Summary

Ultrastrüktürel Analiz ve Antikor Boyama için Planaryan Over Diseksiyonu

Published: September 10, 2021
doi:

Summary

Bu protokol, tatlı su planaryaları Schmidtea mediterranea’daki yumurtalıkları incelemek için atılan adımları sunar.Diseke edilen yumurtalıklar, oositlerin ve somatik hücrelerin hücre biyolojisini incelemek için transmisyon elektron mikroskobu ile antikor immün boyama ve ultrastrüktürel analiz için uyumludur ve daha önce erişilemeyen bir görüntüleme derinliği ve kalitesi sağlar.

Abstract

Germ hücrelerine erişilebilirlik, germ hücresi gelişimi, mayoz bölünme ve rekombinasyon çalışmalarına izin verir. Tatlı su planaryasının cinsel biyotipi olan Schmidtea mediterranea, germ hücrelerinin epigenetik özelliklerini incelemek için güçlü bir omurgasız modelidir. Çok sayıda testis ve erkek germ hücresinin aksine, düzlemsel oositlerin bulunması ve incelenmesi nispeten zordur, çünkü her biri 5-20 oosit içeren sadece iki yumurtalık vardır. Planarian cisim içinde daha derin lokalizasyon ve koruyucu epitel dokularının eksikliği de planarian overlerin doğrudan diseksiyonunu zorlaştırır.

Bu protokol, bu zorlukların üstesinden gelmek için aşağı akış analizi için planaryal yumurtalıkların lokalizasyonunu ve diseksiyonunu kolaylaştırmak için kısa bir fiksasyon adımı kullanır. Diseke edilen yumurtalık, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve antikor immün boyaması ile ultrastrüktürel inceleme için uyumludur. Bu protokolde özetlenen diseksiyon tekniği, yumurtalıkların farklı RNA girişim (RNAi) koşulları altında incelendiği gen pertürbasyon deneylerine de izin verir. Bu protokol ile elde edilen yumurtalıktaki sağlam germ hücrelerine doğrudan erişim, görüntüleme derinliğini ve kalitesini büyük ölçüde artıracak ve oosit biyolojisinin hücresel ve hücre altı sorgulamasına izin verecektir.

Introduction

Düzlemsel anatomi birçok dokuda TEM kullanılarak incelenmiştir 1,2,3,4,5,6. Bununla birlikte, yumurtalıklara veya oositlere çok az dikkat edilmiştir. Oosit literatürünün azlığı, kısmen bu hücrelere erişimin zorluğundan kaynaklanmaktadır ve düzlemsel oositlerin biyolojisini büyük ölçüde keşfedilmemiş bırakmaktadır. Moleküler araçlar, ışık veya floresan mikroskobu 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 kullanarak planaryalarda yumurtalık gelişiminin birçok düzenleyici mekanizmasını ortaya çıkarmıştır.. Tüm bu deneyler bütün solucanlar veya bütün solucanların histolojik bölümleri üzerinde gerçekleştirildi. Bütün solucanlar üzerindeki antikor boyama ve in situ hibridizasyon protokolleri, zaman alıcı ve birkaç gün sürecek olan kapsamlı ağartma, yıkama ve doku temizleme adımlarını içerir.

Burada tarif edilen yöntemin genel amacı, antikor boyama ve in situ hibridizasyonda ağartma veya histolojik kesit alma gerekliliğini ortadan kaldıracak ve yıkama ve doku temizleme süresini kısaltacak sağlam, diseke planarian yumurtalıklara ve oositlere erişilebilirlik sağlamaktır.Diseke edilen yumurtalıklar ayrıca prob veya antikor penetrasyonunu iyileştirecek ve ışık ve elektron mikroskopları için görüntüleme derinliğini ve kalitesini artıracaktır. Diseke edilmiş yumurtalıklara ve oositlere erişilebilirlik, bütün sağlam oositlerle hücresel ve subselüler çözünürlükte hücre biyolojisi araştırmalarına izin verir. Diseke planarian yumurtalıklar üzerinde yakın zamanda yapılan bir çalışmada, TEM ve konfokal mikroskopi ile ilk kez planaryal oosit mayozu karakterize edilmiştir21. Çalışma, mayoz bölünme sırasında nükleer zarf vezikülasyonu adı verilen yeni bir fenomenin kapsamlı bir tanımını sağladı.

