60°C로 설정된 오븐에서 20분 동안 배양합니다.
- 3 분 동안 매번 탈가스 ddH2O 5 번 으로 샘플을 씻으시면됩니다.
- 탈수 및 수지 포함
- 에폭시 수지 준비. 성분(성분 A/M 33.3g, 성분 B 33.3g, 성분 D 1g)의 무게를 측정하고 수지 웰(예: 15mL 튜브에서 로터리 셰이커에 흔들어) 16방울의 가속기를 추가하기 전에 30분 이상 섞는다. 다시 10분간 저어줍니다.
참고 : 연기 후드 아래에 재료를 무게. 이 양의 구성 요소는 샘플이있는 15 개의 바이알에 충분한 약 60 mL의 수지에게 제공합니다. 당신은 덜 준비하거나 4 ° C에서 주사기에 수지의 나머지 부분을 저장하고 다음 날 그것을 활용할 수 있습니다. 주사기의 끝을 밀봉하는 것을 기억하십시오. - 에탄올의 등급 희석으로 바이알을 준비하십시오 (30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 물에 100% 에탄올, 분자 체에서 100% 건조).
- 수지와 1:1 비율로 수지와 섞어 50%의 수지를 얻습니다. 잘 섞으세요.
- 에탄올의 각 희석에서 5분 동안 시료를 탈수하여 30%에서 시작하여 분자 체에서 건조된 100% 무수성 에탄올로 끝납니다. 샘플이 완전히 건조해서는 안됩니다.
- 샘플을 30분 동안 50% 수지에서 먼저 침투한 다음 1시간 동안 100% 수지로, 그리고 하룻밤 사이에 100% 수지로 다시 침투합니다. 일정한 느린 흔들림으로 모든 침투 단계를 수행합니다.
- 다음 날, 샘플을 1시간 동안 신선한 100% 수지에 넣은 다음 불소 중합체 포함 시트 사이에 포함시됩니다. 에탄올이 내장된 시트조각을 데그리스화하고, 두 개의 유리 슬라이드를 지지로 사용하여 샘플을 두 겹 사이에 평평하게 포함시합니다. 수지 또는 샘플 에 가까운 기포를 피하십시오.
- 오븐에서 적어도 48시간 동안 70°C에서 샘플을 치료합니다.
- 에폭시 수지 준비. 성분(성분 A/M 33.3g, 성분 B 33.3g, 성분 D 1g)의 무게를 측정하고 수지 웰(예: 15mL 튜브에서 로터리 셰이커에 흔들어) 16방울의 가속기를 추가하기 전에 30분 이상 섞는다. 다시 10분간 저어줍니다.
- 트리밍 및 마운팅
- 포함 시트를 분리하고 임베디드 샘플(약 1mm x 1mm)의 조각을 면도날로 잘라냅니다. 파라필름으로 전송합니다. 이렇게 하면 정전기로 인해 시료를 잃을 위험이 최소화됩니다.
- 에탄올로 탈그리된 알루미늄 핀을 가져 가라. 전도성 에폭시를 잘 섞고 약간의 양을 사용하여 샘플을 핀에 장착하십시오. 전도성 에폭시를 70°C에서 10분간 치료합니다.
- 샘플 블록의 각 면을 다이아몬드 나이프로 잘라낸 다음 조직이 노출될 때까지 블록의 얼굴을 연마합니다.
참고: 이 단계에서, 일부 섹션을 수집하고 toluidine 파란색 염색16을 수행하거나 전자 현미경으로 확인하여 관심 영역의 존재를 확인합니다. - 시료의 크기를 가능한 한 줄입니다. 그런 다음 시료를 전도성 페인트로 핀에 접고 치료하십시오 (실온에서 24 시간 동안 또는 오븐에서 65 °C에서 40 분 동안).
- 충전 아티팩트를 최소화하기 위해 스퍼터는 얇은 골드 층또는 골드/팔라듐으로 샘플을 코팅합니다.
