Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Hjärnans pericytkalcium och hemodynamisk avbildning hos transgena möss in Vivo

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62725
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll presenterar steg för att förvärva och analysera fluorescerande kalciumbilder från hjärnans värmande pericyter och blodflödesdata från närliggande blodkärl hos sövda möss. Dessa tekniker är användbara för studier av muralcellsfysiologi och kan anpassas för att undersöka kalciumtransienter i vilken celltyp som helst.

Abstract

De senaste framstegen inom proteinbiologi och musgenetik har gjort det möjligt att mäta intracellulära kalciumfluktuationer i hjärnceller in vivo och korrelera detta med lokal hemodynamik. Detta protokoll använder transgena möss som har förberetts med ett kroniskt hjärnskålen fönster och uttrycka den genetiskt kodade kalcium indikatorn, RCaMP1.07, under α-smooth muskel aktin promotorn att specifikt märka väggmålning celler, såsom vaskulär glatt muskelceller och ensheathing pericytes. Steg beskrivs om hur man förbereder en svansvenkateter för intravenös injektion av fluorescerande färgämnen för att spåra blodflödet, liksom hur man mäter hjärnans pericytekalcium och lokal blodkärls hemodynamik (diameter, röd blodcellshastighet etc.) med två fotonmikroskopi in vivo genom hjärnskålen fönstret i ketamin / xylazin bedövade möss. Slutligen ges detaljer för analys av kalciumfluktuationer och blodflödesfilmer via bildbehandlingsalgoritmerna som utvecklats av Barrett et al. 2018, med tonvikt på hur dessa processer kan anpassas till andra cellulära bilddata.

Introduction

Centrala nervsystemet vaskulatur består av genomträngande arterioler, kapillärer och stigande venules. Inom detta nätverk sträcker sig muralceller som kärlsläta muskelceller om arterioler och pericyter cellulära processer längs de första arteriolegrenarna och kapillärerna1. Pericytes verkar ha flera roller i hjärnan inklusive underhåll av blod -hjärnbarriären 1,2, migration och motilitet3, potentiella stamcellsegenskaper och regleringen av hjärnansblodflöde 4,5,6. Många av de funktionella rollerna av pericytes har kopplats till fluktuationer i intracellulärt kalcium som kan reglera utvidgning eller sammandragning av dessa celler4,5,6.

Flera nyligen genomförda studier har satt kriterier för att identifiera olika typer av hjärnans pericyter7,8. Muralceller inom de första 4 grenarna av genomträngande arterioler är omgivande pericyter baserat på deras uttryck av det kontraktila proteinet α-smooth muskelaktin (αSMA) och deras utskjutande, ovoid somata med processer som omsluterkärl 7,8,9. För att visualisera kalciumfluktuationer i ensheathing pericytes använder detta protokoll en ny transgen muslinje, Acta2-RCaMP1.07, även känd som Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Dessa möss uttrycker den röda genetiskt kodade kalciumindikatorn, RCaMP1.07, i αSMA-uttrycksceller (vaskulära glatta muskelceller och ensheathing pericytes). Avelskolonier upprätthålls genom att korsa noncarrier djur med hemizygotes. RCaMP1.07 är ett rött fluorescerande protein med en calmodulin bindande domän, vilket ökar fluorescensen när den binder till det intracellulärakalciumet 10,11. Detta protokoll beskriver stegen för kombinerad kalciumavbildning av ensheathing pericytes och blodflödesmätningar med två fotonmikroskopi inklusive förfaranden för svansvevinjektion av fluorescerande färgämnen, mikroscopebildförvärv hos sövda möss och dataanalys med programmeringsplattformar (Figur 1). Dessa tekniker är användbara för att ta itu med frågor om muralcellsfysiologi men kan anpassas för att studera kalciumtransienter i alla celltyper i hjärnan eller annat organsystem.

En 10 månader gammal kvinnlig Acta2-RCaMP1.07 mus användes för experimentet som presenteras i den här artikeln. Musen genomgick kirurgi för kronisk hjärnskålen fönster och huvudet post implantation två månader tidigare. Detaljer för det kirurgiska protokollet diskuteras i tidigare studier12,13 och liknande förfaranden har utförts i andra tidigare publicerade protokoll14,15. Vaskulaturen är märkt med grön fluorescein-Dextran (70 000 MW, anjonlösning, 2,5% w/v) injicerad intravenöst. Detta färgämne är kostnadseffektivt och lättillgängligt från kommersiella källor, men det har ett bredare utsläppsspektrum som kan överlappa RCaMP-utsläpp och blöda igenom under mikroscopebildförvärv. Steg för spektralremixning beskrivs i avsnitt 4 nedan för att kringgå detta, men även andra gröna färgämnen med smalare utsläppsspektra, såsom de som bygger på EGFP, kan användas.

Protocol

Alla försök som involverar försöksdjur som beskrivs nedan har godkänts av Animal Care Committee vid University of Manitoba, som styrs av Canadian Council on Animal Care.

1. Inställning och förberedelse av förfarandet

OBS: Följande föremål krävs för en injektion med svansvenkateter: insulinsprutor, en 15 cm bit PE10-slang, 30 G nålar, gasväv, saltlösning, tång, grönt fluorescein dextranfärg, tång och sax. Ha också en nål redo med ketamin / xylazin anestesi som kommer att injiceras före bildbehandlingen.

KRITISK: Alla material och all utrustning i steg 1 och 2 måste steriliseras före användning genom autoklavering eller sköljning med 70 % etanol. Om tången inte kan steriliseras ordentligt rekommenderas användning av ett par stora nålhållare. Katetermonteringen måste göras med tång och tång för att undvika oavsiktliga nålpunktioner.

  1. Skär ca 15-20 cm polyetenrör, PE10 (D. 28 mm; O.D. 61 mm).
  2. Fyll en 27 G insulinspruta med 0,9% saltlösning och spetsa sprutans nål i spetsen på polyetenröret. Tryck saltlösning genom röret och se till att det inte finns några läckor.
  3. Böj en 30 G-nål (0,3 mm x 25 mm) fram och tillbaka med hjälp av tång tills den bryts från navet. Nålen måste vara ren utan böjar.
  4. Håll nålen med tång, sätt försiktigt in nålen i änden av PE10-slangen som är fäst vid den saltlösningsfyllda sprutan och ta bort luftbubblor. Detta är katetern för injektion.
  5. Filter 30 μL på 2,5% (w/v) fluorescein dextran genom ett 13-25 μm filter före injektionen.
  6. Fyll en annan insulinspruta med 30 μL alikvoten dextran och se till att det inte finns några bubblor i den fyllda sprutan.

2. Svans ven injektion

  1. Bedöva musen med isofluran (4% induktion, 1,5% underhåll) eller ketamin/xylazin (60 mg/kg; 10 mg/kg; dvs. Ketamin/xylazin rekommenderas för stabilare blodflödesmätningar under avbildning och dosen kan ökas till 90 mg/kg. 10 mg/kg ketamin/xylazin för längre bildbehandling.
  2. När musen är vid anestesiens kirurgiska plan, placera en handske fylld med varmt vatten på svansen för att vidga den laterala venen.
  3. Ta bort handsken efter 30 s och rengör svansen med etanol.
  4. Placera svansen mellan tummen och långfingret. Ge tryck med pekfingret på svansen för att vidga venen. Med den andra handen, plocka upp kateterns nål med tång som orienterar ramen uppåt mot taket.
  5. Efter rengöring av svansen med 70% etanol, sätt smidigt in nålen i venen i 0° vinkel och injicera försiktigt saltlösning genom katetern för att säkerställa att nålen placeras korrekt.
    OBS: Om det inte finns något motstånd på kolven och ingen svullnad i svansen, är nålen i venen. Om det finns betydande motstånd eller svullnad ska nålen avlägsnas. Steg 2.2-2.5 kan upprepas upp till 3 gånger på varje sida av svansen och ersätta 30G-nålen i slutet av katetern varannan försök tills placeringen är korrekt.
  6. När nålen är i venen, byt saltlösningsspruta i slutet av katetern med sprutan som innehåller fluorescein dextran (steg 1.6). Injicera långsamt dextran i kateterslangen, se till att inga bubblor kommer in i röret. Om en luftbubbla är uppenbar, skär slangen som innehåller bubblan för att ta bort den och sätt tillbaka sprutan.
  7. När all dextran (30 μL alikvot) har injicerats, ta bort sprutan och ersätt den med saltlösningssprutan. Injicera den återstående dextran från slangen i musen tills inget färgämne finns kvar i röret.
  8. Ta bort nålen från svansen och ge tryck med gasväv i 10-30 s tills blödningen slutar.
    KRITISK: Om svansvebinjektionen inte lyckas efter 6 försök, ska djuret avbildas i en annan session. Den totala volymen (saltlösning och dextran) som injiceras i musen får inte heller överstiga 100 μL.

3. Två fotonmikroskopi

  1. Fokus på hjärnfönstret
    OBS: Använd ketamin/xylazinbedövning vid datainsamling eftersom det har mindre kärleffekter (vasodilatation) än isofluran. Om isofluran används i stegen ovan, injicera musen med ketamin/xylazin i.p. (rekommenderad dos som beskrivs ovan) före avbildning.
    1. Fäst musen med en skruv genom huvudstolpen till en plattform med en värmedyna under mikroskopet.
    2. Applicera ögonsmörjmedel på musens ögon.
    3. Rengör kranialfönstret med fuktiga tandapplikatorer. Se till att det inte finns några partiklar kvar som kan störa avbildningsprocessen.
    4. Applicera ultraljud gel på fönstret.
    5. Fokusera genom två-foton mikroskop målet tills pial blodkärlen kan ses under fönstret.
    6. Kontrollera musens andning och se till att värmedynan ger tillräckligt med temperaturstöd.
  2. Bildförvärv
    OBS: Det tvåfotonmikroskop som används i detta experiment har en tunabel Ti-Sapphire-laser för fluorescensexcitation med en Pockel-cell som styr mängden laser som når provet. Avgivet ljus delas av ett 565 långt passdiktroiskt till två GaAsP-fotomultiplikatorrör (PMT) med 595/50 bandpassfilter (rött) och 525/70 bandpassfilter (grönt) för detektion.
    De procedurer som beskrivs i steg 3.2–3.4 utförs med hjälp av specifik programvara från tvåfotonmikroskopet från detta protokoll (se Materialförteckning ). Dessa steg kan anpassas till andra mikroskopprogram och utrustning.
    1. Med rumslamporna släckta ställer du in önskad våglängd i mikroskopprogramvaran på 990 nm för att excite både RCaMP och fluorescein-dextran genom att klicka på 2-P Laser-rutan.
    2. Ställ in lasereffekten genom att klicka på avsnittet Effekt/förstärkning /Lasrar och justera Pockels 1-cellsspänningen till 30 % eller ett värde på 300 på en skala från 1000. Lasereffekten som når provet vid denna inställning bestämdes tidigare vara ~30 mW.
    3. Ställ in PMT-detektorns känslighet genom att klicka på avsnittet Effekt/vinst/ PMT och justera värdet till 700-800.
      OBS: Dessa värden kan justeras i förhållande till intensiteten i det fluorescerande provet och bör ställas in på noll innan lamporna tänds i rummet.
    4. Gå till avsnittet Bildupplösning och klicka på upplösningen 512 x 512 för en större bildstorlek.
    5. Klicka på 2-P Laser/Öppen för att öppna 2-P Laser slutaren.
    6. Gå till skanningsavsnittet och klicka på live-skanningsknappen.
      OBS: Live scanning med dessa parametrar och högre upplösning, RCaMP positiva väggmålning celler och fluorescerande märkta blodplasma kan ses. Om signalen är svag kan pockelvärdet ökas tills bilden är klar.
      KRITISK: I de ytliga vävnadsskikten bör lasereffekten inte överstiga 50 mW, vilket är cirka 600 i Pockels-cellinställningarna i det här exemplet.
  3. Förvärva en djupstapel av väggmålningscellerna och kärlnätverket
    OBS: Förvärv av en djupstapel rekommenderas för att korrekt lokalisera pericyter i kärlnätverket. Ensheathing pericytes ligger på den första till fjärde grenarna från den genomträngande arteriole7,8,9. Mikroskopprogramvaran som används i detta protokoll hänvisar till djupstaplar som "Z-serien".
    1. Flytta mikroskopmålet i X-, Y- och Z-planet, lokalisera en stor artär på hjärnans yta baserat på RCaMP: s smidiga muskelcellsmärkning.
    2. Klicka på rutan Z-serien.
    3. Fokusera högst upp i vävnaden nära pialkärlen, ställ in detta som nollpunkt och överst i Z-seriens stack genom att klicka på avsnittet Aktuell Z-serie/ Startposition [μm]. Klicka på rutan med fyra svarta ränder och en röd rand på toppen.
    4. Fokusera ner i vävnaden till önskat djup och ställ in detta som botten av stapeln genom att klicka på avsnittet Aktuell Z-serie/Stoppposition [μm]. Klicka på rutan med fyra svarta ränder och en röd rand på botten.
    5. Ställ in tjockleken på varje bildplan (stegstorlek) till 1-2 μm genom att skriva önskat värde i rutan under knappen "Stegstorlek" (stegstorleksknappen är lokaliserad i avsnittet Z-serie/Aktuell Z-serie). Detta definierar antalet bilder som förvärvas i stapeln.
    6. Ställ in lasereffekten så att den ökar exponentiellt när mikroskopet rör sig djupare genom stacken genom att klicka på rutan Laser/PMT-kompensation och välja Relativ (Exponentiell övertoning).
    7. Namnge filen, välj en mapp för att spara den och klicka på Start Z-serien.
    8. Efter förvärvet öppnar du Z-serien i bildbehandlingsprogramvaran.
    9. Sammanfoga de två kanalerna som färgade bilder och skanna genom stacken och leta efter pericyter och blodkärl av intresse genom att klicka i rutan Bild | Färg | Delade kanaler; Bild | Färg | Slå samman kanaler.
    10. Välj intresseområden som innehåller pericyter och spara positionerna för att hitta dessa platser igen i framtida bildsessioner.
  4. Förvärv av kalciumavbildning i T-serien (tid)
    1. Använd djupstacken och ROIs ovanifrån som referens, flytta mikroskopmålet i X-, Y- och Z-axeln under live-skanningsläge tills en pericyte av intresse hittas.
    2. Om du vill samla in en film med pericytekalciumhändelser ökar du anskaffnings bildhastigheten (>10 bilder per sekund) genom att gå till avsnittet Bildupplösning och klicka på rutan 128x128.
    3. Ställ in bildlängden på 60 s genom att klicka på rutan T-serien och ange tiden i varaktighetsrutan.
    4. Förutom rutan Spara sökväg klickar du på knappen med tre punkter för att uppdatera sparsökvägen med ett unikt filnamn.
    5. Zooma optiskt på kärlet för att ta hänsyn till den lägre upplösningen och för att få en närmare bild av pericyten genom att justera värdet i avsnittet Optisk zoom [mag].
    6. Skaffa T-serien genom att klicka på Start T-serien.
  5. Hemodynamikmätningar med kymografier (linjeskanningar)
    1. Fokusera på det fartyg som är av intresse vid 512 x 512-pixelupplösningi Live Scan-läge.
    2. För att mäta blodkärlets diameter och röda blodkroppars hastighet, klicka på Line Scan för att starta en endimensionell skanning med mikroskopet.
    3. Ställ in skanningens varaktighet (30-60 s) i millisekunder.
    4. Dra en linje som delar fartyget av intresse och rör sig parallellt längs fartyget. Detta kommer att generera en kymograph av kärlets diameter till vänster och streck av de röda blodkropparna som rör sig genom kärlet till höger.
      OBS: Flera blodkärl kan mätas med samma linje så länge de befinner sig i samma bildplan.
    5. Namnge filen och klicka på Start Linescan(erna) för att hämta data.

4. Bildanalys

  1. Kalciumfilmanalys.
    OBS: Detta protokoll beskriver stegen för spektral unmixing (Figur 2) och två olika metoder för att analysera ensheathing pericyte kalcium händelser med manuella, handvalda ROIs (Figur 3) och automatiserat, aktivitetsbaserat VAL AV ROI (Figur 4)16,17. För att upptäcka och klassificera signaltopparna med den normaliserade kalciumspårningen från varje ROI filtreras data med lång passning och bandpass filtreras vilket hjälper till att jämna ut data för amplitud- och bredduppskattningar och även för att identifiera toppar av olika former: enstaka toppar, multitoppar och platåer (Figur 3B). Parametrarna för denna analys kan optimeras för att upptäcka olika typer av dynamiska cellulära signaler. Stegen nedan kommer att kräva användning av bildbehandlingsprogram och programmeringsprogram med bildbehandlingspaket som innehåller olika koder för att analysera kalciumfilmer som nämnts ovan. Se materialtabellen för en fullständig lista över program och paket som används i det här protokollet. Bilddata från olika typer av mikroskop kan importeras med dessa paket som upprätthåller metadata från bilderna.
    OBS: Steg 4.1.1-4.1.7 beskriver hur du väljer ROIs för hand i bildbehandlingsprogram för efterföljande användning i den manuella kalciumanalysmetoden (steg 4.1.16)
    1. Ladda kalciumavbildningS-T-serien i bildbehandlingsprogramvaran genom att dra .xml filen till programvaruverktygsfältet. Klicka på rutan OK.
    2. Ta medelvärdet av stapeln (medelvärdet av stapeln är märkt som "Z-projektion" av bildbehandlingsprogramvaran). Detta kan göras genom att klicka på Bild | Staplar | Z projektion i verktygslisten.
    3. Skapa en färgad bild från båda kanalerna som i steg 3.3.9.
    4. Öppna ROI-chefsfönstret genom att klicka i rutan Analysera | Verktyg | ROI Manager, eller helt enkelt trycka på bokstaven "T" i tangentbordet.
    5. Välj polygonverktyget genom att klicka på polygonformen på bildbehandlingsverktygsfältet och beskriva de synliga ensheathing pericyte-strukturerna, till exempel soma och processer.
    6. Klicka på knappen Lägg till i ROI-chefsfönstret för att lägga till valda ROM-skivor i ROI-chefen.
    7. Ge varje intressant region ett unikt namn genom att klicka på knappen Byt namn och spara dem som en zip-mapp som kan läsas in senare i programmeringsprogrammet genom att klicka på Mer>> | Spara.
      OBS: Steg 4.1.8-4.1.14 beskriver hur man importerar kalcium T-serien till programmeringsplattformen och hur man blandar de olika fluorforer som upptäckts av mikroskop-PMT i olika kanaler (figur 2).
    8. Öppna programmeringsprogrammet och se till att mapparna för bildbehandlingspaketen är på väg (se Materialförteckning).
    9. Importera kalcium T-serien till programmeringsprogramvaran genom att anropa bioformatfunktionen i kommandofönstret för programmeringsplattformen, som automatiskt öppnar filvalsfönstret.
    10. Definiera vad som finns på varje kanal genom att ange önskat nummer. I det här exemplet svarar kanal 1=6 (cellular_signal), Kanal 2-svar=1 (blood_plasma).
    11. Rita data som en film i programmeringsprogrammet för att underlätta visualiseringen genom att anropa plotfunktionen.
    12. För att ta bort grön fluorescens från fluorescein-dextran som blöder igenom i den röda RCaMP-kanalen, blanda bort kanalerna i bildbehandlingspaketet genom att anropa unmix_chs-funktionen i programmeringsplattformens kommandofönster.
    13. Välj en region som bara innehåller fluorescens från denna fluorofor i Kanal 1, till exempel RCaMP i det här fallet.
    14. Välj en region som bara innehåller fluorescens från fluorfor 2, till exempel fluorescein i blodplasman i det här exemplet.
    15. Välj ett bakgrundsområde som inte har fluorescens från någon av fluorforerna. Detta genererar en spektralbidragsmatris som tillämpas på varje pixel i varje kanal. Det förbättrar avsevärt lokaliseringen av RCaMP-signalen vilket kommer att förbättra upptäckten av kalciumhändelser i dessa strukturer.
      OBS: Som nämnts ovan finns det flera sätt att analysera kalciumavbildningsdata i bildbehandlingspaketen. Steg 4.1.16-4.1.23 beskriver metoden för att analysera ensheathing pericyte kalciumhändelser med manuella, handvalda ROIs.
    16. Kör mobilsignalanalysen på den omixade kalciumfilmen genom att anropa CellScan-funktionen i kommandofönstret för programmeringsplattformen.
    17. Koden frågar "Vilken ROI-identifieringsmetod vill du använda?". Skriv siffran 2 för att läsa in de handvalda ROIs till programmeringsplattformen.
    18. Läs in de intresseområden från zip-mappen som valdes från pericytes för hand tidigare (steg 4.1.6).
    19. Koden frågar "Vad är skalfaktorn?". Bestäm skalningsfaktorn för de hand valda ROIs i förhållande till bildserien som analyseras och skriv numret på skalan. I det här exemplet är skalningsfaktorn 1 eftersom ROIs inte behöverdimensioneras eftersom de valdes på bilder med 128x128 pixlar, samma upplösning som den ursprungliga kalciumfilmen.
    20. Generera tomter av varje ROI och de normaliserade kalciumspåren i olika färger (figur 3A) genom att anropa process- och plotfunktionerna i kommandofönstret.
    21. Om koden inte upptäcker de flesta kalciumhändelser i de enskilda spåren ändrar du de inbyggda parametrarna i rutan konfigurationsoptimering genom att anropa funktionen opt_config och justera värdena, till exempel att minska tröskelvärdet för kortpassfiltrerade data till tre gånger standardavvikelsen för baslinjeperioden, som är de första 30 bildrutorna i T-serien.
    22. Välj knappen Process i optimeringsrutan om du vill tillämpa de nya parametrarna.
      OBS: För att upptäcka och klassificera signalerna är det normaliserade kalciumspåret långt passerande och bandpass filtrerat, vilket hjälper till att jämna ut data för amplitud- och bredduppskattningar, men också för att avgöra om signaler är enstaka toppar, multitoppar eller platåer (figur 3B).
    23. Mata ut data som en .csv fil som innehåller rumslig information om de regioner av intresse och toppar som identifierades genom att anropa output_data-funktionen i kommandofönstret. Ge filen ett unikt namn för vidare analys i ett statistikprogram.
      OBS: Steg 4.1.24-4.1.31 beskriver metoden för att analysera ensheathing pericyte kalciumhändelser med hjälp av analys av aktivitetsbaserade ROIs.
    24. Upprepa steg 4.1.8.-4.1.16 för att importera kalciumfilmen, blanda om kanalerna och anropa Funktionen CellScan i programmeringsplattformen.
    25. Koden frågar "Vilken ROI-identifieringsmetod vill du använda?". Skriv siffran 6 för att välja den automatiserade intresseidentifieringsregionen baserat på aktiviteten och förändringen i fluorescens i 3 dimensioner (x, y och tid; "3D FLIKA-algoritm").
    26. Rita de bearbetade resultaten för att visa identifierade regioner av intresse som olika färger genom att anropa process- och ritfunktionerna i kommandofönstret. Varje ROI utmärks i tid och rum och representeras som en överlagd mask (figur 4).
    27. Om algoritmen inte upptäcker ROI:er som är tydligt synliga för ögat ändrar du de inbyggda parametrarna i optimeringsrutan genom att anropa funktionen opt_config och justera värdena, till exempel öka det gaussiska filtret som jämnar ut data i tid (med 2 s) och minska tröskeln för att hitta ROM till 3 gånger standardavvikelsen för baslinjen.
    28. Välj processknappen i optimeringsrutan om du vill tillämpa de nya parametrarna. Med optimeringsprocessen bör fler ROI identifieras (figur 4B).
    29. Rita rois som en film för att tydligt identifiera aktivitetsområden (skisserade i regnbågsfärger) genom att ändra läget för standardrutan till film i optimeringsfönstret för ytterligare visualisering.
    30. Mata ut data som en csv-fil genom att anropa output_data-funktionen i kommandofönstret. Den här filen kan analyseras vidare i ett statistikprogram.
      ANALYSPARAmetrarna kan justeras för att passa alla typer av dynamiska cellulära signaler (kalcium, FRET-förhållanden etc.). Alla steg ovan kan automatiseras med enkel programmeringskod för att batchprocessa många kalciumfilmer med samma inställningar.
  2. Linje skanna blodflöde analys.
    1. Importera datafilen för linjeskanning av kymografi som förvärvats i avsnitt 3.5 till programmeringsprogrammet.
    2. Koden kommer att fråga "Vad visas på kanal 1 och 2?". Definiera vad som finns på varje kanal när du uppmanas att göra det. I det här exemplet är kanal 1 tom (typ 0)och Kanal 2 blood_plasma (typ 1).
    3. Kör diameteranalysfunktionen på linjeskanningen genom att anropa funktionen LineScanDiam, som öppnar en ruta för att välja det område som motsvarar diametern i kymografin (figur 5B, vänster).
    4. Rita en låda utanför kymografins fluorescensgränser som motsvarar kärlets diameter.
    5. Bearbeta denna dataklass genom att anropa processfunktionen för att mäta hela bredden vid halv maxima för fartygsdiameter och generera ett diagram (figur 5C) med plotfunktionen.
    6. Mata ut data som en csv-fil genom att anropa output_data-funktionen i kommandofönstret. Den här filen kan analyseras vidare i ett statistikprogram.
    7. Kör hastigheten radon omvandlingsanalys genom att anropa funktionen LineScanVel, som öppnar en ruta för att välja det område som motsvarar RBC-hastigheten i kymografin (Bild 5B, höger).
    8. Rita en låda innanför kymografins fluorescens som motsvarar fartygets hastighet.
    9. Bearbeta denna dataklass genom att anropa processfunktionen för att beräkna hastighet, flöde och linjär densitet hos röda blodkroppar från vinkeln på strecken i fluorescensen. Generera ett diagram (figur 5D) med plotfunktionen.
    10. Mata ut data som en csv-fil genom att anropa output_data-funktionen i kommandofönstret. Den här filen kan analyseras vidare i ett statistikprogram.
      OBS: Kymografierna måste ha tydlig fluorescens med väldefinierade kanter mellan de svarta utrymmena för att diameter- och hastighetsanalysen ska vara korrekt(figur 5A,B). Det är mycket viktigt att dra orthogonala och parallella linjer på ett exakt sätt, annars kommer tillförlitlig analys av kymografierna inte att vara möjlig. I likhet med kalciumanalys med bildbehandlingsalgoritmerna kan parametrarna för diameter- och hastighetsberäkningar optimeras.

Representative Results

Fluorescein-dextran har ett brett utsläppsspektrum som kan blöda igenom i den röda kanalen, vilket påverkar RCaMP-detektion i ensheathing pericytes(figur 2A). Spektral-unmixing efter datainsamling i programvaran minskar fluoresceinblödningen genom (Figur 2B, lägre), vilket förbättrar kalciumsignaldetektering i efterföljande analyssteg.

Kalciumanalys med de bildbehandlingsalgoritmer som används i detta protokoll gör det möjligt för flera olika metoder att identifiera ROI och intracellulära kalciumfluktuationer (dvs. kalciumsignaler). Genom att välja cellulära strukturer för hand kan kalciumfluktuationer upptäckas inom dessa regioner (figur 3A), inklusive olika typer av signaltoppar, såsom enstaka toppar och multitoppar, efter att de normaliserade kalciumspåren har lågpass och bandpass filtrerats (figur 3B). Dessutom identifieras ROI genom att gruppera aktiva pixlar tillsammans där fluorescensintensiteten förändras över tid med hjälp av bildbehandlingsalgoritmer som utvecklats av Ellefsen et al. 201416 och Barrett et al. 201817 (Figur 4). Detta kan tillämpas på alla dynamiska cellulära signaler genom att justera tid, tröskel och rumsliga parametrar så att de omfattar signalens förväntade storlek och form. Om tröskelvärdet för signalidentifiering sviktar minskar antalet regioner av intresse (figur 4B).

Ljusa och tydliga hemodynamiska kymografier kan analyseras för att mäta diameter och RBC-hastighet i blodkärl nära värmande pericyter(figur 5A,B). Diametern beräknas utifrån hela bredden vid halva fluorescensen(figur 5C). RBC-hastigheten approximeras från strecken från omärkta RBC:er, där vinkeln matas in i en radonomvandling för att beräkna hastighet, flöde (celler/celler) och linjär densitet (celler/mm; Figur 5D). Kymografier av dålig kvalitet där det finns fluorescensmättnad, dåligt signal-till-brusförhållande eller bildfältets rörelse (figur 6A) skapar otillförlitliga områden med felpunkter (röda kors) där data inte kan fastställas (figur 6B, C). Kvaliteten på de förvärvade uppgifterna är avgörande för ett bra resultat och att följa stegen som beskrivs i detta protokoll säkerställer goda resultat.

Figure 1
Figur 1. Sammanfattning av protokollet. Protokollet presenterar stegen för att förvärva och analysera fluorescerande kalciumbilder från hjärnans värmande pericyter och blodflödesdata från närliggande blodkärl hos sövda möss. Protokollet är uppdelat i 4 steg. 1) Förfarandeförberedelse: inrättande av utrustning och kateterberedning. 2) Svansveinjektion; 3) Datainsamling genom två fotonmikroskopi; 4) Dataanalys med bildbehandlingsalgoritmer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2. Spektral unmixing av fluorforer. A) Representativ genomsnittlig bild av RCaMP ensheathing pericyte och fluorescein-dextran märkt blodkärl från en T-serie förvärv. Skalstång= 10 μm.B) Övre: När man överväger enskilda kanaler är avluftning från Kanal 2 uppenbar i kanal 1 (vänster). Lägre: Efter spektral-unmixing reduceras blödningen och signalen från RCaMP är mer framträdande i pericytstrukturen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3. Handpvalade ROIs och optimerade kalciumspår. A) Intresseområden som valts i den använda bildbehandlingsprogramvaran (regnbågsformer) kan användas för att identifiera kalciumsignalspår. B) Signaltoppar från normaliserade spår identifieras genom lågpassering och bandpassfiltrering av data. Vi definierade signaltröskeln som 3 gånger standardavvikelsen för baslinjeperioden (de första 30 bildrutorna) och eventuella toppar över detta tröskelvärde ansågs vara en signal (lägre spår). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4. Automatiserade, aktivitetsbaserade ROI för kalciumanalys. Samma data analyserades med ett tröskelvärde på 7 gånger standardavvikelsen för baslinjen (A) och 3 gånger standardavvikelsen för baslinjen (B). Om du minskar tröskelvärdet för att identifiera aktiva pixlar hittas fler ROI(B) och signaltoppar (cirkeldiagram) i pericyterna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5. Kymograph hemodynamic mätningar. A) Exempel på linjeskanning genom kärlet. B) Exempel på väldefinierade kymografier för diameter (vänster) och hastighet (höger). De svarta strecken inom det högra bandet av fluorescens motsvarar RBCs.C) Diameter analys med tydliga vasomotion fluktuationer. D) Hastighetsanalys med diagram för Y-axeln= RBC-flöde(celler/celler), linjetäthet (celler/mm), hastighet (mm/er) och streckvinkel (grad), signal-till-brusförhållande (godtyckliga enheter, a.u.), X axis=time (sek). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6. Representation av hemodynamiska mätningar av dålig kvalitet. A) Exempel på kymografer av dålig kvalitet med fluorescensmättnad, dåligt signal-till-brusförhållande eller avbildningsfältets rörelse under förvärvet. B och C) Diagram som liknar figur 7 av diameter- och hastighetsdata som har felpunkter (röda punkter) på grund av kymografins dåliga kvalitet. (bild E, Y-axel=Diameter (μm), X axel=tid (sek); bild F, Y-axel= RBC-flöde(celler/celler), linjetäthet (celler/mm), hastighet (mm/s) och streckvinkel (grad), signal-till-brusförhållande (a.u.), X-axel=tid (sek). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Den nuvarande metoden ger detaljer om mussvansveckinjektion med kateter, två-foton mikroskop bildförvärv för djupstaplar, cellkalciumsignaleringsfilmer, skapande av hemodynamiska kymografier och kalcium- och hemodynamisk analys med våra bildbehandlingsalgoritmer17 (Figur 1). Det finns flera fördelar med dessa tekniker som förbättrar in vivo-bildresultatet och minskar tid, resurser och djurstress under sessionen. För det första ger användningen av en kateter för svansvektion mer kontroll över nålen, sprutan och mängden substans som injiceras i musens cirkulation. Dessutom förhindrar det färginjektion i svansvävnaden, vilket sparar dyra reagenser. För det andra använder vi transgena möss som uttrycker genetiskt kodade kalciumsensorer i ensheathing pericytes och visar hur man lokaliserar dem inom hjärnans kärlnätverk med en djup z-stack, vilket underlättar cellidentifiering och omlokalisering i efterföljande bildsessioner på lång sikt. Detta är en viktig faktor i pericytestudier och säkerställer korrekt cellklassificering6,7. För det tredje tillhandahåller vi våra parametrar för insamling av kalciumfilmer och hemodynamiska linjeskanningsdata som är en bra utgångspunkt för att mäta dynamiska cellulära signaler. Slutligen presenterar vi våra bildbehandlingsalgoritmer17, en omfattande verktygslåda för bildbehandling som innehåller flera metoder för förbehandling av bilder (t.ex. spektral-unmixing), kalciumbildanalys och hemodynamisk analys (diameter, hastighet etc.). Dessa algoritmer kan generera tomter för en snabb och enkel visualisering av data, samtidigt som nivån på användarexpertisen som krävs för att analysera resultat minimeras. Dessutom kan det automatiseras med några kodrader för att snabbt batch bearbeta flera data uppsättningar med samma parametrar. Detta kan potentiellt förbättra datavisualiseringen och forskarens tidsinvestering.

Nyckeln till att samla in bra kalciumavbildningsdata är att justera lasereffekten och PMT-inställningarna för tydligt fluorescenssignalförvärv, men att också samla in data med tillräcklig bildhastighet för att fånga hela kalciumhändelsen. Data i detta protokoll förvärvades vid 10-11 ramar per sekund, som fångar de långsammare kalcium svängningarna i ensheathing pericytes. Det finns också flera steg under analysen som kan förbättra analysresultatet. För det första är spektralremixning fördelaktigt om det finns en betydande överlappning mellan utsläppsspektrat av fluorforer (figur 2). Fluorescein-dextran användes i detta protokoll eftersom det är en kostnadseffektiv och kommersiellt tillgänglig dextran konjugat som vanligtvis används för hemodynamiska mätningar5. Spektral unmixing hjälper till att rensa upp data för ökad detektion av kalciumsignaler, men alternativa fluorforer med smalare utsläppsspektra kan också användas. För det andra är handval av cellulära strukturer som ROI (figur 3) användbart för att klassificera kalciumhändelser i olika subcellulära regioner som soma eller processgrenar. Aktivitetsbaserat VAL AV ROI (Figur 4)16 ger mer rumslig och tidsmässig information om enskilda kalciumhändelser. Detta kan vara till hjälp vid bestämning av frekvensen av kalciumhändelser i ett visst område eller spridning av händelser till andra cellområden. Användningen av programmeringsprogram för att analysera bilddata kan spara forskare timmar av tid när data batch bearbetas, men det kräver en viss initial tidsinvestering för att justera parametrarna för optimala resultat. De viktigaste faktorerna är den förväntade storleken (i μm2) i det aktiva området samt signalens varaktighet (minsta signaltid och maximal signaltid måste definieras). Forskare måste undersöka några exempel på T-seriefilmer först för att bäst avgöra vilka parametrar som passar deras data. Slutligen kan data av dålig kvalitet som förvärvats på mikroskopet i hög grad hindra analysen av kalcium och hemodynamik (figur 6). Därför bör man vara noga med att optimera inställningarna för mikroskopförvärv i början. Med dessa faktorer i åtanke, detta protokoll som kan anpassas för att passa kalciumavbildning eller analys av andra dynamiska cellulära signaler (t.ex. fluorescerande natrium, kalium, metabolit eller spänningsfluktuationer) i andra vävnader eller celltyper.

Det finns flera begränsningar i det här protokollet. För det första samlas data in under anestesi, vilket påverkar hjärnans aktivitet och kan påverka blodflödet. Liknande avbildning kan göras hos vakna möss som är utbildade för att acceptera huvudfixering för mer fysiologiska resultat. Dessutom är det viktigt att komma ihåg att vi samlar 2-dimensionella bilder av en 3-dimensionell cell och blodkärl in vivo. Därför kan vi bara fånga en fraktion av kalciumhändelserna i dessa celler eller blodflödet i en enda del av blodkärlet i taget.

En annan begränsning att notera är att två-foton kalcium imaging är känslig för rörelse artefakter, där rörelse in och ut ur fokalplanet kan misstas för kalcium fluktuationer. Detta protokoll utfördes under anestesi, vilket begränsar djurets rörelse; Rörelseartefakter kan dock introduceras genom musens andningshastighet, hjärtfrekvens, eventuell vävnadssvullnad och vid uppvärmning av pericyter, kärlkontraktion eller vasomotion 4,6,18,19. Rörelse artefakter kan mildras av flera strategier. Bildbehandlingspaketen som används i detta protokoll innehåller ett valfritt rörelsekorrigeringssteg, som använder en 2D-faltningsmotor för att justera bilderna i T-serien baserat på den synliga vaskulaturen13,17. Ramar med betydande förändringar i fokalplanet identifieras av denna algoritm och kan uteslutas från analys. Dessutom är det möjligt att använda statistiska strategier i bildbehandlingspaketen, till exempel en Z-poäng när fluorescensspåren genereras för att normalisera rörelsen induceradekalciumfluktuationer 20. Det mest robusta tillvägagångssättet för att redogöra för rörelseartefakter i två-fotonavbildning är att kombinera uttryck av två fluorescerande indikatorer inom samma cell, såsom en kalciumindikator (t.ex. GCaMP) och en fluorescerande reporter (t.ex. mCherry) som är kalciumoberoende. Fluktuationer i den fluorescerande reportern kan sedan hänföras till rörelse och subtraheras från kalciumindikatorsignalen för att normalisera rörelseartefakter.

Syftet med detta protokoll är att ge en tydlig förståelse för hur man samlar in optimal kalciumavbildning och blodflödesdata in vivo och att presentera nya metoder och analysverktyg som forskare kan implementera för att förbättra sina resultat. Dessa tekniker kan tillämpas för att studera olika pericytespopulationer i blodflödeskontroll eller i olika hjärnsjukdomsstater. Dessa bildparametrar kan också användas för att studera kalcium- och blodflödet i andra celltyper och organsystem och liknande principer gäller för andra dynamiska bildtekniker som möjliggörs av andra genetiskt kodade sensorer, utöver kalcium.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

J. Meza stöds av stipendier från Mitacs och Research Manitoba. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av Canadian Institutes for Health Research, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, start-up finansiering från University of Manitoba och Brain Canada genom Canada Brain Research Fund, med ekonomiskt stöd från Health Canada och Azrieli Foundation. De åsikter som uttrycks häri representerar inte nödvändigtvis hälsoministerns eller Kanadas regerings åsikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acta2-RCaMP1.07 The Jackson Laboratory 28345 In the video protocol the animal model used is a female mouse  of  10 months, 1 day old.
Applicators (Regular) Bisco X-80250P
BioFormats package for MATLAB NA NA Denominated in this protocol as "image processing packages".  Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/
CHIPS MATLAB toolbox NA NA Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity HealthCare Plus UGC250
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic Thermo Fisher Scientific D1823
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral Thermo Fisher Scientific D1830
Eye Lube Plus Optixcare NA
FIJI Image J NA Denominated in this protocol as "image processor software".  Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GCaMP6sfl/fl The Jackson Laboratory
Head Post fixing platform University of Zurich NA
Ketamine (Narketan 100 mg/mL) Vetoquinol 440893
MATLAB R2020b NA Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/
Needle 0.3mmx25mm BD PrecisionGlide 305128
Objective XLUMPLFLN20XW Olympus NA https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/
PDGFRβ-CreERT2 The Jackson Laboratory 30201
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) BD Intramedic 427401
Prairie View Bruker Fluorescence Microscopy NA https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope Bruker Fluorescence Microscopy NA https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Under Tank Heater Reptitherm U.T.H E169064
Xylazine (Rompun 20 mg/mL) Bayer HealthCare 2169592

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  3. Berthiaume, A. -A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
  4. Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
  5. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  6. Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
  7. Hartmann, D. a, et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402 (2015).
  8. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
  9. Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
  10. 28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021).
  11. Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
  12. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  13. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  14. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680 (2008).
  15. Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297 (2019).
  16. Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
  17. Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
  18. Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
  19. Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
  20. Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).

Tags

Neurovetenskap nummer 177
Hjärnans pericytkalcium och hemodynamisk avbildning hos transgena <em>möss in Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meza-Resillas, J., Ahmadpour, N.,More

Meza-Resillas, J., Ahmadpour, N., Stobart, M., Stobart, J. Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo. J. Vis. Exp. (177), e62725, doi:10.3791/62725 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter