Summary

En intakt perikardium ischemisk gnagare modell

Published: September 02, 2021
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver stegen för att inducera hjärtinfarkt hos möss samtidigt som perikardiet och dess innehåll bevaras.

Abstract

Detta protokoll har visat att perikardiet och dess innehåll spelar en väsentlig antifibrotisk roll i den ischemiska gnagarmodellen (koronar ligering för att inducera hjärtskada). Majoriteten av prekliniska hjärtinfarktmodeller kräver störning av perikardiell integritet med förlust av den homeostatiska cellulära miljön. Men nyligen har en metodik utvecklats av oss för att inducera hjärtinfarkt, vilket minimerar perikardiell skada och behåller hjärtats bosatta immuncellpopulation. En förbättrad hjärtfunktionell återhämtning hos möss med ett intakt perikardiellt utrymme efter koronar ligering har observerats. Denna metod ger möjlighet att studera inflammatoriska svar i perikardialutrymmet efter hjärtinfarkt. Ytterligare utveckling av märkningsteknikerna kan kombineras med denna modell för att förstå ödet och funktionen hos perikardiella immunceller för att reglera de inflammatoriska mekanismerna som driver ombyggnad i hjärtat, inklusive fibros.

Introduction

Till denna dag erkänns hjärt-kärlsjukdom (CVD) som den ledande dödsorsaken globalt, vilket resulterar i en betydande ekonomisk börda och minskning av patientens livskvalitet1. Kranskärlssjukdom (CAD) är en subtyp av CVD och spelar en viktig roll i utvecklingen av hjärtinfarkt (MI), som är en viktig bidragsgivare till dödligheten. Per definition är MI resultatet av irreversibel skada på myokardvävnaden på grund av långvariga tillstånd av ischemi och hypoxi. Myokardvävnad saknar regenereringskapacitet, så skador är permanenta och resulterar i att hjärtmuskeln ersätts med ett fibrotiskt ärr som initialt kan vara skyddande men i slutändan bidrar till negativ hjärtombyggnad och eventuell hjärtsvikt2.

Även om hanteringen av patienter med CAD har förbättrats dramatiskt under de senaste decennierna, påverkar kronisk hjärtsvikt (CHF) sekundärt till ischemi många patienter över hela världen. För att förebygga och hantera denna epidemi är det nödvändigt att förstå de underliggande mekanismerna mer omfattande och utveckla nya terapeutiska tillvägagångssätt. Dessutom belyser tidigare resultat begränsningarna för systemisk terapi och nödvändigheten av att utveckla exakta alternativ. Med tanke på att undersöka de molekylära följdsjukdomarna av MI hos människor påverkas av förmågan att komma åt infarkterad vävnad, är djurmodeller som rekapitulerar egenskaperna och utvecklingen av human MI och CHF relaterade till CVD oumbärliga.

Eftersom ideala djurmodeller liknar en mänsklig störning för strukturella och funktionella egenskaper, bör sjukdomsetiologi vägleda deras uppfattning. I CAD är det den kroniska aterosklerotiska stenosen i kranskärlen eller akut trombotisk ocklusion. Olika metoder har utvecklats och tillämpats hos olika arter av försöksdjur för att inducera kranskärlsförträngning eller ocklusion. Sådana strategier kan i stort sett klassificeras i två grupper: (1) mekanisk manipulation av en kranskärl för att inducera en MI och (2) påskynda åderförkalkning för att underlätta koronar förträngning som leder till en MI. Den första strategin involverar vanligtvis antingen ligering av en kranskärl eller placering av en stent i artären. Det andra tillvägagångssättet tenderar att förlita sig på att modifiera djurets kost för att inkludera mat med högt fett/ kolesterol. Några av begränsningarna i detta senare tillvägagångssätt inkluderar bristen på kontroll på tidpunkten och platsen för koronar occlusions.

Däremot har den kirurgiska induktionen av MI eller ischemi i en djurmodell flera fördelar, såsom plats, exakt tidpunkt och omfattning av kranskärlshändelsen, vilket leder till mer reproducerbara resultat. Den mest använda metoden är kirurgisk ligering av vänster främre fallande kranskärl (LAD). Sådana modeller rekapitulerar mänskliga svar på akut ischemisk skada, liksom progressionen till CHF3. LAD-kirurgi på små djur som gnagare utvecklades ursprungligen hos större djur och har blivit mer genomförbart med framsteg inom teknik4. Vid upprättandet av sådana modeller har möss gynnats av olika skäl, inklusive deras relativa tillgänglighet, låga kostnader i bostäder och deras kapacitet för genetisk manipulation.

Samtida kirurgiska modeller av ischemisk hjärtsjukdom med LAD-ocklusion kräver att forskaren öppnar perikardiet för att tillfälligt eller permanent ligera artären5. Sådana strategier resulterar i störningar i perikardialutrymmet, vilket spelar en väsentligen mekanisk och smörjande funktion för att säkerställa korrekt hjärtfunktion. En annan nackdel med att öppna perikardiet är att förlora djurets ursprungliga perikardiella vätska med dess olika cellulära och proteinkomponenter 6,7. Som svar utvecklades en metod för att inducera MI samtidigt som perikardiet hölls intakt av oss. Förutom att minimera störningen av denna homeostatiska miljö, möjliggör detta tillvägagångssätt märkning och spårning av specifika celler efter att ha orsakat en MI. Dessutom representerar detta tillvägagångssätt bättre myokardiell ischemisk skada i den mänskliga miljön.

Protocol

Manliga och kvinnliga C57BL / 6J-möss mellan 8-14 veckors ålder användes för dessa experiment. Detta protokoll har fått etiskt godkännande från djurvårdskommittén vid University of Calgary och följer alla riktlinjer för djurvård. 1. Musförberedelse och kirurgi Sterilisera kirurgiska verktyg (via pärlsterilisator eller autoklav). Väg musen för prekirurgisk vikt och smärtstillande dos. Placera musen i en induktionslåda med 4% isofluran och 800 ml/m…

Representative Results

Denna modifierade koronar ligeringsmodell har optimerats för att uppnå reproducerbarhet och djuröverlevnad. På grund av den betydande skada som induceras i hjärtat är emellertid viss förväntad intraoperativ och postoperativ dödlighet associerad med proceduren. Standarddödligheten är vanligtvis högre hos män (~ 25-35%) än hos kvinnor (~ 10-15%). Framgångsrik induktion av en MI med den modifierade koronar ligeringen bör framgå av förändringar i hjärtats funktionella parametra…

Discussion

Att inducera en MI i ett slutet perikardium hos gnagare är unikt och kan ha potentiellt betydande tillämpningar. Förfarandet är starkt beroende av kirurgens förtrogenhet med gnagarmodellen och gnagarens hjärtanatomi. Framgång är också beroende av den vård som ges under tre kritiska steg: interkostalt muskelsnitt och revbensindragning (steg 1.11-1.13), skapande av infarkt (steg 1.17 ) och djuråterhämtning (steg 1.22-1.24).

Torakotomin måste göras flitigt för att undvika punkterin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ingen.

Materials

Steri-350 Bead Sterilizer Inotech NC9449759
10% Formalin Millipore Sigma HT501128-4L
40 µm Cell strainer VWR CA21008-949 Falcon, 352340
70 µm Cell strainer VWR CA21008-952 Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer Thermo Fisher A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" CDMV Inc 108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution) CDMV Inc 104826
Blunt Forceps Fine Science Tools FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment CDMV Inc 17909
Castroviejo Needle Driver Fine Science Tools FST 12061-01
Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
Collagenase I Millipore Sigma SCR103
Collagenase XI Millipore Sigma C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture – CV-11 taper needle Medtronic Canada GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture – PC-13 cutting needle Medtronic Canada SL-1659
Curved Blunt Forceps Fine Science Tools FST 11009-13
Dako Mounting Medium Agilen CS70330-2
DNase I Millipore Sigma 11284932001
Ethanol, 100% Millipore Sigma MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture – BV-130-4 taper needle Johnson & Johnson Inc. 2815G
Fiber-Optic Light Nikon 2208502
Fine Forceps Fine Science Tools FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm Polysciences, Inc. 15702
Geiger Thermal Cautery Unit World Precision Instruments 501293 Model 150-ST
Hyaluronidase Millipore Sigma H4272
Isofluorane Vaporizer Harvard Apparatus 75-0951
Isoflurane USP, 250 mL CDMV Inc 108737
Magnetic Fixator Retraction System Fine Science Tools 18200-20
MX550D- 40 MHz probe Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver Fine Science Tools FST 12002-12
PE-10 Tubing Braintree Scienctific, Inc. PE10 50 FT
Scissors Fine Science Tools FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope Nikon SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) CDMV Inc 124918 controlled drug
Vevo 2100 Software Fujifilm-Visual Sonics

References

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141, 139 (2020).
  2. Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), (2018).
  3. Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).
  4. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. 52, 2581 (2011).
  5. De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
  6. Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment. JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).
  7. Pfaller, M. R., et al. The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).
  8. Deniset, J. F., et al. Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis. Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).
  9. Weber, G. F. Immune targeting of the pleural space by intercostal approach. BMC Pulmonary Medicine. 15, 14 (2015).
  10. Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities. The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).
  11. Tyberg, J. V., et al. The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study. Circulation. 73, 428-432 (1986).
  12. Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study. The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).
  13. Park, D. S. J., et al. Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).

Play Video

Cite This Article
Fatehi Hassanabad, A., Belke, D. D., Turnbull, J., Dundas, J. A., Vasanthan, V., Teng, G., Fedak, P. W. M., Deniset, J. F. An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model. J. Vis. Exp. (175), e62720, doi:10.3791/62720 (2021).

View Video