9. SBEM 이미징
- 시리얼 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경의 챔버에 샘플핀을 놓습니다. 샘플을 칼에 정렬합니다. 챔버를 닫고 매개 변수를 설정합니다.
- 원하는 배율, 픽셀 크기, 슬라이스 두께, 가속 전압(EHT), 조리개, 압력 등에서 이미지 스택을 수집합니다.
참고: 매개 변수는 샘플과 실험의 목표에 따라 달라집니다. 예시적인 초기 이미징 설정은 재료 테이블에 포함되어 있습니다.
10.3D 재건축
참고: 아래에 언급된 단계에 대해서는 피지J17(ImageJ 버전 1.49b), 현미경 이미지 브라우저(MIB)18 및 재구성19와 같은 오픈 액세스 소프트웨어를 사용하지만 다양한 다른 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
- 디지털 마이크로그래프(Dm) 파일을 TIFF 형식으로 변환합니다. 먼저 이미지 시퀀스를 가져 와서 (피지에서: 파일 > 가져오기 > 이미지 시퀀스를 선택 > 8 비트 포맷)다음 TIFF로 저장 (피지에서: 파일 > > 이미지 시퀀스로 저장 > 티프를 선택).
- 이미지 스택의 밝기와 대비를 조정 (피지J에서: 이미지 > 밝기 / 대비를 > 조정)및, 필요한 경우, 디노이즈 (FijJ20에 대한 DenoisEM 플러그인 사용 : 플러그인 > DenoiseEM > Denoise).
- 스택정렬 (피지J에서: 플러그인 > StagReg 또는 MIB: 데이터 셋 > 정렬 도구).
- 세그먼트 수지상 척추 및 시냅스(MIB 또는 재구성 소프트웨어에서는 포괄적인 자습서를 사용할 수 있습니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
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Representative Results
상기 높은 대비를 기재한 방법을 이용하여 마우스 뇌 조직의 좋은 해상도 이미지를 얻을 수 있다. SBEM 기술이 제공하는 넓은 시야는 관심 영역을 정확하게 선택할 수 있도록 합니다. 해마의 CA1 영역의 큰 이미지는 층 라디툼(SR)(도 2A)의 길이를 측정하고, 중앙(도2B)에서정밀하게 이미징을 설정하도록 촬영하였다. 다음으로, 이미지의 스택을 획득하고 점선, 수지상 척추, 시냅스의 포스트 냅스 밀도와 같은 관심있는 개체가 분할되었다(도2C,D).
SBEM 기술의 사용은 비교적 많은 양의 조직을 분석하고 다중 내적 수지상척추(그림 2E)와같은 희귀 한 사건을 인식 할 수있는 가능성을 제공합니다 - 동일한 포스트 냅틱 척추(21)에접촉하는 여러 사전 시냅스 단말이 특징인 특정 유형의 시냅스.
그림 2. 마우스 해마 CA1 지역에서 수지상 척추. 마우스 해마 CA1 영역의 대표적인 이미지. 지층 라디툼(SR)은 흰색화살표(A)로표시됩니다. SR의 중간에 있는 지역은 화상 진찰(B)를위해 선택되었습니다. 수지상 척추(C)와함께 원점원 조각의 재구성. 조직의 부피(D)에서수지상 척추의 재구성. 다중 내면의 수지상 척추(E)의재구성. 동일한 포스트냅틱 척추에 접촉하는 두 개의 사전 시냅틱 단말이 표시됩니다(마젠타 및 녹색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SBEM 샘플 준비를 위한 제출된 프로토콜은 우리가 무겁게 대조되는 막으로 두뇌 조직의 고품질 심상을 얻을 수 있었습니다, 이는 쉽게 분할및 막 포위구조물의 재건을 가능하게 합니다. PFA(도3B)와2단계 고정 접근법의 높은 농도를 가진 표준 고정은 유사한 조직 형태(도 3A)를초래했다.
