Summary
Her giver vi en detaljeret procedure for storstilet produktion af AAV-vektorer af forskningskvalitet ved hjælp af klæbende HEK 293 celler dyrket i cellestakke og affinitetskromatografirensning. Denne protokol giver konsekvent >1 x 1013 vektorgenomer/mL, hvilket giver vektormængder, der er passende til store dyreforsøg.
Abstract
Adeno-associerede virus (AAV) vektorer er blandt de mest klinisk avancerede genterapi vektorer, med tre AAV genterapier godkendt til mennesker. Klinisk udvikling af nye anvendelser af AAV indebærer overgangen fra små dyremodeller, såsom mus, til større dyremodeller, herunder hunde, får og ikke-menneskelige primater. En af begrænsningerne ved at administrere AAV til større dyr er kravet om store mængder af høj titervirus. Mens suspension celle kultur er en skalerbar metode til AAV vektor produktion, få forskningslaboratorier har udstyret (f.eks bioreaktorer) eller ved, hvordan man producerer AAV på denne måde. Desuden er AAV titere ofte betydeligt lavere, når de produceres i suspension HEK 293 celler sammenlignet med klæbende HEK293-celler. Beskrevet her er en metode til fremstilling af store mængder af høj-titer AAV ved hjælp af celle stakke. En detaljeret protokol for titering AAV samt metoder til validering vektor renhed er også beskrevet. Endelig præsenteres repræsentative resultater af AAV-medieret transgeneudtryk i en fåremodel. Denne optimerede protokol til storstilet produktion af AAV-vektorer i klæbende celler vil gøre det muligt for molekylærbiologilaboratorier at fremme afprøvningen af deres nye AAV-behandlinger i større dyremodeller.
Introduction
Genterapi udnytte adeno-associeret virus (AAV) vektorer har gjort store fremskridt i løbet af de sidste tre årtier1,2. Påviste forbedringer i en bred vifte af genetiske sygdomme, herunder medfødt blindhed, hæmofili og sygdomme i bevægeapparatet og centralnervesystemet, har bragt AAV-genterapi i spidsen for klinisk forskning3,4. I 2012 godkendte Det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) Glybera, en AAV1-vektor, der udtrykker lipoprotein lipase (LPL) til behandling af LPL-mangel, hvilket gør det til den første markedsføringstilladelse til en genterapibehandling i enten Europa eller USA5. Siden da har yderligere to AAV-genterapier, Luxturna6 og Zolgensma7, modtaget FDA-godkendelse, og markedet forventes at ekspandere hurtigt i løbet af de næste 5 år med så mange som 10-20 genterapier forventes i 20258. Tilgængelige kliniske data viser, at AAV genterapi er en sikker, veltolereret, og effektiv modalitet gør det til en af de mest lovende virale vektorer, med over 244 kliniske forsøg med AAV registreret med ClinicalTrials.gov. Den stigende interesse for kliniske anvendelser, der involverer AAV-vektorer, kræver robuste og skalerbare produktionsmetoder for at lette evalueringen af AAV-behandlinger i store dyremodeller, da dette er et kritisk skridt i den translationelle pipeline9.
For AAV vektor produktion, de to vigtigste krav er AAV genomet og capsid. Genomet af vildtype (wt)-AAV er enkeltstrenget DNA, der er ca. 4,7 kb i længden10. Wt-AAV-genomet omfatter omvendte terminalgentninger (ITR'er), der findes i begge ender af genomet, som er vigtige for emballagen, og rep- og cap-generne 11. Rep og cap gener, der er nødvendige for genom replikation, samling af viral capsid, og indkapsling af genomet i viral capsid, fjernes fra det virale genom og leveres i trans til AAV vektor produktion12. Fjernelsen af disse gener fra det virale genom giver plads til terapeutiske transgener og alle de nødvendige regulatoriske elementer, herunder promotoren og polyA-signalet. ITR'erne forbliver i vektorgenomet for at sikre korrekt genomreplikation og viral indkapsling13,14. For at forbedre kinetikken i transgene udtryk, AAV vektor genomer kan manipuleres til at være selv komplementære, hvilket mindsker behovet for konvertering fra enkelt-strandede til dobbeltstrenget DNA-konvertering under AAV genom replikation, men reducerer kodning kapacitet til ~ 2,4 kb15.
Ud over AAV genom design, capsid serotype udvælgelse bestemmer væv og celle tropofi af AAV vektor in vivo2. Ud over vævstrofi har forskellige AAV-serotyper vist sig at vise forskellige genekspressions kinetik16. For eksempel klassificerede Zincarelli et al.17 forskellige AAV-serotyper til lavtryks serotyper (AAV2, 3, 4, 5), moderate udtryksrotyper (AAV1, 6, 8) og højtryks serotyper (AAV7 og 9). De kategoriserede også AAV-serotyper i slow-debut udtryk (AAV2, 3, 4, 5) eller hurtig debut udtryk (AAV1, 6, 7, 8 og 9). Disse divergerende troper og genekspression kinetik skyldes aminosyre variationer i capsid proteiner, capsid protein formationer, og interaktioner med værtscelle receptorer / co-receptorer18. Nogle AAV capsids har yderligere gavnlige egenskaber såsom evnen til at krydse blod - hjerne barrieren efter intravaskulær administration (AAV9) eller opholde sig i langlevende muskelceller for holdbare transgene udtryk (AAV6, 6.2FF, 8, og 9)19,20.
Dette papir har til formål at detaljere en omkostningseffektiv metode til fremstilling af høj renhed, høj titer, forskning-grade AAV vektorer til brug i prækliniske store dyremodeller. Produktionen af AAV ved hjælp af denne protokol opnås ved hjælp af dobbelt-plasmid transfection i klæbende menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler dyrket i celle stakke. Desuden beskriver undersøgelsen en protokol for heparin sulfat affinitet kromatografi rensning, som kan bruges til AAV serotyper, der indeholder heparin-bindende domæner, herunder AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13, og DJ21,22.
En række emballagesystemer er tilgængelige til produktion af AAV vektorer. Blandt disse har brugen af to-plasmid co-transfection systemer, hvor Rep og Cap gener og Ad helper gener (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6, og VA RNA) er indeholdt i en plasmid (pHelper), har nogle praktiske fordele i forhold til den fælles tre-plasmid (tredobbelt) transfection metode, herunder reducerede omkostninger for plasmid produktion23,24 . AAV-genomplasmiden, der indeholder transgeneudtrykskassetten (pTransgene), skal flankeres af ITR'er og må ikke overstige ~4,7 kb i længden. Vektor titer og renhed kan blive påvirket af transgene på grund af potentielle cytotoksiske virkninger under transfection. Vurdering af vektor renhed er beskrevet heri. Vektorer produceret ved hjælp af denne metode, som giver en 1 x 1013 vg/ mL for hver, blev evalueret i mus, hamstere og får dyremodeller.
Tabel 1: Sammensætning af nødvendige løsninger. Nødvendige oplysninger, herunder procentdele og mængder, af komponenter, der er nødvendige for forskellige løsninger i hele protokollen. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dobbelt plasmid transfektion af HEK293 celler i celle stakke
- Optø et kryoglas med HEK293-celler i et perlebad, der er indstillet til 37 °C.
BEMÆRK: Forvarm komplet DMEM til 37 °C, mens cellerne optøs for at sikre, at den kolde temperatur ikke chokerer cellerne ved plating. Sørg for, at cellerne har et lavt passagertal, ideelt mindre end 20, for at sikre optimal vækst og transfektionseffektivitet. Sørg for, at cellerne er certificeret til at være mycoplasma-fri. - Indholdet af kryo-hætteglasset falder til et 15 mL konisk rør, der indeholder 10 mL forvarmet komplet DMEM, og centrifuge cellerne ved 500 x g i 5 min.
- Aspirere medierne, og derefter genbruge HEK293 celler i 20 mL af forvarmet komplet DMEM. Frø cellerne i en 15 cm plade og inkuber ved 37 °C med 5% CO2.
- Opdel cellerne fra en 15 cm plade i tre til såning i cellekulturkammeret.
- Når cellerne er 80% sammenflyttede, aspirere medierne og forsigtigt vaske pladen med 3 mL PBS at ikke forstyrre monolayer. Derefter aspirere PBS og tilføje 3 mL trypsin.
- Inkuberes i 2 min ved 37 °C, indtil cellerne løftes fra pladen, og neutralisere trypsin ved at tilføje 7 mL komplet DMEM til pladen.
- Saml alle medier og celler i et 15 ML rør og pellet cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 min.
- Aspirere supernatant fra 15 mL rør og genbruge celle pellet i 3 mL af komplet DMEM. Der tilsættes 1 mL til hver 15 cm plade, der indeholder 20 mL komplet DMEM; forsigtigt rock pladerne til at fordele cellerne jævnt, og inkuberes ved 37 °C, med 5% CO2.
- Når cellerne er 80% sammenløb, gentages trin 1.4.1 og 1.4.2. Saml supernatanten i 50 mL koniske rør, og vend forsigtigt røret for at sikre, at cellerne er homogene.
- Bestem celletætheden ved at blande 10 μL af cellernes prøver med 10 μL trypanblå og tilføje blandingen til et celletællingsdias til analyse i celletælleren.
- Bland 1 L forvarmet komplet DMEM med den nødvendige celleaffjedring til at så cellekulturkammeret (overfladeareal på 6360 cm2) med 1 x 104 celler/cm2. Hæld celleblandingen i cellekulturkammeret, og roter forsigtigt for jævnt at fordele cellerne på tværs af hver monolag (figur 1) og inkuber ved 37 °C med 5% CO2.
- Ud over cellekulturkammeret plade en 15 cm plade med 1 x 104 celler /cm2 som reference for sammenløb.
- Efter ~65-h inkubation, kontrollere referencepladen for sammenløb-ideelt ~ 80%-90% sammenløb.
BEMÆRK: Forvarm komplet DMEM til tilføjelse til cellekulturkammeret ved 37 °C.
Figur 1: Manøvrering af cellestak til cellesåning og transfektion. Til såning af cellestakken skal du starte med at fjerne et af udluftningshætterne og hælde 1 L forvarmet komplet DMEM med den nødvendige mængde HEK293-celler (A). Fordel celler og medier jævnt ved at stramme begge udluftningshætter og bringe alle medier til hjørnet af cellestakken med et af udluftningshætterne og placere den i det hjørne (B), placere cellestakken på siden (C) og derefter dreje cellestakken 90 ° (D), så udluftningsportene er oppe (E). Sænk forsigtigt cellestakken til den normale vandrette position, og sørg for, at alle cellestakkens kamre er helt dækket af medier (F). Ved transfecting skrues både udluftningshætter og hælder langsomt gamle medier ud i en affaldssteril affaldsbeholder, så den ikke forstyrrer cellernes monolag (G). Klik her for at se en større version af dette tal.
- Polyethylenimin (PEI)/DNA-blanding forberedes med et koncentrationsforhold på 3:1 (w/w).
- Dna-blandingen forberedes i et 50 mL konisk rør ved at tilsætte 475 μg pTrangene og 1425 μg pHelper til 40 mL reduceret serum medium for at skabe et 3:1-forhold mellem pHelper:pTrangene.
BEMÆRK: PEI/DNA-blandingsberegneren kan findes ved hjælp af tabel 2. - Der tilsættes 5,7 mL PEI (1 g/L) til det reducerede serummedium og DNA-blandingen dropwise. Derefter hvirvler du kort og inkuberer i 10 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Når PEI/DNA inkuberer ved stuetemperatur, bliver det lidt overskyet.
- Dna-blandingen forberedes i et 50 mL konisk rør ved at tilsætte 475 μg pTrangene og 1425 μg pHelper til 40 mL reduceret serum medium for at skabe et 3:1-forhold mellem pHelper:pTrangene.
- Efter 8 min PEI/DNA-inkubation fjernes mediet fra cellekulturkammeret.
BEMÆRK: Sørg for at løsne begge orange hætter for at opretholde en jævn strøm af medier for at undgå at løsne celler. - Tilsæt PEI / DNA til 1 L forvarmet komplet DMEM, og hæld langsomt blandingen i cellekulturkammerporten. Væsken fordeles jævnt til alle rækker (figur 1) og inkuberes i 72 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
2 Høst af AAV og kemisk lysis af de transfected HEK293 celler
- Ryst cellekulturkammeret kraftigt for at løsne cellerne, indtil medierne ser uklare ud fra løsnede celler og hæld i fire 500 mL centrifugerør.
- Centrifuge rørene ved 18.000 x g i 30 min ved 4 °C for at pille cellerne. Hæld den afklarede supernatant i 1 L polyethylen terephthalat copolyester (PETG) flaske.
BEMÆRK: Hvis man ikke har adgang til en højhastighedscentrifuge, centrifuge ved 12.000 x g i 40 min. De pelleted celler kan ikke være fast ved denne hastighed og vil glide som hælde ud supernatant. - Cellpillerne genbruges i 500 mL centrifugrør med 50 mL lysisbuffer og inkuberes i 60 min ved 37 °C.
- Centrifugere rørene på 18.000 x g i 30 min, og derefter overføre supernatant i samme 1 L PETG flaske. Kassér de pelleterede cellerester.
BEMÆRK: Rengør straks den afklarede supernatant og opbevares ved 4 °C i op til 72 timer. For langtidsopbevaring skal opbevares ved -80 °C. Opbevar ikke ved -20 °C.
3 AAV Vector rensning ved hjælp af heparin affinitet kromatografi
- Fjern det rå lysat fra -80 °C, og lad det være ved 4 °C natten over for at tø op. Når det er optøet, skal du bruge et 0,22 μM-filter til at filtrere det rå lysat.
- Hvis du vil passivere centrifugalkoncentratoren, skal der tilsættes 4 mL filterforbehandlingsbuffer til en centrifugalkoncentrator for hver heparin sepharosekolonne, der anvendes. Opgør centrifugalkoncentratoren ved stuetemperatur i 2-8 timer. Opsætning af passivering umiddelbart før rensningstrinene.
- Sæt slangen og pumpen op (Figur 2).
- Placer slangen i en peristaltisk pumpe og kør 20 mL på 1 M NaOH. Kør derefter 50 mL molekylært vand og kør derefter 50 mL basal DMEM.
- Fastgør 5 mL heparin sepharose kolonne til slanger og køre 25 mL basal DMEM at fjerne konserveringsmiddel.
- Kør 0,2 μM af det filtrerede rålyat gennem kolonnen med en strømningshastighed på 1-2 dråber/s.
Figur 2: Opsætning for peristaltisk pumpe til AAV-rensning. Kør slangen fra den rå lysat, gennem den peristaltiske pumpe, og ind i heparin matrix kolonne. Klik her for at se en større version af dette tal.
BEMÆRK: Sørg for ikke at indføre bobler eller lade kolonnen løbe tør, da dette vil kompromittere kolonnen og forhindre udløsning af AAV. Kassér kolonnen, hvis den løber tør, og brug en ny kolonne til resten af rålyset.
- Læg alt det rå lysat på heparinsøjlen, og brug følgende opløsninger til at vaske kolonnen.
- Vask med 50 mL 1x Hanks Balanced Salt Solutions (HBSS) uden Mg2+ og Ca2+.
- Vask med 15 mL på 0,5 % N-Lauroylsarcosin i HBSS uden Mg2+ og Ca2+.
- Vask med 50 mL HBSS uden Mg2+ og Ca2+.
- Vask med 50 mL HBSS med Mg2+ og Ca2+
- Vask med 50 mL på 200 mM NaCl/HBSS med Mg2+ og Ca2+.
- Elute 5 x 5 mL (25 mL total) med 300 mM NaCl/HBSS med Mg2+ og Ca2+ og mærk elutionerne som E1-E5 (hver opløsning er på 5 mL).
- Koncentration af virus ved hjælp af en centrifugalkoncentrator
- Drej centrifugalkoncentratoren, der indeholder forbehandlingsbufferen ved 900 x g i 2 min. Kassér gennemstrømningen.
- Centrifugalkoncentratorfilteret vaskes med 4 mL HBSS med Mg2+ og Ca2+ og centrifuge ved 1000 x g i 2 min. udsmid gennemstrømningen.
- Tilsættes elution E2 til centrifugalkoncentratoren. Drej ved 1000 x g i 5 min og kassér gennemstrømningen.
- Afslut tilsætning E2 og tilsæt derefter E3 til centrifugalkoncentratoren og drej ved 1000 x g i 5 min, indtil den koncentrerede virus er ca. 1 mL.
BEMÆRK: Undgå at centrifugere vektoren, så lydstyrken er under filterets niveau. Koncentrer ikke E1, E4 eller E5 i centrifugalkoncentratoren, da de indeholder meget lidt eller ingen vektor og indeholder forurenende stoffer. - Fjern den koncentrerede virus fra centrifugalkoncentratoren ved hjælp af en p200 filtreret spids, og læg den i et sterilt 1,5 mL centrifugerør.
- Skyl centrifugalkoncentratoren med 200 μL HBSS med Mg2+ og Ca2+ for at fjerne eventuelle resterende AAV'er fra filteret. Pipette op og ned kraftigt flere gange (for ~ 30 s) for at løsne enhver virus klæbet til membranen og placere i 1,5 mL centrifuge rør med resten af virus. Bland røret godt.
- Aliquot 5 μL til DNA-ekstraktioner og opbevar den rensede vektor ved -80 °C.
- Vask kolonnen med 25 mL på 2 M NaCl. Brug desuden 25 mL 0,1% Triton X-100, foropvarmet til 37 °C til at vaske kolonnen. Vask derefter kolonnen med 50 mL steril dH2O, og vask derefter med 25 mL 20% ethanol.
- Sørg for, at søjlemembranen er fuldt mættet i 20% ethanol, da dette er opbevaringsopløsningen. Forsegl kolonnen med tilfølgende stik, og opbevar den ved 4 °C.
- Opbevar slangen i 1 M NaOH.
BEMÆRK: Hvis de rengøres korrekt, kan heparin sepharosesøjler genbruges op til fem gange.
4 Genomisk DNA-udvinding af AAV
- Forbered den reaktionsblanding, der er nævnt i tabel 3, i et PCR-rør til DNasebehandling.
| Komponent | Lydstyrke |
| Renset AAV vektor | 5 μL |
| 10x DNase Buffer | 2 μL |
| DNase | 1 μL |
| ddH2O | 12 μL |
| Slutvolumen | 20 μL |
Tabel 3: DNase behandling master mix formel. Anbefalede komponenter og mængder, der kræves til DNase-behandling af AAV-virusvektorer under DNA-ekstraktion.
- Vortex PCR-røret til at blande og puls PCR rør til at dreje ned indholdet.
- Ved hjælp af en termocykel inkuberes ved 37 °C i 20 min efterfulgt af 75 °C i 15 min for at opvarme dNase.
- Der tilsættes 5 μL proteinase K.
- Ved hjælp af en termocykel inkuberes ved 50 °C i 60 min og derefter ved 95 °C i 30 min til opvarmning af inaktivere Proteinase K.
- Brug et DNA-oprydningssæt til at fjerne potentielle forurenende stoffer.
BEMÆRK: Dette trin blev udført ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt blod- og vævsoprydningssæt (Materialetabel).- Der tilsættes 200 μL AL-buffer (blod- og vævsoprydningssæt, materialetabel)til PCR-røret, der indeholder DNase/Proteinase K-behandlet vektor.
- Vortex PCR-røret og inkuberes ved 56 °C i 10 min i en termocykel.
- Pipette væsken fra PCR-røret i en steril spin kolonne sidder i en samling rør.
- Tilsæt 200 μL 100% ethanol til kolonnen og blandes grundigt ved hvirvlende.
- Centrifuge ved 6.000 x g i 1 min og kassér strømmen igennem.
- Der tilsættes 500 μL buffer AW1 (Blod- og vævsoprydningssæt, materialetabel)til spinkolonnen.
- Centrifuge ved 6.000 x g i 1 min og kassér strømmen igennem.
- Der tilsættes 500 μL buffer AW2 (Blod- og vævsoprydningssæt, materialebord)til spinkolonnen.
- Centrifuge ved 15.000 x g i 3 min og kassér strømmen igennem.
- Spinsøjlen placeres i et sterilt 1,5 mL centrifugerør, og der tilsættes 200 μL buffer AE (Blod- og vævsoprydningssæt, Materialetabel)direkte til spinkolonnemembranen.
- Inkuber ved stuetemperatur i 1 min.
- Centrifuge ved 6.000 x gi 1 minut for at elute DNA' et.
- Opbevar DNA'et ved -20 °C.
5 Titrering af AAV vektorgenomer ved hjælp af kvantitativ polymerasekædereaktion og en Simian Virus 40 (SV40) sonde
BEMÆRK: Udfør alt qPCR-arbejde i en PCR-hætte ved hjælp af filtrerede pipettespidser for at undgå ekstern DNA-forurening. Hvis AAV-genomet ikke koder en SV40 polyA-sekvens, skal du bruge en sonde mod den ITR, der er beskrevet andetsteds25. Sørg for plasmid DNA valgt som standard indeholder SV40 polyA sekvens.
- Forberedelse af lagerstandard
- Bestanden plasmid DNA-standard (pTransgene plasmid indeholdende SV40 polyA sekvens) til en endelig koncentration på 10 μg/μL og opbevares ved -20 °C i 6 μL aliquots.
- Bestem det kopinummer, der findes i plasmid-DNA-standarden, ved hjælp af følgende onlineberegner26.
BEMÆRK: Brug et plasmid-DNA, der bruges til standarden produceret af en kommerciel leverandør, for at sikre kvalitet og korrekt koncentration. Forbered en stor mængde standard (f.eks. 10 mL) til at gennemføre brostudier, når du overgår til en nyforberedt standard.
- Følgende reagensblanding, der er nævnt i tabel 4, tilberedes til både prøverne og standarden i et 1,5 mL centrifugerør.
BEMÆRK: Forbered tilstrækkelig oversvind af master mix. Se tabel 5 for primer/sondesekvenser.
| Komponent | Lydstyrke |
| Universal qPCR master mix (2X) | 10 μL |
| Molekylær kvalitet vand | 4,5 μL |
| 40x SV40 polyA primer/sonde | 0,5 μL |
| Slutvolumen | 15 μL |
Tabel 4: qPCR master mix til AAV titration. Anbefalede komponenter og mængder, der kræves til qPCR af DNA udvundet fra AAV virale vektorer.
| Komponent | Sekvens |
| Fremadrettet primer | 5'-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3« |
| Omvendt primer | 5'-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3' |
| Sonde | /56-FAM/AGCATTTTT/ZEN/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC/3IABKFQ |
Tabel 5: Primer sekvenser mod SV40 polyA DNA-sekvens. Sekvenser af primere og sonde, der anvendes til qPCR titrering, som binder sig til bestemte områder af AAV virale vektorer, der indeholder SV40 polyA sekvens.
- Pipette master blandes op og ned for at blande.
- Sæt fortyndingspladen op.
- Brug en klar 96-brøndsplade til at forberede standard- og prøvefortyndinger, tilsæt 45 μL molekylært vand til hver brønd i hver anden kolonne startende med kolonne 1 (kolonne 1, 3, 5, 7, 9 og 11).
- Tilsættes 5 μL af standarden til godt A1 og pipette at blande.
- Brug en ny filtreret pipettespids til at skabe en 1/10 fortynding fra brønd A1 til B1.
- Fortsæt en serie af 10 gange fortyndinger ned ad kolonnen, indtil du når G1.
- Tilføj ikke til H1, da dette vil fungere som en negativ kontrol.
- Påfør den første prøve (S1) ved at tilsætte den til brønden A3 og danne en 1/10 fortynding. Pipette denne blanding og overføre 5 μLto godt B3. Kassér pipettespidsen efter denne overførsel.
- Med en ny pipettespids blandes opløsningen i brønd B3 og danner en 1/100 fortynding. Overfør 5 μLof denne blanding til godt C3 og kassér spidsen efter overførslen.
- Med en ny pipettespids skal pipetten op og ned af opløsningen i brønden C3 for at lave en fortynding i 1/1000. Kassér spidsen.
- Fortsæt fortynding af prøver uden at tilføje prøver til kolonne 2, 4, 6, 8, 10 eller 12.
- Når alle prøver er fortyndet, blandes indholdet i brønde i kolonne 1 og overfør derefter 20 μL til kolonne 2.
- Gentag dette for kolonne 3, 5, 7, 9 og 11 for at oprette gentagelser af hver standard og prøvefortynding. Der henvises til figur 3 for pladelayout.
BEMÆRK: Når du følger pladeopsætningen i figur 3, vil prøver fortyndet i række G og H kun have 1/10 og 1/100 fortyndinger.
Figur 3: Pladelayout til qPCR AAV-titrering. Blå angiver placeringen af den serielle fortynding af standarden; grøn angiver placeringen af den negative kontrol; lilla angiver placeringen af fortyndingen af prøverne. Hver standard, negativ eller prøve tilføjes i replikering. Et eksempel for koncentrationen af standarden er blevet tilføjet for at vise standardfortyndingsserien, og placeringen af prøvefortyndinger er blevet tilføjet til deres respektive brønde. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Titrering af SV40 polyA detektion-baseret qPCR
- Tilføj 15 μL qPCR master mix til hver brønd af en hvid-semi skirted 96-godt qPCR plade.
- Overfør 5 μL af hver prøve fra den klare 96-brønds plade til den hvid-semi skørt 96 godt qPCR plade.
- Brug en multikanal pipette for at sikre tilstrækkelig blanding af qPCR master mix og prøve.
- Forsegl pladen med en tætningsfilm og centrifuge qPCR-pladen ved 1500 x g i 30 s.
- Kør qPCR-reaktionen på pladebaseret PCR-forstærknings- og detektionsinstrument i realtid ved hjælp af de foreslåede betingelser i tabel 6.
| Afsnit | Cykler | Tidspunkt | Temperatur | Beskrivelse |
| Præinkubation | 1x | 5 min | 95 °C | DNA-denaturering. |
| Forstærkning | 38x | 15 s | 95 °C | Forstærkning af DNA. Indstillinger kan ændres, hvis du bruger alternative primere med forskellige udglødningstemperaturer. |
| 60 s | 60 °C | |||
| Køling | 1x | 60 s | 40 °C | Pladekøling. Slut på flugt. |
Tabel 6: Thermocycler-protokol til hydrolysesondebaseret qPCR-titrering. Anbefalet termocykelprotokol til brug af sondebaseret qPCR-titrering af DNA-udvundne rensede AAV-vektorer.
BEMÆRK: For qPCR AAV titrering regneark se tabel 7.
- Dataanalyse til bestemmelse af AAV-genomkopinumre.
- Udfyld regnearksdatacellerne (Tabel 7A) med de koncentrationsværdier, der er hentet fra qPCR-kørslen for både standard- og eksempelfortyndinger.
- Brug koncentrationsværdier fra tabel 7A til at producere en standardkurve (tabel 7B).
BEMÆRK: Standardkurven vises som en naturlig logaritme (y = en in(x) + b) sammen med R2-effektivitet. En standardkurve skal have en effektivitet tæt på 100 % og R2 tæt på 1,0 (≥0.99). - Udfyld hældningseffektiviteten ved at udfylde denne online regnemaskine27.
BEMÆRK: En effektivitet mellem 90%-110% er acceptabel. Hvis effektiviteten af qPCR ligger uden for dette interval, skal du køre qPCR igen. - Brug koncentrationsværdier fra tabel 7A til gennemsnittet af fortyndingerne af hver prøve, og fastlæg standardafvigelsen for hver prøve (tabel 7C).
BEMÆRK: Udeluk fortyndinger fra prøver, der er mere end én standardafvigelse væk fra gennemsnittet af prøvefortyndingerne. - Ved hjælp af den gennemsnitlige koncentration af hver fortynding multipliceres med fortyndingsfaktoren, og divideres derefter med fem for at få vektorgenomer (vg)/μL for hver prøve (tabel 7C).
- Hver prøves vg/mL beregnes ved at gange gennemsnittet af hver prøves koncentrationer med 80.000 (tabel 7C).
- Gennemsnitlig vg/mL for hver fortynding for at producere den endelige vg/mL af hver prøve (tabel 7C).
BEMÆRK: Brugeren skal dividere den gennemsnitlige koncentration af hver fortynding med en faktor fem for at tage højde for de 5 μL, der er lagt i hver brønd for qPCR-løbet for at producere koncentrationen i vg/μL. Faktoren på 80.000 tegner sig for overgangen fra hver stikprøves gennemsnitlige koncentrationsværdi til vg/mL. For det første skal gennemsnittet af hver prøves koncentrationsværdi ganges med 2 for at tage højde for de enkeltstrengede genomer, da primersonden kun kvantificerer positivsans, enkeltstrenget DNA (ssDNA), og AAV-genomet findes i et omtrentligt 1:1-forhold mellem positiv og negativ forstand ssDNA25,28. Gennemsnittet af hver prøves koncentrationsværdi multipliceres x40 for at tage højde for prøvefortyndingen fra 5 μL af renset vektor (punkt 4.1) til 200 μL udvundet DNA (punkt 4.6.12). Endelig skal gennemsnittet af hver prøves koncentrationsværdi multipliceres x1000 for at konvertere fra vg/μL til vg/mL.
6 Vurdering af vektorkvalitet og renhed
- Kvalitetskontrol - Western Blot
- Forbered en 12% SDS PAGE gel.
- Udfør polyacrylamidgelelektroforese.
BEMÆRK: Læg 6 x 1010 vg prøver pr. brønd. - Overfør proteinerne til polyvinyliden difluorid (PVDF) membran.
- Blokering af PVDF-membran
- Fjern membranen fra overførselsapparatet og skyl i 0,1% PBST for at fjerne løst acrylamid.
- Anbring membranen i blokerende opløsning i mindst 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Blokeringsbuffer kan yderligere suppleres med 2% gedeserum.
- Inkubation med primært antistof
- Dekanter blokeringsbufferen og tilsæt det primære antistof, et anti-AAV-musemonolonalt antistof ved en fortynding i 1:200.
- Inkuberes natten over ved 4 °C.
- Dekanter det primære antistof og vask fem gange med 0,1% PBST i 5 min ved stuetemperatur med agitation.
- Inkubation med sekundært antistof
- Dekanter vaskeopløsningen og tilsæt HRP konjugeret sekundært antistof, fortyndet ved en 1:7500 i blokerende buffer, og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med agitation.
- Dekanter det sekundære antistof og vask fem gange med 0,1% PBST i 5 min ved stuetemperatur med agitation.
- Udfør en sidste vask med PBS ved stuetemperatur med omrøring.
- Detekter proteinerne ved hjælp af forbedret chemiluminescerende (ECL) substrat.
- Forestil dig gelen for at visualisere de virale proteiner (VP1, VP2 og VP3-underenheder) (Figur 4).
Figur 4: Western blot viser AAV capsid proteiner. Bane A; MW stigen, bane B; AAV6.2FF-hIgG01, Bane C; AAV6.2FF-hIgG02, Bane D; AAV6.2FF-hIgG03 og Lane E; AAV6.2FF-hIgG04. 6 x 1010 vg af hver AAV6.2FF-hIgG blev læsset i deres respektive baner. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Renhedskontrol - SDS PAGE og Coomassie Stain
- SDS-PAGE gel og prøver forberedes som beskrevet fra trin 6.1.1 og 6.1.2.
- Fastgør gelen i fastgørelsesopløsningen i 1 time eller natten over med blid omrøring. Skift fastgørelsesopløsningen én gang i løbet af den første time.
- Farvning af gelen i 2-4 timer med blid omrøring.
- Afstain gelen med en afsmitning opløsning. Genopfyld afsmitning opløsningen flere gange, indtil baggrunden af gelen er fuldt destained (4-24 timer).
- Opbevar den de farvede gel i en opbevaringsløsning.
- Forestil dig gelen for at visualisere alle proteiner, der er farvet af Coomassie farvningsopløsning.
Figur 5: Coomassie-farvet gel. Bane A; MW stigen, bane B; AAV6.2FF-hIgG01, Bane C; AAV6.2FF-hIgG02, Bane D; AAV6.2FF-hIgG03, Bane E; AAV6.2FF-hIgG04, Bane F; AAV6.2FF-hIgG05 og Lane G; AAV6.2FF-hIgG06. 6 x 1010 vg af hver AAV6.2FF-hIgG blev indlæst i deres respektive baner. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Alternativ renhedskontrolanalyse - HEK293 værtscelleproteindetektering ELISA
- Udfør HEK293-værtscelleproteindetektering via ELISA i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Brug fortyndinger på 5 x 10-2 og 1 x 10-3 til rensede rAAV-prøver. Når TMB er tilføjet til brønden, inkuberes væk fra lys. Lineær regression kan ikke bruges til at analysere resultaterne. - Udfør en punkt-til-punkt-analyse, kubisk spline eller fire parameterlogistisk tilpasningsmetode for at interpolere koncentrationer af ubekendte og multiplicere med fortyndingsfaktoren for at bestemme den oprindelige prøvekoncentration.
- Udfør HEK293-værtscelleproteindetektering via ELISA i henhold til producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversættelse fra små gnavermodeller til større dyremodeller og eventuel klinisk anvendelse udgør en betydelig udfordring på grund af den store mængde AAV, der kræves for at transduce større dyr og opnå terapeutiske virkninger. For at sammenligne transduktionseffektiviteten af den rationelt designede AAV6.2FF capsid, der tidligere blev påvist en 101-dobling af transduktionseffektiviteten i murinmuskelceller sammenlignet med AAV63, blev mus, hamstere og lam alle administreret AAV6.2FF, der udtrykte et humant monoklonalt antistof (hIgG). Den AAV6.2FF-hIgG-udtrykke vektor indeholdt en CASI promotor4, en Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatoriske element (WPRE), og en SV40 polyA sekvens. Seks uger gamle hunBALB/c (n = 4) mus blev intramuskulært (IM) administreret 1 x 1011 vg AAV6.2FF-hIgG i 40 μL, og der blev opsamlet blod på dag 0, 7, 14, 21 og 28 post AAV-administration til hIgG-overvågning. Fire uger gamle syriske hamstere (to hunner og to hanner) blev IM administreret 1 x 1012 vg AAV6.2FF-hIgG i 40 μL, og blod blev indsamlet ugentligt for at overvåge for hIgG udtryk. Endelig blev 10 dage gamle dorsetlam (n = 3) IM-administreret 1 x1013 vg /kg AAV6.2FF-hIgG i to til tre 1 mL-injektioner i gumpen. Ugentlig blodprøve blev afsluttet ved halspulsårer og hIgG blev overvåget ugentligt i 28 dage. Alle dyreforsøg blev godkendt af den institutionelle Animal Care Committee ved universitetet i Guelph.
Mus IM administreret 5 x 1012 vg/kg AAV6.2FF-hIgG udtrykt mellem 171-237 μg/mL hIgG i serumet ved dag 28 efter administration (Figur 6). Hamstere IM administreret 2 x 1013 vg/kg AAV6.2FF-hIgG udtrykte meget højere niveauer end musene, med serum hIgG niveauer på 495-650 μg/mL om dag 28 efter administration. Endelig administrerede fåre-im 1 x 1013 vg/kg udtrykt serum hIgG-niveauer på 21-46 μg/mL om dagen 28 efter administration. På tværs af alle dyremodeller syntes vektoren ikke at hindre nogen sundhedsindekser, såsom vægt, der beviser sikkerheden og kvaliteten af de producerede vektorer. Det er velkendt, at AAV-medieret monoklonalt antistof (mAb) udtryk varierer betydeligt afhængigt af arten og mAb. Så vidt forfatterne ved, er der ingen rapporter om AAV-mAb-udtryk hos fårearter, og der er således ingen benchmark for forventede udtryksniveauer. Det er bemærkelsesværdigt, at fårene i denne undersøgelse fordobledes i vægt i løbet af 28-dages perioden efter injektionen, og at dyrene i figur 6 alle blev transduced med forskellige AAV-mAbs og derfor ikke kan sammenlignes.
Figur 6: Intramuskulær levering af AAV6.2FF-hIgG fører til vedvarende serum hIgG-udtryk hos mus, hamstere og får. Kvindelige BALB/c-mus (n = 4) blev IM administreret 5 x 1012 vg/kg AAV6.2FF-hIgG, syriske hamstere (2 hanner, 2 hunner), blev IM administreret 1 x 1013 vg/kg AAV6.2FF-hIgG, og 10 dage gamle han-Dorset lam (n = 3) blev IM administreret 1 x 1013 vg/kg. Serum blev overvåget for hIgG-udtryk over en periode på 28 dage. Data repræsenteres som middel ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Transfection af Celle Kultur Kammer | |||||
| Protokol | |||||
| 1. Lad DNA, OptiMEM og PEI varme til stuetemperatur før transfektion | |||||
| 2. Input antallet af celle stakke, der skal overføres (ingen overage kræves) | |||||
| 3. Sørg for, at DNA-koncentrationerne er korrekte, da dette vil ændre de nødvendige | |||||
| Antal cellekulturkamre | 1 | ||||
| Koncentration af transgene plasmid | 1 | mg/mL | |||
| Koncentration af pDGM6.2FF plasmid | 1 | mg/mL | |||
| Beløb Pr. cellekulturkamre | Transfection Mastermix | ||||
| OptiMEM | 48.1 | Ml | 48.1 | Ml | |
| 1:3-forhold pTransgene:pHelper | pTransgene | 475 | μg | 475 | μL |
| pHelper | 1425 | μg | 1425 | μL | |
| 4. Tilføj nødvendige mængder OptiMEM og plasmid DNA til et 50 mL konisk rør | |||||
| 5. Inverter 10 gange for at blande | |||||
| 3:1 PEI:DNA-forhold | PEI Maks. | 5.7 | Ml | 5.7 | Ml |
| 6. Tilsæt den nødvendige mængde PEI til 50 mL-røret, der indeholder OptiMEM og plasmid DNA | |||||
| 7. Immeditely lukke 50 mL rør og vortex og invertere 3-5 gange for at blande. | |||||
| 8. Indstil en timer til 10 min for PEI-komplekserne til at inkubere | |||||
| 9. Flyt cellestakke, der skal overføres til BSC | |||||
| 10. Efter 10 min hæld trasnfection mix i en orange port. | |||||
| 11. Bland forsigtigt væske i hele cellestakken | |||||
| 12. Returner de transfected celler stak til inkubatoren sikre lige volumen på hvert lag | |||||
| 13. Høst cellekulturkammer 72 timer senere | |||||
Tabel 2: Transfection regnemaskine til celle kultur kammer. Interaktivt regneark til at bestemme den korrekte koncentration af pTransgene, pHelper og PEI til transfektion af cellekulturkammer.
Tabel 7: AAV Titration Calculator. Interaktivt regneark til bestemmelse af den endelige koncentration af AAV-prøver fra qPCR udtrykt som vg/mL. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Produktionen af rekombinante AAV (rAAV) vektorer beskrevet i dette papir bruger fælles materialer, reagenser, og udstyr findes i de fleste af de molekylærbiologiske forskningslaboratorier og faciliteter. Dette papir giver mulighed for høj kvalitet in vitro og in vivo kvalitet rAAV, der skal produceres af læseren. Frem for alt er denne protokol for rAAV-produktion sammenlignet med mere kedelige protokoller, der involverer rensning af cæsiumchlorid, effektiv og undgår brugen af ultracentrifugering. Når HEK293-celler er blevet overført, er renset AAV klar til brug inden for 5 arbejdsdage.
Under rAAV-produktions- og rensningsprocessen kan mange trin påvirke vektorens renhed og endelige titer. Det første og mest kritiske trin er hek293-cellernes sundhed, som har en direkte effekt på vektortitereren. Brugen af HEK293-celler i modsætning til andre celletyper eller systemer, såsom HEK293T-celler, er fordelagtig, idet HEK293-celler har en større evne til at klæbe til plastbelægningen af plader og celler, der skaber robuste cellenetværk til kontinuerlig cellevækst. Det anbefales at overvåge celler for mycoplasma forurening og for at undgå passaging HEK293 celler forbi ~ 40 passager eller når deres fordobling tid synes at være aftagende, da dette vil føre til lavere AAV udbytter. Desuden er bekræftende celler ca. 80% sammenløb før transfektion sikrer, at cellerne ikke er for sparsomme eller tilgroede. Med hensyn til transfectionkomponenter anbefales det stærkt at anvende plasmid-DNA af høj kvalitet (f.eks. kommercielt forberedt plasmid-DNA) for at sikre, at DNA forbliver i opløsning og interagerer korrekt med komponenter til levering af kemisk transinfektion, såsom PEI. Endelig har transfection reagens en betydelig indvirkning på rAAV udbytter. Her bruges PEI som transfection agent. PEI er en stabil kationisk polymer, der leverer eksogent DNA til kernen af celler gennem produktion af plasmid-polymer komplekser, som derefter tages op af celler og smuglede til kernen gennem værtscelleprocesser29. PEI-baserede transinfektioner er hurtige og nemme i forhold til andre metoder til DNA-levering, herunder calciumphosphat eller lipofectamin. Forholdet mellem PEI:DNA skal dog optimeres.
Brugen af celle stakke i modsætning til traditionelle klæbende plader giver en mere bekvem og konsekvent metode til produktion af rAAV. Celle stakke indebærer mindre teknisk manipulation under transfection, afbøde den mulige udlodning af celler fra den klæbende monolag, giver mulighed for stærkere cellenet, og bedre produktion af rAAV. Posttransfection, indsamling af supernatant og lysis af celler er effektiv og konsekvent. For at høste rAAV fra celler er fysiske celle lysis-metoder som fryse-optøning ineffektive og inkonsekvente, da der ikke er nogen måde at sikre, at alle cellerne lyser. Her beskrives en kemisk lysis-procedure. Brugen af kemisk lysisbuffer sikrer, at alle celler udsættes for lysismidlet i en bestemt koncentration samt tilsætningsstoffer såsom proteasehæmmer for at forhindre capsidforringelse. Denne metode mere konsekvent lyses celler giver mulighed for en mere effektiv høst af rAAV. Desuden eliminerer peltering og fjernelse af cellulære snavs mulige forurenende stoffer fra det rå lysat, hvilket kan øge tid og omkostninger ved filtrering lysate før rensning.
Selvom rAAV kan være til stede i store mængder i det rå lysat, kan den handling at indfange og rense rAAV variere mellem forskellige rensningsmetoder, såsom cæsiumchloridgradienter. Her giver brugen af heparin sepharose affinitetskromatografirensning en hurtig og nem metode til vektorrensning, der resulterer i ultrapur virus og ikke kræver gradient ultracentrifugering. Det er dog ikke alle AAV-serotyper, der indeholder heparinbindende domæner, så for disse serotyper ville denne rensningsmetode ikke være hensigtsmæssig. For eksempel, mens AAV2 og AAV6 binder heparin sulfat, AAV4 og AAV5 ikke30. Selv om denne metode ikke er universel, er det effektivt og nemt for de capsider, der binder heparin sulfat. I modsætning til ultracentrifugeringsgradienter som joxanol er alle rAAV-partikler bundet til kolonnens membran, indtil de eluteres ved hjælp af høj saltkoncentrationsvask, så man undgår problemer som blanding af gradienter og færdigheder, der er nødvendige for at genvinde fraktioner fra gradienten. Elution gennem høj saltkoncentration vasker giver mulighed for kontrolleret og præcis udløsning af virus i fraktioner, der kan koncentreres yderligere. Kun koncentrere visse fraktioner af den eluted virus yderligere fjerner potentielle forurenende stoffer, mens inddrive >97% af den eluted virus. En begrænsning af heparin sepharose affinitet kromatografi rensning er, at det ikke skelner mellem tomme og fulde partikler. Yderligere analytiske ultracentrifugeringstrin skal indarbejdes for at fjerne tomme capsids31.
qPCR er en omkostningseffektiv og hurtig metode til bestemmelse af antallet af vektorgenomer i en AAV-vektorforberedelse. Selvom qPCR er en følsom kvantificeringsmetode, giver den ingen oplysninger om antallet af smitsomme partikler i prep. Desuden kan følsomheden af denne analyse resultere i variation, da tekniske fejl under pipettering kan føre til variabilitet mellem analysen. For ethvert eksperiment, der involverer sammenligning af forskellige AAV-vektorer, er det derfor afgørende, at vektorerne titeres på den samme qPCR-plade. På trods af disse begrænsninger er qPCR den mest nøjagtige metode, der er udviklet til titering AAV og er i øjeblikket den mest udbredte og accepterede metode til kvantificering af AAV-vektorer32. Brugen af en primer / sonde, der binder sig til SV40 polyA af en rAAV genom er baseret på det faktum, at denne sekvens er bevaret på tværs af mange AAV genom plasmider manipuleret i laboratoriet. Ud over at vælge en bevaret sekvens blandt læserens rAAV genom plasmids, qPCR sonder kan være designet til alle dele af rAAV genomet, herunder, men ikke begrænset til, initiativtagere, transgener, eller post-transcriptional faktorer.
Vurdering af renheden og kvaliteten af AAV-produktet er et vigtigt skridt i produktionsprocessen. Vestlige blotting kan bruges til at opdage VP1, VP2 og VP3 strukturelle proteiner, der udgør capsid af AAV, samt eventuelle ændrede former for VP. VP1, VP2 og VP3 er typisk til stede i et forhold på 1:1:10, men dette kan variere fra 1:1:5 til 1:1:20 afhængigt af serotypen. Derfor er det afgørende at bestemme forholdet for hvert system empirisk, især fordi N-terminal-regionen VP1 har vist sig at være vigtig for infektionsevne og transduktion33. SDS-PAGE kombineret med Coomassie farvning er en ret ligetil metode til at opdage VP1, VP2 og VP3 samt værtscelleproteinforurenende stoffer. Brugen af fluorescerende proteinpletter såsom SYPRO Ruby giver højere følsomhedsdetektering af værtscelleproteinforurenende stoffer end Coomassie; Det er dog ikke alle laboratorier, der har adgang til det billedudstyr, der er nødvendigt for at visualisere gelen. Endelig kan kommercielle ELISA'er bruges til at kvantificere værtscelleproteinforurenende stoffer i AAV-vektorer produceret i HEK293-celler.
Denne protokol giver et dybdegående overblik over at producere høj titer, høj renhed rAAV for serotyper, der binder sig til heparin. I afsnittet om repræsentative resultater viser brugen af romanen AAV6.2FF, der udtrykker hIgG i en række dyremodeller, sikkerheden og effektiviteten af denne rAAV in vivo. Selvom AAV6.2FF-vektoren blev administreret IM, kan disse højkvalitets vira af høj renhed administreres via en række forskellige ruter in vivo, som mulige inflammatoriske forurenende stoffer, såsom værtscelleprotein, er blevet elimineret gennem vores rensningsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sarah K. Wootton er en opfinder på et amerikansk patent US10806802B2 for AAV6.2FF capsid.
Acknowledgments
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas, og Jacob G. E. Yates var modtagere af Ontario Veterinary College Student Stipends samt Ontario Graduate Stipendier. Amira D. Rghei var modtager af en Mitacs Accelerate Studentship. Dette arbejde blev finansieret af canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (#66009) og et Collaborative Health Research Projects (NSERC partnered) grant (#433339) til SKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
- FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
- Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
- Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
- Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
- Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
- Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
- Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
- Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
- Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
- van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
- Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
- Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
- qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
- Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).
