Summary
Vellykket kimlinje transformation i efteråret armyworm, Spodoptera frugiperda, blev opnået ved hjælp af mRNA af hyperaktiv piggyBac transposase.
Abstract
Stabil indsættelse af genetisk last i insektgenomer ved hjælp af transposable elementer er et kraftfuldt værktøj til funktionelle genomiske undersøgelser og udvikling af genetiske skadedyrsbekæmpelsesstrategier. Det mest anvendte transposable element i insekttransformation er piggyBac, og piggyBac-baseretkimlinjetransformation er blevet udført med succes i modelinsekter. Det er dog stadig udfordrende at anvende denne teknologi i ikke-modelinsekter, der omfatter skadedyr i landbruget. Dette papir rapporter om kimlinje transformation af en global landbrugs skadedyr, faldet armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, ved hjælp af hyperaktiv piggyBac transposase (hyPBase).
I dette arbejde blev hyPBase mRNA produceret og brugt i stedet for hjælper plasmid i embryo mikroinjections. Denne ændring førte til en vellykket generation af transgene FAW. Desuden beskrives metoderne til screening af transgene dyr, PCR-baseret hurtig påvisning af transgeneindføring og termisk asymmetrisk interlaced PCR (TAIL-PCR)-baseret bestemmelse af integrationsstedet. Således præsenterer dette papir en protokol til fremstilling af transgene FAW, som vil lette piggyBac-baserettransgenese i FAW og andre lepidopteran insekter.
Introduction
Faldet armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, er hjemmehørende i tropiske og subtropiske regioner i Amerika. I øjeblikket er dette en ødelæggende insekt planteæder i mere end 100 lande verden over1. FAW larver foder på mere end 350 værtsplanter, herunder nogle vigtige korte fødevarer afgrøder2. FAW-voksnes stærke migrationsevne bidrager til dens nylige hurtige spredning fra Amerika til andre steder1,2. Som følge heraf truer dette insekt nu fødevaresikkerheden internationalt. Anvendelse af nye teknologier kan lette avancerede undersøgelser i FAW og give nye strategier til at styre dette skadedyr.
Transformation af insektkimlinjen er blevet brugt til at studere genfunktion og generere transgene insekter til brug i genetisk kontrol3,4. Blandt de forskellige metoder, der anvendes til at opnå genetisk transformation i insekter, er piggyBac-elementbaseret metode den mest anvendte metode5. På grund af den lave gennemførelsesrate er det dog stadig udfordrende at udføre transgenese hos ikke-modelinsekter. For nylig blev en hyperaktiv version af piggyBac transposase (hyPBase) udviklet6,7. Germline transformation blev opnået i FAW for nylig8, hvilket er den første rapport, der brugte hyPBase i lepidopteran insekter. I denne rapport beskrives detaljerede oplysninger om anvendelse af hyPBase mRNA til generering af transgen FAW. Den metode, der er beskrevet her, kunne anvendes til at opnå omdannelsen af andre lepidopteran insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro syntese af hyPBase mRNA
BEMÆRK: Den komplette kodningssekvens af hyPBase-sekvensen blev syntetiseret og indsat i en pTD1-Cas9-vektor (se materialetabellen) for at producere pTD1-hyPBase-konstruktionen, som indeholder en hyPBase-udtrykkende kassette, T7 promotor: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A). Den fulde sekvens af pTD1-hyPBase-konstruktionen findes i det supplerende materiale.
- Udarbejdelse af skabelonen til in vitrosyntese
- Udfør en PCR-reaktion for at forstærke hyPBase-udtrykkende kassette ved hjælp af en fremad primer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', og en omvendt primer 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', high-fidelity polymerase, og pTD1-hyPBase plasmid som en skabelon.