그림 3. 형태학적 세부 사항. 여기에 제시 된 프로토콜의 사용으로 시 냅 스 소포의 형태를 보여주는 좋은 품질의 이미지, PSD와 미토 콘 드리아를 얻었다. 2단계접근법(A)또는 표준고정(B)으로고정된 뇌 조직. 배율 막대 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
결과는 재현할 수 있습니다, 이 프로토콜을 사용하여 준비된 모든 견본이 두뇌 조직 뿐 아니라 또한 배양된 세포의 단층이었다는 것을 의미합니다, 잘 대조되었다.
온화한 1 차 고정의 사용은 가벼운 현미경을 관련시키는 면역 형광 연구를 위해 또한 조직을 사용하는 기회를 제공합니다. PSD-95 항체의 경우, 우리는 2단계 고정(온화한 1차 및 전통적인 고정을 이용한 다음 이차)으로 고정된 시료 들 사이의 면역스테인링 결과의 차이를 관찰하지 않았고, 4% PFA만으로 전통적인 고정을 사용하여 얻은샘플(그림 4A 및 4B).
그림 4. 다양한 프로토콜로 고정된 샘플에서 PSD-95 면역 형광의 비교. 등쪽 해마에서 CA1 영역의 층 라디엄 층에서 PSD-95 면역 염색의 대표적인 마이크로 사진. (A)온화한 1차 고정 후 공초점 이미지, 표준 고정을 통해 사후 고정이 뒤따릅니다. (B)표준 후 공초점 이미지, 강한 고정. 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
2010 년10에서Deerinck에 의해 설명 된 기본 NCMIR 방법의 많은 변형이 있습니다. 기본 원칙은 동일하게 유지되지만 연구된 자료유형에 따라 약간의 변화가 구현됩니다. 이전에는 상이한 수지가 SBEM용 시편을 포함시키는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 식물의 경우, Spurr's는세포벽(22,23)을통해 더 나은 침투를 허용하는 낮은 점도로 인해 선택의 수지이다. 더욱이, 다양한 완충액은 고정(예를 들어, 카코딜레이트 완충, HEPES, 또는 인산염 완충제뿐만 아니라 글루타랄데히드(2-3%) 및 파라포름알데히드(2-4%)23,24,25,26,27,28)의상이한 농도를 적용할 수 있다. 식물 재료의 염색을 개선하기 위해 세포외 매트릭스(29) 또는 루테늄 레드가 풍부한 시료의 염색을 향상시키기 위해 탄닌산을 사용하는것은 또다른 개정이다. 탈수에 관한 한 일반적으로 에탄올 및/또는 아세톤은 에폭시 수지24,28에권장됩니다.
여기에 설명된 것과 동일한 프로토콜, 또는 매우 유사한, 성공적으로 우리 팀과 다른 그룹에 의해 이전에 사용되었습니다4,5,24. 이 방법에 따라 처리된 샘플은 TEM이미징(31)과호환된다. 2010년10년에 발표된 원래 NCMIR 프로토콜과 비교하여, 인산염 버퍼를 장착한 고정 및 osmium 후 고정 단계에서 독성 코코디레이트 버퍼의 교체와 같은 사소한 변경 사항을 소개합니다. 위에서 언급했듯이 EM 준비 중에 다양한 버퍼를 사용할 수 있으며, 우리의 경험에 따르면 무독성 PB는 만족스러운 결과를 제공합니다.
또 다른 변화는 탈수의 마지막 단계 동안 덜 사용자 유해한 에탄올아톤의 교체입니다. 에탄올은 또한 임베딩 공정 중에 수지 용매로 사용되었다. 더욱이, DMP-30은32,33전에 발표된 에폭시 수지 성분 C 대신 사용되었다.
