Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ייצור וקטורים הקשורים אדנו וירוס בערימות תאים למחקרים פרה קליניים במודלים בעלי חיים גדולים

Published: June 30, 2021 doi: 10.3791/62727
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור בקנה מידה גדול של וקטורים AAV ברמה מחקרית באמצעות תאי HEK 293 דבקים הגדלים בערימות תאים וטיהור כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי >1 x 1013 גנומים וקטוריים /mL, ומספק כמויות וקטוריות המתאימות למחקרים גדולים בבעלי חיים.

Abstract

וקטורים הקשורים לווירוסים הקשורים לאדנו (AAV) הם בין וקטורי הטיפול הגנטי המתקדמים ביותר מבחינה קלינית, עם שלושה טיפולים גנטיים AAV שאושרו לבני אדם. קידום קליני של יישומים חדשניים עבור AAV כרוך במעבר ממודלים קטנים של בעלי חיים, כגון עכברים, למודלים בעלי חיים גדולים יותר, כולל כלבים, כבשים ופרימטים לא אנושיים. אחת המגבלות של מתן AAV לבעלי חיים גדולים יותר היא הדרישה לכמויות גדולות של וירוס טיטר גבוה. בעוד שתרבית תאי ההשעיה היא שיטה מדרגית לייצור וקטור AAV, מעבדות מחקר מעטות יש את הציוד (למשל, bioreactors) או יודע איך לייצר AAV באופן זה. יתר על כן, TITERS AAV הם לעתים קרובות נמוך באופן משמעותי כאשר מיוצרים השעיה HEK 293 תאים לעומת תאי HEK293 דבק. המתואר כאן היא שיטה לייצור כמויות גדולות של AAV titer גבוהה באמצעות ערימות תאים. פרוטוקול מפורט עבור titering AAV, כמו גם שיטות לאימות טוהר וקטור מתוארים גם. לבסוף, מוצגות תוצאות מייצגות של ביטוי טרנסג'ן בתיווך AAV במודל כבשים. פרוטוקול ממוטב זה לייצור בקנה מידה גדול של וקטורים AAV בתאים חסידים יאפשר מעבדות ביולוגיה מולקולרית לקדם את הבדיקה של טיפולים AAV החדש שלהם במודלים בעלי חיים גדולים יותר.

Introduction

טיפול גנטי המשתמש בווקטורים הקשורים לווירוסים הקשורים לאדנו (AAV) עשה צעדים עצומים בשלושת העשורים האחרונים1,2. שיפורים שהפגינו במגוון רחב של מחלות גנטיות, כולל עיוורון מולד, המופיליה ומחלות של מערכת העצבים השלד והמרכז, הביאו את הטיפול הגנטי AAV לחזית המחקר הקליני3,4. בשנת 2012, סוכנות התרופות האירופית (EMA) אישרה את Glybera, וקטור AAV1 המבטא ליפופרוטאין ליפאז (LPL) לטיפול במחסור ב- LPL, מה שהופך אותו לאישור השיווק הראשון לטיפול גנטי באירופה או בארצות הברית5. מאז, שני טיפולים גנטיים נוספים של AAV, Luxturna6 ו- Zolgensma 7 ,קיבלואת אישור ה-FDA, והשוק צפוי להתרחב במהירות במהלך 5 השנים הקרובות עם עד 10-20 טיפולים גנטיים הצפויים עד 20258. נתונים קליניים זמינים מצביעים על כך שטיפול גנטי AAV הוא מודל בטוח, נסבל היטב ויעיל, מה שהופך אותו לאחד הווקטורים הנגיפיים המבטיחים ביותר, עם מעל 244 ניסויים קליניים מעורבים AAV רשום עם ClinicalTrials.gov. העניין הגובר ביישומים קליניים המערבים וקטורים AAV דורש שיטות ייצור חזקות ומדרגיות כדי להקל על הערכת טיפולים AAV במודלים בעלי חיים גדולים, שכן זהו צעד קריטי בצינור התרגומי9.

עבור ייצור וקטור AAV, שתי הדרישות העיקריות הן הגנום AAV ואת capsid. הגנום של סוג בר (wt)-AAV הוא DNA חד גדילי כי הוא כ 4.7 kbאורך 10. הגנום wt-AAV כולל חזרות מסוף הפוכות (ITRs) שנמצאות בשני קצות הגנום, החשובות לאריזה, ואת הגנים של הנציג והכובע 11. הגנים נציג וכובע, הדרושים לשכפול הגנום, הרכבה של קפסיד ויראלי, אנקפסולציה של הגנום לתוך קפסיד ויראלי, מוסרים מן הגנום הנגיפי מסופקים טרנס לייצור וקטור AAV12. הסרת גנים אלה מהגנום הנגיפי מספקת מקום לטרנסגנים טיפוליים ולכל האלמנטים הרגולטוריים הדרושים, כולל המקדם ואות הפוליה. ה- ITRs נשארים בגנום הווקטורי כדי להבטיח שכפול גנום תקין ו אנקפסולציה ויראלית13,14. כדי לשפר את הקינטיקה של ביטוי טרנסג'ן, ניתן להנדס גנומים וקטוריים של AAV להיות משלימים את עצמם, מה שמפחית את הצורך בהמרה ממרת דנ"א חד-גדילית לדו-גדילית במהלך שכפול הגנום של AAV, אך מפחית את יכולת הקידוד ל- ~ 2.4 kb15.

מעבר לעיצוב הגנום של AAV, בחירת הסרוטיפ קבסידי קובעת את הרקמה ואת tropism התא של וקטור AAV ב vivo2. בנוסף לטרופיזם רקמה, סרוטיפים שונים של AAV הוכחו כמציגים קינטיקה שונה של ביטויגנים 16. לדוגמה, זינצרליואח' 17 סיווגו סרוטיפים שונים של AAV לסרוטיפים בעלי הבעה נמוכה (AAV2, 3, 4, 5), סרוטיפים מתונים (AAV1, 6, 8) וסרוטיפים בעלי ביטוי גבוה (AAV7 ו-9). הם גם סיווגו סרוטיפים של AAV לביטוי פתיחה איטית (AAV2, 3, 4, 5) או ביטוי פתיחה מהירה (AAV1, 6, 7, 8 ו-9). טרופיזם מפוצלים אלה וביטוי גנים קינטיקה נובעים וריאציות חומצת אמינו חלבונים קפסיד, תצורות חלבון capsid, ואינטראקציות עם קולטני תא מארח / קולטנים משותפים18. כמה capsids AAV יש מאפיינים מועילים נוספים כגון היכולת לחצות את מחסום הדם - מוח בעקבות ניהול תוך כלי דם (AAV9) או מתגוררים בתאי שריר חיים ארוכים עבור ביטוי transgene עמיד (AAV6, 6.2FF, 8, ו 9)19,20.

מאמר זה נועד לפרט שיטה חסכונית לייצור וקטורים AAV באיכות גבוהה, בעלי טוהר גבוה, ברמת מחקר לשימוש במודלים פרה-אקליניים של בעלי חיים גדולים. ייצור AAV באמצעות פרוטוקול זה מושגת באמצעות transfection כפול פלסמיד לתוך כליות עובריות אנושיות דבקות (HEK)293 תאים הגדלים בערימות תאים. יתר על כן, המחקר מתאר פרוטוקול עבור טיהור כרומטוגרפיה זיקה הפרין גופרתי, אשר יכול לשמש עבור סרוטיפים AAV המכילים תחומים מחייב הפרין, כולל AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13, ו DJ21,22.