BEMÆRK: PCR-reaktionen (sidste volumen på 50 μL) indeholder 5,0 μL 10x Reaktionsbuffer, 4,0 μL på 10 mM deoxynucleoside triphosphat (dNTP), 1,0 μL plasmid (50 μg/μL), 1,0 μL high-fidelity polymerase, 1,0 μL hver af 10 μM frem- og omvendte primere og 33 μL nucleasefrit vand. Indstillingerne var som følger: en indledende inkubation på 95 °C i 3 min, efterfulgt af 35 cyklusser på 98 °C for 10 s, 60 °C i 15 s og 68 °C i 2 min. - Kontroller PCR-produktet på en 1% agarosegel ved 120 V i frisk Tris-acetat-ethylendiamin tetraacesyre (TAE) buffer i 30 min og rense produktet med geludvindingssættet.
BEMÆRK: Brug ikke PCR-produktrensningssættet. Selv en spormængde af pTD1-hyPBase plasmid reducerer effektiviteten af in vitro syntese betydeligt.
- Udfør en PCR-reaktion for at forstærke hyPBase-udtrykkende kassette ved hjælp af en fremad primer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', og en omvendt primer 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', high-fidelity polymerase, og pTD1-hyPBase plasmid som en skabelon.
-
In vitro syntese af hyPBase mRNA ved hjælp af et kommercielt sæt
- Optø de frosne reagenser helt, opbevar enzymet og 2x NTP/CAP-opløsningen på is, og lad den optøede 10x Reaktionsbuffer stå ved stuetemperatur.
- Reaktionen samles ved stuetemperatur ved at tilføje følgende komponenter: 2x NTP/CAP-opløsning: 10 μL; 10x Reaktionsbuffer: 2 μL; Skabelon DNA: 0,1-0,2 μg; Enzymblanding: 2 μL; Nucleasefrit vand til 20 μL.
- Reagenserne blandes grundigt ved forsigtigt at pipetter blandingen op og ned og inkuberes ved 37 °C i 2-4 timer.
- Genvinding af syntetiseret mRNA ved lithiumchlorid nedbør
- Tilsæt 30 μL LiCl Nedbørsopløsning, bland grundigt ved at svirpe røret, og hold derefter ved -20 °C i ≥ 30 min.
- Centrifuge ved 4 °C i 15 min ved maksimal hastighed, og fjern forsigtigt supernatanten.
- Vask pellet en gang med 1 mL 70% ethanol, re-centrifuge, og fjern supernatanten forsigtigt.
- Tør pellet ved stuetemperatur i 1-2 min, og derefter genbruge pellet med 20-40 μL nuclease-fri vand.
- Fortynd 1 μL mRNA-opløsning med 9 μL nucleasefrit vand. Tag 2 μL for at bestemme mRNA-koncentrationen og brug 8 μL til at kontrollere mRNA-kvaliteten på en 1% agarosegel ved 100 V i frisk TAE-buffer i 40 min.
- Aliquot mRNA opløsningen og opbevares frosset ved -70 °C i op til et år.
BEMÆRK: MRNA-pellet må ikke tørres helt. det kan være sværere at opløse det i vand.
2. Mikroinjektion
- Ægopsamling
- Placer 12 hanunge og 12 hununge i en 15 cm x 15 cm x 10 cm kasse. Dæk kassen med et køkkenrulle. Placer en 10% saccharoseopløsning i kassen til fodring af voksne.
- På dag 2 efter eclosion, udsætte de voksne for intenst lys natten over.
- På dag 3 efter eclosion overføres de voksne fra trin 2.1.2 til et mørkt sted. Saml embryonerne inden for 2 timer efter oviposition.
- Tilsæt dråber vand til stykket af et køkkenrulle med friske æg opbevaret i en petriskål på is. Overfør æggene forsigtigt til en glasrutschebane med en fin børste og juster dem en efter en på en glasrutschebane. Hold glasset glider med de justerede æg på is før microinjection.
- Opsætning af mikroinjection
- Indsprøjt en blanding af et transgent forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP)-udtrykkende plasmid (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) og sterilt destilleret vand i æggene ved hjælp af kompensationstrykket fra den automatiserede mikroinjektor (se materialetabellen).
