Summary
يقدم هذا البروتوكول بناء واستخدام جهاز مبسط لتخطيط التحجم لكامل الجسم لمراقبة تطور أمراض الجهاز التنفسي البكتيرية بشكل غير جراحي.
Abstract
تخضع النماذج الحيوانية البديلة للمرض ل 3Rs من البحوث المسؤولة. هناك إعادة النظر بشكل متكرر في التحسينات على النماذج الحيوانية لضمان تقدم كل من رعاية الحيوان والرؤى العلمية مع توافر التقنيات الجديدة. توضح هذه المقالة استخدام تخطيط التحجم المبسط لكامل الجسم (sWBP) لدراسة فشل الجهاز التنفسي بشكل غير جراحي في نموذج من داء الميليويد التنفسي المميت. لدى sWBP حساسية للكشف عن التنفس في الفئران خلال مسار المرض بأكمله ، مما يسمح بقياس الأعراض المرتبطة بالموت (بطء التنفس ونقص التنفس) وربما استخدامها لتطوير معايير نقطة النهاية الإنسانية.
بعض فوائد sWBP في سياق أمراض الجهاز التنفسي هي أن مراقبة التنفس المضيف تأتي الأقرب من أي قياس فسيولوجي في تقييم الخلل الوظيفي في الأنسجة المصابة الأولية ، أي الرئة. بالإضافة إلى الأهمية البيولوجية ، فإن استخدام sWBP سريع وغير جراحي ، مما يقلل من الإجهاد في البحث. يوضح هذا العمل استخدام جهاز sWBP الداخلي لمراقبة المرض طوال فترة فشل الجهاز التنفسي في نموذج الفئران من داء الميليويد التنفسي.
Introduction
غالبا ما ترتبط مسببات الأمراض البكتيرية التنفسية باستجابة التهابية في الرئة تؤدي إلى أمراض الرئة 1,2. في البيئة السريرية ، يتضمن تشخيص الالتهاب الرئوي عادة تقنيات المزرعة من البلغم ، وتحليل تشبع الدم بالأكسجين ، والأشعة السينية للصدر. يمكن ترجمة هذه التقنيات لنماذج عدوى الحيوانات الصغيرة ، ولكن تحليل تشبع الأكسجين فقط يمثل تحليلا سريعا في الوقت الفعلي في الفئران لشدة المرض. تم التحقيق سابقا في تشبع الأكسجين في الدم (SpO2) كوسيلة لتتبع تطور المرض في دراسات أمراض الجهاز التنفسي. ومع ذلك ، فإن الفئران المحتضرة لديها قراءات SpO2 عالية بشكل غير متوقع في كل من نموذج Pseudomonas aeruginosa 3 ، والتي ليست مرضا تنبؤيا أو محتضرا ، على الأرجح لأن الفئران يمكنها تعديل نشاطها الفسيولوجي. تحقيقا لهذه الغاية ، لم يتم العثور على مستويات تشخيصية من SpO2 لأمراض الجهاز التنفسي البكتيرية في الفئران حتى الآن.
لذلك ، بحث هذا العمل في استخدام طرق أخرى ذات صلة سريريا للكشف عن آثار أمراض الرئة على وظائف الرئة كقياس فسيولوجي سريع. يوفر تخطيط التحجم المبسط لكامل الجسم (sWBP) الفرصة للتحقيق في معدل التنفس وعمقه كتحليل بيومتري سريع وغير جراحي. أظهرت الدراسات السابقة كيفية تجميع جهاز WBP في المختبر4 ؛ ومع ذلك ، فإن العديد من المكونات الموضحة في مثل هذه الدراسات غير متوفرة تجاريا حاليا. علاوة على ذلك ، يتطلب WBP التقليدي جمع البيانات المعقدة ومعالجة البيانات بناء على الرطوبة ودرجة الحرارة 5,6. ومن ثم ، فقد تقرر تطوير جهاز WBP مبسط يتم معايرته يوميا لدرجة حرارة / رطوبة الغرفة وتقييم ما إذا كانت مساهمة درجة الحرارة / الرطوبة للموضوع نفسه لها أي تأثير على حجم التنفس المقاس أم لا. وبالتالي ، تم إنشاء جهاز sWBP معدل والذي يوفر المواد المتاحة حاليا. علاوة على ذلك ، تم التحقيق فيما إذا كان هذا الجهاز من مصادر معملية يمكنه اكتشاف التغيرات في التنفس المرتبطة بتطور المرض خلال نموذج داء الميليويد التنفسي القاتل في الفئران.
