Summary

Disección de ovario planario para análisis ultraestructural y tinción de anticuerpos

Published: September 10, 2021
doi:

Summary

Este protocolo presenta los pasos tomados para diseccionar los ovarios en las planarias de agua dulce, Schmidtea mediterranea. Los ovarios disecados son compatibles para la inmunotinción de anticuerpos y el análisis ultraestructural con microscopía electrónica de transmisión para estudiar la biología celular de los ovocitos y las células somáticas, proporcionando una profundidad y calidad de imagen que antes eran inaccesibles.

Abstract

El acceso a las células germinales permite el estudio del desarrollo, la meiosis y la recombinación de las células germinales. El biotipo sexual de la planaria de agua dulce, Schmidtea mediterranea, es un potente modelo de invertebrado para estudiar la especificación epigenética de las células germinales. A diferencia del gran número de testículos y células germinales masculinas, los ovocitos planarios son relativamente difíciles de localizar y examinar, ya que solo hay dos ovarios, cada uno con 5-20 ovocitos. La localización más profunda dentro del cuerpo planario y la falta de tejidos epiteliales protectores también dificultan la disección directa de los ovarios planarios.

Este protocolo utiliza un breve paso de fijación para facilitar la localización y disección de los ovarios planarios para el análisis posterior para superar estas dificultades. El ovario disecado es compatible para el examen ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) e inmunotinción de anticuerpos. La técnica de disección descrita en este protocolo también permite experimentos de perturbación génica, en los que se examinan los ovarios en diferentes condiciones de ARN de interferencia (ARNi). El acceso directo a las células germinales intactas en el ovario logrado por este protocolo mejorará en gran medida la profundidad y la calidad de las imágenes y permitirá la interrogación celular y subcelular de la biología de los ovocitos.

Introduction

La anatomía de las planarias se ha examinado mediante el uso de TEM en muchos tejidos 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, se ha prestado poca atención a los ovarios o los ovocitos. La escasez de literatura sobre ovocitos se debe en parte a la dificultad de acceder a estas células, lo que deja la biología de los ovocitos planarios en gran medida inexplorada. Las herramientas moleculares han descubierto muchos mecanismos reguladores del desarrollo de los ovarios en las planarias utilizando microscopía de luz o fluorescencia 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Todos estos experimentos se realizaron en gusanos enteros o en secciones histológicas de gusanos enteros. Los protocolos de tinción de anticuerpos e hibridación in situ en gusanos enteros implican extensos pasos de blanqueo, lavado y limpieza de tejidos, que requieren mucho tiempo y llevarán varios días.

El objetivo general del método descrito aquí es proporcionar acceso a ovarios y ovocitos planarios intactos y disecados, lo que eliminará la necesidad de blanqueamiento o corte histológico y acortará el tiempo para el lavado y la limpieza del tejido en la tinción de anticuerpos y la hibridación in situ. Los ovarios disecados también mejorarán la penetración de la sonda o los anticuerpos y aumentarán la profundidad y la calidad de las imágenes para los microscopios ópticos y electrónicos. La accesibilidad a los ovarios y ovocitos disecados permite la investigación en biología celular a resolución celular y subcelular con ovocitos enteros intactos. Un estudio reciente sobre ovarios planarios disecados caracterizó por primera vez la meiosis de ovocitos planarios con TEM y microscopía confocal21. El trabajo proporcionó una descripción completa de un nuevo fenómeno durante la meiosis llamado vesiculación de la envoltura nuclear.

Aquí, presentamos los procedimientos detallados en la disección de ovarios planarios. Un paso de fijación fue suficiente para preservar la estructura de las células del ovario para la disección y la manipulación posterior (es decir, el procesamiento para el análisis de TEM y microscopio óptico). Dada su similitud en los planes corporales y la arquitectura de los tejidos, este protocolo también debería ser ampliamente informativo para el estudio de los ovocitos y sus núcleos en varias otras especies de Platyhelminthes (por ejemplo, el género Dugesia o Polycelis). Este protocolo es probablemente irrelevante para Macrostomum lignano por su pequeño tamaño y su arquitectura corporal casi transparente, lo que permitirá la observación directa del ovario y los ovocitos 22,23,24. El área del cuerpo que contiene los ovarios es más distinguible ópticamente (p. ej., pigmentación más oscura o pigmentación más clara) en algunas especies (p. ej., Dugesia ryukyuensis 9,25) que en S. mediterranea. Los estudios en estas especies pueden basarse menos en las pautas para la localización de los ovarios en S. mediterranea presentadas aquí, sino aprovechar las condiciones de fijación y disección.

Protocol

1. Preparación Prepara lombrices: alimenta a las planarias sexuales dos veces por semana con pasta de hígado orgánica para lograr la madurez sexual.NOTA: Generalmente, estos gusanos miden más de 1 cm de largo y tienen un gonoporo posterior a la abertura de la faringe. Preparar soluciones.Prepare los siguientes reactivos: 16% de paraformaldehído (PFA); solución acuosa de glutaraldehído (GA) al 50%; N-acetil-L-cisteína (NAC); 1x solución salina tamp…

Representative Results

El método aquí presentado ha sido descrito por Guo et al.21. La clave para una disección exitosa es identificar la pigmentación del ovario y colocar las guías correctamente. La estrategia del método es pasar de posiciones amplias a una ubicación específica. En primer lugar, para lograr esto, confíe en los patrones de pigmentación dorsal y ventral (Figura 1A,B). La pigmentación ventral, donde residen los ova…

Discussion

Estos procedimientos basados en la fijación para la disección de ovarios planarios facilitarán la comprensión de la meiosis de los ovocitos, así como el desarrollo y la regeneración de los ovarios. El tamaño de los ovocitos y sus células somáticas de soporte puede oscilar entre 20 μm y 50 μm. Los métodos basados en la disección proporcionarán accesibilidad a las células intactas de un solo ovario que los métodos basados en el corte o en la montura completa no pueden logra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo contó con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes (LK y ASA) y la Fundación Helen Hay Whitney (LHG).

Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito en el Repositorio de Datos Originales de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

Materials

16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 EM grade
2% aqueous OsO4 Electron Microscopy Sciences 19152
50% glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320 EM grade
Digital Micrograph Gatan Inc. Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resin Electron Microscopy Sciences 14120 Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
Ethanol Ted Pella 19207 Denatured
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Horse serum Sigma H1138
Lead Acetate Electron Microscopy Sciences 6080564
MilliQ water reverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A7250
Parafilm sigma P7793
Prolong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36965
Propylene oxide Electron Microscopy Sciences 75569 EM grade
 Proteinase K Thermo Fisher Scientific 25530049
Toluidine blue O Electron Microscopy Sciences 92319
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 541093

References

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Guo, F., McClain, M., Zhao, X., Yi, K., Parmely, T., Unruh, J., Slaughter, B., Kruglyak, L., Guo, L., Sánchez Alvarado, A. Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining. J. Vis. Exp. (175), e62713, doi:10.3791/62713 (2021).

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