Este protocolo presenta los pasos tomados para diseccionar los ovarios en las planarias de agua dulce, Schmidtea mediterranea. Los ovarios disecados son compatibles para la inmunotinción de anticuerpos y el análisis ultraestructural con microscopía electrónica de transmisión para estudiar la biología celular de los ovocitos y las células somáticas, proporcionando una profundidad y calidad de imagen que antes eran inaccesibles.
El acceso a las células germinales permite el estudio del desarrollo, la meiosis y la recombinación de las células germinales. El biotipo sexual de la planaria de agua dulce, Schmidtea mediterranea, es un potente modelo de invertebrado para estudiar la especificación epigenética de las células germinales. A diferencia del gran número de testículos y células germinales masculinas, los ovocitos planarios son relativamente difíciles de localizar y examinar, ya que solo hay dos ovarios, cada uno con 5-20 ovocitos. La localización más profunda dentro del cuerpo planario y la falta de tejidos epiteliales protectores también dificultan la disección directa de los ovarios planarios.
Este protocolo utiliza un breve paso de fijación para facilitar la localización y disección de los ovarios planarios para el análisis posterior para superar estas dificultades. El ovario disecado es compatible para el examen ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) e inmunotinción de anticuerpos. La técnica de disección descrita en este protocolo también permite experimentos de perturbación génica, en los que se examinan los ovarios en diferentes condiciones de ARN de interferencia (ARNi). El acceso directo a las células germinales intactas en el ovario logrado por este protocolo mejorará en gran medida la profundidad y la calidad de las imágenes y permitirá la interrogación celular y subcelular de la biología de los ovocitos.
La anatomía de las planarias se ha examinado mediante el uso de TEM en muchos tejidos 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, se ha prestado poca atención a los ovarios o los ovocitos. La escasez de literatura sobre ovocitos se debe en parte a la dificultad de acceder a estas células, lo que deja la biología de los ovocitos planarios en gran medida inexplorada. Las herramientas moleculares han descubierto muchos mecanismos reguladores del desarrollo de los ovarios en las planarias utilizando microscopía de luz o fluorescencia 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Todos estos experimentos se realizaron en gusanos enteros o en secciones histológicas de gusanos enteros. Los protocolos de tinción de anticuerpos e hibridación in situ en gusanos enteros implican extensos pasos de blanqueo, lavado y limpieza de tejidos, que requieren mucho tiempo y llevarán varios días.
El objetivo general del método descrito aquí es proporcionar acceso a ovarios y ovocitos planarios intactos y disecados, lo que eliminará la necesidad de blanqueamiento o corte histológico y acortará el tiempo para el lavado y la limpieza del tejido en la tinción de anticuerpos y la hibridación in situ. Los ovarios disecados también mejorarán la penetración de la sonda o los anticuerpos y aumentarán la profundidad y la calidad de las imágenes para los microscopios ópticos y electrónicos. La accesibilidad a los ovarios y ovocitos disecados permite la investigación en biología celular a resolución celular y subcelular con ovocitos enteros intactos. Un estudio reciente sobre ovarios planarios disecados caracterizó por primera vez la meiosis de ovocitos planarios con TEM y microscopía confocal21. El trabajo proporcionó una descripción completa de un nuevo fenómeno durante la meiosis llamado vesiculación de la envoltura nuclear.
Aquí, presentamos los procedimientos detallados en la disección de ovarios planarios. Un paso de fijación fue suficiente para preservar la estructura de las células del ovario para la disección y la manipulación posterior (es decir, el procesamiento para el análisis de TEM y microscopio óptico). Dada su similitud en los planes corporales y la arquitectura de los tejidos, este protocolo también debería ser ampliamente informativo para el estudio de los ovocitos y sus núcleos en varias otras especies de Platyhelminthes (por ejemplo, el género Dugesia o Polycelis). Este protocolo es probablemente irrelevante para Macrostomum lignano por su pequeño tamaño y su arquitectura corporal casi transparente, lo que permitirá la observación directa del ovario y los ovocitos 22,23,24. El área del cuerpo que contiene los ovarios es más distinguible ópticamente (p. ej., pigmentación más oscura o pigmentación más clara) en algunas especies (p. ej., Dugesia ryukyuensis 9,25) que en S. mediterranea. Los estudios en estas especies pueden basarse menos en las pautas para la localización de los ovarios en S. mediterranea presentadas aquí, sino aprovechar las condiciones de fijación y disección.
Estos procedimientos basados en la fijación para la disección de ovarios planarios facilitarán la comprensión de la meiosis de los ovocitos, así como el desarrollo y la regeneración de los ovarios. El tamaño de los ovocitos y sus células somáticas de soporte puede oscilar entre 20 μm y 50 μm. Los métodos basados en la disección proporcionarán accesibilidad a las células intactas de un solo ovario que los métodos basados en el corte o en la montura completa no pueden logra…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo contó con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes (LK y ASA) y la Fundación Helen Hay Whitney (LHG).
Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito en el Repositorio de Datos Originales de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM grade |
2% aqueous OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19152 | |
50% glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | EM grade |
Digital Micrograph | Gatan Inc. | Version 2.33.97.1, TEM data collection | |
Epon resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin |
Ethanol | Ted Pella | 19207 | Denatured |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Horse serum | Sigma | H1138 | |
Lead Acetate | Electron Microscopy Sciences | 6080564 | |
MilliQ water | reverse-osmosis treated water | ||
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | |
Parafilm | sigma | P7793 | |
Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | |
Propylene oxide | Electron Microscopy Sciences | 75569 | EM grade |
Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
Toluidine blue O | Electron Microscopy Sciences | 92319 | |
Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit BioTWIN | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 541093 |