استخدم جهاز sWBP الذي تم إنشاؤه لهذا العمل المعدات والبرامج المتاحة تجاريا لمعالجة بيانات مستشعر الضغط التناظري في قراءات رقمية. تم تركيب مستشعر الضغط في وعاء زجاجي محكم الإغلاق مع موصلات الحاجز. تتمثل فائدة الجرة الزجاجية في الصلابة الهيكلية للمادة ، والتي ستقاوم التغيرات في الضغط الداخلي للجرة ، مما يؤثر على قياسات تغيرات الحجم أثناء مراقبة التنفس. تم تصميم غرفة أخذ العينات لتحتوي على منفذين على السطحين المستويين للجرة المربعة ، أحدهما للوصول إلى الغرفة بواسطة موصل Luer للمعايرة والآخر لإيواء مستشعر الضغط. يحتوي مستشعر الضغط المحدد على محول ضغط مقياس حساس للغاية مع نطاق للتغيرات الصغيرة في الضغط (نطاق 25 ملي بار).
يتم توضيح هذا البروتوكول باستخدام نموذج الفئران من داء الميليويد التنفسي. Burkholderia pseudomallei (Bp) هو العامل البكتيري لداء الميليويد - وهو مرض مرتبط بالمناطق الاستوائية في العالم7. تم العثور على BP في البيئة ، وتحديدا في البيئات الرطبة للمياه الراكدة والتربة الرطبة ، والتي تسبب عادة التهابات تحت الجلد من جروح / خدوش المضيفين المعرضين للإصابة. ومع ذلك ، فإن Bp معدي أيضا عند استنشاقه ويشكل تهديدا محتملا للاستخدام في الإرهاب البيولوجي عن طريق تشتت الهباء الجوي. بينما يتطلب Bp الخبيث بالكامل التعامل معه في مختبر BSL-3 ، فقد تم تصميم سلالة متحولة كبسولية مسبقا ، والتي يمكن التعامل معها بأمان في BSL-2 واستبعادها من معايير العامل المحدد8. علاوة على ذلك ، تم تطوير نموذج عدوى داخل القصبة الهوائية بوساطة التنبيب (IMIT) لداء الميليويد التنفسي لدراسة تطور أمراض الجهاز التنفسي ل Bp 5,9. لقد استخدمنا نموذج العدوى هذا لتوصيف التغير في التنفس الذي يحدث أثناء تطور المرض من خلال نقطة النهاية المحتضرة.
Protocol
تمت مراجعة الإجراءات الموضحة هنا والموافقة عليها من قبل لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية بجامعة لويزفيل (البروتوكول # 14-038) واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (البروتوكول # 19567).
1. تجميع غرفة أخذ العينات
- قم بإنشاء فتحتين باستخدام مثقاب ماسي 3/4 بوصة على مكبس حفر على الأسطح المستوية لجرة تعليب ميسون ذات فم عريض سعة 600 مل من الزجاج المربع مع حشية 95 مم وأغطية محكمة الإغلاق ، مع أغطية الكفالة والمشبك الزناد (الشكل 1).
ملاحظة: غرفة أخذ العينات غير متاحة تجاريا ويجب بناؤها. - قم بتجميع حاجز نحاسي (1/4 "خيط داخلي NPT ، خيط خارجي 3/4-16 UNF) من خلال كل من الثقوب الموجودة في جرة Mason باستخدام غسالات مطاطية (3/4 "قطر داخلي ، 1" قطر خارجي) على كلا وجهي التلامس بين الحاجز والزجاج لضمان ختم محكم الإغلاق.
- استخدم مجموعة حاجز واحدة لمستشعر الضغط أثناء توصيل الحاجز الآخر بواسطة حقنة متصلة باللور لأغراض المعايرة.
- بالنسبة لمستشعر الضغط ، قم بلف خيوط NPT مقاس 1/4 بوصة لمحول ضغط مقياس عالي الأداء بشريط تفلون وقم بربطها في الحاجز. استخدم مكواة لحام لتوصيل أسلاك مستشعر الضغط بموصل DIN ذكر مكون من 8 سنون ، باستخدام تعليمات أسلاك الشركة المصنعة للواجهة مع جهاز الحصول على بيانات عالي الجودة متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يتطلب ذلك استخدام مقاوم فيلم معدني 150 كيلو أوم 1/8 واط 1٪ داخل أسلاك موصل DIN. - بالنسبة لمنفذ المعايرة ، استخدم 1/4 "ذكر NPT إلى 1/8" محول NPT أنثى لتوصيل 1/8 "ذكر NPT بموصل أنثى مطلي بالنيكل قفل Luer إلى الحاجز النحاسي التفاف الوصلات الملولبة بشريط تفلون. استخدم غطاء Luer للذكور الملولبين من مادة البولي بروبيلين لإغلاق موصل Luer عندما لا يكون قيد الاستخدام.
ملاحظة: لا تفرط في ربط موصلات الحاجز على البرطمان الزجاجي ، لأن ذلك سيؤدي إلى حدوث تشققات. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إضافة السيليكون إلى الحشوات المطاطية لضمان إحكام إغلاق الحواجز إلى الجرة الزجاجية.