Burada, planarian overlerin diseksiyonunda ayrıntılı prosedürleri sunuyoruz. Diseksiyon ve aşağı akış manipülasyonu için yumurtalık hücre yapısını korumak için bir fiksasyon aşaması yeterliydi (yani, TEM ve ışık mikroskobu analizi için işleme). Vücut planları ve doku mimarisindeki benzerlikleri göz önüne alındığında, bu protokol aynı zamanda diğer bazı Platyhelminthes türlerinde (örneğin, Dugesia veya Polycelis cinsi) oositleri ve çekirdeklerini incelemek için geniş ölçüde bilgilendirici olmalıdır. Bu protokol, yumurtalık ve oositlerin 22,23,24 doğrudan gözlemlenmesine izin verecek olan küçük boyutları ve neredeyse şeffaf vücut mimarisi nedeniyle Macrostomum lignano için muhtemelen ilgisizdir. Yumurtalıkları içeren vücut bölgesi, bazı türlerde (örneğin, Dugesia ryukyuensis 9,25) S. mediterranea’dan daha optik olarak ayırt edilebilir (örneğin, daha koyu pigmentli veya daha açık pigmentli). Bu türlerdeki çalışmalar, burada sunulan S. mediterranea’daki yumurtalıkların yerini belirleme kılavuzlarına daha az güvenebilir, ancak fiksasyon ve diseksiyon koşullarından yararlanır.

Protocol

1. Hazırlık Solucanlar hazırlayın: Cinsel olgunluğa ulaşmak için cinsel planaryaları haftada iki kez organik karaciğer macunu ile besleyin.NOT: Genel olarak, bu tür solucanların uzunluğu 1 cm’den büyüktür ve farenks açıklığının arkasında bir gonopore bulunur. Çözümler hazırlayın.Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın: paraformaldehit (PFA); % 50 glutaraldehit (GA) sulu çözelti; N-asetil-L-sistein (NAC); 1x fosfat tamponlu sa…

Representative Results

Burada sunulan yöntem Guo ve ark.21 tarafından tanımlanmıştır. Başarılı diseksiyonun anahtarı, yumurtalık pigmentasyonunu ve pozisyon kılavuzlarını doğru bir şekilde tanımlamaktır. Yöntemin stratejisi, geniş pozisyonlardan belirli bir konuma geçmektir. İlk olarak, bunu başarmak için dorsal ve ventral pigmentasyon modellerine güvenin (Şekil 1A,B). Yumurtalıkların bulunduğu ventral pigmentas…

Discussion

Planaryal yumurtalıkların diseksiyonu için bu fiksasyona dayalı prosedürler, oosit mayozunun yanı sıra yumurtalık gelişimi ve rejenerasyonunun anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Oositlerin ve somatik destek hücrelerinin boyutları 20 μm ila 50 μm arasında değişebilir. Diseksiyon tabanlı yöntemler, kesit alma veya tam montaj tabanlı yöntemlerin elde edemediği sağlam tek yumurtalık hücrelerine erişilebilirlik sağlayacaktır. Bu protokol, hücresel ve subsell?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (LK ve ASA) ve Helen Hay Whitney Vakfı (LHG) tarafından desteklendi.

Bu el yazmasının temelini oluşturan orijinal verilere, http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628 adresindeki Stowers Orijinal Veri Deposundan erişilebilir.

Materials

16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 EM grade
2% aqueous OsO4 Electron Microscopy Sciences 19152
50% glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320 EM grade
Digital Micrograph Gatan Inc. Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resin Electron Microscopy Sciences 14120 Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
Ethanol Ted Pella 19207 Denatured
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Horse serum Sigma H1138
Lead Acetate Electron Microscopy Sciences 6080564
MilliQ water reverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A7250
Parafilm sigma P7793
Prolong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36965
Propylene oxide Electron Microscopy Sciences 75569 EM grade
 Proteinase K Thermo Fisher Scientific 25530049
Toluidine blue O Electron Microscopy Sciences 92319
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 541093

