Summary
Denne protokollen presenterer konstruksjon og bruk av et forenklet helkropps pletysmografiapparat for å overvåke bakteriell respiratorisk sykdomsprogresjon ikke-invasivt.
Abstract
Surrogatdyrmodeller av sykdom er underlagt 3Rs of Responsible Research. Det er en hyppig revisjon av forbedringer til dyremodeller for å sikre at både dyrevelferd og vitenskapelig innsikt avanserer med tilgjengeligheten av ny teknologi. Denne artikkelen demonstrerer bruken av forenklet Whole Body Plethysmography (sWBP) for å ikke-invasivt studere respirasjonssvikt i en modell av dødelig respiratorisk melioidose. sWBP har følsomheten for å oppdage pusting hos mus gjennom hele sykdomsforløpet, slik at de døende assosierte symptomene (bradypné og hypopné) kan måles og potensielt brukes til å utvikle humane endepunktkriterier.
Noen av fordelene med sWBP i sammenheng med luftveissykdom er at vertspusteovervåking kommer nærmest enhver fysiologisk måling ved vurdering av dysfunksjon av det primære infiserte vevet, nemlig lungen. I tillegg til biologisk betydning er bruken av sWBP rask og ikke-invasiv, noe som minimerer stress hos forsøksdyr. Dette arbeidet demonstrerer bruken av internt sWBP-apparat for å overvåke sykdom i løpet av respiratorisk svikt i murine modell av respiratorisk melioidose.
Introduction
Respiratoriske bakterielle patogener er ofte forbundet med en inflammatorisk respons i lungen som fører til lungepatologi 1,2. I klinisk setting inkluderer diagnose av lungebetennelse vanligvis kulturteknikker fra sputum, blod-oksygenmetningsanalyse og røntgenrøntgen. Disse teknikkene kan oversettes for små dyreinfeksjonsmodeller, men bare oksygenmetningsanalyse representerer en rask sanntidsanalyse hos mus for sykdomsalvorlighetsgrad. Oksygenmetningen i blodet (SpO2) ble tidligere undersøkt som en metode for å spore sykdomsprogresjon i respiratoriske sykdomsstudier; Imidlertid har døende mus uventet høye SpO2-avlesninger både i en Pseudomonas aeruginosa modell3, som ikke er den prediktive eller døende sykdommen, sannsynligvis fordi mus kan modulere sin fysiologiske aktivitet. Til dette formål ble diagnostiske nivåer av SpO2 ikke funnet for bakteriell respiratorisk sykdom hos mus så langt.
Derfor undersøkte dette arbeidet bruken av andre klinisk relevante metoder for å oppdage effekten av lungesykdom på lungefunksjonen som en rask fysiologisk måling. Simplified Whole Body Plethysmography (sWBP) gir mulighet til å undersøke pustefrekvens og dybde som en rask, ikke-invasiv biometrisk analyse. Tidligere studier har vist hvordan man monterer WBP-apparater i et laboratorium4; Imidlertid er flere av komponentene vist i slike studier for tiden ikke kommersielt tilgjengelige. Videre krever tradisjonell WBP kompleks datainnsamling og databehandling basert på fuktighet og temperatur 5,6. Derfor ble det besluttet å utvikle et forenklet WBP-apparat som kalibreres daglig til romtemperatur / fuktighet og vurdere om temperaturen / fuktighetsbidraget til selve motivet har noen effekt på det målte pustevolumet. Dermed er det opprettet et modifisert sWBP-apparat som kilder til de tilgjengelige materialene. Videre har det blitt undersøkt om dette laboratoriebaserte apparatet kan oppdage endringer i pusten assosiert med sykdomsprogresjon under modellen av dødelig respiratorisk melioidose hos mus.
SWBP-apparatet konstruert for dette arbeidet brukte kommersielt tilgjengelig utstyr og programvare for å behandle analoge trykksensordata til en digital avlesning. Trykksensoren ble montert på en lufttett glasskrukke med skottkontakter. Fordelen med en glassburk er materialets strukturelle stivhet, som vil motstå endringer i krukkens indre trykk, noe som påvirker målinger av volumendringer under overvåking av pusten. Prøvetakingskammeret er konstruert for å ha to porter på de to flate overflatene på den firkantede krukken, en for å få tilgang til kammeret med en Luer-kontakt for kalibrering og den andre for å huse trykksensoren. Den valgte trykksensoren har en svært følsom målertrykktransduser med et område for små trykkendringer (25 mbar rekkevidde).