מספר מערכות אריזה זמינות לייצור וקטורים AAV. בין אלה, השימוש במערכות שיתוף פעולה דו-פלסמיד, שבהן הגנים Rep ו- Cap וגנים מסייעים עד (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 ו- VA RNA) כלולים בתוך פלסמיד אחד (pHelper), יש כמה יתרונות מעשיים על פני שיטת טרנספקטציה נפוצה של שלושה פלסמיד (משולש), כולל עלות מופחתת לייצור plasmid23,24 . גנום AAV plasmid המכיל את קלטת הביטוי transgene (pTransgene), חייב להיות מוקף על ידי ITRs, ואסור לחרוג ~ 4.7 kb אורך. טיטר וקטור וטוהר יכול להיות מושפע טרנסג'ן בשל השפעות ציטוטוקסיות פוטנציאליות במהלך transfection. הערכה של טוהר וקטור מתוארת כאן. וקטורים המיוצרים בשיטה זו, אשר מניבים 1 x 1013 vg / mL עבור כל אחד, הוערך בעכברים, אוגרים, מודלים בעלי חיים הביצית.

טבלה 1: הרכב הפתרונות הנדרשים. מידע הכרחי, כולל אחוזים ואמצעי אחסון, של רכיבים הדרושים לפתרונות שונים לאורך הפרוטוקול. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טרנספלציה כפולה של תאי HEK293 בערימות תאים

  1. להפשיר קריו-ביון של תאי HEK293 באמבט חרוזים להגדיר ב 37 °C (50 °F).
    הערה: DMEM מלא מראש עד 37 °C (7 °F) בעוד תאים מפשירים כדי להבטיח את הטמפרטורה הקרה לא לזעזע תאים בעת ציפוי. ודא שלתאים יש מספר מעבר נמוך, באופן אידיאלי פחות מ-20, כדי להבטיח צמיחה אופטימלית ויעילות טרנס-זיהום. ודא שהתאים מאושרים להיות ללא מיקופלסמה.
  2. העבר את התוכן של טיפת הקפאה-vial לתוך צינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של DMEM מלא מחומם מראש צנטריפוגה התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות.
  3. שאפו את המדיה, ולאחר מכן resuspened תאי HEK293 ב 20 מ"ל של DMEM מלא התחמם מראש. זרע את התאים בצלחת 15 ס"מ ודגורה ב 37 °C (5%, עם 5% CO2.
  4. לפצל את התאים מצלחת אחת 15 ס"מ לשלושה עבור זריעה בתא תרבית התא.
    1. לאחר התאים הם 80% מפגש, לשאוף את התקשורת בעדינות לשטוף את הצלחת עם 3 מ"ל של PBS לא לשבש את monolayer. לאחר מכן, לשאוף PBS ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין.
    2. דגירה במשך 2 דקות ב 37 °C עד התאים להרים מן הצלחת, ולאחר מכן לנטרל טריפסין על ידי הוספת 7 מ"ל של DMEM מלא לצלחת.
    3. לאסוף את כל המדיה והתאים לתוך צינור 15 מ"ל גלולה את התאים על ידי centrifuging ב 500 x g במשך 5 דקות.
    4. שאפו את supernatant מצינור 15 מ"ל ו resuspend גלולה התא ב 3 מ"ל של DMEM מלא. הוסף 1 מ"ל לכל צלחת 15 ס"מ המכילה 20 מ"ל של DMEM מלא; בעדינות לטלטל את הצלחות כדי להפיץ את התאים באופן שווה, ודגורה ב 37 °C (5%, עם 5% CO2.
  5. לאחר התאים הם 80% מפגש, לחזור על שלבים 1.4.1 ו 1.4.2. לאסוף את supernatant ב 50 mL צינורות חרוטיים, בעדינות הפוך את הצינור כדי להבטיח את התאים הומוגניים.
  6. לקבוע את צפיפות התא על ידי ערבוב 10 μL של דגימות של תאים עם 10 μL של כחול טריפן והוספת התערובת שקופית ספירת תאים לניתוח בדלפק התא.
  7. ערבבו 1 ליטר של DMEM מלא מחומם מראש עם השעיית התא הדרושה כדי לזרוע את תא תרבית התא (שטח פנים של 6360 ס"מ2) עם 1 x 104 תאים / ס"מ2. יוצקים את תערובת התאים לתא תרבית התאים ומסובבים בעדינות כדי לפזר באופן שווה את התאים על פני כל מונו-שכבתית(איור 1)ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2.
  8. בנוסף לתא תרבית התא, צלחת 15 ס"מ עם 1 x 104 תאים / ס"מ2 כהפניה למפגש.
  9. לאחר דגירה ~ 65 שעות, לבדוק את לוח ההתייחסות למפגש - אידיאלי ~ 80%-90% confluent.
    הערה: DMEM מלא מראש להוספת תא תרבית התא ב 37 °C (50 °F).

Figure 1
איור 1: תמרון של מחסנית תאים לזריעת תאים ולהצלה. עבור ערימת תאים זריעה, להתחיל על ידי הסרת אחד כובעי האוורור ושפוך 1 ליטר של DMEM מלא מחומם מראש עם הכמות הדרושה של תאי HEK293 (A). פזר באופן שווה תאים ומדיה על-ידי הידוק שני כובעי האוורור והבא את כל המדיה לפינה של מחסנית התאים עם אחד מכובעי האוורור והצבתו בפינה זו (B), מקם את מחסנית התאים בצד שלה (C) ולאחר מכן סובב את מחסנית התאים ב- 90° (D) כך שיציאות האוורור למעלה (E). הוריד בעדינות את מחסנית התאים למיקומה האופקי הרגיל והבטח שכל התאים של מחסנית התאים מכוסים לחלוטין במדיה (F). בעת ביצוע ההדבקה, פתחו את שני כובעי האוורור ושפכו לאט לאט את המדיה הישנה לתוך מיכל פסולת סטרילי לזרימה אפילו לא להפריע למונו-שכבתית של התאים (G). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הכן תערובת פוליאתילנית (PEI)/DNA ביחס ריכוז של 3:1 (w/w).
    1. הכן את תערובת ה- DNA בצינור חרוטי 50 מ"ל על ידי הוספת 475 מיקרוגרם של pTrangene ו 1425 מיקרוגרם של pHelper ל 40 מ"ל של מדיום בסרום מופחת כדי ליצור יחס 3:1 של pHelper:pTrangene.
      הערה: ניתן למצוא את מחשבון תערובת PEI / DNA באמצעות טבלה 2.
    2. הוסיפו 5.7 מ"ל של PEI (1 גרם/ליטר) למדיום בסרום מופחת ותערובת הדנ"א טיפה. לאחר מכן, מערבולת בקצרה ודגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: כאשר PEI / DNA מדגירה בטמפרטורת החדר, יהיה מעונן מעט.
  2. לאחר 8 דקות של דגירה PEI / DNA, להסיר את המדיה מתא תרבית התא.
    הערה: יש להקפיד לשחרר את שני כובעי הכתומים כדי לשמור על זרימה חלקה של מדיה כדי למנוע פירוק תאים.
  3. הוסיפו PEI/DNA ל-1 ליטר של DMEM שלם שהתחמם מראש, ושפכו לאט לאט את התערובת ליציאת התאים. פזורו את הנוזל באופן שווה לכל השורות(איור 1)ודגרו במשך 72 שעות ב-37 °C (5%), עם 5% CO2.