References

  1. Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy. Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).
  2. Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B. Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala. I. Normal eye. Cell Tissue Research. 148 (2), 143-158 (1974).
  3. Ishii, S. The ultrastructure of the protonephridial flame cell of the freshwater planarian Bdellocephala brunnea. Cell Tissue Research. 206 (3), 441-449 (1980).
  4. Morita, M., Best, J. B., Noel, J. Electron microscopic studies of planarian regeneration: I. Fine structure of neoblasts in Dugesia dorotocephala. Journal of Ultrastructure Research. 27 (1), 7-23 (1969).
  5. Hyman, L. H. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. 2, 550 (1951).
  6. Higuchi, S., et al. Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis. Development, Growth & Differentiation. 49 (7), 571-581 (2007).
  7. Chong, T., Stary, J. M., Wang, Y., Newmark, P. A. Molecular markers to characterize the hermaphroditic reproductive system of the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 11, 69 (2011).
  8. Handberg-Thorsager, M., Salo, E. The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Development Genes and Evolution. 217 (5), 403-411 (2007).
  9. Kobayashi, K., et al. The identification of D-tryptophan as a bioactive substance for postembryonic ovarian development in the planarian Dugesia ryukyuensis. Scientific Reports. 7, 45175 (2017).
  10. Maezawa, T., et al. Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction. Mechanisms of Development. 132, 69-78 (2014).
  11. Rouhana, L., Tasaki, J., Saberi, A., Newmark, P. A. Genetic dissection of the planarian reproductive system through characterization of Schmidtea mediterranea CPEB homologs. Developmental Biology. 426 (1), 43-55 (2017).
  12. Sato, K., et al. Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Development, Growth & Differentiation. 48 (9), 615-628 (2006).
  13. Tharp, M. E., Collins, J. J., Newmark, P. A. A lophotrochozoan-specific nuclear hormone receptor is required for reproductive system development in the planarian. Developmental Biology. 396 (1), 150-157 (2014).
  14. Wang, Y., Zayas, R. M., Guo, T., Newmark, P. A. nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5901-5906 (2007).
  15. Zhang, S., et al. A nuclear hormone receptor and lipid metabolism axis are required for the maintenance and regeneration of reproductive organs. bioRxiv. , 279364 (2018).
  16. Saberi, A., Jamal, A., Beets, I., Schoofs, L., Newmark, P. A. GPCRs direct germline development and somatic gonad function in planarians. PLoS Biology. 14, 1002457 (2016).
  17. Steiner, J. K., Tasaki, J., Rouhana, L. Germline defects caused by Smed-boule RNA-interference reveal that egg capsule deposition occurs independently of fertilization, ovulation, mating, or the presence of gametes in planarian flatworms. PLoS Genetics. 12, 1006030 (2016).
  18. Iyer, H., Issigonis, M., Sharma, P. P., Extavour, C. G., Newmark, P. A. A premeiotic function for boule in the planarian Schmidtea mediterranea. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3509-3518 (2016).
  19. Rouhana, L., Vieira, A. P., Roberts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. PRMT5 and the role of symmetrical dimethylarginine in chromatoid bodies of planarian stem cells. Development. 139 (6), 1083-1094 (2012).
  20. Wang, Y., Stary, J. M., Wilhelm, J. E., Newmark, P. A. A functional genomic screen in planarians identifies novel regulators of germ cell development. Genes & Development. 24 (18), 2081-2092 (2010).
  21. Guo, L., et al. Subcellular analyses of planarian meiosis implicates a novel, double-membraned vesiculation process in nuclear envelope breakdown. bioRxiv. , 620609 (2019).
  22. Grudniewska, M., et al. Transcriptional signatures of somatic neoblasts and germline cells in Macrostomum lignano. Elife. 5, 20607 (2016).
  23. Wudarski, J., et al. The free-living flatworm Macrostomum lignano. Evodevo. 11, 5 (2020).
  24. Wudarski, J., et al. Efficient transgenesis and annotated genome sequence of the regenerative flatworm model Macrostomum lignano. Nature Communications. 8 (1), 2120 (2017).
  25. Maezawa, T., Sekii, K., Ishikawa, M., Okamoto, H., Kobayashi, K., Kobayashi, K., Kitano, T., Iwao, Y., Kondo, M. . Reproductive and Developmental Strategies: The Continuity of Life. , 175-201 (2018).
  26. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F., Sanchez Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11861-11865 (2003).
  27. Orii, H., Mochii, M., Watanabe, K. A simple “soaking method” for RNA interference in the planarian Dugesia japonica. Development Genes and Evolution. 213 (3), 138-141 (2003).
  28. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Developmental Dynamics. 242 (6), 718-730 (2013).

Play Video

Cite This Article
Guo, F., McClain, M., Zhao, X., Yi, K., Parmely, T., Unruh, J., Slaughter, B., Kruglyak, L., Guo, L., Sánchez Alvarado, A. Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining. J. Vis. Exp. (175), e62713, doi:10.3791/62713 (2021).

View Video