Summary
Bu protokol, bakteriyel solunum yolu hastalığının ilerlemesini invaziv olmayan bir şekilde izlemek için Basitleştirilmiş Tüm Vücut Pletismografi aparatının yapımını ve kullanımını sunar.
Abstract
Vekil hayvan hastalık modelleri, Sorumlu Araştırmanın 3R'sine tabidir. Hem hayvan refahının hem de bilimsel anlayışların yeni teknolojilerin mevcudiyeti ile ilerlemesini sağlamak için hayvan modellerinde iyileştirmelerin sık sık yeniden gözden geçirilmesi söz konusudur. Bu makalede, ölümcül solunum melioidozu modelinde solunum yetmezliğini invaziv olmayan bir şekilde incelemek için Basitleştirilmiş Tüm Vücut Pletismografisinin (sWBP) kullanımı gösterilmektedir. sWBP, hastalığın seyrinin tamamı boyunca farelerde nefes almayı tespit etme duyarlılığına sahiptir ve can çekişen ilişkili semptomların (bradipne ve hipopne) ölçülmesine ve potansiyel olarak insancıl son nokta kriterleri geliştirmek için kullanılmasına izin verir.
Solunum yolu hastalığı bağlamında sWBP'nin faydalarından bazıları, konakçı nefes izlemesinin, birincil enfekte dokunun, yani akciğerin işlev bozukluğunu değerlendirmede herhangi bir fizyolojik ölçüme en yakın olmasıdır. Biyolojik önemine ek olarak, sWBP'nin kullanımı hızlı ve invaziv değildir, bu da araştırma hayvanlarında stresi en aza indirir. Bu çalışma, solunum melioidozunun murin modelinde solunum yetmezliği seyri boyunca hastalığı izlemek için şirket içi sWBP aparatının kullanımını göstermektedir.
Introduction
Respiratuar bakteriyel patojenler sıklıkla akciğerde akciğer patolojisine yol açan inflamatuar bir yanıt ile ilişkilidir 1,2. Klinik ortamda, pnömoni tanısı tipik olarak balgam, kan-oksijen doygunluk analizi ve göğüs röntgeninden kültür tekniklerini içerir. Bu teknikler küçük hayvan enfeksiyonu modelleri için çevrilebilir, ancak yalnızca oksijen doygunluğu analizi, farelerde hastalık şiddeti için hızlı, gerçek zamanlı bir analizi temsil eder. Kan oksijen doygunluğu (SpO2) daha önce solunum yolu hastalığı çalışmalarında hastalığın ilerlemesini izlemek için bir yöntem olarak araştırılmıştır; Bununla birlikte, can çekişen fareler, hem Pseudomonas aeruginosa model3'te beklenmedik derecede yüksek SpO2 okumalarına sahiptir, bunlar öngörücü veya can çekişen hastalık değildir, çünkü muhtemelen fareler fizyolojik aktivitelerini modüle edebilirler. Bu amaçla, şimdiye kadar farelerde bakteriyel solunum yolu hastalığı için SpO2'nin tanısal seviyeleri bulunamamıştır.
Bu nedenle, bu çalışmada hızlı fizyolojik ölçüm olarak akciğer hastalığının akciğer fonksiyonu üzerindeki etkilerini saptamak için klinik olarak ilgili diğer yöntemlerin kullanımı araştırılmıştır. Basitleştirilmiş Tüm Vücut Pletismografisi (sWBP), hızlı, invaziv olmayan bir biyometrik analiz olarak nefes hızını ve derinliğini araştırma fırsatı sunar. Önceki çalışmalar, WBP cihazının bir laboratuvarda nasıl monte edileceğini göstermiştir4; Bununla birlikte, bu tür çalışmalarda gösterilen bileşenlerin birçoğu şu anda ticari olarak temin edilememektedir. Ayrıca, geleneksel WBP, nem ve sıcaklığa dayalı karmaşık veri toplama ve veri işleme gerektirir 5,6. Bu nedenle, günlük olarak oda sıcaklığına/neme göre kalibre edilen basitleştirilmiş bir WBP aparatı geliştirilmesine ve konunun sıcaklık/nem katkısının ölçülen nefes hacmi üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığının değerlendirilmesine karar verilmiştir. Böylece, şu anda mevcut malzemeleri tedarik eden modifiye edilmiş bir sWBP aparatı oluşturulmuştur. Ayrıca, bu laboratuvar kaynaklı aparatın, farelerde ölümcül solunum melioidoz modeli sırasında hastalık ilerlemesi ile ilişkili solunumdaki değişiklikleri tespit edip edemediği araştırılmıştır.
Bu çalışma için inşa edilen sWBP cihazı, analog basınç sensörü verilerini dijital bir okumaya işlemek için piyasada bulunan ekipman ve yazılımları kullandı. Basınç sensörü, bölme konektörlerine sahip hava geçirmez bir cam kavanoza takıldı. Bir cam kavanozun yararı, kavanozun iç basıncındaki değişikliklere direnecek ve solunumun izlenmesi sırasında hacim değişikliklerinin ölçümlerini etkileyecek malzemenin yapısal sertliğidir. Numune alma odası, kare kavanozun iki düz yüzeyinde, biri kalibrasyon için bir Luer konektörü ile odaya erişmek ve diğeri basınç sensörünü barındırmak için iki bağlantı noktasına sahip olacak şekilde tasarlanmıştır. Seçilen basınç sensörü, basınçtaki küçük değişiklikler için bir aralığa (25 mbar aralığı) sahip oldukça hassas bir gösterge basınç transdüserine sahiptir.
Bu protokol, solunum melioidozunun bir murin modeli kullanılarak gösterilmiştir. Burkholderia pseudomallei (Bp), dünyanın tropikal bölgeleriyle ilişkili bir hastalık olan melioidozun bakteriyel ajanıdır7. Bp, çevrede, özellikle durgun su ve nemli toprağın ıslak ortamlarında bulunur ve tipik olarak hassas konakçıların kesiklerinin / çiziklerinin deri altı enfeksiyonlarına neden olur. Bununla birlikte, Bp solunduğunda da bulaşıcıdır ve aerosol dispersiyonu ile biyoterörizmde kullanım için potansiyel bir tehdittir. Tamamen virülan Bp'nin bir BSL-3 laboratuvarında elleçlenmesini gerektirmekle birlikte, BSL-2'de güvenli bir şekilde ele alınabilen ve seçilen ajan kriterleri8'in dışında tutulabilen bir kapsüler mutant suşu daha önce tasarlanmıştı. Ayrıca, Bp 5,9'un solunum yolu hastalığı progresyonunu incelemek için entübasyon aracılı intratrakeal (IMIT) bir solunum melioidoz enfeksiyon modeli geliştirilmiştir. Bu enfeksiyon modelini, hastalığın can çekişen son nokta boyunca ilerlemesi sırasında meydana gelen solunum değişikliğini karakterize etmek için kullandık.
Protocol
Burada açıklanan prosedürler, Louisville Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (protokol # 14-038) ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokol # 19567) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Numune alma odasının montajı
- Kefalet ve tetik kelepçe kapakları ile 600 mL kare cam geniş ağızlı Mason konserve kavanozunun düz yüzeylerinde matkap presinde 3/4" elmas matkap ucu kullanarak iki delik oluşturun (Şekil 1).
NOT: Bir numune alma odası ticari olarak temin edilemez ve inşa edilmelidir. - Hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için bölme ve cam arasındaki temasın her iki yüzünde kauçuk rondekalar (3/4" iç çap, 1" dış çap) kullanarak Mason kavanozdaki her iki delikten pirinç bir bölme (1/4" NPT iç diş, 3/4-16 UNF dış dişli) monte edin.
- Kalibrasyon amacıyla Luer'e bağlı bir şırıngayla diğer bölmeyi takarken basınç sensörü için bir bölme tertibatı kullanın.
- Basınç sensörü için, yüksek performanslı bir gösterge basınç dönüştürücüsünün 1/4" NPT dişlerini Teflon bantla sarın ve bunları bölmeye geçirin. Basınç sensörü kablolarını 8 pimli bir erkek DIN konektörüne bağlamak için, ticari olarak temin edilebilen yüksek kaliteli bir veri toplama cihazıyla arayüz için üretici kablolama talimatlarını kullanarak bir havya kullanın (bkz.
NOT: Bu, DIN konektör kabloları içinde 150 K ohm 1/8 watt %1 metal film direncinin kullanılmasını gerektirir. - Kalibrasyon portu için, 1/8" erkek NPT'yi dişi Luer kilitli nikel kaplama konektöre Teflon bantlı pirinç bölme sarma dişli bağlantılara bağlamak için 1/4" erkek NPT ila 1/8" dişi NPT adaptörü kullanın. Kullanılmadığında Luer konektörünü kapatmak için polipropilen dişli erkek Luer kapağı kullanın.
NOT: Bölme konektörlerini cam kavanozun üzerine aşırı sıkmayın, çünkü bu çatlaklara neden olur. İstenirse, bölmelerin cam kavanoza hava geçirmez bir şekilde kapatılmasını sağlamak için lastik contalara silikon eklenebilir.
- Basınç sensörü için, yüksek performanslı bir gösterge basınç dönüştürücüsünün 1/4" NPT dişlerini Teflon bantla sarın ve bunları bölmeye geçirin. Basınç sensörü kablolarını 8 pimli bir erkek DIN konektörüne bağlamak için, ticari olarak temin edilebilen yüksek kaliteli bir veri toplama cihazıyla arayüz için üretici kablolama talimatlarını kullanarak bir havya kullanın (bkz.
2. Sistem kurulumu
- Üreticinin talimatlarını izleyerek 8 pimli DIN konektörü kullanarak örnekleme odasını bir köprü amplifikatörüne ve köprü amplifikatörünü veri toplama cihazına bağlayın.
- Veri toplama aygıtını bir güç kaynağına ve üreticinin kablolarını kullanarak fizyolojik veri analizi yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlayın.
NOT: Sensörün ölçümlerini stabilize ettiğinden emin olmak için veri toplama cihazının açılmadığından ve kullanmadan önce en az 5 dakika ısıtıldığından emin olun. - Veri toplama sistemi ile arayüz oluşturmak için yazılımı başlatın.
- Yazılımdaki isteğe bağlı Spirometri Modülünü indirin ve Spirometri > Ayarlar penceresinde varsayılan birim ayarlarını L / s'den μL / s'ye değiştirin.
3. Sistem kalibrasyonu
- Yazılım içinde, aşağıdaki veri pencerelerine sahip 4 Kanallı bir pencere oluşturun: Kanal 1: 4 k/s örnekleme hızında ve 1 mV aralığında kaynak veri; Kanal 2: Yüksek geçişli 1 Hz otomatik ayar filtresi kullanan Kanal 1'in dijital filtresi; Kanal 3: Kanal 2 verilerinin ortalama 100 örnekle düzeltilmesi ; Kanal 4: Kanal 3 verilerinin Spirometri Akışı (Özel Akış Kafası, Formüle göre kalibre edilmiş (μL/s) = 120.000 x Voltaj).
NOT: 120.000, kalibrasyon sırasında değiştirilecek bir yer tutucu korelasyon katsayısıdır. - Kanal 4'ün DataPad analizini aşağıdaki Sütunlarla ayarlayın: Sütun 1: Kanal 4 Verileri, Yorumlar > Tam Yorum Metni; Sütun 2: Kanal 4 verileri, Döngüsel Ölçümler > Ortalama Döngüsel Frekans; Sütun 3: Kanal 4 verileri, Döngüsel Ölçümler > Ortalama Döngüsel Yükseklik.
- Grafik ekranının sağ alt köşesinde kare hızını 100:1 olarak ayarlayın. Bu pencere yapılandırmasını gelecekteki tüm etütler için şablon olarak kaydedin.
- Numune Odası kapağını kapatın ve Luer bölme konnektörüne 25 μL Gaz Geçirmez şırınga takın. Şırıngayı tekrar tekrar 20 μL'lik bir hacim verecek şekilde ayarlanmış bir Chaney adaptörü ile takın.
NOT: Şırıngayı Numune Odasına bağlamak için isteğe bağlı kısa bir 1/16" boru parçası ve Luer/diken konektörleri kullanılabilir. Bununla birlikte, Numune Odasının toplam hava hacminde önemli değişikliklerden kaçınmak için uzun borulardan kaçınılmalıdır. - Chaney adaptörünün derinlik durağını kullanarak şırıngaya 20 μL hava çekin.
- Yazılımdaki pletiği sıfırlayın (Kurulum > Tüm Girişleri Sıfırla (Alt-Z)) ve bir kayıt başlatın.
- Kayıt sırasında ve sabit bir taban çizgisiyle, ölçülen 20 μL nefesle denek nefesini çoğaltmak için Şırınga pistonunu yaklaşık 10 tekrar boyunca hızla bastırın / geri çekin. Kaydı durdurun.
NOT: Kalibrasyonun tekrarlanabilirliğini en üst düzeye çıkarmak için yapay nefeslerin frekansı 2 Hz'i geçmelidir. - Numaralandırılmış pleth kaydının başlangıcına sağ tıklayarak ölçülen numunenin kimliğini etiketleyin ve Yorum Ekle'ye tıklayın.
- Şırıngayı sıfırlayın, girişi sıfırlayın ve 20 μL darbenin kayıt ölçümlerini iki kez daha tekrarlayın (toplam üç kayıt oturumu).
- Tüm ölçümleri tamamladıktan sonra, yapay 20 μL nefesleri doğru bir şekilde temsil eden solunum pletinin bir bölümünü seçmek için bilgisayar faresini kullanın.
NOT: DataPad modülünde, nefes hızı (Ortalama Döngüsel Frekans, Hz) ve nefes derinliğinin (Ortalama Döngüsel Yükseklik, μL) geçici olarak okunmasını sağlayan veriler önizleme üstbilgisinde görünür. Veri önizlemesi, DataPad'e Ekle simgesi kullanılarak DataPad'e kaydedilebilir. - Sütun 3 verilerini (Ortalama Döngüsel Yükseklik) gözden geçirin ve üç kayıttan ölçülen ortalama nefes hacmini hesaplayın. Ölçülen ortalama nefes hacminin aşağıdaki hesaplamasını yapın: Kalibrasyon katsayısı = teslim edilen hacim / ölçülen hacim x 120.000.
NOT: Adım 3.1'de kullanılan yer tutucu Akış Kafası Kalibrasyon katsayısı 120.000, şimdi ölçülen verilerden değiştirildi. Sistem artık mevcut ortam sıcaklığı ve nemi kullanarak tipik fare solunumuna göre kalibre edilmiştir. Sistem artık nesnenin nefes almasını izleyebilir ve sıcaklık/nemdeki herhangi bir dalgalanmayı hesaba katmak için kalibrasyon günlük olarak yeniden gerçekleştirilebilir.
4. Konu izleme
- Adım 3.4'te özetlendiği gibi bir ana şablon açın veya 4.2 ile 4.3 arasındaki adımları tamamlayın.
- Yazılım içinde, aşağıdaki veri işlemeye sahip 4 Kanallı bir pencere oluşturun: Kanal 1: 4 k / s örnekleme hızında ve 1 mV aralığında kaynak veri; Kanal 2: Yüksek Geçişli 1 Hz Otomatik Ayarlama filtresi kullanan Kanal 1'in dijital filtresi; Kanal 3: Kanal 2 verilerinin 100 Numunenin Ortalaması ile Yumuşatılması ; Kanal 4: Kanal 3 verilerinin Spirometri Akışı (Özel Akış Kafası, Formüle göre kalibre edilmiş (μL/s) = 120.000 x Voltaj).
NOT: 120.000, mevcut basınç sensörü için hesaplanan korelasyon katsayısıdır; ancak, kullanıcı adım 3'te açıklanan sistem kalibrasyonunu gerçekleştirmeli ve bunun yerine bu kullanıcı tanımlı korelasyon katsayısını kullanmalıdır. - Kanal 4'ün DataPad analizini aşağıdaki Sütunlarla ayarlayın: Sütun 1: Kanal 4 Verileri, Yorumlar > Tam Yorum Metni; Sütun 2: Kanal 4 verileri, Döngüsel Ölçümler > Ortalama Döngüsel Frekans; Sütun 3: Kanal 4 verileri, Döngüsel Ölçümler > Ortalama Döngüsel Yükseklik.
- Konuyu numune alma odasına yerleştirin ve kapağı kapatın. Bu deney için bilinçli 4-12 haftalık dişi albino C57BL/6J fare (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) kullanıldı.
- Luer bölme kapağını kısa bir süre gevşeterek odadaki atmosferik basıncı eşitleyin (kapağın sızdırmazlığından) ve yeniden sıkın.
- Tüm Girişleri Sıfırlamadan (Alt-Z kısayolu) ve bir kayda başlamadan önce nesnenin örnekleme odasında aktif olarak hareket etmediğini gözlemleyin.
NOT: Özne örnekleme odasında hareket etmeye başlarsa, taban çizgisi ölçeğin dışına çıkabilir ve bu da kaydın ortasındaki tüm girişlerin yeniden sıfırlanmasıyla ele alınabilir ve bu da ölçekte yeni bir kayıt oluşturur. Konunun kayıt sırasında keşif veya tımar ile uğraştığını varsayalım; Pletismografi kaydının hangi kısmının normal solunuma en doğru şekilde yansıdığına dikkat edin. - Numaralandırılmış pleth kaydının başlangıcına sağ tıklayarak konunun kimliğini etiketleyin ve Yorum Ekle'ye tıklayın.
- Nesneyi kafesine geri döndürün. Boğulma ve stresi önlemek için kapalı numune alma odasında geçirilen süreyi 5 dakika ile sınırlandırın.
NOT: Numune Odasının 600 mL hava hacminin, sağlıklı bir farenin <15 mL/dak'da nefes alması ile hızlı bir şekilde harcanmayacağı göz önüne alındığında, boğulma riski düşüktür. - Nesnenin nefes almasını doğru bir şekilde temsil eden nefes alma işleminin bir bölümünü seçmek için bilgisayar faresini kullanın.
NOT: DataPad modülünde, nefes hızının (Ortalama Döngüsel Frekans, Hz) ve nefes hacminin (Ortalama Döngüsel Yükseklik, μL) geçici olarak okunmasını sağlayan veriler önizleme başlığında görünür. Veri önizlemesi, DataPad'e Ekle simgesi kullanılarak DataPad'e kaydedilebilir. - Denek farelerini teker teker ölçmeye ve nefes alma pleth'inin temsili bölümlerini DataPad'e kaydetmeye devam edin.
- Veri kaydından sonra, DataPad verilerini Excel'e aktarın. Dakika hacmini şu şekilde hesaplayın: Dakika Hacmi (mL/dak) = Nefes Hızı (Hz) x Nefes Hacmi (μl) x 0,06.
Representative Results
Sistem kalibrasyonu
Veri analizi yazılımı, burada açıklananlar gibi özel bir akış kafasının doğrudan kalibrasyonuna izin verir. Bu, Spirometri Akışı ayarlanırken gerçekleştirilir. Adım 3.1'de açıklandığı gibi, sistem içindeki voltaj-hacim korelasyon katsayısını hesaplayan bilinen kalibrasyon hava hacmini girmek için bir seçenek mevcuttur. Bununla birlikte, bu, tek bir okumaya dayalı bir korelasyon katsayısı oluşturur ve n = 1 standardından kalibrasyonun doğal varyasyonunun zayıf bir faydaya sahip olduğu gözlenmiştir. Mevcut yaklaşım bu eksikliği giderebilir ve bir kullanıcının kalibrasyon katsayısını hesaplamak için ortalaması alınan çoklu okumaları kullanarak günlük kalibrasyon yapmasına izin verir. Burada 20 μL enjekte edilen hava ile kalibrasyon, tipik bir farede tipik bir üst düzey nefes hacmini temsil eden gösterilmiştir. Yazılım bir menşe kesişimi (0,0) varsayar ve böylece bu yaklaşım kullanılarak 0-20 μL'den kalibre edilir.
Burada sWBP için önerilen metodoloji günlük olarak kalibre edilir, böylece çevresel nem/sıcaklıktaki dalgalanmalar hesaba katılır. Belirli WBP için kullanılan orijinal yöntemler, insan bebeklerinde ventilasyonu ölçmek için WBP'yi geliştiren 1955'ten itibaren Drorbaugh ve Fenn'in metodolojisine kadar uzanmaktadır5. Drorbaugh ve Fenn hesaplamaları, çevrenin ve konunun sıcaklık ve nemindeki değişimleri açıklar. Mevcut yaklaşım, her sWBP oturumunu kalibre ederek çevresel dalgalanmaları düzeltir. Yine de, bir farenin burun boşluğu / akciğeri boyunca solunumun ısıtılması ve nemlendirilmesinin, bilinen bir hava hacminin ölçümünü etkileyip etkilemediğinin ele alınmasına karar verildi. Böylece, deneğin kalibre edilmiş hava ölçümlerini ısıtma ve nemlendirme üzerindeki etkisini taklit etmek için yapay bir aparat oluşturuldu. Luer konektörleri 15 mL'lik bir konik boruya tutturuldu ve bu kapalı konik sıralı olarak numune haznesi ile gaz geçirmez kalibrasyon şırıngası arasına yerleştirildi. Oda sıcaklığında (23 °C) tutulan boş bir konik tüp kullanılarak 20 μL'lik bir kalibrasyon gerçekleştirildi. Konik tüp daha sonra kısmen Luer konektörlerinin hemen altına damıtılmış su ile dolduruldu ve koniklerin kafa boşluğunu dengelemek için zaman sağladı; kalibrasyon hacmi daha sonra nemin etkisini araştırmak için yeniden ölçüldü. Konik tüp bir ısıtma bloğuna yerleştirildi ve nemli bir ortamda 37 ° C'de dengelendi ve son olarak, konu ısıtmasının etkisini değerlendirmek için su olmadan ve nemin ek bir katkısı olmadan 37 ° C'ye dengelendi. Şekil 2 , test edilen tüm koşulların, gaz geçirmez şırınga tarafından sağlanan kalibre edilmiş 20 μL ölçümünü önemli ölçüde etkilemediğini göstermektedir. Bu bulgudan, sWBP'nin, hayvan deneğinin sıcaklığına ve nemine dayanan karmaşık hesaplamalara gerek kalmadan araştırma hayvanlarında nefes almayı izlemek için erişilebilir bir yaklaşım sunduğu sonucuna varılmıştır, çünkü bunlar ölçülen nefes hacmi üzerinde önemli bir etki yaratmamaktadır.
Konu izleme
sWBP, bakteriyel patojen B. pseudomallei ile ölümcül solunum yolu enfeksiyonları hastalığı sırasında solunumu izlemek için kullanıldı. Bilinçli hayvanlarda nefes almayı izlemenin bir zorluğu, numune odasında hareket eden normal sağlıklı hayvanların merakıdır. Farenin hareketi, ölçümden birkaç gün önce kondisyonlu deneklerin odaya önceden koşullandırılmasıyla kısmen hafifletilebilen sürekli hareket eden bir taban çizgisi oluşturur. Bu sorun öncelikle sağlıklı farelerde temel ölçümü etkiler, çünkü denekler enfeksiyon sırasında uyuşuk hale gelir ve sWBP'yi azaltılmış denek aktivitesi ile çok daha yönetilebilir hale getirir. Fiziksel veya anestezi olsun, bir tür kısıtlama kullanmaya çalışmak cazip gelebilir. Fiziksel kısıtlama kullanımı, strese neden olarak doğal nefes almayı etkileyebilir. Ayrıca, anestezik kullanımının nefes hızı ve derinlik10 üzerinde belirgin etkileri olduğu bilinmektedir; Bu nedenle, anestezinin kurum içi sWBP aparatı ile etkisinin araştırılmasına karar verildi. İzofluran enfeksiyon modelleri sırasında in vivo tanısal görüntüleme yapmak için yaygın olarak kullanılır ve bu nedenle bir C57BL / 6 fare anestezi altına alındı ve sWBP kullanılarak anesteziden kurtulana kadar ilerlemeyi izledi. Bu çalışma, anesteziden iyileşme penceresini uzatmak için 4 haftalık genç bir albino C57BL / 6J fare ile gerçekleştirildi. Şekil 3 , tercih edilen anestezinin, farelerin büyük bir gelgit hacmi ile yavaş bir nefes alma hızı sergilemesine neden olduğunu göstermektedir. Fareler sedasyondan kurtulmaya başladıkça, nefes hızları artar ve nefes hacmi azalır, toplam ilham veren havanın net etkisi yavaş yavaş artar. Bu çalışmada, iyileşmenin ilk 30 saniyesinde nefes hacminin anestezi öncesi seviyelere geri döndüğü bulunmuştur. Nefes hızı, başlangıçtaki solunum anesteziden çıkarıldıktan sonra 2-2.5 dakikaya geri dönene kadar istikrarlı bir şekilde artar. Dakika hacmi, nefes hızının etkilerini yakından takip etti ve anesteziden çıkarıldıktan sonra 2.5 dakika ile başlangıç dakika hacmine ulaştı. Bu bulgu, sWBP yaklaşımında anestezinin kullanılmaması gerektiğini desteklemektedir. Anestezi konakçı metabolizmasını yavaşlatacağı ve ilham verici oksijen için daha az talep yaratacağı için şaşırtıcı olmayan bir şekilde başlangıçtaki solunumu önemli ölçüde etkiler. Numune odasının sanitasyonu, çalışmaya özgü enfeksiyon kontrolünün yanı sıra feromonların idrar veya dışkıdan kaynaklanan ve denekler arasındaki stresi etkileyebilecek etkilerini ele almak için denekler arasında da düşünülmelidir.
WBP, solunum yolu hastalığı modellerinde akciğer fonksiyonunu non-invaziv bir şekilde izlemek için cazip bir stratejidir. sWBP, ölümcül solunum yolu melioidoz enfeksiyonları sırasında solunumun nasıl değiştiğini incelemek için kullanıldı (Şekil 4), zaman noktaları akciğerde biyolüminesans izlemesini yansıtıyor. Bu modelin, enfeksiyondan yaklaşık 3 gün sonra can çekişen hastalığın gelişmesine kadar yavaş ilerleyen bir şekilde devam eden erken bir uyuşukluk başlangıcı ile ilişkili olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, farelerin nefes alma hızının ve toplam ilham veren havanın (dakika hacmi) enfeksiyonun ilk gününde hızla azaldığı ve enfeksiyon seyrinin geri kalanında düşük kaldığı gözlenmiştir (Şekil 4A, C). Bu model, enfeksiyonun sonraki 2 günü boyunca devam eden erken başlangıçlı uyuşukluk ile tutarlıdır. Buna karşılık, nefes hacmi ilk 24 saat boyunca dik bir şekilde düşmez ve bunun yerine hastalığın 3 günlük seyri boyunca doğrusal bir düşüşe yaklaşan hafif ve sabit bir düşüşe sahiptir (Şekil 4B).
Resim 1: sWBP aparatı. Özel bir Numune Odası, iki düz yüzünde bölme konektörleri bulunan kapatılabilir kare cam kavanozdan inşa edilmiştir. Bir bölme, 8 pimli DIN bağlantısı üzerinden bir köprü amplifikatörü ve veri toplama cihazı sayısallaştırıcısına bağlı bir gösterge basınç sensörünü monte etmek için kullanıldı. İkinci bölmeye, gaz geçirmez bir şırınga ile kalibrasyon için bir Luer konektörü takıldı. Cihaz, yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Konu sıcaklığının ve nemin nefes hacmi üzerindeki etkisi. Luer konektörlü 15 mL'lik bir konik tüp, 20 μL kalibrasyon şırıngası ile Numune Odası arasına sıralı olarak monte edildi. Sistem, konik tüpten ek sıcaklık/nem katkısı olmadan 20 μL'ye kalibre edildi. Diğer ölçümler, damıtılmış sudan doymuş nem ve / veya konik tüpün oda sıcaklığından (23 ° C) vücut sıcaklığına (37 ° C) ısınması ile denge sonrası toplanmıştır. Tukey'in Çoklu Karşılaştırma son testi ile Tek Yönlü ANOVA tarafından her koşulun n = 5 ölçümünden anlamlı bir fark tespit edilmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Gaz anestezisinin farelerde solunum üzerine etkisi. 4 haftalık dişi albino C57BL/6J fareden (8.6 g) elde edilen temsili veriler, oksijende %3 izofluran ile 5 dakika boyunca yatıştırıldı ve bir sWBP Numune Odasına aktarıldı. Pleth verileri anesteziden çıkarıldıktan sonra 150 s için toplandı. Denek anesteziden çıkarıldıktan sonra ilk ambulasyona 100 s başladı. (A) Anestezi öncesi 4.97 Hz nefes hızını, 9.74 μL nefes hacmini ve 2.91 mL dakika hacmini ölçen temel solunum. (B) Anesteziden iyileşme sırasında solunumdaki değişikliklerin ilk 60 saniyesi. (A-B) Nefes başına μL ölçen dikey eksen ve saniyeler içinde yatay eksen. (C-E) Ventilasyon verileri, anesteziden 150 saniyelik iyileşme sırasında, (C) Nefes Hızı, (D) Nefes Hacmi ve (E) hesaplanan Dakika Hacmi için zaman noktası başına ortalama ≥3 nefes döngüsünden toplandı. Anestezi öncesi taban çizgisi değerleri, ilgili her grafikte yatay noktalı bir çizgi ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Respiratuar melioidozun konakçı solunumu üzerine etkisi. Beş adet 8 haftalık dişi C57BL/6 fare, 4.9 log CFU biyolüminesan B. pseudomallei suşu JW270 ile enfekte oldu. sWBP, 3 günlük enfeksiyon seyri boyunca Nefes Hızı (A) ve Nefes Hacmi (B) ölçülerek gerçekleştirildi. Toplam ilham veren hava, Dakika Hacmi (C) olarak hesaplandı. Beş deneğin her biri için veriler, üçüncü dereceden polinom regresyonu ile bağımsız olarak çizilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
sWBP, küçük hayvan modellerinde solunum yolu enfeksiyonunun anlaşılmasını geliştirmek için çekici bir yaklaşımdır. Önemli olarak, invaziv olmayan bir yaklaşımdır ve bu nedenle, bir enfeksiyon zorluğu sırasında araştırma hayvanlarına aşırı strese neden olma konusunda önemli bir risk oluşturmaz. Gerçekten de, denek solunumunu izleme prosedürü, birkaç dakika ve minimum konu kullanımı gerektiren hızlı bir testtir. Bilimsel yarar, mikrobiyal patojenlerin hastalık sırasında akciğer fonksiyonunu nasıl etkilediğinin yüksek çözünürlüklü bir şekilde anlaşılmasıdır. Bu yaklaşım, bir patojenin hastalığa nasıl neden olduğunun anlaşılmasını kolaylaştıran temel araştırmalara fayda sağlayacak ve yeni bir terapinin solunum sağlığı durumuna tabi bir araştırmayı nasıl geri yüklediğini anlamak için translasyonel bir fayda sağlayacaktır.
Bu yazıda, erken uyuşuk yanıta neden olan patojen B. pseudomallei için temsili sonuçlar verilmiştir. Tüm bakteriyel akciğer enfeksiyonları fare enfeksiyonu modellerinde aynı şekilde bulunmaz. Diğer enfeksiyon modelleriyle ilgili önceki deneyimler, bakteriyel patojen Klebsiella pneumoniae'nin, farelerin enfeksiyona yenik düştüğü noktaya kadar, aynı zamanda enfeksiyon sonrası yaklaşık 3. Gün11'de asemptomatik bir enfeksiyon olarak ortaya çıktığını göstermiştir. Konakçının ilham verici havaya olan talebinin (yani, dakika hacmi), belirli bir hastalığın ortaya çıktığı uyuşukluk derecesiyle yakından ilişkili olabileceği varsayılmıştır. Farklı bakteriyel patojenlerin solunum yolu hastalığı sırasında akciğer fonksiyonunu nasıl etkilediğini incelemek için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. Farklı patojenlerin, (1) hücre içi veya hücre dışı patojenler olma eğilimi, (2) erken / geç hipotermik yanıta neden olma yeteneği ve (3) virülans belirleyicilerinin farklı repertuarlarının kullanımı 3,12,13 gibi farklılıklar da dahil olmak üzere konakçı savunmasından kaçınmak için benzersiz yaklaşımlara sahip oldukları anlaşılmaktadır. Bu nedenle, farklı hastalık stratejilerinin enfeksiyon sırasında akciğer fonksiyonu ve solunum üzerinde benzersiz etkilere neden olması muhtemeldir.
Bu protokolde açıklanan önerilen ayarlar, sWBP sırasında ortaya çıkan benzersiz zorluklara uyum sağlayacak şekilde değiştirilebilir. Bir sWBP kayıt oturumu sırasında karşılaşılan yaygın sorunlardan biri, öznenin Örnek Odası içindeki hareketidir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu hareket taban çizgisini değiştirir ve solunum ölçümlerinin doğruluğunu etkileyebilir. Değişen taban çizgisini normalleştirmek için bir Dijital filtre kullanıldı ve küçük hareketlere rağmen uygulanabilir nefes ölçümlerine izin verildi. Aşırı hareket, bir taban çizgisi ölçümünü sıfırlanmış bir girdi aralığının dışına itebilir. Kayıtlar 1 mV aralığında önerilir (Kanal 1 ayarı), bu da aralık dışındaki veri kaybını önlerken pletismografinin zirvelerini hala gözlemlemekten ödün verir. Olağanüstü aktif deneklerde, sürekli aralık dışı sinyalleri önlemek için kayıt aralığını >1 mV'a uzatmak gerekebilir.
Önerilen prosedür, çevresel nem/sıcaklık dalgalanmalarına uyum sağlamak için günlük kalibrasyon (veya her seansta) gerektirir. Geleneksel WBP, hem ortamın hem de konu 5,6'nın sıcaklığını/nemini etkileyen karmaşık hesaplamalar kullanır. Mevcut sWBP cihazında, konakçı sıcaklığının/neminin etkilerinin bir kalibrasyon kaynağının ölçülen nefes hacmini önemli ölçüde değiştirmediği gösterilmiştir. Bu nedenle, sWBP'deki bu yaklaşım, Drorbaugh ve Fenn'in >50 yıllık yaklaşımından temelde farklıdır. Burada, sWBP, basınç değişikliklerini doğrudan ölçülen bir nefes hacmine bağlar ve konakçıdan başka bir düzeltme yapılmaz.
Araştırma hayvanı WBP'sini klinik WBP'ninkiyle karşılaştırmak önemlidir. sWBP tarafından toplanmaya çalışılan biyometrik veri türleri nefes hacmi ve frekansıdır. Bu tür ölçümler, bir hastanın ağzına bir nefes monitörü tuttuğu ve normal olarak hava akışını izleyen bir cihaza nefes aldığı basit spirometri ekipmanı kullanılarak klinik olarak toplanır. Araştırma hayvanlarında benzer spirometri kısıtlama gerektirir, bu nedenle strese ve solunumda doğal bir bozulmaya katkıda bulunur. Bu nedenle, basit spirometri klinik olarak işlevseldir, ancak araştırma hayvanları için değildir. WBP, klinikte artık akciğer hacmi gibi ölçümler de dahil olmak üzere gelişmiş verilerin toplanması için önemli bir amaca hizmet eder. Bu tür veriler yalnızca, bir deneğin Zorla Son Kullanma (akciğerlerinin derin bir nefes verme ile boşaltılması) dahil olmak üzere nasıl nefes aldıklarına dair talimatları izleyebilmesi bağlamında bulunabilir. Araştırma hayvanlarına bir araştırmacının solunum talimatlarını takip etmeleri için güvenilemez. WBP sırasında klinik olarak toplanan gelişmiş ölçümlerin çoğu araştırma hayvanlarında çoğaltılamaz. Araştırma hayvanlarında WBP, klinik WBP'den temel olarak farklıdır. Animal WBP, hayvan stresini ve solunum pertürbasyonunu önlemek için basit havalandırma verilerini (nefes hızı ve hacmi) kısıtlanmamış bir şekilde toplamayı amaçlamaktadır. Şimdiye kadar, WBP'nin araştırma hayvanlarında kullanılması, çevresel ve konu sıcaklığı ve neme dayalı karmaşık hesaplamalar da dahil olmak üzere klinik WBP'de kullanılan teknikleri çoğaltıyor gibi görünmektedir, ancak zorla sona erme işleminin nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin talimatları izleyebilen bir konudan gelişmiş verileri toplama yeteneği yoktur. Bunu akılda tutarak, WBP'nin basitleştirilmiş bir versiyonunun, solunum yolu hastalığı çalışmaları ile ilgili ilgili solunum sıklığını ve hacmini toplamak için yeterli olup olmayacağını göstermeye çalışılmıştır. Ortam sıcaklığı ve nemindeki herhangi bir değişikliği telafi eden bir kalibrasyon oturumu yapıldı. Ayrıca, ölçülen bir nefes hacmine sıcaklık ve nemin maruz kaldığı yapay bir fare ile gösterilmiştir, nefes hacminin doğru bir şekilde ölçülmesinde önemli bir etkisi yoktur. sWBP'nin, kullanıcının verilerin hantal matematiksel muamelesini kullanmasına gerek kalmadan, hayvan çalışmalarını araştırmak için mükemmel bir uygulamaya sahip olduğu sonucuna varılmıştır.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri COBRE hibesi P20GM125504-01 Alt Proje 8246 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A. Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. Gullo, A. , Springer. (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