2 קציר AAV ותסיסה כימית של תאי HEK293 שהודבקו

  1. לנער את תא תרבית התא במרץ כדי לסלק את התאים עד התקשורת נראית מעוננת מתאים מנותקים לשפוך לתוך ארבעה צינורות צנטריפוגה 500 מ"ל.
  2. צנטריפוגות הצינורות ב 18,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי כדורי התאים. יוצקים את supernatant המובהק לתוך 1 L פוליאתילן טרפתלט copolyester (PETG) בקבוק.
    הערה: אם אין גישה לצנטריפוגה במהירות גבוהה, צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 40 דקות. התאים כדורית לא יכול להיות מוצק במהירות זו יהיה להחליק כמו לשפוך החוצה supernatant.
  3. resuspend כדורי התא ב 500 mL צינורות צנטריפוגה עם 50 מ"ל של חוצץ תמוגה ודגרה במשך 60 דקות ב 37 °C (57 °F).
  4. צנטריפוגות הצינורות ב 18,000 x g במשך 30 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant לאותו בקבוק PETG 1 L. השלך את פסולת התאים המנוצלים.
    הערה: לטהר את supernatant המובהק מיד ולאחסן ב 4 °C (72 °F) עד 72 שעות. לאחסון לטווח ארוך יותר, יש לאחסן ב- -80 °C (70 °F). אין לאחסן ב--20 מעלות צלזיוס.

3 AAV וקטור טיהור באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה הפרין

  1. הסר את ליסאט גולמי מ -80 °C (50 °F) ולהשאיר בשעה 4 °C (50 °F) לילה כדי להפשיר. לאחר הפשרה, השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את ה- lysate הגולמי.
  2. כדי להעביר את רכז הצנטריפוגלי, להוסיף 4 מ"ל של חיץ טרום טיפול מסנן לרכז צנטריפוגלי עבור כל עמוד ספרוז הפרין בשימוש. יש להעביר את הרכז הצנטריפוגלי בטמפרטורת החדר למשך 2-8 שעות. הגדר פסיבים מיד לפני שלב הטיהור.
  3. הגדירו את הצינורות ואת המשאבה(איור 2).
    1. מניחים את הצינורות במשאבה פריסטלטית ולהפעיל 20 מ"ל של 1 M NaOH. לאחר מכן, להפעיל 50 מ"ל של מים מולקולריים כיתה, ולאחר מכן להפעיל 50 מ"ל של DMEM בזאלי.
    2. צרף עמודת ספרון הפרין 5 מ"ל לצינורות והפעל 25 מ"ל של DMEM בזאלי כדי להסיר את החומר המשמר.
  4. הפעל 0.2 μM של ליסייט גולמי מסונן דרך העמודה בקצב זרימה של 1-2 טיפות/s.

Figure 2
איור 2: הגדירו משאבה פרייסטלית לטיהור AAV. הפעל את הצינורות מן lysate הגולמי, דרך המשאבה peristaltic, ולתוך עמוד מטריצת הפרין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: הקפד לא להציג בועות או לאפשר לעמודה להתייבש, שכן זה יסכן את העמודה וימנע את ההבעה של AAV. השלך את העמודה אם היא מתייבשת והשתמש בעמודה חדשה למשך שארית ה- lysate הגולמי.

  1. טען את כל lysate הגולמי על עמוד הפרין ולהשתמש בפתרונות הבאים כדי לשטוף את העמודה.
    1. לשטוף באמצעות 50 מ"ל של 1x האנק פתרונות מלח מאוזנים (HBSS) ללא Mg2 + ו Ca2 +.
    2. לשטוף באמצעות 15 מ"ל של 0.5 % N-Lauroylsarcosine ב HBSS ללא Mg2 + ו Ca2 +.
    3. לשטוף באמצעות 50 מ"ל של HBSS ללא Mg2 + ו Ca2 +.
    4. לשטוף באמצעות 50 מ"ל של HBSS עם Mg2+ ו Ca2 +
    5. לשטוף באמצעות 50 מ"ל של 200 mM NaCl / HBSS עם Mg2 + ו Ca2 +.
    6. אלוט 5 x 5 מ"ל (25 מ"ל סה"כ) עם 300 מ"מ של NaCl /HBSS עם Mg2+ ו- Ca2+ ולתייג את האלוטות כ- E1-E5 (כל אלוטציה היא של 5 מ"ל).
  2. ריכוז הנגיף באמצעות רכז צנטריפוגלי
    1. סובבו את הרכז הצנטריפוגלי המכיל את המאגר לפני הטיפול ב-900 x g למשך 2 דקות. זרוק את הזרימה דרך.
    2. לשטוף את מסנן רכז צנטריפוגלי עם 4 מ"ל של HBSS עם Mg2+ ו Ca2 + וצנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 2 דקות; זרוק את הזרימה דרך.
    3. מוסיפים את ה-E2 לרכז הצנטריפוגלי. ספין ב 1000 x g במשך 5 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.
    4. לסיים להוסיף E2 ולאחר מכן להוסיף E3 לרכז צנטריפוגלי להסתובב ב 1000 x g במשך 5 דקות עד הווירוס המרוכז הוא כ 1 מ"ל.
      הערה: הימנעו משימוש בווקטור כך שהנפח יהיה מתחת לרמת המסנן. אין לרכז את E1, E4 או E5 ברכז הצנטריפוגלי, שכן הם מכילים מעט מאוד עד ללא וקטור ומכילים מזהמים.
    5. הסר את הווירוס המרוכז מן רכז צנטריפוגלי באמצעות קצה מסונן p200 ומניחים אותו לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל.
    6. יש לשטוף את הרכז הצנטריפוגלי עם 200 מיקרו-אל של HBSS עם Mg2+ ו-Ca2+ כדי להעיף את כל ה-AAV הנותר מהמסנן. פיפטה למעלה ולמטה במרץ מספר פעמים (עבור ~ 30 s) כדי להעביר כל וירוס דבק בממברנה ולהניח את צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל עם שארית הנגיף. מערבבים היטב את הצינור.
    7. Aliquot 5 μL עבור עקירות DNA ולאחסן את הווקטור המטוהר ב -80 °C (50 °F).
  3. לשטוף את העמודה באמצעות 25 מ"ל של 2 M NaCl. יתר על כן, השתמש 25 מ"ל של 0.1% Triton X-100, מחומם מראש ל 37 °C (7 °F) לשטוף את העמודה. לאחר מכן, לשטוף את העמודה באמצעות 50 מ"ל של סטרילי dH2O, ולאחר מכן לשטוף באמצעות 25 מ"ל של 20% אתנול.
  4. ודא קרום העמודה רוויה לחלוטין 20% אתנול, כמו זה פתרון האחסון. חתום את העמודה עם תקעים שסופקו ולאחסן ב 4 °C (7 °F).
  5. אחסן את הצינורות ב 1 M NaOH.
    הערה: אם מנקים כראוי, עמודות ספרון הפרין ניתן להשתמש מחדש עד חמש פעמים.

4 מיצוי דנ"א גנומי AAV

  1. הכן את תערובת התגובה המוזכרת בטבלה 3 בצינור PCR לטיפול DNase.
רכיב נפח
וקטור AAV מטוהר 5 μL
מאגר DNase 10x 2 μL
DNase 1 μL
ddH2O 12 μL
אמצעי אחסון סופי 20 μL

טבלה 3: נוסחת תערובת מאסטר לטיפול DNase. רכיבים ונפחים מומלצים הנדרשים לטיפול DNase של וקטורים ויראליים AAV במהלך מיצוי DNA.

