Bu protokol, tatlı su planaryaları Schmidtea mediterranea’daki yumurtalıkları incelemek için atılan adımları sunar.Diseke edilen yumurtalıklar, oositlerin ve somatik hücrelerin hücre biyolojisini incelemek için transmisyon elektron mikroskobu ile antikor immün boyama ve ultrastrüktürel analiz için uyumludur ve daha önce erişilemeyen bir görüntüleme derinliği ve kalitesi sağlar.
Germ hücrelerine erişilebilirlik, germ hücresi gelişimi, mayoz bölünme ve rekombinasyon çalışmalarına izin verir. Tatlı su planaryasının cinsel biyotipi olan Schmidtea mediterranea, germ hücrelerinin epigenetik özelliklerini incelemek için güçlü bir omurgasız modelidir. Çok sayıda testis ve erkek germ hücresinin aksine, düzlemsel oositlerin bulunması ve incelenmesi nispeten zordur, çünkü her biri 5-20 oosit içeren sadece iki yumurtalık vardır. Planarian cisim içinde daha derin lokalizasyon ve koruyucu epitel dokularının eksikliği de planarian overlerin doğrudan diseksiyonunu zorlaştırır.
Bu protokol, bu zorlukların üstesinden gelmek için aşağı akış analizi için planaryal yumurtalıkların lokalizasyonunu ve diseksiyonunu kolaylaştırmak için kısa bir fiksasyon adımı kullanır. Diseke edilen yumurtalık, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve antikor immün boyaması ile ultrastrüktürel inceleme için uyumludur. Bu protokolde özetlenen diseksiyon tekniği, yumurtalıkların farklı RNA girişim (RNAi) koşulları altında incelendiği gen pertürbasyon deneylerine de izin verir. Bu protokol ile elde edilen yumurtalıktaki sağlam germ hücrelerine doğrudan erişim, görüntüleme derinliğini ve kalitesini büyük ölçüde artıracak ve oosit biyolojisinin hücresel ve hücre altı sorgulamasına izin verecektir.
Düzlemsel anatomi birçok dokuda TEM kullanılarak incelenmiştir 1,2,3,4,5,6. Bununla birlikte, yumurtalıklara veya oositlere çok az dikkat edilmiştir. Oosit literatürünün azlığı, kısmen bu hücrelere erişimin zorluğundan kaynaklanmaktadır ve düzlemsel oositlerin biyolojisini büyük ölçüde keşfedilmemiş bırakmaktadır. Moleküler araçlar, ışık veya floresan mikroskobu 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 kullanarak planaryalarda yumurtalık gelişiminin birçok düzenleyici mekanizmasını ortaya çıkarmıştır.. Tüm bu deneyler bütün solucanlar veya bütün solucanların histolojik bölümleri üzerinde gerçekleştirildi. Bütün solucanlar üzerindeki antikor boyama ve in situ hibridizasyon protokolleri, zaman alıcı ve birkaç gün sürecek olan kapsamlı ağartma, yıkama ve doku temizleme adımlarını içerir.
Burada tarif edilen yöntemin genel amacı, antikor boyama ve in situ hibridizasyonda ağartma veya histolojik kesit alma gerekliliğini ortadan kaldıracak ve yıkama ve doku temizleme süresini kısaltacak sağlam, diseke planarian yumurtalıklara ve oositlere erişilebilirlik sağlamaktır.Diseke edilen yumurtalıklar ayrıca prob veya antikor penetrasyonunu iyileştirecek ve ışık ve elektron mikroskopları için görüntüleme derinliğini ve kalitesini artıracaktır. Diseke edilmiş yumurtalıklara ve oositlere erişilebilirlik, bütün sağlam oositlerle hücresel ve subselüler çözünürlükte hücre biyolojisi araştırmalarına izin verir. Diseke planarian yumurtalıklar üzerinde yakın zamanda yapılan bir çalışmada, TEM ve konfokal mikroskopi ile ilk kez planaryal oosit mayozu karakterize edilmiştir21. Çalışma, mayoz bölünme sırasında nükleer zarf vezikülasyonu adı verilen yeni bir fenomenin kapsamlı bir tanımını sağladı.
Burada, planarian overlerin diseksiyonunda ayrıntılı prosedürleri sunuyoruz. Diseksiyon ve aşağı akış manipülasyonu için yumurtalık hücre yapısını korumak için bir fiksasyon aşaması yeterliydi (yani, TEM ve ışık mikroskobu analizi için işleme). Vücut planları ve doku mimarisindeki benzerlikleri göz önüne alındığında, bu protokol aynı zamanda diğer bazı Platyhelminthes türlerinde (örneğin, Dugesia veya Polycelis cinsi) oositleri ve çekirdeklerini incelemek için geniş ölçüde bilgilendirici olmalıdır. Bu protokol, yumurtalık ve oositlerin 22,23,24 doğrudan gözlemlenmesine izin verecek olan küçük boyutları ve neredeyse şeffaf vücut mimarisi nedeniyle Macrostomum lignano için muhtemelen ilgisizdir. Yumurtalıkları içeren vücut bölgesi, bazı türlerde (örneğin, Dugesia ryukyuensis 9,25) S. mediterranea’dan daha optik olarak ayırt edilebilir (örneğin, daha koyu pigmentli veya daha açık pigmentli). Bu türlerdeki çalışmalar, burada sunulan S. mediterranea’daki yumurtalıkların yerini belirleme kılavuzlarına daha az güvenebilir, ancak fiksasyon ve diseksiyon koşullarından yararlanır.
Planaryal yumurtalıkların diseksiyonu için bu fiksasyona dayalı prosedürler, oosit mayozunun yanı sıra yumurtalık gelişimi ve rejenerasyonunun anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Oositlerin ve somatik destek hücrelerinin boyutları 20 μm ila 50 μm arasında değişebilir. Diseksiyon tabanlı yöntemler, kesit alma veya tam montaj tabanlı yöntemlerin elde edemediği sağlam tek yumurtalık hücrelerine erişilebilirlik sağlayacaktır. Bu protokol, hücresel ve subsell?…
The authors have nothing to disclose.
Çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (LK ve ASA) ve Helen Hay Whitney Vakfı (LHG) tarafından desteklendi.
Bu el yazmasının temelini oluşturan orijinal verilere, http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628 adresindeki Stowers Orijinal Veri Deposundan erişilebilir.
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM grade |
2% aqueous OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19152 | |
50% glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | EM grade |
Digital Micrograph | Gatan Inc. | Version 2.33.97.1, TEM data collection | |
Epon resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin |
Ethanol | Ted Pella | 19207 | Denatured |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Horse serum | Sigma | H1138 | |
Lead Acetate | Electron Microscopy Sciences | 6080564 | |
MilliQ water | reverse-osmosis treated water | ||
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | |
Parafilm | sigma | P7793 | |
Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | |
Propylene oxide | Electron Microscopy Sciences | 75569 | EM grade |
Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
Toluidine blue O | Electron Microscopy Sciences | 92319 | |
Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit BioTWIN | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 541093 |