면역형광 연구에 동일한 뇌를 사용해야 하기 때문에 2단계 고정 접근법이 도입되었다. 첫째, 동물은 글루타랄데히드의 낮은 농도를 포함하는 완충제로 침투했다 (포함 버퍼와 관혈에 의해 온화한 기본 고정 2% PFA 와 0.5% GA) 그 후 전념 뇌의 절반만 EM은 글루타랄데히드(PFA 2% 및 2.5% GA)의 고농도로 추가로 후진되었고, 나머지 절반은 면역염색에 대한 표준 고정(4% PFA)으로 대체되었다. PFA의 낮은 농도와 EM 고정의 사용은 다른 사람과 우리 그룹에 의해 전에 발표되었다4,5,31,34. 여기에 제시된 2단계 고정은 전통적인 1단계접근법(도 3 및 도 4)만큼충분합니다. 그러나, 우리는 두뇌의 각 반을 개별적으로 처리할 수 있다는 것을 건의하기 때문에, 우리의 프로토콜은 사용된 동물의 수를 감소시킬 수 있습니다. 온화한 1 차 고정은 성공적으로 조직 항원성을 유지, PSD-95 단백질에 대한 항체에 대해 입증 된 바와 같이 추가 면역 형광을 가능하게. 그러나 우리의 접근 방식의 유용성은 다른 항체에 대해 검증되어야 한다는 점을 강조해야 합니다.
제시된 방법은 명확하게 보이는 막을 가진 두뇌 조직의 높은 대비 심상을 초래합니다. 그러나 SBEM 샘플 준비의 다른 방법의 경우와 같이 실패하는 경향이 있는 동일한 단계가 있으며 특별한 주의를 기울여야 한다는 점은 언급할 가치가 있습니다. 조직 형태 자체의 품질은 주로 관류에 달려 있습니다. 성공적으로 고정된 표본만이 만족스러운 결과를 제공하기 때문에 중요한 단계입니다. 불행히도, 고정 관류는 동물 간의 개별 적인 가변성에 의해 영향을 받습니다, 따라서 이미지의 질은 한 동물에서 다른 에 다를 수 있습니다. 또한 탈수 중에 시편을 건조시키지 않도록 주의해야 합니다. 그렇지 않으면 샘플이 수지와 함께 제대로 침투하지 않습니다. 또 다른 중요한 측면은 핀에 샘플 장착입니다. 에폭시 수지는 비전도성이므로 충전 아티팩트의 원인을 이미징 하는 동안 전자를 축적합니다. SBEM의 충전 효과를 줄이기 위해 시편 의 모든 면에서 과도한 수지를 조심스럽게 제거하고 은 페인트 및 스퍼터 코팅으로 샘플을 정확하게 접지해야합니다.
현재 프로토콜은 뇌 조직에 초점을 맞추고; 그러나 셀 단층, 조직화 조각 또는 기타 조직에 맞게 조정할 수 있습니다. 원래 NCMIR 프로토콜과 마찬가지로 여기에 제시된 샘플은 SBEM뿐만 아니라 FIB-SEM 및 ATUM-SEM 실험에도 적합한 매우 대조되는 샘플을 생성합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
SBEM 이미징, 가벼운 현미경 이미징 및 전자 현미경 샘플 제제는 Ncki 실험 생물학 연구소의 이미징 코어 시설로 작용하는 이미징 조직 및 기능 실험실의 장비를 사용하여 수행되었습니다.
도 1의 준비를 위해, 마우스(Souris_02)의 이미지와 https://smart.servier.com/ 바이알이 사용되었다.
이 작품은 국립 과학 센터 (폴란드) 그랜트 오푸스 (UMO-2018/31/B /NZ4/01603)에 의해 지원되었다 KR에 수여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Fixatives: | |||
| Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
| Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade,  98%, pellets (anhydrous) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
| Perfusion: | |||
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
| Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
| Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
| Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
| Brain slices preparation for EM: | |||
| 12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
| Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
| Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
| Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
| Brain slices preparation for IF: | |||
| 96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
| Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
| Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
| Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
| Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
| Immunostaining: | |||
| 24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
| Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
| Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
| Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
| Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
| Electron microsocpy sample preparation | |||
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
| Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
| DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
| Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
| Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
| Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
| Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
| Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
| Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
| pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
| Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
| Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
| Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
| Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
| Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
| Specimen mounting for SBEM | |||
| 96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
| AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
| Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
| Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
| Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
| Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
| Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
| Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
| trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
| Software | webpage | tutorials | |
| FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
| Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| Animals | |||
| Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |
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