- بالنسبة لمستشعر الضغط ، قم بلف خيوط NPT مقاس 1/4 بوصة لمحول ضغط مقياس عالي الأداء بشريط تفلون وقم بربطها في الحاجز. استخدم مكواة لحام لتوصيل أسلاك مستشعر الضغط بموصل DIN ذكر مكون من 8 سنون ، باستخدام تعليمات أسلاك الشركة المصنعة للواجهة مع جهاز الحصول على بيانات عالي الجودة متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
2. إعداد النظام
- قم بتوصيل غرفة أخذ العينات بمضخم جسر باستخدام موصل DIN ذي 8 سنون ومضخم الجسر بجهاز الحصول على البيانات ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- قم بتوصيل جهاز الحصول على البيانات بمصدر طاقة وجهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل برنامج تحليل البيانات الفسيولوجية باستخدام كبلات الشركة المصنعة.
ملاحظة: تأكد من تشغيل جهاز الحصول على البيانات وتسخينه لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الاستخدام للتأكد من أن المستشعر يعمل على تثبيت قياساته. - بدء البرنامج للتفاعل مع نظام الحصول على البيانات.
- قم بتنزيل وحدة قياس التنفس الاختيارية داخل البرنامج ، وقم بتعديل إعدادات الوحدة الافتراضية من L / s إلى μL / s في نافذة إعدادات > قياس التنفس .
3. معايرة النظام
- داخل البرنامج ، قم بإنشاء نافذة ذات 4 قنوات مع نوافذ البيانات التالية: القناة 1: بيانات المصدر بمعدل عينة 4 كيلو / ثانية ونطاق 1 مللي فولت ؛ القناة 2: مرشح رقمي للقناة 1 باستخدام مرشح ضبط تلقائي عالي التمرير 1 هرتز ؛ القناة 3: تجانس بيانات القناة 2 بمتوسط 100 عينة ؛ القناة 4: تدفق قياس التنفس لبيانات القناة 3 (رأس التدفق المخصص ، تمت معايرته إلى الصيغة (ميكرولتر / ثانية) = 120000 × الجهد).
ملاحظة: 120000 هو معامل ارتباط عنصر نائب سيتم تعديله أثناء المعايرة. - قم بإعداد تحليل DataPad للقناة 4 باستخدام الأعمدة التالية: العمود 1: بيانات القناة 4 ، التعليقات > نص التعليق الكامل ؛ العمود 2: بيانات القناة 4 ، القياسات الدورية > متوسط التردد الدوري ؛ العمود 3: بيانات القناة 4 ، القياسات الدورية > متوسط الارتفاع الدوري.
- اضبط معدل الإطارات على 100: 1 في الزاوية السفلية اليمنى من عرض المخطط. احفظ تكوين هذه النافذة كقالب لجميع الدراسات المستقبلية.
- أغلق غطاء غرفة العينة وقم بتوصيل حقنة محكمة الغاز سعة 25 ميكرولتر بموصل حاجز Luer. قم بتركيب المحقنة مع محول Chaney مضبوطا لتوصيل حجم 20 ميكرولتر بشكل متكرر.
ملاحظة: يمكن استخدام قطعة قصيرة اختيارية من أنابيب مقاس 1/16 بوصة وموصلات Luer / Barbb لتوصيل المحقنة بغرفة العينة. ومع ذلك ، يجب تجنب الأنابيب الطويلة لتجنب التغييرات الكبيرة في إجمالي حجم الهواء في غرفة العينة. - اسحب 20 ميكرولتر من الهواء إلى المحقنة باستخدام توقف عمق محول Chaney.
- صفر pleth في البرنامج (الإعداد > صفر جميع المدخلات (Alt-Z)) وبدء التسجيل.
- أثناء التسجيل ، ومع خط أساس مستقر ، قم بالضغط / السحب السريع لمكبس المحقنة لما يقرب من 10 تكرارات لتكرار تنفس الموضوع مع قياس 20 ميكرولتر. أوقف التسجيل.
ملاحظة: يجب أن يتجاوز تردد التنفس الاصطناعي 2 هرتز لزيادة قابلية استنساخ المعايرة. - قم بتسمية هوية العينة المقاسة بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق بداية تسجيل pleth المرقم والنقر فوق إضافة تعليق.
- أعد ضبط المحقنة ، وقم بتصفير الإدخال ، وكرر قياسات التسجيل لنبضة 20 ميكرولتر مرتين إضافيتين (ثلاث جلسات تسجيل إجمالية).
- بعد الانتهاء من جميع القياسات ، استخدم فأرة الكمبيوتر لتحديد جزء من التنفس الذي يمثل بدقة الأنفاس الاصطناعية 20 ميكرولتر.
ملاحظة: داخل وحدة DataPad ، ستظهر البيانات في رأس المعاينة مما يوفر قراءة مؤقتة لمعدل التنفس (متوسط التردد الدوري ، هرتز) وعمق التنفس (متوسط الارتفاع الدوري ، ميكرولتر). يمكن تسجيل معاينة البيانات في DataPad باستخدام أيقونة إضافة إلى DataPad . - راجع بيانات العمود 3 (متوسط الارتفاع الدوري) ، واحسب متوسط حجم التنفس المقاس من التسجيلات الثلاثة. قم بإجراء الحساب التالي لمتوسط حجم التنفس المقاس: معامل المعايرة = حجم التسليم / الحجم المقاس × 120,000.
ملاحظة: كان 120000 هو معامل معايرة رأس التدفق النائب المستخدم في الخطوة 3.1 المعدل الآن من البيانات المقاسة. تتم معايرة النظام الآن لتنفس الفأر النموذجي باستخدام درجة الحرارة والرطوبة البيئية الحالية. يمكن للنظام الآن مراقبة تنفس الموضوع ، ويمكن إعادة إجراء المعايرة يوميا لحساب أي تقلبات في درجة الحرارة / الرطوبة.
4. مراقبة الموضوع
- افتح قالبا رئيسيا كما هو موضح في الخطوة 3.4، أو أكمل الخطوات من 4.2 إلى 4.3.
- داخل البرنامج ، قم بإنشاء نافذة 4 قنوات مع معالجة البيانات التالية: القناة 1: بيانات المصدر بمعدل عينة 4 كيلو / ثانية ونطاق 1 مللي فولت ؛ القناة 2: مرشح رقمي للقناة 1 باستخدام مرشح ضبط تلقائي عالي التمريرات 1 هرتز ؛ القناة 3: تجانس بيانات القناة 2 بمتوسط 100 عينة ؛ القناة 4: تدفق قياس التنفس لبيانات القناة 3 (رأس التدفق المخصص ، تمت معايرته إلى الصيغة (ميكرولتر / ثانية) = 120000 × الجهد).
ملاحظة: 120,000 هو معامل الارتباط المحسوب لمستشعر الضغط الحالي ؛ ومع ذلك، يجب على المستخدم إجراء معايرة النظام الموضحة في الخطوة 3 واستخدام معامل الارتباط المعرف من قبل المستخدم بدلا من ذلك. - قم بإعداد تحليل DataPad للقناة 4 باستخدام الأعمدة التالية: العمود 1: بيانات القناة 4 ، التعليقات > نص التعليق الكامل ؛ العمود 2: بيانات القناة 4 ، القياسات الدورية > متوسط التردد الدوري ؛ العمود 3: بيانات القناة 4 ، القياسات الدورية > متوسط الارتفاع الدوري.
- ضع الموضوع في غرفة أخذ العينات وأغلق الغطاء. في هذه التجربة ، تم استخدام فأرة ألبينو واعية من 4 إلى 12 أسبوعا (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J).
- قم بموازنة الضغط الجوي في الغرفة (من إغلاق الغطاء) عن طريق فك غطاء حاجز Luer لفترة وجيزة وإعادة إحكام ربطه.
- لاحظ أن الموضوع لا يتحرك بنشاط داخل غرفة أخذ العينات قبل تصفير جميع المدخلات (اختصار Alt-Z) وبدء التسجيل.
ملاحظة: إذا بدأ الموضوع في التحرك في غرفة أخذ العينات ، فقد يتحرك خط الأساس خارج المقياس ، والذي يمكن معالجته عن طريق إعادة تصفير جميع المدخلات في منتصف التسجيل ، مما سيؤدي إلى إنشاء تسجيل جديد على المقياس. افترض أن الموضوع يشارك في الاستكشاف أو الاستمالة أثناء التسجيل ؛ لاحظ أي جزء من تسجيل تخطيط التحجم يعكس بدقة التنفس الطبيعي. - قم بتسمية هوية الموضوع بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق بداية التسجيل المرقم والنقر فوق إضافة تعليق.
- أعد الموضوع إلى قفصه. قلل من الوقت الذي تقضيه في غرفة أخذ العينات المغلقة إلى 5 دقائق لتجنب الاختناق والإجهاد.
ملاحظة: خطر الاختناق منخفض بالنظر إلى أن حجم الهواء البالغ 600 مل في غرفة العينة لن يتم إنفاقه بسرعة بواسطة فأر سليم يتنفس بسرعة عند <15 مل / دقيقة. - استخدم فأرة الكمبيوتر لتحديد جزء من التنفس الذي يمثل بدقة تنفس الموضوع.
ملاحظة: ضمن وحدة DataPad، ستظهر البيانات في رأس المعاينة مما يوفر قراءة مؤقتة لمعدل التنفس (متوسط التردد الدوري، هرتز) وحجم التنفس (متوسط الارتفاع الدوري، ميكرولتر). يمكن تسجيل معاينة البيانات في DataPad باستخدام أيقونة إضافة إلى DataPad . - استمر في قياس الفئران الخاضعة واحدة تلو الأخرى وتسجيل أقسام تمثيلية من التنفس إلى DataPad.
- بعد تسجيل البيانات ، قم بتصدير بيانات DataPad إلى Excel. احسب حجم الدقيقة على النحو التالي: حجم الدقيقة (مل / دقيقة) = معدل التنفس (هرتز) × حجم التنفس (ميكرولتر) × 0.06.
Representative Results
معايرة النظام
يسمح برنامج تحليل البيانات بالمعايرة المباشرة لرأس تدفق مخصص ، مثل الموضح هنا. يتم تنفيذ ذلك عند ضبط تدفق قياس التنفس. كما هو موضح في الخطوة 3.1 ، يوجد خيار لإدخال حجم هواء المعايرة المعروف ، والذي يحسب معامل ارتباط الجهد إلى الحجم داخل النظام. ومع ذلك ، فإن هذا يولد معامل ارتباط يعتمد على قراءة واحدة ، وقد لوحظ أن الاختلاف المتأصل في المعايرة من معيار n = 1 له فائدة ضعيفة. يمكن للنهج الحالي معالجة هذا القصور ويسمح للمستخدم بإجراء معايرة يومية باستخدام قراءات متعددة في المتوسط لحساب معامل المعايرة. تم توضيح المعايرة مع 20 ميكرولتر من الهواء المحقون هنا ، وهو ما يمثل حجم التنفس النموذجي المتطور في الماوس النموذجي. يفترض البرنامج اعتراض الأصل (0,0) وبالتالي يتم معايرته من 0-20 ميكرولتر باستخدام هذا النهج.
تتم معايرة المنهجية المقترحة هنا ل sWBP يوميا ، وبالتالي حساب أي تقلبات في الرطوبة / درجة الحرارة البيئية. تعود الطرق الأصلية المستخدمة في WBP المحدد إلى منهجية Drorbaugh و Fenn من عام 1955 ، الذين طوروا WBP لقياس التهوية عند الرضعالرضع 5. تمثل حسابات Drorbaugh و Fenn الاختلافات في درجة الحرارة والرطوبة في البيئة والموضوع. يصحح النهج الحالي التقلبات البيئية عن طريق معايرة كل جلسة من جلسات sWBP. ومع ذلك ، فقد تقرر معالجة ما إذا كان تسخين وترطيب التنفس عبر تجويف الأنف / الرئة للفأر يؤثر على قياس حجم معروف من الهواء. وهكذا ، تم إنشاء جهاز اصطناعي لتقليد تأثير الموضوع على تسخين وترطيب قياسات الهواء المعايرة. تم توصيل موصلات Luer بأنبوب مخروطي سعة 15 مل ووضعت هذا المخروط المختوم في خط بين غرفة العينة وحقنة المعايرة محكمة الإغلاق. تم إجراء معايرة 20 ميكرولتر باستخدام أنبوب مخروطي فارغ مثبت في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). ثم تم ملء الأنبوب المخروطي جزئيا بالماء المقطر إلى أسفل موصلات Luer مباشرة ، مما يتيح الوقت لموازنة مساحة الرأس المخروطية. ثم تم إعادة قياس حجم المعايرة للتحقيق في تأثير الرطوبة. تم وضع الأنبوب المخروطي في كتلة تسخين وتوازنه عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة ، وأخيرا تمت موازنته إلى 37 درجة مئوية بدون ماء لتقييم تأثير تسخين الموضوع وبدون مساهمة إضافية من الرطوبة. يوضح الشكل 2 أن جميع الظروف التي تم اختبارها لم تؤثر بشكل كبير على قياس 20 ميكرولتر المعاير الذي توفره المحقنة محكمة الغلق. من هذه النتيجة ، استنتج أن sWBP يوفر نهجا يمكن الوصول إليه لمراقبة التنفس في البحث دون الحاجة إلى حسابات معقدة تستند إلى درجة حرارة ورطوبة الحيوان ، لأن هذه لا تؤثر بشكل كبير على حجم التنفس المقاس.
مراقبة الموضوع
تم استخدام sWBP لمراقبة التنفس أثناء مرض التهابات الجهاز التنفسي القاتلة مع العامل الممرض البكتيري B. pseudomallei. يتمثل أحد تحديات مراقبة التنفس في الحيوانات الواعية في فضول الحيوانات السليمة الطبيعية التي تتحرك داخل غرفة العينة. تخلق حركة الماوس خط أساس متحرك باستمرار يمكن تخفيفه جزئيا عن طريق التكييف المسبق للغرفة على مدى عدة أيام قبل القياس. تؤثر هذه المشكلة بشكل أساسي على قياس خط الأساس في الفئران السليمة ، حيث يصبح الأشخاص خاملين أثناء الإصابة ، مما يجعل sWBP أكثر قابلية للإدارة مع انخفاض نشاط الموضوع. قد يكون من المغري محاولة استخدام شكل من أشكال ضبط النفس ، سواء كان جسديا أو تخديرا. قد يؤثر استخدام ضبط النفس البدني على التنفس الطبيعي عن طريق التسبب في الإجهاد. علاوة على ذلك ، من المعروف أن استخدام التخدير له تأثيرات واضحة على معدل التنفس والعمق10 ؛ وبالتالي ، تقرر التحقيق في تأثير التخدير باستخدام جهاز sWBP الداخلي. يستخدم Isoflurane بشكل شائع لإجراء التصوير التشخيصي في الجسم الحي أثناء نماذج العدوى ، وبالتالي ، تم تخدير الماوس C57BL / 6 ومراقبة التقدم حتى الشفاء من التخدير باستخدام sWBP. أجريت هذه التجربة على فأر ألبينو C57BL / 6J للأحداث يبلغ من العمر 4 أسابيع لإطالة نافذة الشفاء من التخدير. يوضح الشكل 3 أن المخدر المفضل يجعل الفئران تظهر معدل تنفس بطيء مع حجم كبير من المد والجزر من الهواء. عندما تبدأ الفئران في التعافي من التخدير ، يزداد معدل التنفس وينخفض حجم التنفس ، مع التأثير الصافي الذي يزيد إجمالي الهواء المستوحى منه ببطء. في هذه التجربة ، وجد أن حجم التنفس يتم استعادته إلى مستويات ما قبل التخدير خلال أول 30 ثانية من الشفاء. يزداد معدل التنفس بشكل مطرد حتى يتم استعادة التنفس الأساسي إلى 2-2.5 دقيقة بعد الإزالة من التخدير. تابع حجم الدقيقة عن كثب تأثيرات معدل التنفس ، حيث وصل إلى حجم الدقيقة الأساسي بمقدار 2.5 دقيقة بعد الإزالة من التخدير. تدعم هذه النتيجة أنه لا ينبغي استخدام التخدير في نهج sWBP. إنه يؤثر بشكل كبير على التنفس الأساسي ، وليس من المستغرب ، لأن التخدير سيبطئ عملية التمثيل الغذائي للمضيف ، مما يؤدي إلى انخفاض الطلب على الأكسجين الملهم. يجب أيضا مراعاة الصرف الصحي لغرفة العينة بين الأشخاص لمعالجة مكافحة العدوى الخاصة بالدراسة بالإضافة إلى تأثير الفيرومونات من البول أو البراز التي يمكن أن تؤثر على الإجهاد بين الأشخاص.
WBP هي استراتيجية جذابة لمراقبة وظائف الرئة في نماذج أمراض الجهاز التنفسي بطريقة غير جراحية. تم استخدام sWBP لدراسة كيفية تغير التنفس أثناء عدوى داء الميليويد التنفسي المميت (الشكل 4) ، مع نقاط زمنية تعكس مراقبة التلألؤ الحيوي في الرئة. وقد لوحظ أن هذا النموذج يرتبط ببداية مبكرة من الخمول ، والتي تستمر بطريقة تدريجية ببطء حتى تطور المرض المحتضرة في حوالي 3 أيام بعد الإصابة. ولوحظ أيضا أن معدل التنفس وإجمالي الهواء المستوحى (حجم الدقيقة) للفئران ينخفض بسرعة خلال اليوم الأول من الإصابة ويظل منخفضا لبقية مسار العدوى (الشكل 4 أ ، ج). هذا النمط يتوافق مع الخمول في وقت مبكر ، والذي يستمر لمدة 2 أيام القادمة من العدوى. في المقابل ، لا ينخفض حجم التنفس بشكل حاد خلال أول 24 ساعة وبدلا من ذلك يكون لديه انخفاض طفيف وثابت ، والذي يقترب من انخفاض خطي على مدار 3 أيام من المرض (الشكل 4 ب).
الشكل 1: جهاز sWBP. تم بناء غرفة عينة مخصصة من جرة زجاجية مربعة قابلة للغلق مع موصلات حاجز على وجهين مسطحين. تم استخدام حاجز واحد لتركيب مستشعر ضغط مقياس متصل بمكبر صوت الجسر ومحول رقمي لجهاز الحصول على البيانات عبر اتصال DIN ذي 8 سنون. تم تزويد الحاجز الثاني بموصل Luer للمعايرة بواسطة حقنة محكمة الغلق. تم توصيل الجهاز بجهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل البرنامج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تأثير درجة حرارة الموضوع والرطوبة على حجم التنفس. تم تركيب أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع موصلات Luer في خط مستقيم بين حقنة المعايرة 20 ميكرولتر وغرفة العينة. تمت معايرة النظام إلى 20 ميكرولتر مع عدم وجود مساهمة إضافية في درجة الحرارة / الرطوبة من الأنبوب المخروطي. تم جمع قياسات أخرى بعد التوازن مع الرطوبة المشبعة من الماء المقطر و / أو ارتفاع درجة حرارة الأنبوب المخروطي من درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) إلى درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية). لم يتم الكشف عن أي فرق معنوي من n = 5 قياسات لكل حالة بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey's Multiple Comparison البعدي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تأثير التخدير الغازي على التنفس في الفئران. تم تخدير البيانات التمثيلية من أنثى الفأر الأبيض C57BL / 6J البالغة من العمر 4 أسابيع (8.6 جم) لمدة 5 دقائق مع 3٪ إيزوفلوران في الأكسجين ونقلها إلى غرفة عينة sWBP. تم جمع بيانات Pleth لمدة 150 ثانية بعد الإزالة من التخدير. بدأ الموضوع في الإسعاف الأولي بمقدار 100 ثانية بعد الإزالة من التخدير. (أ) التنفس الأساسي قبل التخدير ، وقياس معدل التنفس 4.97 هرتز ، وحجم التنفس 9.74 ميكرولتر ، وحجم الدقيقة 2.91 مل. ب: أول 60 ثانية من التغيرات التي تطرأ على التنفس أثناء التعافي من التخدير. (أ-ب) المحور الرأسي قياس ميكرولتر لكل نفس والمحور الأفقي في ثوان. (جيم - ه) تم جمع بيانات التهوية خلال 150 ثانية من التعافي من التخدير ، بمتوسط من ≥3 دورات تنفس لكل نقطة زمنية ل (C) معدل التنفس ، (D) حجم التنفس ، و (E) حجم الدقيقة المحسوب. يشار إلى قيم خط الأساس قبل التخدير بخط منقط أفقي في كل رسم بياني على حدة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تأثير داء الميليويد التنفسي على تنفس المضيف. أصيبت خمس إناث من فئران C57BL / 6 لمدة 8 أسابيع ب 4.9 سجل CFU من سلالة B. pseudomallei المضيئة بيولوجيا JW270. تم إجراء sWBP طوال فترة العدوى لمدة 3 أيام ، وقياس معدل التنفس (A) وحجم التنفس (B). تم حساب إجمالي الهواء المستوحى على أنه حجم الدقيقة (C). يتم رسم البيانات لكل من الموضوعات الخمسة بشكل مستقل مع الانحدار متعدد الحدود من الدرجة الثالثة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
sWBP هو نهج جذاب لتعزيز فهم عدوى الجهاز التنفسي في نماذج الحيوانات الصغيرة. الأهم من ذلك ، أنه نهج غير جراحي ، وعلى هذا النحو ، فإنه لا يشكل خطرا كبيرا للتسبب في إجهاد لا داعي له لحيوانات البحث أثناء تحدي العدوى. في الواقع ، فإن إجراء مراقبة تنفس الموضوع هو اختبار سريع يتطلب عدة دقائق والحد الأدنى من التعامل مع الموضوع. الفائدة العلمية هي الفهم عالي الدقة لكيفية تأثير مسببات الأمراض الميكروبية على وظائف الرئة أثناء المرض. سيوفر هذا النهج فائدة للبحوث الأساسية ، مما يسهل فهم كيفية تسبب العامل الممرض في المرض ، بالإضافة إلى توفير فائدة انتقالية لفهم كيف يعيد العلاج الجديد موضوع البحث إلى حالة صحة الجهاز التنفسي.
في هذه المخطوطة ، يتم تقديم نتائج تمثيلية للممرض B. pseudomallei ، الذي يسبب استجابة خاملة مبكرة. ليست كل التهابات الرئة البكتيرية موجودة بنفس الطريقة في نماذج عدوى الفئران. أظهرت التجربة السابقة مع نماذج العدوى الأخرى أن العامل الممرض البكتيري Klebsiella pneumoniae يظهر كعدوى بدون أعراض حتى النقطة التي تستسلم فيها الفئران للعدوى ، أيضا في اليوم 3 تقريبا بعد الإصابة11. يفترض أن طلب المضيف على الهواء المستوحى (أي الحجم الدقيق) قد يرتبط ارتباطا وثيقا بدرجة الخمول التي يظهر بها مرض معين. ستكون هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية لفحص كيفية تأثير مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة على وظائف الرئة أثناء أمراض الجهاز التنفسي. من المفهوم أن مسببات الأمراض المختلفة لها طرق فريدة للتهرب من دفاع المضيف ، بما في ذلك الاختلافات في ، (1) الميل إلى أن تكون مسببات الأمراض داخل الخلايا أو خارج الخلية ، (2) القدرة على التسبب في استجابة منخفضة الحرارة مبكرة / متأخرة ، و (3) استخدام ذخيرة مختلفة من محددات الفوعة3،12،13. لذلك ، من المحتمل أن تؤدي استراتيجيات المرض المختلفة إلى تأثيرات فريدة على وظائف الرئة والتنفس أثناء العدوى.
يمكن تعديل الإعدادات الموصى بها الموضحة في هذا البروتوكول لاستيعاب التحديات الفريدة الموجودة أثناء sWBP. واحدة من القضايا الشائعة التي تواجهها أثناء جلسة تسجيل sWBP هي حركة الموضوع داخل غرفة العينة. كما ذكرنا ، تعدل هذه الحركة خط الأساس ويمكن أن تؤثر على دقة قياسات التنفس. تم استخدام مرشح رقمي لتطبيع خط الأساس المتغير ، مما يسمح بقياسات التنفس القابلة للتطبيق على الرغم من الحركات الصغيرة. يمكن أن تؤدي الحركة المفرطة إلى دفع قياس خط الأساس خارج نطاق المدخلات الصفرية. يوصى بالتسجيلات في نطاق 1 مللي فولت (إعداد القناة 1) ، والذي يوفر حلا وسطا لاستمرار مراقبة قمم تخطيط التحجم مع تجنب فقدان البيانات خارج النطاق. بالنسبة للأهداف النشطة بشكل استثنائي ، قد يكون من الضروري توسيع نطاق التسجيل >1 مللي فولت لتجنب الإشارات المستمرة خارج النطاق.
يتطلب الإجراء الموصى به معايرة يومية (أو في كل جلسة) لاستيعاب تقلبات الرطوبة / درجة الحرارة البيئية. يستخدم WBP التقليدي حسابات معقدة تأخذ في الاعتبار درجة الحرارة / الرطوبة لكل من البيئة والموضوع 5,6. لقد ثبت أنه في جهاز sWBP الحالي ، لا تغير تأثيرات درجة حرارة / رطوبة المضيف بشكل كبير حجم التنفس المقاس لمصدر المعايرة. لذلك ، يختلف هذا النهج في sWBP اختلافا جوهريا عن نهج Drorbaugh و Fenn البالغ من العمر >50 عاما. هنا ، يربط sWBP بشكل مباشر تغيرات الضغط بحجم التنفس المقاس دون مزيد من التصحيح من المضيف.
من الضروري مقارنة WBP الحيواني البحثي ب WBP السريري. أنواع البيانات البيومترية التي تمت محاولة جمعها بواسطة sWBP هي حجم التنفس وتردده. يتم جمع هذه القياسات سريريا باستخدام معدات قياس التنفس البسيطة التي يمسك فيها المريض بجهاز مراقبة التنفس في فمه ويتنفس بشكل طبيعي في جهاز يراقب تدفق الهواء. يتطلب قياس التنفس المماثل في البحث ضبط النفس ، مما يساهم في الإجهاد واضطراب متأصل في التنفس. لذلك ، فإن قياس التنفس البسيط يعمل سريريا ولكن ليس لحيوانات البحث. يخدم WBP غرضا أساسيا في العيادة لجمع البيانات المتقدمة ، بما في ذلك قياسات مثل حجم الرئة المتبقي. لا يمكن احتواء هذه البيانات إلا في سياق قدرة الشخص على اتباع التعليمات حول كيفية تنفسه ، بما في ذلك انتهاء الصلاحية القسري (إفراغ رئته عن طريق الزفير العميق). لا يمكن الاعتماد على البحث لاتباع تعليمات التنفس من الباحث. لا يمكن استنساخ العديد من القياسات المتقدمة التي تم جمعها سريريا خلال WBP في البحث. يختلف WBP في البحث اختلافا جوهريا عن WBP السريري. يسعى Animal WBP إلى جمع بيانات تهوية بسيطة (معدل التنفس وحجمه) بطريقة غير مقيدة لتجنب إجهاد الحيوانات واضطراب التنفس. حتى الآن ، يبدو أن استخدام WBP في البحث يكرر التقنيات المستخدمة في WBP السريري ، بما في ذلك الحسابات المعقدة القائمة على درجة الحرارة والرطوبة البيئية والموضوعية ، ولكن دون القدرة على جمع البيانات المتقدمة من موضوع يمكنه اتباع التعليمات حول كيفية إجراء انتهاء الصلاحية القسري. مع وضع ذلك في الاعتبار ، تم السعي إلى إثبات ما إذا كانت نسخة مبسطة من WBP كافية لجمع تواتر التنفس ذي الصلة وحجمه ذي الصلة بدراسات أمراض الجهاز التنفسي. تم استخدام جلسة معايرة ، والتي عوضت عن أي اختلاف في درجة الحرارة والرطوبة البيئية. علاوة على ذلك ، تم إثبات ذلك باستخدام فأر اصطناعي أن درجة الحرارة والرطوبة لحجم التنفس المقاس ليس لها تأثير كبير على قياس حجم التنفس بدقة. تم التوصل إلى أن sWBP له تطبيق ممتاز للبحث في الدراسات على الحيوانات ، دون الحاجة إلى المستخدم لاستخدام معالجة رياضية مرهقة للبيانات.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسات من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة COBRE P20GM125504-01 المشروع الفرعي 8246.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A. Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. Gullo, A. , Springer. (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