Denne protokollen er demonstrert ved hjelp av en murine modell av respiratorisk melioidose. Burkholderia pseudomallei (Bp) er bakterielt middel for melioidose - en sykdom forbundet med tropiske områder i verden7. Bp finnes i miljøet, spesielt i våte miljøer med stående vann og fuktig jord, hvorfra det vanligvis forårsaker subkutane infeksjoner av kutt / riper av følsomme verter. Imidlertid er Bp også smittsom ved innånding og er en potensiell trussel for bruk i bioterrorisme ved aerosolspredning. Mens fullstendig virulent Bp krever håndtering i et BSL-3-laboratorium, ble en akapsulær mutantstamme tidligere konstruert, som trygt kan håndteres ved BSL-2 og utelukkes fra de utvalgte agentkriteriene8. Videre er det utviklet en intubasjonsmediert intratrakeal (IMIT) infeksjonsmodell for respiratorisk melioidose for å studere progresjon av luftveissykdommer av Bp 5,9. Vi har brukt denne infeksjonsmodellen til å karakterisere pusteendringen som oppstår under sykdomsprogresjon gjennom det døende endepunktet.
Protocol
Prosedyrene beskrevet her ble gjennomgått og godkjent av University of Louisville Institutional Biosafety Committee (protokoll # 14-038) og Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll # 19567).
1. Montering av prøvetakingskammeret
- Lag to hull ved hjelp av en 3/4" diamantborkrone på en borepresse på de flate overflatene på en 600 ml firkantet glass bred munn Mason hermetikkkrukke med 95 mm pakning og lufttette lokk, med kausjon og utløserklemmelokk (figur 1).
MERK: Et prøvetakingskammer er ikke kommersielt tilgjengelig og må konstrueres. - Monter et messingskott (1/4" NPT innvendig gjenge, 3/4-16 UNF utvendig gjenge) gjennom begge hullene i Mason-krukken ved hjelp av gummiskiver (3/4" indre diameter, 1" ytre diameter) på begge sider av kontakt mellom skottet og glasset for å sikre en lufttett forsegling.
- Bruk en skottenhet for en trykksensor mens du fester det andre skottet med en Luer-tilkoblet sprøyte for kalibreringsformål.
- For trykksensoren pakker du inn 1/4" NPT-trådene til en høyytelsesmåler trykktransduser med teflontape og trer dem inn i skottet. Bruk et loddejern for å koble trykksensorledningene til en 8-pinners mannlig DIN-kontakt, ved hjelp av produsentens ledningsinstruksjoner for grensesnitt med en kommersielt tilgjengelig datainnsamlingsenhet av høy kvalitet (se Materialtabell).
MERK: Dette krever bruk av en 150 K ohm 1/8 watt 1% metallfilmmotstand i DIN-kontaktledningene. - For kalibreringsporten, bruk en 1/4 "mannlig NPT til 1/8" kvinnelig NPT-adapter for å koble en 1/8" mannlig NPT til en kvinnelig Luer-lås nikkelbelagt kontakt til messingskottet som pakker gjengede forbindelser med Teflon-tape. Bruk en Luer-hette av polypropylentråd for å forsegle Luer-kontakten når den ikke er i bruk.
MERK: Ikke stram skottkontaktene for mye på glasskrukken, da dette vil utvikle sprekker. Om ønskelig kan silikon legges til gummipakningene for å sikre en lufttett forsegling av skottene til glassburken.
- For trykksensoren pakker du inn 1/4" NPT-trådene til en høyytelsesmåler trykktransduser med teflontape og trer dem inn i skottet. Bruk et loddejern for å koble trykksensorledningene til en 8-pinners mannlig DIN-kontakt, ved hjelp av produsentens ledningsinstruksjoner for grensesnitt med en kommersielt tilgjengelig datainnsamlingsenhet av høy kvalitet (se Materialtabell).