  1. מערבולת צינור PCR לערבב ולפעום את צינור PCR לסובב את התוכן.
  2. באמצעות תרמוציקלר, דגירה ב 37 °C (55 °F) במשך 20 דקות ואחריו 75 °C (75 °F) במשך 15 דקות כדי לחמם את DNase.
  3. יש להוסיף 5 מיקרו-אל של פרוטאינאז קיי.
  4. באמצעות תרמוציקלר, דגירה ב 50 °C (50 °F) במשך 60 דקות ולאחר מכן ב 95 °C (30 °F) במשך 30 דקות כדי לחמם את Proteinase K.
  5. השתמש בערכת ניקוי DNA כדי להסיר מזהמים פוטנציאליים.
    הערה: שלב זה בוצע באמצעות ערכת ניקוי דם ורקמות זמינה מסחרית(טבלת החומרים).
    1. הוסף 200 μL של חיץ AL (ערכת ניקוי דם ורקמות, טבלת חומרים) לצינור PCR המכיל את הווקטור המטופל DNase / Proteinase K.
    2. מערבולת צינור PCR ודגרה ב 56 °C (56 °F) במשך 10 דקות תרמוציקלר.
    3. Pipette את הנוזל מצינור PCR לתוך עמוד ספין סטרילי יושב בצינור אוסף.
    4. הוסף 200 μL של 100% אתנול לעמוד ולערבב ביסודיות על ידי מערבולת.
    5. צנטריפוגה ב 6,000 x g במשך 1 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.
    6. הוסף 500 μL של חוצץ AW1 (ערכת ניקוי דם ורקמות, טבלת חומרים) לעמודת הסיבוב.
    7. צנטריפוגה ב 6,000 x g במשך 1 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.
    8. הוסף 500 μL של חוצץ AW2 (ערכת ניקוי דם ורקמות, טבלת חומרים) לעמודת הסיבוב.
    9. צנטריפוגה ב 15,000 x g במשך 3 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.
    10. מניחים את עמוד הספין לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל ולהוסיף 200 μL של AE חיץ (ערכת ניקוי דם ורקמות, שולחן חומרים) ישירות לקרום עמוד ספין.
    11. דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
    12. צנטריפוגה ב 6,000 x gבמשך 1 דקות כדי לחמוק מהדנ"א.
    13. לאחסן את ה- DNA ב - -20 °C (50 °F).

5 טיטרציה של גנומים וקטוריים AAV באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית ווירוס Simian 40 (SV40) בדיקה

הערה: בצע את כל עבודת qPCR במכסה המנוע של PCR באמצעות טיפים מסוננים של פיפטה כדי למנוע זיהום DNA חיצוני. אם הגנום AAV אינו מקודד רצף פוליה SV40, השתמש בבדיקה נגד ITR המתואר במקום אחר25. ודא שהדנ"א הפלסמי שנבחר כסטנדרט מכיל רצף פוליה SV40.

  1. הכנת תקן מלאי
    1. לדלל את תקן ה- DNA plasmid המלאי (pTransgene plasmid המכיל רצף פוליה SV40) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / μL ולאחסן ב -20 °C ב 6 aliquots μL.
    2. קבע את מספר העותק הנמצא בתקן ה- DNA של פלסמיד באמצעות המחשבון המקוון הבא26.
      הערה: השתמש בדנ"א פלסמי המשמש לתקן המיוצר על ידי ספק מסחרי כדי להבטיח איכות וריכוז נכון. הכן כמות גדולה של תקן (למשל, 10 מ"ל) כדי לערוך מחקרי גישור בעת מעבר לתקן שהוכן לאחרונה.
  2. הכן את תערובת הריאגנט הבאה המוזכרת בטבלה 4 הן עבור הדגימות והן עבור התקן בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
    הערה: הכן עודף מספיק של תערובת מאסטר. ראה טבלה 5 עבור רצפי פריימר /בדיקה.
רכיב נפח
תערובת אב אוניברסלית של qPCR (פי 2) 10 μL
מים ברמה מולקולרית 4.5 μL
40x SV40 פוליה פריימר/בדיקה 0.5 μL
אמצעי אחסון סופי 15 μL

טבלה 4: תערובת תבנית בסיס של qPCR עבור טיטרציה של AAV. רכיבים ונפחים מומלצים הנדרשים ל- qPCR של DNA שחולצו מווקטורים ויראליים של AAV.

רכיב רצף
פריימר קדמי 5'-אגקטאגקטקאקאאטקאה-3'
פריימר הפוך 5'-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3'
בדיקה /56-FAM/AGCATTTTT/Zen/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC/3IABKFQ

טבלה 5: רצפי פריימר נגד רצף ה- DNA של הפוליה SV40. רצפים של פריימרים וגשוש המשמשים titration qPCR, אשר נקשרים לאזורים ספציפיים של וקטורים ויראליים AAV המכילים את רצף הפוליA SV40.

  1. פיפטה, התבנית הראשית, מערבבת מעלה ומטה כדי לערבב.
  2. תסדר את לוח הדילול.
    1. השתמש בצלחת ברורה של 96 באר כדי להכין דילול סטנדרטי ודגם, הוסף 45 μL של מים ברמה מולקולרית לכל באר בכל עמודה אחרת החל בעמודה 1 (עמודות 1, 3, 5, 7, 9 ו- 11).
    2. הוסף 5 μL של התקן כדי גם A1 ו pipette לערבב.
    3. השתמש בקצה פיפטה מסונן חדש כדי ליצור דילול של 1/10 מבאר A1 ל- B1.
    4. המשך סדרה של דילול פי 10 במורד העמודה עד להגעה ל- G1.
    5. אל תוסיף ל- H1, שכן פעולה זו תפעל כשליטה שלילית.
    6. החל את המדגם הראשון (S1) על ידי הוספתו ל- A3, ויוצר דילול 1/10. Pipette תערובת זו ולהעביר 5 μLto היטב B3. יש להשליך את טיפ הפיפטה לאחר העברה זו.
    7. עם טיפ פיפטה חדש, מערבבים את התמיסה היטב B3 ויוצרים דילול 1/100. מעבירים 5 μLof תערובת זו היטב C3 ולהשליך את הקצה לאחר ההעברה.
    8. עם טיפ פיפטה חדש, פיפטה למעלה ולמטה הפתרון היטב C3 כדי להפוך דילול 1/1000. זרוק את הקצה.
    9. המשך לדלל דוגמאות מבלי להוסיף דוגמאות לעמודות 2, 4, 6, 8, 10 או 12.
    10. לאחר כל הדגימות מדוללות, מערבבים את התוכן בבארות של עמודה 1 ולאחר מכן מעבירים 20 μL לעמודה 2.
    11. חזור על פעולה זו עבור עמודות 3, 5, 7, 9 ו- 11 כדי ליצור שכפולים של כל דילול סטנדרטי ודגם. עיין באיור 3 לפריסת לוחית רישוי.
      הערה: בעת הגדרת הלוח הבא באיור 3, דגימות מדוללות בשורות G ו- H יהיו רק 1/10 ו- 1/100 דילול.

Figure 3
איור 3: פריסת לוחית עבור titration AAV qPCR. כחול מציין את מיקום הדילול הטורי של התקן; ירוק מציין את המיקום של הפקד השלילי; סגול מציין את המיקום של דילול הדגימות. כל דוגמה סטנדרטית, שלילית או מדגם מתווספת לשכפול. דוגמה לריכוז התקן נוספה כדי להציג את סדרת הדילול של התקן, ומיקום דילול מדגם נוספו לבארות שלהם בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. טיטרציה על ידי SV40 פוליה מבוסס זיהוי qPCR
    1. הוסף 15 μL של תערובת מאסטר qPCR לכל באר של צלחת qPCR 96-חצאית לבן.
    2. העבר 5 μL של כל מדגם מן צלחת ברור 96-well לצלחת 96 חצא לבן חצאי היטב qPCR.
    3. השתמש בצינור רב-ערוצי כדי להבטיח ערבוב הולם של התערובת והדגימה הראשית של qPCR.
    4. לאטום את הצלחת עם סרט איטום צנטריפוגה צלחת qPCR ב 1500 x g עבור 30 s.
    5. הפעל את תגובת qPCR במכשיר הגברה וזיהוי PCR מבוסס לוחית בזמן אמת, תוך שימוש בתנאים המוצעים בטבלה 6.
במקטע מחזורים זמן טמפרטורה תיאור
לפני הדגירה 1x 5 דקות 95 °C (75 °F) דנ"א.
הגברה 38x 15 s 95 °C (75 °F) הגברה של דנ"א. ניתן לשנות את ההגדרות אם משתמשים בפריימרים חלופיים עם טמפרטורות חישול שונות.
שנות ה-60 60 °C (70 °F)
קירור 1x שנות ה-60 40 °C (70 °F) צלחת קירור. סוף הריצה.

טבלה 6: פרוטוקול תרמוציקלר עבור titration qPCR מבוסס בדיקה הידרוליזה. פרוטוקול תרמוציקלר מומלץ לשימוש titration qPCR מבוסס בדיקה של DNA שחולצו וקטורים AAV מטוהרים.

הערה: עבור גליון עבודה של titration AAV של qPCR ראה טבלה 7.

  1. ניתוח נתונים כדי לקבוע מספרי העתקת גנום AAV.
    1. מלא את תאי הנתונים של הגיליון האלקטרוני (טבלה 7A) בערכי הריכוז המתקבלים מהפעלת qPCR הן עבור דילול רגיל והן עבור דילול מדגם.
    2. השתמש בערכי ריכוז מטבלה 7A כדי ליצור עקומה סטנדרטית (טבלה 7B).
      הערה: העקומה הסטנדרטית תוצג כלוגריתם טבעי (y = ln(x) + b) יחד עם יעילות R2. לעקומה סטנדרטית חייבת להיות יעילות הקרובה ל- 100 % ו- R2 קרוב ל- 1.0 (≥0.99).
    3. מלא את יעילות השיפוע על ידי מילוי מחשבון מקוון זה27.
      הערה: יעילות בין 90%-110% מקובלת. אם היעילות של qPCR נמצאת מחוץ לטווח זה, הפעל מחדש את ה- qPCR.
    4. השתמש בערכי ריכוז מטבלה 7A כדי לממוצע את הדילול של כל מדגם ולקבוע את סטיית התקן של כל מדגם (טבלה 7C).
      הערה: אל תכלול דילול מדגימות הנמצאות במרחק של יותר מסטיית תקן אחת מהממוצע של דילול המדגם.
    5. באמצעות הריכוז הממוצע של כל דילול, להכפיל על ידי גורם דילול, ולאחר מכן לחלק בחמש כדי לקבל את הגנומים וקטור (vg)/μL של כל מדגם (טבלה 7C).
    6. חשב את vg/mL של כל מדגם על ידי הכפלת הממוצע של ריכוזי כל מדגם ב-80,000 (טבלה 7C).
    7. ממוצע vg / mL של כל דילול כדי לייצר את vg הסופי / mL של כל מדגם (טבלה 7C).
      הערה: המשתמש חייב לחלק את הריכוז הממוצע של כל דילול על ידי גורם חמש כדי להסביר את 5 μL טעון לתוך כל באר עבור ריצת qPCR כדי לייצר את הריכוז vg / μL. הגורם של 80,000 חשבונות עבור המעבר מערך הריכוז הממוצע של כל דגימות ל- vg / mL. ראשית, יש להכפיל את ממוצע ערך הריכוז של כל דגימה ב- 2 כדי להסביר את הגנום החד-גדילי, שכן ערכת בדיקת הפריימר מכמתת רק את ה- DNA החיובי-חושי, החד-גדילי (ssDNA), וגנום AAV קיים ביחס משוער של 1:1 בין ssDNA חיובי לתחושה שלילית25,28. יש להכפיל את ממוצע ערך הריכוז של כל דגימה x40 כדי להסביר את דילול הדגימה מ- 5 μL של וקטור מטוהר (סעיף 4.1) ל- 200 μL של DNA שחולץ (סעיף 4.6.12). לבסוף, הממוצע של ערך הריכוז של כל מדגם חייב להיות מוכפל x1000 כדי להמיר מ vg / μL ל vg / mL.

6 הערכה של איכות וקטור וטוהר

  1. בקרת איכות - כתם מערבי
    1. הכן ג'ל SDS PAGE 12%.
    2. בצע אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide.
      הערה: לטעון 6 x 1010 vg של דגימות לבאר.
    3. העבר את החלבונים לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF).
    4. חסימת קרום PVDF
      1. הסר את הממברנה ממנגנון ההעברה ולשטוף 0.1% PBST כדי להסיר אקרילאמיד רופף.
      2. מניחים את הממברנה בחסימת פתרון לפחות 1 שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (70 °F).
        הערה: ניתן להשלים עוד יותר את חסימת המאגר עם סרום עזים של 2%.
    5. דגירה עם נוגדן ראשוני
      1. פירוק מאגר החסימה והוסף את הנוגדן העיקרי, נוגדן חד שבטי נגד עכבר AAV בדילול של 1:200.
      2. דגירה לילה ב 4 °C (5 °F).
      3. יש לנקות את הנוגדן העיקרי ולשטוף חמש פעמים עם 0.1% PBST למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה.
    6. דגירה עם נוגדן משני
      1. נקו את תמסת הכביסה והוסיפו נוגדן משני מצומד של HRP, מדולל ב-1:7500 בחסימת חוצץ, ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתסיסה.
      2. הדק את הנוגדן המשני לשטוף חמש פעמים עם 0.1% PBST במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות.
      3. בצע שטיפה סופית עם PBS בטמפרטורת החדר עם עצבנות.
    7. לזהות את החלבונים באמצעות מצע כימותרפיה משופרת (ECL).
    8. דמיינו את הג'ל כדי לדמיין את החלבונים הנגיפיים (VP1, VP2 ו-VP3) (איור 4).

Figure 4
איור 4: כתם מערבי המציג חלבונים קבסיד AAV. נתיב א'; סולם MW, ליין B; AAV6.2FF-hIgG01, ליין C; AAV6.2FF-hIgG02, ליין D; AAV6.2FF-hIgG03, וליין E; AAV6.2FF-hIgG04. 6 x 1010 vg של כל AAV6.2FF-hIgG הועמסו לנתיבים שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בקרת טוהר - דף SDS וכתם קומאסי
    1. הכן ג'ל SDS-PAGE ודוגמאות כמתואר מהשלב 6.1.1 ו- 6.1.2.
    2. תקן את הג'ל בתיקון פתרון במשך שעה אחת או לילה עם עצבנות עדינה. שנה את פתרון התיקון פעם אחת במהלך השעה הראשונה.
    3. מכתימים את הג'ל בתמיסת כתמים למשך 2-4 שעות בתסיסה עדינה.
    4. תמנע את הג'ל עם פתרון תיעה. לחדש את הפתרון destaining מספר פעמים עד הרקע של הג'ל הוא destained לחלוטין (4-24 שעות).
    5. אחסן את הג'ל המוכתם בפתרון אחסון.
    6. דמיינו את הג'ל כדי לדמיין את כל החלבונים המוכתמים בתמיסת כתמי קומאסי.

Figure 5
איור 5: ג'ל מוכתם בקומה. נתיב א'; סולם MW, ליין B; AAV6.2FF-hIgG01, ליין C; AAV6.2FF-hIgG02, ליין D; AAV6.2FF-hIgG03, ליין E; AAV6.2FF-hIgG04, ליין F; AAV6.2FF-hIgG05, וליין G; AAV6.2FF-hIgG06. 6 x 1010 vg של כל AAV6.2FF-hIgG הועמסו לנתיבים שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בקרת טוהר חלופית - זיהוי חלבון תאי מארח HEK293 ELISA
    1. בצע את זיהוי חלבון התא המארח HEK293 באמצעות ELISA בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: השתמש בדילול של 5 x 10-2 ו- 1 x 10-3 עבור דגימות rAAV מטוהרות. לאחר TMB מתווסף לבאר, דגירה הרחק מהאור. אין אפשרות להשתמש ברגרסיה ליניארית כדי לנתח את התוצאות.
    2. בצע ניתוח מנקודה לנקודה, spline מעוקב, או שיטת התאמה לוגיסטית ארבעה פרמטרים כדי interpolate ריכוזים של לא ידועים ולהכפיל על ידי גורם הדילול כדי לקבוע את ריכוז המדגם המקורי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרגום ממודלים מכרסמים קטנים למודלים בעלי חיים גדולים יותר ובסופו של דבר יישום קליני מהווה אתגר משמעותי בשל הכמות הגדולה של AAV הנדרשת כדי transduce בעלי חיים גדולים יותר ולהשיג השפעות טיפוליות. כדי להשוות את יעילות התמסורת של AAV6.2FF capsid שתוכנן באופן רציונלי, הפגין בעבר עלייה של פי 101 ביעילות התמרה בתאי שריר מורין בהשוואה ל- AAV63, עכברים, אוגרים וכבשים נוהלו כולם AAV6.2FF המבטאים נוגדן מונקלונלי אנושי (hIgG). וקטור ההבעה AAV6.2FF-hIgG הכיל מקדם CASI4, וירוס הפטיטיס וודצ'וק לאחר תמלול אלמנט רגולטורי (WPRE), ורצף פוליה SV40. עכברים בני שישה שבועות BALB/c (n = 4) היו תוך שרירית (IM) מנוהל 1 x 1011 vg של AAV6.2FF-hIgG ב 40 μL, ודם נאסף בימים 0, 7, 14, 21, ו 28 לאחר ניהול AAV לניטור hIgG. אוגרים סורים בני ארבעה שבועות (שתי נקבות ושני זכרים) קיבלו הודעות מיידיות של 1 x 1012 vg של AAV6.2FF-hIgG ב-40 μL, ודם נאסף שבועי כדי לפקח על ביטוי hIgG. לבסוף, כבשי דורסט זכרים בני 10 ימים (n = 3) היו IM מנוהלים 1 x1013 vg / קילוגרם של AAV6.2FF-hIgG בשתיים עד שלוש זריקות 1 מ"ל בעכוז. איסוף הדם השבועי הושלם על ידי דימומים ורידים ו hIgG היה במעקב שבועי במשך 28 ימים. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת גאלף.

עכברים IM מנוהל 5 x 1012 vg /kg של AAV6.2FF-hIgG מבוטא בין 171-237 מיקרוגרם /mL של hIgG בסרום ביום 28 לאחר הממשל(איור 6). אוגרים IM מנוהל 2 x 1013 vg / קילוגרם של AAV6.2FF-hIgG הביע רמות גבוהות בהרבה מאשר העכברים, עם רמות hIgG בסרום של 495-650 מיקרוגרם / מ"ל ביום 28 לאחר הממשל. לבסוף, כבשים IM מנוהל 1 x 1013 vg / קילוגרם הביע רמות hIgG בסרום של 21-46 מיקרוגרם / מ"ל ביום 28 לאחר הממשל. בכל המודלים של בעלי החיים, הווקטור לא נראה לעכב מדדים בריאותיים כלשהם, כגון משקל, להוכיח את הבטיחות והאיכות של הווקטורים המיוצרים. ידוע כי ביטוי נוגדן חד שבטי בתיווך AAV (mAb) משתנה במידה ניכרת בהתאם למין ול- mAb. למיטב ידיעת המחברים, אין דיווחים על ביטוי AAV-mAb במין הביצית ולכן, אין אמת מידה לרמות הביטוי הצפויות. ראוי לציין כי הכבשים במחקר זה הוכפלו במשקל במהלך 28 הימים שלאחר ההזרקה וכי בעלי החיים באיור 6 הועברו כולם עם AAV-mAbs שונים ולכן לא ניתן להשוות.

Figure 6
איור 6: משלוח תוך שרירי של AAV6.2FF-hIgG מוביל לביטוי hIgG בסרום מתמשך בעכברים, אוגרים וכבשים. עכברי BALB/c נקבות (n = 4) היו IM מנוהלים 5 x 1012 vg / קילוגרם של AAV6.2FF-hIgG, אוגרים סוריים (2 זכר, 2 נקבה), היו IM מנוהלים 1 x 1013 vg / קילוגרם של AAV6.2FF-hIgG, ו כבשי דורסט זכר בן 10 ימים (n = 3) היו IM מנוהלים 1 x 1013 vg / קילוגרם. סרום היה במעקב עבור ביטוי hIgG על פני תקופה של 28 ימים. הנתונים מיוצגים כסטיית התקן הממוצעת ±. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טרנספקטציה של תא תרבות התא
פרוטוקול
1. אפשר לדנ"א, OptiMEM ו- PEI להתחמם לטמפרטורת החדר לפני ההדבקה
2. הזן את מספר ערימות התאים שיש לבצע (אין צורך בגז- עודף)
3. ודא שריכוזי הדנ"א נכונים מכיוון שהדבר ישנה את הנפחים הנדרשים
מספר תאי תרביות התאים 1
ריכוז טרנסג'ן פלסמיד 1 מ"ג/מ"ל
ריכוז pDGM6.2FF פלסמיד 1 מ"ג/מ"ל
סכום לתאי תרבית תאים טרנספקטו מאסדמיקס
OptiMEM 48.1 מ"ל 48.1 מ"ל
1:3 ratio pTransgene:pHelper pTransgene 475 מיקרוגרם 475 μL
pHelper 1425 מיקרוגרם 1425 μL
4. הוסף נפחים נדרשים של OptiMEM ו- DNA פלסמיד לצינור חרוט 50 מ"ל
5. הפוך 10 פעמים לערבב
יחס 3:1 PEI:DNA PEI Max 5.7 מ"ל 5.7 מ"ל
6. הוסף את הכמות הנדרשת של PEI לצינור 50 מ"ל המכיל את OptiMEM ו- DNA פלסמיד
7. סגורים את צינור 50 מ"ל ומערבולת והפוך 3-5 פעמים לערבב.
8. הגדר שעון זמן במשך 10 דקות עבור מתחמי PEI לדגור
9. העבר ערימות תאים שיועברו ל- BSC
10. לאחר 10 דקות, יוצקים את תערובת הטרסנדיון ליציאה כתומה אחת.
11. מערבבים בעדינות נוזלים בכל ערימת התאים
12. החזר את ערימת התאים שהודבקו לאינקובטור והבטיח נפח שווה בכל שכבה
13. קציר תא תרבית 72 שעות מאוחר יותר

טבלה 2: מחשבון טרנספקטיון לתא תרבית התא. גליון עבודה אינטראקטיבי כדי לקבוע ריכוז נכון של pTransgene, pHelper ו- PEI עבור transfection של תא תרבית התא.

טבלה 7: מחשבון טיטריון AAV. גליון עבודה אינטראקטיבי כדי לקבוע את הריכוז הסופי של דגימות AAV מ- qPCR, המבוטא כ- vg/ mL. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הייצור של וקטורים AAV רקומביננטיים (rAAV) המתוארים במאמר זה משתמש בחומרים נפוצים, ריאגנטים, וציוד שנמצא ברוב המעבדות והמתקנים למחקר ביולוגיה מולקולרית. מאמר זה מאפשר ייצור באיכות גבוהה במבחנה וב-in vivo כיתה rAAV על ידי הקורא. מעל לכל, פרוטוקול זה לייצור rAAV, בהשוואה לפרוטוקולים מייגעים יותר הכוללים טיהור צסיום כלוריד, יעיל ונמנע משימוש בצנטריפוגה אולטרה-מרכזית. לאחר שתאי HEK293 הועברו, AAV מטוהר מוכן לשימוש תוך 5 ימי עבודה.

במהלך תהליך הייצור והטיהור של rAAV, צעדים רבים יכולים להשפיע על הטוהר והטייטר הסופי של הווקטור. השלב הראשון והביקורתי ביותר הוא הבריאות של תאי HEK293, אשר יש השפעה ישירה על טיטר וקטור. השימוש בתאי HEK293 בניגוד לסוגי תאים או מערכות אחרים, כגון תאי HEK293T, הוא יתרון בכך שלתאי HEK293 יש יכולת גדולה יותר לדבוק בציפוי הפלסטיק של לוחות ותאים היוצרים רשתות תאים חזקות לצמיחת תאים מתמדת. מומלץ לעקוב אחר תאים לזיהום mycoplasma ולהימנע העברת תאי HEK293 בעבר ~ 40 מעברים או פעם זמן ההכפלה שלהם נראה האטה כמו זה יוביל תשואות AAV נמוכות יותר. יתר על כן, אישור תאים הם כ 80% מפגש לפני transfection מבטיח כי התאים אינם דלילים מדי או מגודלים. לגבי רכיבי transfection, השימוש ב- DNA פלסמיד באיכות גבוהה (למשל, DNA פלסמיד מוכן מסחרית) מומלץ מאוד להבטיח שה- DNA יישאר בתמיסה ואינטראקציה נכונה עם רכיבי אספקת transfection כימיים, כגון PEI. לבסוף, ריאגנט transfection יש השפעה משמעותית על תשואות rAAV. כאן, PEI משמש כסוכן transfection. PEI הוא פולימר קטיקטי יציב המספק DNA אקסוגני לגרעין התאים באמצעות ייצור של מתחמי פלסמיד-פולימר, אשר נלקחים לאחר מכן על ידי תאים ונסחרים לגרעין באמצעות תהליכים של תאים מארחים29. טרנספקטים מבוססי PEI מהירים וקלים בהשוואה לשיטות אחרות של אספקת DNA, כולל סידן פוספט או ליפופקטמין. עם זאת, היחס של PEI:DNA חייב להיות ממוטב.

השימוש בערימות תאים בניגוד ללוחות חסידים מסורתיים מספק שיטה נוחה ועקבית יותר לייצור rAAV. ערימות תאים כרוכות במניפולציה טכנית פחות במהלך טרנס-זיהום, מקלות על הניתוק האפשרי של תאים מהמונו-שכבתית החסידה, ומאפשרות רשתות תאים חזקות יותר וייצור טוב יותר של rAAV. לאחר ההדבקה, האוסף של supernatant ותסיסה של תאים הוא יעיל ועקבי. כדי לקצור rAAV מתאים, שיטות תמותה של תאים פיזיים כגון הפשרת קיפאון אינן יעילות ולא עקביות מכיוון שאין דרך להבטיח שכל התאים יתמכרו. כאן מתואר הליך תמה כימית. השימוש במאגר תמה כימי מבטיח כי כל התאים נחשפים לסוכן תמיס בריכוז מסוים, כמו גם תוספים כגון מעכב פרוטאז כדי למנוע השפלה capsid. שיטה זו מתירה באופן עקבי יותר תאים המאפשרים קציר יעיל יותר של rAAV. יתר על כן, גלולה והסרה של פסולת הסלולר מבטל מזהמים אפשריים מן lysate הגולמי, אשר יכול להגדיל את הזמן ואת העלות של סינון ליסאט לפני הטיהור.

למרות rAAV עשוי להיות נוכח בכמויות גבוהות lysate גס, הפעולה של לכידה וניקוי rAAV יכול להיות שונה בין שיטות טיהור שונות, כגון שיפועים צסיום כלוריד. כאן, השימוש של טיהור כרומטוגרפיה זיקה ספרין sepharose מספק שיטה מהירה וקלה לטיהור וקטורי המביא וירוס ultrapure ואינו דורש אולטרה צנטריפוגה הדרגתית. עם זאת, לא כל serotypes AAV מכילים תחומים מחייב הפרין, כך עבור אלה סרוטיפים שיטת טיהור זו לא תהיה מתאימה. לדוגמה, בעוד AAV2 ו AAV6 לקשור הפרין גופרתי, AAV4 ו AAV5 לא30. למרות שיטה זו אינה אוניברסלית, היא יעילה וקלה עבור אותם capsids כי לאגד הפרין גופרתי. שלא כמו שיפועים אולטרה-צנטריפוגה כגון יודיקסנול, כל חלקיקי rAAV קשורים לממברנה של העמודה עד שהם נמוגים באמצעות שטיפות ריכוז מלח גבוהות, הימנעות מבעיות כגון ערבוב של שיפועים ומיומנות הדרושים כדי לשחזר שברים מן השיפוע. אלוטציה באמצעות שטיפת מלח גבוהה מאפשרת בחינה מבוקרת ומדויקת של הנגיף לשברים שניתן להתרכז בהם עוד יותר. רק ריכוז שברים מסוימים של הנגיף eluted מסיר עוד יותר מזהמים פוטנציאליים תוך החלמה >97% של הנגיף eluted. מגבלה אחת של טיהור כרומטוגרפיה של זיקת הפרין ספרוז היא שהיא אינה מבחינה בין חלקיקים ריקים ומלאים. שלבי ultracentrifugation אנליטיים נוספים יצטרכו להיות משולבים על מנת להסיר capsids ריק31.

qPCR היא שיטה חסכונית ומהירה לקביעת מספר הגנומים הווקטוריים בהכנה וקטורית AAV. למרות ש- qPCR היא שיטת כימות רגישה, היא אינה מספקת מידע על מספר החלקיקים הזיהומיים בהכנה. יתר על כן, הרגישות של בדיקה זו יכולה לגרום שונות כמו שגיאות טכניות במהלך pipetting יכול להוביל השתנות בין אסאי. לכן, עבור כל ניסוי הכולל השוואת וקטורים שונים של AAV, זה קריטי כי הווקטורים להיות titered על אותו צלחת qPCR. למרות מגבלות אלה, qPCR היא השיטה המדויקת ביותר שפותחה עבור titering AAV והיא כיום השיטה הנפוצה והמקובלת ביותר לכימות של וקטורים AAV32. השימוש בפריימר/בדיקה שנקשר ל- SV40 polyA של גנום rAAV מבוסס על העובדה שרצף זה נשמר על פני פלסמידים רבים של גנום AAV שהונדסו במעבדה. מעבר לבחירת רצף שמור בין פלסמידים של הגנום rAAV של הקורא, ניתן לתכנן בדיקות qPCR עבור כל חלקי הגנום rAAV, כולל, אך לא רק, מקדמים, טרנסג'נים או גורמים לאחר תמלול.

הערכת הטוהר והאיכות של מוצר AAV היא צעד חשוב בתהליך הייצור. ניתן להשתמש בכתמים מערביים כדי לזהות את ה-VP1, VP2 ו-VP3 חלבונים מבניים המרכיבים את ה-CAPSID של AAV, כמו גם כל צורה שונה של VP. VP1, VP2 ו-VP3 נוכחים בדרך כלל ביחס של 1:1:10, אך זה יכול להשתנות בין 1:1:5 ל-1:1:20 בהתאם לסרוטיפ. לכן, זה קריטי כדי לקבוע את היחס עבור כל מערכת אמפירית, במיוחד משום אזור N-מסוף של VP1 הוכח להיות חשוב עבור זיהום transduction33. SDS-PAGE בשילוב עם כתמי קומאסי היא שיטה פשוטה למדי לאיתור VP1, VP2 ו- VP3, כמו גם מזהמי חלבון תא מארח. השימוש בכתמי חלבון פלואורסצנטיים כגון SYPRO Ruby מציעים זיהוי רגישות גבוהה יותר של מזהמי חלבון התא המארח מאשר קומאסי; עם זאת, לא לכל המעבדות יש גישה לציוד ההדמיה הנדרש כדי לדמיין את הג'ל. לבסוף, ELISAs מסחרי יכול לשמש כדי לכמת מזהמי חלבון התא המארח בווקטורים AAV המיוצר בתאי HEK293.

פרוטוקול זה מספק סקירה מעמיקה של ייצור rAAV טוהר גבוה וטוהר גבוה עבור סרוטיפים שנקשרים להפרין. בסעיף התוצאות הייצוגיות, השימוש ברומן AAV6.2FF המבטא hIgG במגוון דגמים של בעלי חיים מראה את הבטיחות והיעילות של rAAV זה ב vivo. למרות וקטור AAV6.2FF היה מנוהל IM, אלה באיכות גבוהה, וירוסים טוהר גבוה יכול להינתן באמצעות מגוון רחב של מסלולים שונים vivo, כמו מזהמים דלקתיים אפשריים, כגון חלבון התא המארח, בוטלו באמצעות תהליכי הטיהור שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שרה ק. ווטון היא ממציאה על פטנט אמריקאי US10806802B2 עבור AAV6.2FF capsid.

Acknowledgments

אמירה ד. ראג'י, ברנה א. י. סטיבנס, סילביה פ. תומאס וג'ייקוב ג'י אי ייטס היו מקבלים מלגות סטודנטים לסטודנטים וטרינריים באונטריו וכן מלגות בוגרים של אונטריו. אמירה ד. ראג'י קיבלה תואר שני בסטודנטית מואצת. עבודה זו מומנה על ידי מענק הפרויקט של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) (#66009) ומענק לחקר הבריאות השיתופי (NSERC שותף) (#433339) ל- SKW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore Sigma S2GPU05RE
0.25% Trypsin Fisher Scientific SM2001C
1-Butanol Thermo Fisher Scientific A399-4 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
10 chamber cellstack Corning 3271
1L PETG bottle Thermo Fisher Scientific 2019-1000
30% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad 1610158
96-well skirted plate FroggaBio FS-96
Adhesive plate seals Thermo Fisher Scientific 08-408-240
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Blood and Tissue Clean up Kit Qiagen 69506 Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol
Bromophenol blue Fisher Scientific B392-5 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Cell Culture Dishes Greiner bio-one 7000232 15 cm plates
Culture Conical Tube Thermo Fisher Scientific 339650 15 mL conical tube
Culture Conical Tube Fisher Scientific 14955240 50 mL conical tube
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine Cytiva Life Sciences SH30022.01
ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific 32209
Ethanol Greenfield P016EA95 Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30396.03
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-500 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glycine Fisher Scientific BP381-500
HBSS with Mg2+ and Ca2+ Thermo Fisher Scientific SH302268.02
HBSS without Mg2+ and Ca2+ Thermo Fisher Scientific SH30588.02
HEK293 cells American Tissue Culture Collection CRL-1573 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots
HEK293 host cell protein ELISA kit Cygnus Technologies F650S Follow manufacturer’s instructions
Heparin sulfate column Cytiva Life Sciences 17040703
Kimwipe Thermo Fisher Scientific KC34120
 L-glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific SH30034.02
Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion Corning CLS431124 Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions
Large Volume Centrifuge Tubes Corning CLS431123-6EA 500 mL centrifuge tubes
MgCl2  Thermo Fisher Scientific 7791-18-6
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use
Molecular Grade Water Cytiva Life Sciences SH30538.03
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma Aldrich L5125 CAUTION. Wear gloves
NaCl Thermo Fisher Scientific BP35810
Optimem, reduced serum medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D Sterilize prior to use
PBS (10x) Thermo Fisher Scientific 70011044 Dilute to 1x for use on cells
Penicillin-Streptomycin Solution Cytiva Life Sciences SV30010
pHelper plasmid De novo design or obtained from plasmid repository NA
Pipet basin Thermo Fisher Scientific 13-681-502 Purchase sterile pipet basins
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) Thermo Fisher Scientific 9002-93-1 CAUTION. Wear gloves
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 24765-1 Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C
Polypropylene semi-skirted PCR Plate FroggaBio WS-96
Polysorbate 20 (Tween 20) Thermo Fisher Scientific BP337-100 CAUTION. Wear gloves
polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Cytiva Life Sciences 10600023 Use forceps to manipulate. Wear gloves.
Primary antibody Progen 65158
Protein Ladder FroggaBio PM008-0500
Proteinase K Thermo Fisher Scientific AM2546
pTrangene plasmid De novo design or obtained from plasmid repository NA Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0
Pump tubing Cole-Parmer RK-96440-14 Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5
RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer Promega M6101 Use at 10x concentration in protocol from section 4.0
RQ1 Rnase-free Dnase Promega M6101
Sample dilutent Cygnus Technologies I700 Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit
Secondary antibody, HRP Thermo Fisher Scientific G-21040
Skim milk powder Oxoid LP0033B
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific 28312 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Sodium hydroxide (NaOH) Thermo Fisher Scientific SS266-4
SV40 polyA primer probe IDT Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Thermo Fisher Scientific 15524010 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypan blue Bio-Rad 1450021
Ultra-Filter Millipore Sigma UFC810024 Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff
Universal Nuclease for cell lysis Thermo Fisher Scientific 88702
Universal qPCR master mix NEB M3003L
Whatman Paper Millipore Sigma WHA1001325
β-mercaptoethanol Fisher Scientific 21985023 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  2. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  3. Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
  6. FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
  7. FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
  8. Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
  9. Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
  10. Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
  11. Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
  12. Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
  13. Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
  14. Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
  17. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  18. Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
  19. Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
  20. van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
  21. Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
  22. Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
  23. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  24. Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
  25. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  26. dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
  27. qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
  28. Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
  29. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  30. Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
  31. Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
  32. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
  33. Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 172 וקטורים הקשורים לאדנו טיפול גנטי ערימות תאים טיהור זיקה מחקרים פרה-קליניים מודלים בעלי חיים גדולים ביטוי טרנסג'ן AAV6 AAV6.2FF
ייצור וקטורים הקשורים אדנו וירוס בערימות תאים למחקרים פרה קליניים במודלים בעלי חיים גדולים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rghei, A. D., Stevens, B. A. Y.,… More

Rghei, A. D., Stevens, B. A. Y., Thomas, S. P., Yates, J. G. E., McLeod, B. M., Karimi, K., Susta, L., Bridle, B. W., Wootton, S. K. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (172), e62727, doi:10.3791/62727 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter