Summary
Dieses Protokoll stellt den Aufbau und die Verwendung eines vereinfachten Ganzkörperplethysmographie-Geräts vor, um das Fortschreiten bakterieller Atemwegserkrankungen nicht-invasiv zu überwachen.
Abstract
Ersatztiermodelle von Krankheiten unterliegen den 3Rs der verantwortungsvollen Forschung. Es gibt eine häufige Überprüfung von Verfeinerungen von Tiermodellen, um sicherzustellen, dass sowohl der Tierschutz als auch die wissenschaftlichen Erkenntnisse mit der Verfügbarkeit neuer Technologien voranschreiten. Dieser Artikel demonstriert die Verwendung der vereinfachten Ganzkörperplethysmographie (sWBP) zur nicht-invasiven Untersuchung der respiratorischen Insuffizienz in einem Modell der letalen respiratorischen Melioidose. sWBP hat die Empfindlichkeit, die Atmung bei Mäusen während des gesamten Krankheitsverlaufs zu erkennen, so dass die moribund-assoziierten Symptome (Bradypnoe und Hypopnoe) gemessen und möglicherweise zur Entwicklung humaner Endpunktkriterien verwendet werden können.
Einige der Vorteile von sWBP im Zusammenhang mit Atemwegserkrankungen sind, dass die Überwachung der Wirtsatmung bei der Beurteilung der Funktionsstörung des primär infizierten Gewebes, nämlich der Lunge, am nächsten kommt. Neben der biologischen Bedeutung ist der Einsatz von sWBP schnell und nicht-invasiv, wodurch Stress bei Versuchstieren minimiert wird. Diese Arbeit demonstriert den Einsatz von hauseigenen sWBP-Geräten zur Überwachung von Erkrankungen im Verlauf der Ateminsuffizienz im murinen Modell der respiratorischen Melioidose.
Introduction
Respiratorische bakterielle Krankheitserreger sind oft mit einer Entzündungsreaktion in der Lunge verbunden, die zu einer Lungenpathologie führt 1,2. Im klinischen Umfeld umfasst die Diagnose einer Lungenentzündung typischerweise Kulturtechniken aus Sputum, Blutsauerstoffsättigungsanalyse und Thoraxröntgen. Diese Techniken können für Kleintierinfektionsmodelle übersetzt werden, aber nur die Sauerstoffsättigungsanalyse stellt eine schnelle Echtzeitanalyse bei Mäusen auf den Schweregrad der Erkrankung dar. Die Blutsauerstoffsättigung (SpO2) wurde zuvor als Methode zur Verfolgung des Krankheitsverlaufs in Studien zu Atemwegserkrankungen untersucht; Sterbende Mäuse haben jedoch unerwartet hohe SpO2-Werte sowohl in einem Pseudomonas aeruginosa-Modell 3, die nicht die prädiktive oder sterbende Krankheit sind, wahrscheinlich, weil Mäuse ihre physiologische Aktivität modulieren können. Zu diesem Zweck wurden bisher keine diagnostischen SpO2-Werte für bakterielle Atemwegserkrankungen bei Mäusen gefunden.
Daher untersuchte diese Arbeit die Verwendung anderer klinisch relevanter Methoden zum Nachweis der Auswirkungen von Lungenerkrankungen auf die Lungenfunktion als schnelle physiologische Messung. Die vereinfachte Ganzkörperplethysmographie (sWBP) bietet die Möglichkeit, Atemfrequenz und Tiefe als schnelle, nicht-invasive biometrische Analyse zu untersuchen. Frühere Studien haben gezeigt, wie WBP-Geräte in einem Labor zusammengebautwerden 4; Einige der in solchen Studien gezeigten Komponenten sind jedoch derzeit nicht kommerziell verfügbar. Darüber hinaus erfordert das traditionelle WBP eine komplexe Datenerfassung und Datenverarbeitung basierend auf Feuchtigkeit und Temperatur 5,6. Daher wurde beschlossen, ein vereinfachtes WBP-Gerät zu entwickeln, das täglich auf Raumtemperatur / Luftfeuchtigkeit kalibriert wird und bewertet, ob der Temperatur-/Feuchtigkeitsbeitrag des Probanden selbst einen Einfluss auf das gemessene Atemvolumen hat oder nicht. So wurde eine modifizierte sWBP-Apparatur geschaffen, die die aktuell verfügbaren Materialien beschafft. Darüber hinaus wurde untersucht, ob dieses Laborgerät Veränderungen in der Atmung im Zusammenhang mit dem Fortschreiten der Krankheit während des Modells der tödlichen respiratorischen Melioidose bei Mäusen erkennen kann.
Die für diese Arbeit konstruierte sWBP-Apparatur verwendete handelsübliche Geräte und Software, um analoge Drucksensordaten zu einer digitalen Anzeige zu verarbeiten. Der Drucksensor wurde an einem luftdichten Glasgefäß mit Schottsteckern angebracht. Der Vorteil eines Glasgefäßes ist die strukturelle Steifigkeit des Materials, die Änderungen des Innendrucks des Glases widersteht und die Messung von Volumenänderungen während der Überwachung der Atmung beeinflusst. Die Probenahmekammer wurde so konstruiert, dass sie zwei Anschlüsse auf den beiden ebenen Oberflächen des quadratischen Glases hat, einen, um über einen Luer-Anschluss zur Kalibrierung auf die Kammer zuzugreifen, und den anderen, um den Drucksensor aufzunehmen. Der gewählte Drucksensor verfügt über einen hochempfindlichen Überdruckmessumformer mit einem Bereich für kleine Druckänderungen (25 mbar Bereich).
Dieses Protokoll wird anhand eines murinen Modells der respiratorischen Melioidose demonstriert. Burkholderia pseudomallei (Bp) ist der bakterielle Erreger der Melioidose - einer Krankheit, die mit tropischen Regionen der Welt assoziiertist 7. Bp wird in der Umwelt gefunden, insbesondere in feuchten Umgebungen mit stehendem Wasser und feuchtem Boden, aus denen es typischerweise subkutane Infektionen von Schnitten / Kratzern von anfälligen Wirten verursacht. Bp ist jedoch auch beim Einatmen infektiös und stellt durch Aerosolausbreitung eine potenzielle Bedrohung für den Einsatz im Bioterrorismus dar. Während vollständig virulentes Bp die Handhabung in einem BSL-3-Labor erfordert, wurde zuvor ein akapsulärer mutierter Stamm entwickelt, der bei BSL-2 sicher gehandhabt und vom Auswahlkriterium8 ausgeschlossen werden kann. Darüber hinaus wurde ein intubationsvermitteltes intratracheales (IMIT) Infektionsmodell der respiratorischen Melioidose entwickelt, um das Fortschreiten von Atemwegserkrankungen von Bp 5,9 zu untersuchen. Wir haben dieses Infektionsmodell verwendet, um die Veränderung der Atmung zu charakterisieren, die während des Fortschreitens der Krankheit durch den sterbenden Endpunkt auftritt.
Protocol
Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom University of Louisville Institutional Biosafety Committee (Protokoll # 14-038) und dem Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll # 19567) überprüft und genehmigt.
1. Montage der Probenahmekammer
- Erstellen Sie zwei Löcher mit einem 3/4"-Diamantbohrer auf einer Bohrmaschine auf den ebenen Oberflächen eines 600-ml-Vierkantglas-Einmachglases mit 95-mm-Dichtung und luftdichten Deckeln mit Bügel- und Abzugsklemmdeckeln (Abbildung 1).
HINWEIS: Eine Probenahmekammer ist nicht im Handel erhältlich und muss gebaut werden. - Montieren Sie ein Messingschott (1/4" NPT-Innengewinde, 3/4-16 UNF-Außengewinde) durch beide Löcher im Mason-Glas mit Gummischeiben (3/4" Innendurchmesser, 1" Außendurchmesser) auf beiden Kontaktseiten zwischen Schott und Glas, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten.
- Verwenden Sie eine Schottbaugruppe für einen Drucksensor, während Sie die andere Trennwand zu Kalibrierzwecken mit einer mit Luer verbundenen Spritze befestigen.
- Für den Drucksensor wickeln Sie die 1/4" NPT-Gewinde eines Hochleistungs-Manometer-Druckmessumformers mit Teflonband ein und fädeln sie in die Trennwand ein. Verwenden Sie einen Lötkolben, um die Verkabelung des Drucksensors an einen 8-poligen DIN-Stecker anzuschließen, und verwenden Sie die Verdrahtungsanweisungen des Herstellers für die Schnittstelle zu einem handelsüblichen hochwertigen Datenerfassungsgerät (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Dies erfordert die Verwendung eines 150 K Ohm 1/8 Watt 1% Metallfilmwiderstands innerhalb der DIN-Steckerverdrahtung. - Verwenden Sie für den Kalibrierungsanschluss einen 1/4"-NPT-Stecker auf 1/8"-NPT-Buchseadapter, um einen 1/8"-NPT-Stecker an eine Luer-Lock-Buchse anzuschließen, die vernickelt an die Messingschott, die Gewindeverbindungen mit Teflonband umwickelt. Verwenden Sie eine Luer-Außenkappe mit Polypropylengewinde, um den Luer-Stecker bei Nichtgebrauch abzudichten.
HINWEIS: Ziehen Sie die Schottverbinder am Glasgefäß nicht zu fest an, da dies zu Rissen führt. Auf Wunsch kann Silikon zu den Gummidichtungen hinzugefügt werden, um eine luftdichte Abdichtung der Schotte zum Glasgefäß zu gewährleisten.
- Für den Drucksensor wickeln Sie die 1/4" NPT-Gewinde eines Hochleistungs-Manometer-Druckmessumformers mit Teflonband ein und fädeln sie in die Trennwand ein. Verwenden Sie einen Lötkolben, um die Verkabelung des Drucksensors an einen 8-poligen DIN-Stecker anzuschließen, und verwenden Sie die Verdrahtungsanweisungen des Herstellers für die Schnittstelle zu einem handelsüblichen hochwertigen Datenerfassungsgerät (siehe Materialtabelle).
2. Systemeinrichtung
- Schließen Sie die Probenahmekammer über einen 8-poligen DIN-Stecker an einen Brückenverstärker und den Brückenverstärker gemäß den Anweisungen des Herstellers an das Datenerfassungsgerät an.
- Schließen Sie das Datenerfassungsgerät über die Kabel des Herstellers an eine Stromversorgung und einen Computer an, auf dem eine Software zur Analyse physiologischer Daten ausgeführt wird.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Datenerfassungsgerät eingeschaltet und mindestens 5 Minuten lang aufgewärmt ist, bevor es verwendet wird, um sicherzustellen, dass der Sensor seine Messungen stabilisiert. - Starten Sie die Software, um eine Schnittstelle zum Datenerfassungssystem herzustellen.
- Laden Sie das optionale Spirometrie-Modul in der Software herunter und ändern Sie die Standardgeräteeinstellungen von L/s in μL/s im Fenster Spirometrie->-Einstellungen.
3. Systemkalibrierung
- Erstellen Sie in der Software ein 4-Kanal-Fenster mit den folgenden Datenfenstern: Kanal 1: Quelldaten mit 4 k/s Abtastrate und 1 mV-Bereich; Kanal 2: Digitalfilter von Kanal 1 mit einem Hochpass-1-Hz-Auto-Adjust-Filter; Kanal 3: Glättung der Kanal-2-Daten durch Mittelung von 100 Proben; Kanal 4: Spirometriefluss von Kanal-3-Daten (benutzerdefinierter Durchflusskopf, kalibriert nach Formel (μL/s) = 120.000 x Spannung).
HINWEIS: 120.000 ist ein Platzhalterkorrelationskoeffizient, der während der Kalibrierung geändert wird. - Richten Sie die DataPad-Analyse von Channel 4 mit den folgenden Spalten ein: Spalte 1: Channel 4 Daten, Kommentare > vollständigen Kommentartext; Spalte 2: Kanaldaten 4, zyklische Messungen > mittlere zyklische Frequenz; Spalte 3: Kanaldaten 4, zyklische Messungen > durchschnittliche zyklische Höhe.
- Stellen Sie die Bildrate in der unteren rechten Ecke der Diagrammanzeige auf 100:1 ein. Speichern Sie diese Fensterkonfiguration als Vorlage für alle zukünftigen Studien.
- Schließen Sie den Deckel der Probenkammer und befestigen Sie eine 25-μL-Gasspritze am Luer-Schottanschluss. Passen Sie die Spritze mit einem Chaney-Adapter an, der wiederholt ein Volumen von 20 μL abgibt.
HINWEIS: Ein optionales kurzes Stück 1/16"-Schläuche und Luer/Barb-Anschlüsse können verwendet werden, um die Spritze mit der Probenkammer zu verbinden. Lange Schläuche sollten jedoch vermieden werden, um signifikante Veränderungen des Gesamtluftvolumens der Probenkammer zu vermeiden. - Saugen Sie 20 μL Luft mit dem Tiefenanschlag des Chaney-Adapters in die Spritze.
- Stellen Sie die Pleth in der Software auf Null (Setup > Null alle Eingänge (Alt-Z)) und starten Sie eine Aufnahme.
- Während der Aufnahme und mit einer stabilen Basislinie den Spritzenkolben für etwa 10 Wiederholungen schnell drücken/zurückziehen, um die Atmung der Probanden mit einer gemessenen 20 μL-Atemluft zu replizieren. Stoppen Sie die Aufnahme.
HINWEIS: Die Frequenz der künstlichen Atemzüge sollte 2 Hz überschreiten, um die Reproduzierbarkeit der Kalibrierung zu maximieren. - Beschriften Sie die Identität der gemessenen Probe, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Anfang der nummerierten Pleth-Aufzeichnung klicken und auf Kommentar hinzufügen klicken.
- Setzen Sie die Spritze zurück, stellen Sie den Eingang auf Null und wiederholen Sie die Aufzeichnungsmessungen von 20-μL-Impulsen zwei weitere Male (insgesamt drei Aufnahmesitzungen).
- Nachdem Sie alle Messungen abgeschlossen haben, wählen Sie mit der Computermaus einen Teil der Atemfläche aus, der die künstlichen 20 μL-Atemzüge genau darstellt.
HINWEIS: Innerhalb des DataPad-Moduls werden Daten im Vorschau-Header angezeigt, der eine temporäre Anzeige der Atemfrequenz (Average Cyclic Frequency, Hz) und der Atemtiefe (Average Cyclic Height, μL) bietet. Die Datenvorschau kann über das Symbol Zu DataPad hinzufügen in DataPad aufgezeichnet werden. - Überprüfen Sie die Daten von Spalte 3 (Durchschnittliche zyklische Höhe) und berechnen Sie das durchschnittlich gemessene Atemvolumen aus den drei Aufnahmen. Führen Sie die folgende Berechnung des durchschnittlich gemessenen Atemvolumens durch: Kalibrierkoeffizient = geliefertes Volumen / gemessenes Volumen x 120.000.
HINWEIS: 120.000 war der Platzhalter-Durchflusskopfkalibrierungskoeffizient, der in Schritt 3.1 verwendet wurde und nun von den Messdaten modifiziert wurde. Das System ist jetzt auf die typische Mausatmung unter Verwendung der aktuellen Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit kalibriert. Das System kann nun die Atmung des Subjekts überwachen, und die Kalibrierung kann täglich wiederholt werden, um Temperatur- / Feuchtigkeitsschwankungen zu berücksichtigen.
4. Personenüberwachung
- Öffnen Sie eine Mastervorlage wie in Schritt 3.4 beschrieben, oder führen Sie die Schritte 4.2 bis 4.3 aus.
- Erstellen Sie innerhalb der Software ein 4-Kanal-Fenster mit der folgenden Datenverarbeitung: Kanal 1: Quelldaten bei 4 k/s Abtastrate und 1 mV-Bereich; Kanal 2: Digitaler Filter von Kanal 1 mit einem Hochpass 1 Hz Auto Adjust-Filter; Kanal 3: Glättung von Kanal-2-Daten durch Mittelung von 100 Proben; Kanal 4: Spirometriefluss von Kanal-3-Daten (benutzerdefinierter Durchflusskopf, kalibriert nach Formel (μL/s) = 120.000 x Spannung).
HINWEIS: 120.000 ist der Korrelationskoeffizient, der für den aktuellen Drucksensor berechnet wird. Der Benutzer sollte jedoch die in Schritt 3 beschriebene Systemkalibrierung durchführen und stattdessen diesen benutzerdefinierten Korrelationskoeffizienten verwenden. - Richten Sie die DataPad-Analyse von Channel 4 mit den folgenden Spalten ein: Spalte 1: Channel 4 Daten, Kommentare > vollständigen Kommentartext; Spalte 2: Kanaldaten 4, zyklische Messungen > mittlere zyklische Frequenz; Spalte 3: Kanaldaten 4, zyklische Messungen > durchschnittliche zyklische Höhe.
- Probanden in die Probenahmekammer geben und den Deckel schließen. Für dieses Experiment wurde eine bewusste 4-12 Woche weibliche Albino C57BL/6J Maus (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) verwendet.
- Gleichen Sie den atmosphärischen Druck in der Kammer aus (vom Verschließen des Deckels), indem Sie die Luer-Schottkappe kurz lösen und wieder festziehen.
- Beachten Sie, dass sich das Subjekt nicht aktiv innerhalb der Probenahmekammer bewegt, bevor Sie alle Eingaben auf Null setzen (Alt-Z-Tastenkombination) und eine Aufnahme beginnen.
HINWEIS: Wenn sich das Subjekt in der Probenahmekammer zu bewegen beginnt, kann sich die Basislinie von der Skala entfernen, was durch erneutes Nullstellen aller Eingaben in der Mitte einer Aufzeichnung behoben werden kann, wodurch eine neue Aufzeichnung auf der Skala erstellt wird. Angenommen, das Subjekt beschäftigt sich während der Aufnahme mit Erkundung oder Pflege; Beachten Sie, welcher Teil der Plethysmographie-Aufzeichnung die normale Atmung am genauesten widerspiegelt. - Beschriften Sie die Identität des Subjekts, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Anfang der nummerierten Pleth-Aufnahme klicken und auf Kommentar hinzufügen klicken.
- Bringen Sie das Subjekt in seinen Käfig zurück. Begrenzen Sie die Zeit in der verschlossenen Probenahmekammer auf 5 Minuten, um Erstickung und Stress zu vermeiden.
HINWEIS: Das Erstickungsrisiko ist gering, da das 600 ml Luftvolumen der Probenkammer nicht schnell von einer gesunden Mausatmung bei <15 ml / min verbraucht wird. - Verwenden Sie die Computermaus, um einen Teil der Atemfläche auszuwählen, der die Atmung des Subjekts genau darstellt.
HINWEIS: Innerhalb des DataPad-Moduls werden Daten im Vorschau-Header angezeigt, der eine temporäre Anzeige der Atemfrequenz (durchschnittliche zyklische Frequenz, Hz) und des Atemvolumens (durchschnittliche zyklische Höhe, μL) bietet. Die Datenvorschau kann über das Symbol Zu DataPad hinzufügen in DataPad aufgezeichnet werden. - Messen Sie weiterhin nacheinander Mäuse und zeichnen Sie repräsentative Abschnitte der Atempleth auf DataPad auf.
- Exportieren Sie nach der Datenaufzeichnung die DataPad-Daten nach Excel. Berechnen Sie das Minutenvolumen wie folgt: Minutenvolumen (ml/min) = Atemfrequenz (Hz) x Atemvolumen (μl) x 0,06.
Representative Results
Systemkalibrierung
Die Datenanalysesoftware ermöglicht die direkte Kalibrierung eines kundenspezifischen Durchflusskopfes, wie der hier beschriebene. Dies wird beim Einstellen des Spirometrieflusses durchgeführt. Wie in Schritt 3.1 beschrieben, besteht die Möglichkeit, das bekannte Kalibrierluftvolumen einzugeben, das den Korrelationskoeffizienten von Spannung zu Volumen innerhalb des Systems berechnet. Dies erzeugt jedoch einen Korrelationskoeffizienten, der auf einem einzelnen Lesevorgang basiert, und es wurde beobachtet, dass die inhärente Variation der Kalibrierung von einem n = 1-Standard einen schlechten Nutzen hat. Der derzeitige Ansatz kann diesen Mangel beheben und ermöglicht es einem Benutzer, eine tägliche Kalibrierung mit mehreren gemittelten Messwerten durchzuführen, um einen Kalibrierkoeffizienten zu berechnen. Hierin wurde die Kalibrierung mit 20 μL eingeblasener Luft demonstriert, die ein typisches High-End-Atemvolumen in einer typischen Maus darstellt. Die Software geht von einem Ursprungsabschnitt (0,0) aus und wird daher mit diesem Ansatz von 0-20 μL kalibriert.
Die hier vorgeschlagene Methodik für sWBP kalibriert sich täglich und berücksichtigt so Schwankungen der Umgebungsfeuchte/-temperatur. Die ursprünglichen Methoden, die für spezifische WBP verwendet wurden, gehen auf die Methodik von Drorbaugh und Fenn aus dem Jahr 1955 zurück, die WBP zur Messung der Beatmung bei menschlichen Säuglingen entwickelten5. Die Berechnungen von Drorbaugh und Fenn berücksichtigen Temperatur- und Feuchtigkeitsschwankungen der Umgebung und des Subjekts. Der aktuelle Ansatz korrigiert Umgebungsschwankungen durch Kalibrierung jeder sWBP-Sitzung. Dennoch wurde beschlossen, zu untersuchen, ob die Erwärmung und Befeuchtung der Atmung über die Nasenhöhle / Lunge einer Maus die Messung eines bekannten Luftvolumens beeinflusst. So wurde ein künstlicher Apparat geschaffen, um die Wirkung des Probanden auf die Erwärmung und Befeuchtung kalibrierter Luftmessungen nachzuahmen. Luer-Anschlüsse wurden an einem konischen 15-ml-Röhrchen befestigt und diese versiegelte konische Inline zwischen der Probenkammer und der gasdichten Kalibrierspritze platziert. Eine 20-μL-Kalibrierung wurde mit einem leeren konischen Röhrchen durchgeführt, das bei Raumtemperatur (23 °C) gehalten wurde. Das konische Rohr wurde dann teilweise mit destilliertem Wasser bis knapp unter die Luer-Anschlüsse gefüllt, so dass Zeit blieb, den Kopfraum des Konikums auszugleichen; Das Kalibriervolumen wurde dann erneut gemessen, um den Einfluss der Feuchtigkeit zu untersuchen. Das konische Rohr wurde in einen Heizblock gelegt und bei 37 °C in einer feuchten Umgebung ausgeglichen und schließlich auf 37 °C ohne Wasser ausgeglichen, um die Wirkung der Erwärmung zu beurteilen, und ohne zusätzlichen Feuchtigkeitsbeitrag. Abbildung 2 zeigt, dass alle getesteten Bedingungen die kalibrierte 20-μL-Messung der gasdichten Spritze nicht signifikant beeinflusst haben. Aus diesem Ergebnis wurde gefolgert, dass sWBP einen zugänglichen Ansatz zur Überwachung der Atmung bei Versuchstieren bietet, ohne dass komplexe Berechnungen erforderlich sind, die auf der Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Tieres basieren, da diese keinen signifikanten Einfluss auf das gemessene Atemvolumen haben.
Probandenüberwachung
sWBP wurde verwendet, um die Atmung während der Erkrankung von tödlichen Atemwegsinfektionen mit dem bakteriellen Erreger B. pseudomallei zu überwachen. Eine Herausforderung bei der Überwachung der Atmung bei bewussten Tieren ist die Neugier normaler gesunder Tiere, die sich in der Probenkammer bewegen. Die Bewegung der Maus erzeugt eine sich ständig bewegende Basislinie, die zum Teil durch die Vorkonditionierung der Probanden in der Kammer über einen Zeitraum von mehreren Tagen vor der Messung gemildert werden kann. Dieses Problem betrifft in erster Linie die Baseline-Messung bei gesunden Mäusen, da die Probanden während der Infektion lethargisch werden, was sWBP bei reduzierter Probandenaktivität viel besser handhabbar macht. Es kann verlockend sein, zu versuchen, irgendeine Form der Zurückhaltung anzuwenden, sei es körperlich oder Anästhesie. Die Anwendung von körperlicher Zurückhaltung kann die natürliche Atmung beeinträchtigen, indem sie Stress verursacht. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Verwendung von Anästhetika ausgeprägte Auswirkungen auf die Atemfrequenz und -tiefe hat10; Daher wurde beschlossen, die Auswirkungen der Anästhesie mit dem hauseigenen sWBP-Gerät zu untersuchen. Isofluran wird häufig verwendet, um in vivo diagnostische Bildgebung während der Infektionsmodelle durchzuführen, und daher wurde eine C57BL / 6-Maus anästhesiert und die Progression überwacht, bis sie sich aus der Anästhesie mit sWBP erholte. Diese Studie wurde mit einer juvenilen 4 Wochen alten Albino C57BL / 6J-Maus durchgeführt, um das Zeitfenster der Erholung von der Anästhesie zu verlängern. Abbildung 3 zeigt, dass das bevorzugte Anästhetikum dazu führt, dass Mäuse eine langsame Atemfrequenz mit einem großen Tidalvolumen an Luft aufweisen. Wenn sich Mäuse von der Sedierung erholen, steigt ihre Atemfrequenz und das Atemvolumen nimmt ab, mit dem Nettoeffekt, dass die gesamte eingeatmete Luft langsam zunimmt. In dieser Studie wurde festgestellt, dass das Atemvolumen innerhalb der ersten 30 s der Genesung wieder auf das Niveau vor der Narkose gebracht wird. Die Atemfrequenz steigt stetig an, bis die Grundatmung auf 2-2,5 Minuten nach der Entfernung aus der Narkose wiederhergestellt ist. Das Minutenvolumen folgte eng den Auswirkungen der Atemfrequenz und erreichte 2,5 Minuten nach der Entfernung aus der Narkose das Ausgangsminutenvolumen. Dieser Befund unterstützt, dass Anästhesie nicht im sWBP-Ansatz verwendet werden sollte. Es wirkt sich dramatisch auf die Grundatmung aus, nicht überraschend, da die Anästhesie den Stoffwechsel des Wirts verlangsamt und einen reduzierten Bedarf an inspiriertem Sauerstoff schafft. Die Desinfektion der Probenkammer sollte auch zwischen den Probanden in Betracht gezogen werden, um die studienspezifische Infektionskontrolle sowie die Auswirkungen von Pheromonen aus Urin oder Kot zu berücksichtigen, die den Stress zwischen den Probanden beeinflussen könnten.
WBP ist eine attraktive Strategie zur nicht-invasiven Überwachung der Lungenfunktion in Modellen für Atemwegserkrankungen. sWBP wurde verwendet, um zu untersuchen, wie sich die Atmung während tödlicher respiratorischer Melioidose-Infektionen verändert (Abbildung 4), wobei die Zeitpunkte die Biolumineszenzüberwachung in der Lunge widerspiegeln. Es wurde beobachtet, dass dieses Modell mit einem frühen Beginn der Lethargie verbunden ist, die langsam fortschreitend bis zur Entwicklung der sterbenden Krankheit etwa 3 Tage nach der Infektion anhält. Es wurde auch beobachtet, dass die Atemfrequenz und die gesamte eingeatmete Luft (Minutenvolumen) der Mäuse am ersten Tag der Infektion rapide abnehmen und für den Rest des Infektionsverlaufs niedrig bleiben (Abbildung 4A,C). Dieses Muster stimmt mit der früh einsetzenden Lethargie überein, die für die nächsten 2 Tage der Infektion anhält. Im Gegensatz dazu fällt das Atemvolumen während der ersten 24 h nicht steil ab, sondern nimmt leicht und stetig ab, was sich über den 3-tägigen Krankheitsverlauf einem linearen Rückgang nähert (Abbildung 4B).
Abbildung 1: sWBP-Apparatur. Eine kundenspezifische Musterkammer wurde aus einem verschließbaren quadratischen Glasgefäß mit Schottverbindern an zwei flachen Seiten hergestellt. Ein Schott wurde verwendet, um einen Überdrucksensor zu montieren, der über einen 8-poligen DIN-Anschluss mit einem Brückenverstärker und einem Digitizer für Datenerfassungsgeräte verbunden war. Die zweite Trennwand war mit einem Luer-Anschluss zur Kalibrierung durch eine gasdichte Spritze ausgestattet. Das Gerät war mit einem PC verbunden, auf dem die Software ausgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Einfluss von Probandentemperatur und Luftfeuchtigkeit auf das Atemvolumen. Ein konischer 15-ml-Schlauch mit Luer-Anschlüssen wurde inline zwischen der 20-μL-Kalibrierspritze und der Probenkammer installiert. Das System wurde auf 20 μL kalibriert, ohne dass das konische Rohr zusätzliche Temperatur-/Feuchtigkeitsbeiträge leistete. Andere Messungen wurden nach dem Ausgleich mit gesättigter Luftfeuchtigkeit aus destilliertem Wasser und/oder Erwärmung des konischen Rohres von Raumtemperatur (23 °C) auf Körpertemperatur (37 °C) erhoben. Es wurde kein signifikanter Unterschied von n = 5 Messungen jeder Bedingung durch Einweg-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleich nach dem Test festgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Wirkung der Gasanästhesie auf die Atmung bei Mäusen. Repräsentative Daten einer 4 Wochen alten Albino-Hündin C57BL/6J (8,6 g) wurden für 5 min mit 3% Isofluran in Sauerstoff sediert und in eine sWBP-Probenkammer überführt. Pleth-Daten wurden für 150 s nach Entfernung aus der Narkose gesammelt. Das Subjekt begann die anfängliche Gehfähigkeit um 100 s nach Entfernung aus der Anästhesie. (A) Ausgangsatmung vor der Anästhesie mit einer Atemfrequenz von 4,97 Hz, einem Atemvolumen von 9,74 μl und einem Volumen von 2,91 ml Minuten. (B) Die ersten 60 s der Veränderungen der Atmung während der Erholung von der Anästhesie. (A-B) Vertikale Achse mit μL pro Atemzug und horizontale Achse in Sekunden. (C-E) Die Beatmungsdaten wurden während der 150 s der Erholung von der Anästhesie gesammelt, gemittelt von ≥3 Atemzyklen pro Zeitpunkt für (C) Atemfrequenz, (D) Atemvolumen und das (E) berechnete Minutenvolumen. Die Ausgangswerte vor der Anästhesie sind in der jeweiligen Grafik mit einer horizontalen gestrichelten Linie angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Wirkung der respiratorischen Melioidose auf die Wirtsatmung. Fünf 8-wöchige weibliche C57BL/6-Mäuse wurden mit 4,9 log CFU des biolumineszierenden B. pseudomallei-Stammes JW270 infiziert. sWBP wurde während des gesamten 3-tägigen Infektionsverlaufs durchgeführt, wobei die Atemfrequenz (A) und das Atemvolumen (B) gemessen wurden. Die gesamte eingeströmte Luft wurde als Minutenvolumen (C) berechnet. Die Daten für jedes der fünf Subjekte werden unabhängig voneinander mit Polynomregression dritter Ordnung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
sWBP ist ein attraktiver Ansatz, um das Verständnis von Atemwegsinfektionen in Kleintiermodellen zu verbessern. Wichtig ist, dass es sich um einen nicht-invasiven Ansatz handelt, und als solcher stellt er kein signifikantes Risiko dar, Versuchstiere während einer Infektionsherausforderung übermäßig zu belasten. In der Tat ist das Verfahren zur Überwachung der Atmung der Probanden ein Schnelltest, der mehrere Minuten und minimale Handhabung des Probanden erfordert. Der wissenschaftliche Nutzen ist das hochauflösende Verständnis, wie mikrobielle Krankheitserreger die Lungenfunktion während einer Erkrankung beeinflussen. Dieser Ansatz wird der Grundlagenforschung zugute kommen, das Verständnis dafür erleichtern, wie ein Krankheitserreger Krankheiten verursacht, und einen translationalen Nutzen bieten, um zu verstehen, wie ein neuartiges Therapeutikum eine Forschung wiederherstellt, die einen Zustand der Atemwegsgesundheit betrifft.
In diesem Manuskript liegen repräsentative Ergebnisse für den Erreger B. pseudomallei vor, der eine frühe lethargische Reaktion hervorruft. Nicht alle bakteriellen Lungeninfektionen sind in Mausinfektionsmodellen auf die gleiche Weise vorhanden. Bisherige Erfahrungen mit anderen Infektionsmodellen haben gezeigt, dass sich der bakterielle Erreger Klebsiella pneumoniae als asymptomatische Infektion bis zu dem Punkt darstellt, an dem Mäuse einer Infektion erliegen, ebenfalls etwa am Tag 3 nach der Infektion11. Es wird angenommen, dass der Wirtsbedarf an inspirierter Luft (d.h. das winzige Volumen) eng mit dem Grad der Lethargie zusammenhängen kann, mit dem eine bestimmte Krankheit auftritt. Zukünftige Studien werden erforderlich sein, um zu untersuchen, wie verschiedene bakterielle Krankheitserreger die Lungenfunktion während Atemwegserkrankungen beeinflussen. Es versteht sich, dass verschiedene Pathogene einzigartige Ansätze haben, um die Wirtsabwehr zu umgehen, einschließlich Unterschieden in (1) der Neigung, intrazelluläre oder extrazelluläre Pathogene zu sein, (2) der Fähigkeit, eine frühe/späte hypothermische Reaktion zu verursachen, und (3) der Verwendung verschiedener Repertoires von Virulenzdeterminanten 3,12,13. Daher ist es wahrscheinlich, dass verschiedene Krankheitsstrategien zu einzigartigen Auswirkungen auf die Lungenfunktion und die Atmung während der Infektion führen.
Die in diesem Protokoll beschriebenen empfohlenen Einstellungen können geändert werden, um den besonderen Herausforderungen während des sWBP gerecht zu werden. Eines der häufigsten Probleme, die während einer sWBP-Aufnahmesitzung auftreten, ist die Bewegung des Probanden innerhalb der Probenkammer. Wie bereits erwähnt, verändert diese Bewegung die Grundlinie und kann die Genauigkeit der Atemmessungen beeinträchtigen. Ein Digitalfilter wurde verwendet, um die Shifting-Baseline zu normalisieren, was trotz kleiner Bewegungen praktikable Atemmessungen ermöglicht. Übermäßige Bewegung kann eine Baseline-Messung aus dem Bereich einer Nulleingabe verschieben. Aufnahmen werden im Bereich von 1 mV (Einstellung Kanal 1) empfohlen, wodurch die Peaks der Plethysmographie noch beobachtet werden können und gleichzeitig Datenverluste außerhalb des Bereichs vermieden werden. Bei außergewöhnlich aktiven Probanden kann es notwendig sein, den Aufnahmebereich >1 mV zu erweitern, um persistente Signale außerhalb des Bereichs zu vermeiden.
Das empfohlene Verfahren erfordert eine tägliche Kalibrierung (oder bei jeder Sitzung), um Schwankungen der Umgebungsfeuchtigkeit / Temperatur zu berücksichtigen. Traditionelle WBP verwendet komplexe Berechnungen, die die Temperatur / Luftfeuchtigkeit sowohl der Umgebung als auch des Subjektsberücksichtigen 5,6. Es wurde gezeigt, dass in der vorliegenden sWBP-Vorrichtung die Auswirkungen der Wirtstemperatur/-feuchte das gemessene Atemvolumen einer Kalibrierquelle nicht signifikant verändern. Daher unterscheidet sich dieser Ansatz in sWBP grundlegend von dem >50 Jahre alten Ansatz von Drorbaugh und Fenn. Hier setzt sWBP Druckänderungen direkt mit einem gemessenen Atemvolumen in Beziehung, ohne dass der Wirt weitere Korrekturen vornehmen muss.
Es ist wichtig, das WBP von Versuchstieren mit dem klinischen WBP zu vergleichen. Die Arten von biometrischen Daten, die von sWBP zu sammeln versucht wurden, sind Atemvolumen und -frequenz. Solche Messungen werden klinisch mit einfachen Spirometriegeräten durchgeführt, bei denen ein Patient einen Atemmonitor an den Mund hält und normal in ein Gerät zur Überwachung des Luftstroms einatmet. Eine ähnliche Spirometrie bei Versuchstieren erfordert Zurückhaltung und trägt so zu Stress und einer inhärenten Störung der Atmung bei. Daher ist die einfache Spirometrie klinisch funktionell, aber nicht für Versuchstiere. WBP dient einem wesentlichen Zweck in der Klinik, um fortgeschrittene Daten zu sammeln, einschließlich solcher Messungen wie das Restvolumen der Lunge. Solche Daten können nur im Zusammenhang mit der Fähigkeit eines Probanden enthalten sein, Anweisungen zum Atmen zu befolgen, einschließlich erzwungener Exspiration (Entleerung der Lunge durch ein tiefes Ausatmen). Man kann sich nicht darauf verlassen, dass Versuchstiere den Atemanweisungen eines Forschers folgen. Viele der fortgeschrittenen Messungen, die während der WBP klinisch gesammelt wurden, können nicht an Versuchstieren reproduziert werden. WBP bei Versuchstieren unterscheidet sich grundlegend von klinischem WBP. Animal WBP versucht, einfache Beatmungsdaten (Atemfrequenz und -volumen) auf uneingeschränkte Weise zu sammeln, um Tierstress und Atemstörungen zu vermeiden. Bisher scheint die Verwendung von WBP bei Versuchstieren die in der klinischen WBP verwendeten Techniken zu replizieren, einschließlich komplexer Berechnungen basierend auf Umgebungs- und Probandentemperatur und -feuchtigkeit, jedoch ohne die Möglichkeit, die erweiterten Daten von einem Probanden zu sammeln, das Anweisungen zur Durchführung einer erzwungenen Exspiration befolgen kann. Vor diesem Hintergrund sollte gezeigt werden, ob eine vereinfachte Version des WBP ausreichen würde, um die relevante Atemfrequenz und das Atemvolumen zu erfassen, die für Studien zu Atemwegserkrankungen relevant sind. Es wurde eine Kalibrierungssitzung durchgeführt, die jede Variation der Umgebungstemperatur und -feuchtigkeit kompensierte. Darüber hinaus wurde mit einer künstlichen Maus gezeigt, dass Temperatur und Feuchtigkeit einem gemessenen Atemvolumen keinen signifikanten Einfluss auf die genaue Messung des Atemvolumens haben. Es wurde der Schluss gezogen, dass sWBP eine ausgezeichnete Anwendung für Forschungstierstudien hat, ohne dass der Benutzer eine umständliche mathematische Behandlung von Daten anwenden muss.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studien wurden durch den COBRE-Zuschuss P20GM125504-01 Sub-Project 8246 der National Institutes of Health unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
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- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
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- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
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