2. System oppsett
- Koble prøvetakingskammeret til en broforsterker ved hjelp av en 8-pinners DIN-kontakt og broforsterkeren til datainnsamlingsenheten, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Koble datainnsamlingsenheten til en strømforsyning og en datamaskin som kjører programvare for fysiologisk dataanalyse ved hjelp av produsentens kabler.
MERK: Forsikre deg om at datainnsamlingsenheten er slått på og varmet opp i minst 5 minutter før bruk for å sikre at sensoren stabiliserer målingene. - Start programvaren for å kommunisere med datainnsamlingssystemet.
- Last ned den valgfrie spirometrimodulen i programvaren, og endre standard enhetsinnstillinger fra L/s til μL/s i vinduet Spirometri > Innstillinger .
3. System kalibrering
- I programvaren oppretter du et 4-kanals vindu med følgende datavinduer: Kanal 1: Kildedata med 4 k/s samplingsfrekvens og 1 mV-område ; Kanal 2: Digitalt filter på kanal 1 ved hjelp av et høyt pass 1 Hz automatisk justeringsfilter ; Kanal 3: Utjevning av kanal 2-data ved hjelp av gjennomsnittlig 100 prøver; Kanal 4: Spirometriflyt av kanal 3-data (egendefinert flythode, kalibrert til formel (μL/s) = 120 000 x spenning).
MERK: 120 000 er en plassholderkorrelasjonskoeffisient som vil bli endret under kalibrering. - Sett opp DataPad-analyse av Channel 4 med følgende kolonner: Kolonne 1: Kanal 4-data, kommentarer > full kommentartekst; Kolonne 2: Kanal 4-data, sykliske målinger > gjennomsnittlig syklisk frekvens; Kolonne 3: Kanal 4-data, Sykliske målinger > Gjennomsnittlig syklisk høyde.
- Still inn bildefrekvensen til 100:1 nederst til høyre i diagramvisningen. Lagre denne vinduskonfigurasjonen som en mal for alle fremtidige studier.
- Lukk lokket på prøvekammeret og fest en 25 μL gasstett sprøyte til Luer-skottkontakten. Sett sprøyten med en Chaney-adapter for gjentatte ganger å levere et volum på 20 μL.
MERK: Et valgfritt kort stykke 1/16" slange og Luer/barb-kontakter kan brukes til å koble sprøyten til prøvekammeret. Lange slanger bør imidlertid unngås for å unngå vesentlige endringer i prøvekammerets totale luftvolum. - Trekk 20 μL luft inn i sprøyten ved hjelp av dybdestoppet på Chaney-adapteren.
- Null mengden i programvaren (oppsett > null alle innganger (Alt-Z)) og start et opptak.
- Under opptak, og med en stabil baseline, trykkes/trekkes sprøytestemplet raskt ned i ca. 10 repetisjoner for å gjenskape forsøkspersonenes pusting med et målt pust på 20 μL. Stopp opptaket.
MERK: Frekvensen av kunstige åndedrag bør overstige 2 Hz for å maksimere reproduserbarheten av kalibreringen. - Merk identiteten til den målte prøven ved å høyreklikke på begynnelsen av nummerert pleth-opptak og klikk på Legg til kommentar.
- Tilbakestill sprøyten, null inngangen, og gjenta opptaksmålinger på 20 μL pulser to ekstra ganger (tre totale opptaksøkter).
- Etter å ha fullført alle målingene, bruk datamusen til å velge en del av pusteplingen som nøyaktig representerer de kunstige 20 μL-pustene.
MERK: I DataPad-modulen vises data i forhåndsvisningsoverskriften som gir en midlertidig avlesning av pustefrekvensen (gjennomsnittlig syklisk frekvens, Hz) og pustedybden (gjennomsnittlig syklisk høyde, μL). Forhåndsvisningen av dataene kan spilles inn i DataPad ved hjelp av ikonet Legg til i DataPad . - Se gjennom kolonne 3-dataene (gjennomsnittlig syklisk høyde), og beregn gjennomsnittlig målt pustevolum fra de tre opptakene. Utfør følgende beregning av gjennomsnittlig målt pustevolum: Kalibreringskoeffisient = levert volum / målt volum x 120 000.