- De injicerede æg holdes på 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % relativ luftfugtighed, indtil de klækkes.
- Foder de udklækkede larver på en kunstig kost, og overfør hver larve til en lille kop i begyndelsen af 3rd instar fase (~ 6 mm i længden, og kropsfarve bliver sort).
3. Fluorescensscreening og genetisk krydsning
- Saml pupper og sted ~ 150 kvindelige pupper og ~ 150 mandlige pupper i en 35 cm x 35 cm x 35 cm bur. Hæng flere stykker papirhåndklæder (~ 30 cm x 15 cm) i buret for at samle æggene.
- Saml papirhåndklæderne med æg dagligt, og opbevar æggene på 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relativ luftfugtighed indtil udklækning.
- Opbevar de nyfødte larver ved 4 °C i 5 minutter for at immobilisere dem, og overfør dem derefter til en iskold plade.
- Screen de immobiliserede nyfødte larver under et fluorescens stereomikroskop. Vælg egfp-positive nyfødte, hæv dem til pupalstadiet om ~ 2 uger ved 27 ± 1 °C, og adskil dem efter køn i henhold til fænotypeforskellene ved de ventrale mavesegmenter.
BEMÆRK: Den kvindelige puppe har en slidslignende genital åbning på det ottende abdominalsegment og de cephaliske margener i niende og tiende segmenter, der buede mod genital åbning. Den genitale åbning af hanungen har en lille højde på det niende abdominalsegment. - Placer egfp-positive pupper og den vilde pupper af det modsatte køn i et hunforhold: kvindeligt forhold på 1:1 i et bur. Sib-cross egfp-udtrykkende voksne til at producere de følgende generationer.
4. PCR-påvisning af transgen indsættelse
- Uddrag genomisk DNA fra de vilde og EGFP-positive individuelle larver ved hjælp af et kommercielt genomisk DNA-ekstraktionssæt efter producentens anvisninger.
- Udfør en PCR-reaktion ved hjælp af det genomiske DNA som skabelon; en fremadrettet primer, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' beliggende i ie1 promotorregionen og en omvendt primer, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' beliggende i EGFP-regionen af transformationsvektoren.
- Konfigurer hver PCR-reaktion (sidste volumen på 40 μL) til at indeholde 20 μL af polymeraseblandingen, 1,0 μL genomisk DNA (40 μg/μL), 1,0 μL hver af 10 μM frem- og omvendte primere og 17 μL nucleasefrit vand. Brug følgende indstillinger: en indledende inkubation på 95 °C i 3 min, efterfulgt af 35 cyklusser på 95 °C i 20 s, 56 °C i 20 s og 68 °C for 40 s indstillinger.
- Tjek PCR-produkterne på en 1% agarosegel ved 120 V i 30 min.
5. Bestemmelse af det transgene indføringssted
- Udfør højeffektiv TAIL-PCR ved hjælp af genomisk DNA som skabelon til at bestemme integrationsstedet for transgene indsættelse i EGFP-positive insekter.
- Udfør PCR-reaktionerne efter de trin, der er beskrevet andetsteds9.
- Brug tre primere, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', og P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacgacggattcgct-3', som er specifikke for piggyBac vektor, i de 3 runder af PCR reaktion, henholdsvis.
- Udfør PCR-reaktionerne efter de trin, der er beskrevet andetsteds9.
- Sekvens de endelige PCR-produkter for at bestemme integrationsstedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En konstruktion til udtryk for hyPBase-holdige T7 promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal blev genereret (Figur 1A) og forstærket som en ~ 2,2 kb PCR fragment til at syntetisere hyPBase mRNA in vitro (Figur 1B). Derefter blev hyPBase mRNA produceret og udsat for agarosegelelektroforese. mRNA'et af den forventede størrelse (~1,1 kb bånd) blev fundet på en 1 % agarosegel (Figur 1C).
Derefter blev der udarbejdet en piggyBac-baseretEGFP-udtrykskonstruktion (figur 2A). En blanding af denne plasmid og hyPBase mRNA, eller PBS opløsning, blev injiceret i embryoner inden for 2 timer efter oviposition. Ved 24 timer efter injektionen blev der observeret et forbigående signal om EGFP-udtryk hos de injicerede embryoner. De PBS-injicerede embryoner viste ikke EGFP-signal (Figur 2B), mens egfp-udtrykkende plasmid- og hyPBase mRNA-injicerede embryoner viste EGFP-fluorescens (Figur 2C), hvilket indikerer, at piggyBac-konstruktionen var vellykket. Således kan hr5ie1 promotor fungere under den tidlige embryonale udvikling.
Omkring 2.000 æg blev injiceret, og ~ 700 af dem udviklede sig til pupper. G0 voksne blev selvkorset, og æg blev indsamlet. G1 larverne udklækket fra disse æg blev undersøgt for EGFP-signalet under et fluorescens stereomikroskop. Som vist i figur 3Aviste de transgene larver et stærkt EGFP-signal. For at teste indføringen af EGFP-ekspreskassetten i genomer af EGFP-positive insekter blev et fragment, der indeholdt promotoren og EGFP-fragmentet, forstærket ved hjælp af det genomiske DNA isoleret fra de EGFP-positive larver som skabelon (Figur 3B). Dette fragment blev ikke påvist, da genomisk DNA blev isoleret fra de vilde larver som skabelon (Figur 3B). Ved at udføre højeffektiv TAIL-PCR og sekventering af PCR-produkterne blev integrationsstedet for transgeneindføring fastlagt. Som vist i figur 4ligger transgeneintegrationsstedet i den 81. intron af Twinchin-lignende gen i kromosom 26.
Figur 1: Produktion af hyPBase mRNA. (A) HyPBase-udtrykkende kassette indeholdende T7 promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal blev konstrueret. (B) ~2,2 kb DNA-skabelonen til syntetisering af hyPBase mRNA blev forstærket fra hyPBase-konstruktionen. Den venstre vognbane viser 1-kb stigen køre på samme gel. (C) En ~1,1 kb hyPBase mRNA blev syntetiseret ud fra den forstærkede DNA-skabelon. Den venstre vognbane viser 1-kb stigen køre på samme gel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ekspression af EGFP i injicerede embryoner. (A) Skematisk diagram over piggyBac vektor, der anvendes i denne undersøgelse. (B) Der blev ikke påvist egfp-signal hos embryoner injiceret med 1x PBS. (C) EGFP-signalet blev påvist i embryoner injiceret med piggyBac vektor og hyPBase mRNA. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein og PBS = fosfatbufferet saltvand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Karakterisering af transgene FAW. (A) EGFP-udtryk i transgene, men ikke i faw-larver af vildtypen. Skalastænger = 0,5 mm. (B) PCR-analyse af genomisk indsættelse af transgenene. Et par primere rettet mod promotor- og EGFP-regionerne blev brugt til at forstærke et ~ 0,5 kb fragment ved hjælp af det genomiske DNA isoleret fra transgene eller vilde FAW-larver som skabelon. Forkortelser: EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein og FAW = Fall armyworm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Genomisk indsættelse af piggyBac konstruktion. Genomisk indsættelse af piggyBac-konstruktionen i transgen FAW blev bestemt af TAIL-PCR og sekventering. Kromosom lokalisering og delvis genomiske DNA-sekvenser flankerer grænserne for piggyBac konstruktion er vist. Forkortelser: FAW = Fall armyworm og TAIL-PCR = termisk asymmetrisk interlaced PCR. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende materiale. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den lave gennemførelsesgrad og vanskeligheden ved at levere transgene komponenter til friske embryoner begrænser succesen af bakterielintransformation i mange ikke-modelinsekter, især dem fra orden, Lepidoptera. For at øge bakterielinjen transformation sats, en hyperaktiv version af de mest udbredte piggyBac transposase (hyPBase) blev udviklet7,10. Til dato er vellykket kimlinjetransformation i lepidopteran insekter hovedsageligt rapporteret i modellen insekt silkeorm, Bombyx mori11. Men at udføre transgenesearbejde i andre lepidopteran insekter, herunder nogle store landbrugs skadedyr, er stadig udfordrende.
De vigtigste begrænsninger og de vigtigste trin i etableringen af en transgen FAW-linje ved hjælp af denne protokol er at syntetisere hyPBase mRNA af høj kvalitet og levere piggyBac-gennemførelseskomponenter i de tidlige embryoner. De to kernekomponenter i det traditionelle piggyBac-system er en donorplasmid, der indeholder den last, der skal indsættes i genomet, og en hjælperplasmid, der giver transposase12. For at øge transformationseffektiviteten bruges meget aktive initiativtagere i hjælperen plasmid til at drive udtrykket transposase13,14. Da disse initiativtagere normalt er fremstillet af modelinsekter, er deres aktivitet i andre insekter muligvis ikke høj som i de arter, hvorfra promotoren blev identificeret. Således er transposase mRNA mere effektiv end hjælper plasmid, hvilket kan forbedre kimlinjetransformation i de fleste ikke-model insekter.
I denne protokol blev hyPBase mRNA udarbejdet in vitro ved at konstruere en plasmid, der indeholder hyPBase-udtrykkende kassette (T7 promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal). T7 promotor tillader in vitro syntese af mRNA ved hjælp af kommercielt tilgængelige mRNA syntese kits. Både polyhedrin-5'UTR og polyhedrin-3'UTR kunne hjælpe med at forbedre transskription af hyPBase mRNA in vitro og oversættelse af hyPBase protein in vivo. Tilstedeværelsen af poly (A) signalet hjælper med at øge stabiliteten af hyPBase mRNA in vivo15. Derudover er injektion af piggyBac-komponenterne i de meget tidlige embryoner med et begrænset antal dividerende celler også afgørende for at forbedre chancerne for at levere piggyBac-systemkomponentleverandører af kimceller. De gennemførelseshændelser, der forekommer i kimlinjecellerne, kan nedarves. I denne protokol blev FAW-embryoner, der var mindre end 2 timer gamle, indsamlet og opbevaret på is for at bremse deres udvikling før injektion. For de fleste insekter kan indsamling af embryoner så tidligt som muligt og finde en måde at bremse deres udvikling også hjælpe med vellykket bakterielinjetransformation.
Brug af fluorescerende proteiner i insekttransgenese hjælper med at identificere transgene dyr. I denne protokol, IE1 promotor, som er blevet rapporteret til at være en effektiv og allestedsnærværende promotor i lepidopteran insekter11, stammer fra Autographa California multicapsid nuklear polyhedrose virus (AcNPV) umiddelbart tidlig gen, blev fusioneret med hr5 forstærker til at drive udtrykket af EGFP. Hos transgene personer, hvor EGFP blev indsat i FAW-genomet, kunne EGFP-signalet observeres på alle stadier (data, der ikke er vist). Molekylær bekræftelse af piggyBac-medieret indsættelse blev normalt udført af sydlige blot eller omvendt PCR og sekventering. I denne protokol blev PCR-forstærkning af et fragment i den transgene last anvendt til at bekræfte den transgene indsættelse hurtigt. Derudover blev der anvendt en PCR-baseret højeffektiv TAIL-PCR-metode til at identificere integrationsstedet for transgen indsættelse9, hvilket er let at manipulere sammenlignet med den udbredte inverse PCR-metode. Den højeffektive TAIL-PCR-metode blev udviklet til at identificere de transgene integrationssteder i planter. I denne undersøgelse anvendes denne metode for første gang i insekter. Den præsenterede protokol er en effektiv måde at generere transgen FAW på og kan også anvendes yderligere på mange andre model- og ikke-modelinsekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Den rapporterede forskning er støttet af National Science Foundation I / UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, under Grant No IIP-1821936 og af industripartnere, Landbrug og Fødevareforskningsinitiativ Competitive Grant No. 2019-67013-29351 og National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 og 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