MERK: 120 000 var plassholderens strømningshodekalibreringskoeffisient som ble brukt i trinn 3.1, nå modifisert fra målte data. Systemet er nå kalibrert til typisk musepust ved hjelp av gjeldende omgivelsestemperatur og fuktighet. Systemet kan nå overvåke forsøkspersonens pust, og kalibreringen kan utføres på nytt daglig for å ta hensyn til eventuelle svingninger i temperatur/fuktighet.
4. Overvåking av forsøkspersoner
- Åpne en hovedmal som beskrevet i trinn 3.4, eller fullfør trinn 4.2 til 4.3.
- I programvaren oppretter du et 4-kanals vindu med følgende databehandling: Kanal 1: Kildedata med 4 k/s samplingsfrekvens og 1 mV-område; Kanal 2: Digitalt filter på kanal 1 ved hjelp av et High Pass 1 Hz Auto Adjust-filter; Kanal 3: Utjevning av kanal 2-data ved gjennomsnitt på 100 prøver; Kanal 4: Spirometriflyt av kanal 3-data (egendefinert flythode, kalibrert til formel (μL/s) = 120 000 x spenning).
MERK: 120 000 er korrelasjonskoeffisienten beregnet for den nåværende trykksensoren; Brukeren bør imidlertid utføre systemkalibreringen som er beskrevet i trinn 3, og bruke denne brukerdefinerte korrelasjonskoeffisienten i stedet. - Sett opp DataPad-analyse av Channel 4 med følgende kolonner: Kolonne 1: Kanal 4-data, kommentarer > full kommentartekst; Kolonne 2: Kanal 4-data, sykliske målinger > gjennomsnittlig syklisk frekvens; Kolonne 3: Kanal 4-data, Sykliske målinger > Gjennomsnittlig syklisk høyde.
- Plasser motivet i prøvetakingskammer og lukk lokket. For dette eksperimentet ble en bevisst 4-12 ukers kvinnelig albino C57BL / 6J mus (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) brukt.
- Utjevn atmosfæretrykket i kammeret (fra å forsegle lokket) ved å løsne Luer-skotthetten kort og stram igjen.
- Vær oppmerksom på at motivet ikke beveger seg aktivt i prøvetakingskammeret før du nullstiller alle innganger (Alt-Z-snarvei) og begynner et opptak.
MERK: Hvis motivet begynner å bevege seg i prøvetakingskammeret, kan grunnlinjen bevege seg utenfor skalaen, noe som kan løses ved å nullstille alle inngangene midt i et opptak, noe som vil skape et nytt opptak på skalaen. Anta at motivet engasjerer seg i leting eller grooming under opptaket; Legg merke til hvilken del av plethysmografiopptaket som mest nøyaktig gjenspeiler normal pust. - Merk subjektets identitet ved å høyreklikke på begynnelsen av nummerert pleth-opptak og klikk på Legg til kommentar.
- Returner motivet til buret. Begrens tiden i det forseglede prøvetakingskammeret til 5 minutter for å unngå kvelning og stress.
MERK: Risikoen for kvelning er lav gitt at 600 ml luftvolum av prøvekammeret ikke vil bli raskt brukt av en sunn mus puste på <15 ml / min. - Bruk datamusen til å velge en del av pustehullet som nøyaktig representerer motivet som puster.
MERK: I DataPad-modulen vises data i forhåndsvisningsoverskriften som gir en midlertidig avlesning av pustefrekvensen (gjennomsnittlig syklisk frekvens, Hz) og pustevolumet (gjennomsnittlig syklisk høyde, μL). Forhåndsvisningen av dataene kan spilles inn i DataPad ved hjelp av ikonet Legg til i DataPad . - Fortsett å måle forsøksmus én om gangen og ta opp representative deler av pusteleiet til DataPad.
- Etter dataregistrering eksporterer du DataPad-data til Excel. Beregn minuttvolumet på følgende måte: Minuttvolum (ml/min) = Pustefrekvens (Hz) x Pustevolum (μl) x 0,06.
Representative Results
Kalibrering av systemet
Dataanalyseprogramvaren tillater direkte kalibrering av et tilpasset flythode, for eksempel det som er beskrevet her. Dette utføres når du stiller inn spirometristrømmen. Som beskrevet i trinn 3.1, finnes det et alternativ for å legge inn det kjente kalibreringsluftvolumet, som beregner spenningen til volumkorrelasjonskoeffisienten i systemet. Dette genererer imidlertid en korrelasjonskoeffisient basert på en enkelt avlesning, og det har blitt observert at den iboende variasjonen av kalibrering fra en n = 1 standard har dårlig nytte. Den nåværende tilnærmingen kan løse denne mangelen og lar en bruker utføre en daglig kalibrering ved hjelp av flere avlesninger i gjennomsnitt for å beregne en kalibreringskoeffisient. Kalibrering med 20 μL injisert luft ble demonstrert her, som representerer et typisk high-end pustevolum i en typisk mus. Programvaren antar en opprinnelseskår (0,0) og kalibreres dermed fra 0-20 μL ved hjelp av denne tilnærmingen.
Metodikken som foreslås her for sWBP kalibrerer daglig, og tar dermed hensyn til eventuelle svingninger i miljøfuktighet / temperatur. De opprinnelige metodene som ble brukt for spesifikk WBP, dateres tilbake til metodikken til Drorbaugh og Fenn fra 1955, som utviklet WBP for måling av ventilasjon hos menneskelige spedbarn5. Drorbaugh- og Fenn-beregningene tar hensyn til variasjoner i temperatur og fuktighet i miljøet og emnet. Den nåværende tilnærmingen korrigerer for miljøsvingninger ved å kalibrere hver sWBP-økt. Likevel ble det besluttet å ta opp om oppvarming og fukting av pust over nesehulen/lungen til en mus påvirker målingen av et kjent luftvolum. Dermed ble det opprettet et kunstig apparat for å etterligne motivets effekt på oppvarming og fukting av kalibrerte luftmålinger. Luer-kontaktene ble festet til et 15 ml konisk rør og plassert denne forseglede koniske in-line mellom prøvekammeret og den gasstette kalibreringssprøyten. En kalibrering på 20 μL ble utført ved hjelp av et tomt konisk rør holdt ved romtemperatur (23 °C). Det koniske røret ble deretter delvis fylt med destillert vann til like under Luer-kontaktene, noe som ga tid til å balansere hoderommet til den koniske; Kalibreringsvolumet ble deretter målt på nytt for å undersøke effekten av fuktighet. Det koniske røret ble plassert i en varmeblokk og likevektet ved 37 °C i et fuktig miljø, og til slutt likevektet til 37 °C uten vann for å vurdere effekten av gjenstandsoppvarming og uten ekstra bidrag av fuktighet. Figur 2 viser at alle forholdene som ble testet, ikke signifikant påvirket den kalibrerte 20 μL-målingen som ble gitt av den gasstette sprøyten. Fra dette funnet ble det konkludert med at sWBP tilbyr en tilgjengelig tilnærming for å overvåke pusting i forsøksdyr uten behov for komplekse beregninger basert på temperatur og fuktighet hos dyreforsøket, da disse ikke har noen signifikant innvirkning på målt pustevolum.
Overvåking av forsøkspersoner
sWBP ble brukt til å overvåke pusten under sykdommen av dødelige luftveisinfeksjoner med bakteriepatogenet B. pseudomallei. En utfordring med å overvåke pusting i bevisste dyr er nysgjerrigheten til normale friske dyr som beveger seg i prøvekammeret. Musens bevegelse skaper en konstant bevegelig grunnlinje som delvis kan reduseres ved å prekondisjonere forsøkspersoner til kammeret over en periode på flere dager før måling. Dette problemet påvirker primært baselinemålingen hos friske mus, da individene blir sløv under infeksjon, noe som gjør sWBP mye mer håndterbar med redusert fagaktivitet. Det kan være fristende å forsøke å bruke en form for tilbakeholdenhet, enten fysisk eller bedøvelse. Bruk av fysisk tilbakeholdenhet kan påvirke naturlig pust ved å forårsake stress. Videre er bruk av anestetika kjent for å ha uttalt effekt på pustefrekvens og dybde10; dermed ble det besluttet å undersøke virkningen av anestesi med det interne sWBP-apparatet. Isofluran brukes ofte til å utføre in vivo diagnostisk avbildning under infeksjonsmodellene, og derfor ble en C57BL/6-mus bedøvet og overvåket progresjon til utvinning ut av anestesi ved bruk av sWBP. Denne studien ble utført med en juvenil 4 uker gammel albino C57BL / 6J mus for å forlenge vinduet for utvinning fra anestesi. Figur 3 viser at den foretrukne bedøvelsen får mus til å utvise en langsom pustefrekvens med et stort tidevannsvolum av luft. Når mus begynner å komme seg fra sedasjon, øker pustefrekvensen og pustevolumet reduseres, med nettoeffekten at total inspirert luft sakte øker. I denne studien ble det funnet at pustevolumet gjenopprettes til pre-anestesi nivåer innen de første 30 s av utvinning. Pustefrekvensen øker jevnt til grunnpusten gjenopprettes til 2-2,5 minutter etter fjerning fra anestesi. Minuttvolumet fulgte nøye effekten av pustefrekvensen, og nådde baseline minuttvolum med 2,5 minutter etter fjerning fra anestesi. Dette funnet støtter at anestesi ikke bør brukes i sWBP-tilnærmingen. Det påvirker baseline pust dramatisk, ikke overraskende, da anestesi vil redusere vertsmetabolismen, noe som skaper redusert etterspørsel etter inspirert oksygen. Sanering av prøvekammeret bør også vurderes mellom forsøkspersoner for å håndtere studiespesifikk infeksjonskontroll, samt virkningen av feromoner fra urin eller avføring som kan påvirke stresset mellom forsøkspersonene.
WBP er en attraktiv strategi for å overvåke lungefunksjonen i respiratoriske sykdomsmodeller på en ikke-invasiv måte. sWBP ble brukt til å studere hvordan pusten endres under dødelige respiratoriske melioidoseinfeksjoner (figur 4), med tidspunkter som speiler bioluminescensovervåking i lungen. Det ble observert at denne modellen er assosiert med en tidlig utbrudd av sløvhet, som vedvarer på en sakte progressiv måte til utviklingen av den døende sykdommen ca. 3 dager etter infeksjon. Det ble også observert at musens pustefrekvens og totale inspirerte luft (minuttvolum) avtar raskt i løpet av den første infeksjonsdagen og forblir lav for resten av infeksjonsforløpet (figur 4A, C). Dette mønsteret er i samsvar med tidlig begynnende sløvhet, som vedvarer de neste 2 dagene av infeksjonen. I motsetning til dette faller pustevolumet ikke bratt i løpet av de første 24 timene og har i stedet en liten og jevn reduksjon, noe som nærmer seg en lineær nedgang i løpet av 3-dagers sykdomsforløpet (figur 4B).
Figur 1: sWBP-apparater. Et tilpasset prøvekammer ble konstruert av en forseglbar firkantet glasskrukke med skottkontakter på to flate ansikter. Ett skott ble brukt til å montere en målertrykksensor koblet til en broforsterker og datainnsamlingsenhet digitaliseringsenhet via en 8-pinners DIN-tilkobling. Det andre skottet var utstyrt med en Luer-kontakt for kalibrering med en gasstett sprøyte. Enheten var koblet til en PC som kjørte programvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekt av motivets temperatur og fuktighet på pustevolumet. Et 15 ml konisk rør med Luer-kontakter ble installert på linje mellom kalibreringssprøyten på 20 μL og prøvekammeret. Systemet ble kalibrert til 20 μL uten ekstra temperatur-/fuktighetsbidrag fra det koniske røret. Andre målinger ble samlet inn etter likevekt med mettet fuktighet fra destillert vann og/eller oppvarming av det koniske røret fra romtemperatur (23 °C) til kroppstemperatur (37 °C). Ingen signifikant forskjell ble påvist fra n = 5 målinger av hver tilstand ved enveis ANOVA med Tukeys multiple comparison post-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av gassbedøvelse på å puste inn mus. Representative data fra en 4 uker gammel hunn-albino C57BL/6J-mus (8,6 g) ble sedert i 5 minutter med 3 % isofluran i oksygen og overført til et sWBP-prøvekammer. Pleth data ble samlet inn i 150 s etter fjerning fra anestesi. Observanden begynte innledende ambulering ved 100 s etter fjerning fra anestesi. (A) Baseline pusting før anestesi, måling av en pustefrekvens på 4,97 Hz, 9,74 μL pustevolum og 2,91 ml minuttvolum. (B) De første 60 s av endringer i pusten under utvinning fra anestesi. (AB) Vertikal akse som måler μL per pust og horisontal akse i sekunder. (CE) Ventilasjonsdata ble samlet inn i løpet av 150-tallet av utvinning fra anestesi, i gjennomsnitt fra ≥3 pustesykluser per tidspunkt for (C) pustefrekvens, (D) pustevolum og (E) beregnet minuttvolum. Utgangsverdiene for prebedøvelse er angitt med en horisontal stiplet linje i hver respektive graf. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekt av respiratorisk melioidose på vertspust. Fem 8-ukers kvinnelige C57BL/6-mus ble infisert med 4,9 log CFU av bioluminescerende B. pseudomallei-stamme JW270. sWBP ble utført gjennom hele 3-dagers infeksjonsforløpet, og målte pustefrekvens (A) og pustevolum (B). Den totale inspirerte luften ble beregnet som minuttvolum (C). Data for hvert av de fem forsøkspersonene er uavhengig plottet med tredjeordens polynomregresjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
sWBP er en attraktiv tilnærming for å øke forståelsen av luftveisinfeksjon i smådyrmodeller. Det er viktig at det er en ikke-invasiv tilnærming, og som sådan utgjør den ikke en betydelig risiko for å forårsake unødig stress for forsøksdyr under en infeksjonsutfordring. Faktisk er prosedyren for å overvåke forsøkspersonens pusting en rask test som krever flere minutter og minimal pasienthåndtering. Den vitenskapelige fordelen er den høyoppløselige forståelsen av hvordan mikrobielle patogener påvirker lungefunksjonen under sykdom. Denne tilnærmingen vil gi nytte for grunnforskning, forenkle forståelsen av hvordan et patogen forårsaker sykdom, samt gi et translasjonelt verktøy for å forstå hvordan en ny terapeutisk gjenoppretter et forskningsemne til en tilstand av respiratorisk helse.
I dette manuskriptet er det gitt representative resultater for patogenet B. pseudomallei, noe som forårsaker en tidlig sløv respons. Ikke alle bakterielle lungeinfeksjoner finnes på samme måte i museinfeksjonsmodeller. Tidligere erfaring med andre infeksjonsmodeller har vist at bakteriepatogenet Klebsiella pneumoniae presenterer seg som en asymptomatisk infeksjon frem til det punktet hvor mus bukker under for infeksjon, også på omtrent dag 3 etter infeksjon11. Det er en hypotese at vertens behov for inspirert luft (dvs. minuttvolum) kan være nært knyttet til graden av sløvhet som en gitt sykdom presenterer. Fremtidige studier vil være nødvendig for å undersøke hvordan forskjellige bakterielle patogener påvirker lungefunksjonen under luftveissykdom. Det er forstått at forskjellige patogener har unike tilnærminger for å unngå vertsforsvar, inkludert forskjeller i, (1) tilbøyelighet til å være intracellulære eller ekstracellulære patogener, (2) evnen til å forårsake tidlig / sen hypoterm respons og (3) bruk av forskjellige repertoarer av virulensdeterminanter 3,12,13. Derfor er det sannsynlig at ulike sykdomsstrategier vil resultere i unike effekter på lungefunksjon og pust under infeksjon.
De anbefalte innstillingene som er beskrevet i denne protokollen, kan endres for å imøtekomme unike utfordringer som er tilstede under sWBP. Et av de vanligste problemene som oppleves under en sWBP-innspilling, er motivets bevegelse i prøvekammeret. Som nevnt endrer denne bevegelsen grunnlinjen og kan påvirke nøyaktigheten av pustemålinger. Et digitalt filter ble brukt til å normalisere den skiftende grunnlinjen, slik at levedyktige pustemålinger til tross for små bevegelser. Overdreven bevegelse kan skyve en grunnlinjemåling ut av rekkevidden til en nullet inngang. Opptak anbefales ved 1 mV-område (kanal 1-innstilling), noe som gir et kompromiss om fortsatt å observere toppene i plethysmografien samtidig som man unngår tap av data utenfor rekkevidde. For eksepsjonelt aktive personer kan det være nødvendig å utvide opptaksområdet >1 mV for å unngå vedvarende signaler utenfor rekkevidde.
Den anbefalte prosedyren krever daglig kalibrering (eller ved hver økt) for å imøtekomme fuktighet / temperatursvingninger i omgivelsene. Tradisjonell WBP bruker komplekse beregninger som tar hensyn til temperatur / fuktighet i både miljø og emne 5,6. Det er vist at i det nåværende sWBP-apparatet endrer ikke effekten av vertstemperaturen/-fuktigheten signifikant det målte pustevolumet til en kalibreringskilde. Derfor skiller denne tilnærmingen i sWBP seg fundamentalt fra den >50 år gamle tilnærmingen til Drorbaugh og Fenn. Her relaterer sWBP direkte trykkendringer til et målt pustevolum uten ytterligere korreksjon fra verten.
Det er viktig å kontrastere forskningsdyret WBP til det for klinisk WBP. De typer biometriske data som ble forsøkt å samle inn av sWBP er pustevolum og frekvens. Slike målinger samles klinisk ved hjelp av enkelt spirometriutstyr der en pasient holder en pustemonitor til munnen og puster normalt inn i en enhet som overvåker luftstrømmen. Lignende spirometri hos forsøksdyr krever selvbeherskelse, og bidrar dermed til stress og en iboende forstyrrelse i pusten. Derfor er enkel spirometri funksjonell klinisk, men ikke for forsøksdyr. WBP tjener et viktig formål i klinikken for å samle inn avanserte data, inkludert slike målinger som gjenværende lungevolum. Slike data kan bare finnes i sammenheng med at et emne kan følge instruksjonene om hvordan de puster, inkludert tvungen utløp (tømming av lungen ved dyp utånding). Forsøksdyr kan ikke stoles på for å følge pusteinstruksjoner fra en forsker. Mange av de avanserte målingene samlet klinisk under WBP kan ikke reproduseres i forsøksdyr. WBP i forsøksdyr er fundamentalt forskjellig fra klinisk WBP. Animal WBP søker å samle enkle ventilasjonsdata (pustefrekvens og volum) på en ikke-begrenset måte for å unngå dyrestress og pusteforstyrrelse. Så langt ser bruken av WBP i forsøksdyr ut til å replikere teknikkene som brukes i klinisk WBP, inkludert komplekse beregninger basert på miljø- og emnetemperatur og fuktighet, men uten muligheten til å samle inn avanserte data fra et emne som kan følge instruksjonene om hvordan man utfører en tvungen utløp. Med dette i bakhodet ble det søkt å demonstrere om en forenklet versjon av WBP ville være tilstrekkelig til å samle den relevante pustefrekvensen og volumet som er relevant for respiratoriske sykdomsstudier. En kalibreringsøkt ble benyttet, som kompenserte for enhver variasjon i miljøtemperatur og fuktighet. Videre ble det demonstrert med en kunstig mus at den utsatte temperaturen, og fuktigheten til et målt pustevolum ikke har noen signifikant effekt på nøyaktig måling av pustevolum. Det ble konkludert med at sWBP har utmerket anvendelse for å forske på dyreforsøk, uten krav fra brukeren om å bruke tungvint matematisk behandling av data.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Disse studiene ble støttet av National Institutes of Health COBRE grant P20GM125504-01 Sub-Project 8246.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A. Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. Gullo, A. , Springer. (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
