Summary
Her gir vi en detaljert prosedyre for storskala produksjon av AAV-vektorer av forskningskvalitet ved hjelp av tilhenger HEK 293 celler dyrket i cellebunker og affinitet kromatografirensing. Denne protokollen gir konsekvent >1 x 1013 vektorgenomer / ml, og gir vektormengder som passer for store dyrestudier.
Abstract
Adeno-assosierte virusvektorer (AAV) er blant de mest klinisk avanserte genterapivektorene, med tre AAV-genterapier godkjent for mennesker. Klinisk utvikling av nye applikasjoner for AAV innebærer overgang fra små dyremodeller, for eksempel mus, til større dyremodeller, inkludert hunder, sauer og ikke-menneskelige primater. En av begrensningene ved å administrere AAV til større dyr er kravet til store mengder høytitreringsvirus. Mens suspensjon cellekultur er en skalerbar metode for AAV vektor produksjon, få forskningslaboratorier har utstyret (f.eks, bioreaktorer) eller vet hvordan å produsere AAV på denne måten. Videre er AAV-titere ofte betydelig lavere når de produseres i suspensjon HEK 293 celler sammenlignet med tilhenger HEK293 celler. Beskrevet her er en metode for å produsere store mengder høytitrere AAV ved hjelp av cellebunker. En detaljert protokoll for titering av AAV samt metoder for validering av vektorrenhet er også beskrevet. Til slutt presenteres representative resultater av AAV-mediert transgene uttrykk i en sauemodell. Denne optimaliserte protokollen for storskala produksjon av AAV-vektorer i adherentceller vil gjøre det mulig for molekylærbiologiske laboratorier å fremme testingen av sine nye AAV-terapier i større dyremodeller.
Introduction
Genterapi ved hjelp av adeno-assosierte virusvektorer (AAV) har gjort store fremskritt de siste tre tiårene1,2. Demonstrerte forbedringer i et mangfoldig spekter av genetiske sykdommer, inkludert medfødt blindhet, hemofili og sykdommer i muskel- og sentralnervesystemet, har brakt AAV genterapi i forkant av klinisk forskning3,4. I 2012 godkjente Det europeiske legemiddelkontoret (EMA) Glybera, en AAV1-vektor som uttrykker lipoprotein lipase (LPL) for behandling av LPL-mangel, noe som gjør det til den første markedsføringstillatelsen for en genterapibehandling i enten Europa eller USA5. Siden da har ytterligere to AAV-genterapier, Luxturna6 og Zolgensma7, fått FDA-godkjenning, og markedet forventes å ekspandere raskt i løpet av de neste 5 årene med så mange som 10-20 genterapier forventet innen 20258. Tilgjengelige kliniske data indikerer at AAV genterapi er en trygg, godt tolerert og effektiv modalitet, noe som gjør den til en av de mest lovende virale vektorer, med over 244 kliniske studier som involverer AAV registrert hos ClinicalTrials.gov. Den økende interessen for kliniske applikasjoner som involverer AAV-vektorer krever robuste og skalerbare produksjonsmetoder for å lette evalueringen av AAV-terapier i store dyremodeller, da dette er et kritisk skritt i den translasjonelle rørledningen9.
For AAV vektorproduksjon er de to hovedkravene AAV genomet og capsid. Genomet av wild-type (wt)-AAV er enkeltstrenget DNA som er omtrent 4,7 kb i lengde10. Wt-AAV-genomet består av inverterte terminale repetisjoner (ITRs) som finnes i begge ender av genomet, som er viktige for emballasje, og rep- og cap-genene 11. Rep- og capgenene, som er nødvendige for genomreplikasjon, montering av viral capsid og innkapsling av genomet i viral capsid, fjernes fra viralgenomet og leveres i trans for AAV vektorproduksjon12. Fjerning av disse genene fra viralgenom gir rom for terapeutiske transgenes og alle nødvendige regulatoriske elementer, inkludert promotor og polyA-signal. ITR-ene forblir i vektorgenomet for å sikre riktig genomreplikasjon og viral innkapsling13,14. For å forbedre kinetikken til transgene uttrykk, kan AAV-vektorgenomer konstrueres for å være selv-komplementære, noe som reduserer behovet for konvertering fra enkeltstrenget til dobbeltstrenget DNA-konvertering under AAV-genomreplikering, men reduserer kodingskapasiteten til ~ 2,4 kb15.
Utover AAV genom design, capsid serotype utvalg bestemmer vev og celle tropisme av AAV vektor in vivo2. I tillegg til vevtropisme har forskjellige AAV-serotyper vist seg å vise forskjellige genuttrykk kinetikk16. For eksempel klassifiserte Zincarelli et al.17 forskjellige AAV-serotyper i serotyper med lavt uttrykk (AAV2, 3, 4, 5), moderate uttrykksservotyper (AAV1, 6, 8) og serotyper med høyt uttrykk (AAV7 og 9). De kategoriserte også AAV-serotyper i sakte utbruddsuttrykk (AAV2, 3, 4, 5) eller raskt utbruddsuttrykk (AAV1, 6, 7, 8 og 9). Disse divergerende tropismer og genuttrykk kinetikk skyldes aminosyre variasjoner i capsid proteiner, capsid protein formasjoner, og interaksjoner med vertscelle reseptorer /co-reseptorer 18. Noen AAV-capsider har ytterligere fordelaktige egenskaper som evnen til å krysse blod-hjernebarrieren etter intravaskulær administrering (AAV9) eller bor i langvarige muskelceller for holdbart transgene uttrykk (AAV6, 6.2FF, 8 og 9)19,20.
Denne artikkelen tar sikte på å detaljere en kostnadseffektiv metode for å produsere høy renhet, høy titer, forskningsklasse AAV-vektorer for bruk i prekliniske store dyremodeller. Produksjon av AAV ved hjelp av denne protokollen oppnås ved hjelp av dual-plasmid transfeksjon til tilhenger av human embryonal nyre (HEK) 293 celler dyrket i cellebunker. Videre beskriver studien en protokoll for heparinsulfataffinitetskromatografirensing, som kan brukes til AAV-serotyper som inneholder heparinbindende domener, inkludert AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 og DJ21,22.
En rekke emballasjesystemer er tilgjengelige for produksjon av AAV-vektorer. Blant disse har bruken av et toplasmid co-transfeksjonssystemer, der Rep- og Cap-genene og ad helpergenene (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 og VA RNA) finnes innenfor en plasmid (pHelper), noen praktiske fordeler i forhold til den vanlige treplasmid (trippel) transfeksjonsmetoden, inkludert redusert kostnad for plasmidproduksjon23,24 , 24 . AAV-genomplasmidet som inneholder transgene expression-kassetten (pTransgene), må flankes av ITR-er, og må ikke overstige ~ 4,7 kb i lengde. Vektortipper og renhet kan påvirkes av transgene på grunn av potensielle cytotoksiske effekter under transfeksjon. Vurdering av vektor renhet er beskrevet heri. Vektorer produsert ved hjelp av denne metoden, som gir en 1 x 1013 vg / ml for hver, ble evaluert hos mus, hamstere og eggstokkdyrmodeller.
Tabell 1: Sammensetning av nødvendige løsninger. Nødvendig informasjon, inkludert prosenter og volumer, av komponenter som trengs for ulike løsninger i hele protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dobbel plasmidtransfeksjon av HEK293-celler i cellebunker
- Tin et kryo-hetteglass med HEK293-celler i et perlebad satt til 37 °C.
MERK: Forvarm fullstendig DMEM til 37 °C mens cellene tiner for å sikre at den kalde temperaturen ikke sjokkerer celler når de plating. Sørg for at cellene har et lavt passasjenummer, ideelt mindre enn 20, for å sikre optimal vekst og transfeksjonseffektivitet. Sørg for at cellene er sertifisert til å være mykoplasmafrie. - Overfør innholdet i kryo-hetteglasset dråpevis inn i et 15 ml konisk rør som inneholder 10 ml forvarmet komplett DMEM og sentrifuger cellene på 500 x g i 5 minutter.
- Aspirer mediet, og bruk deretter HEK293-cellene på nytt i 20 ml forvarmet fullstendig DMEM. Frø cellene i en 15 cm plate og inkuber ved 37 °C, med 5 % CO2.
- Del cellene fra en 15 cm plate i tre for såing i cellekulturkammeret.
- Når cellene er 80% konfluensierende, aspirerer du mediet og vasker platen forsiktig med 3 ml PBS for ikke å forstyrre monolayeren. Deretter aspirerer du PBS og legger til 3 ml trypsin.
- Inkuber i 2 min ved 37 °C til cellene løfter seg fra platen, og nøytraliser deretter trypsin ved å tilsette 7 ml fullstendig DMEM på platen.
- Samle alle medier og celler i et 15 ml rør og pellet cellene ved sentrifugering ved 500 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten fra 15 ml-røret og resuspend cellepelleten i 3 ml komplett DMEM. Tilsett 1 ml til hver 15 cm plate som inneholder 20 ml fullstendig DMEM; forsiktig rocke platene for å fordele cellene jevnt, og inkubere ved 37 °C, med 5 % CO2.
- Når cellene er 80 % sammenfallende, gjentar du trinn 1.4.1 og 1.4.2. Samle supernatanten i 50 ml koniske rør, og inverter forsiktig røret for å sikre at cellene er homogene.
- Bestem celletettheten ved å blande 10 μL av celleprøvene med 10 μL trypanblå og legge blandingen til et celletellingslysbilde for analyse i celletelleren.
- Bland 1 L for forhåndsvarmet komplett DMEM med den nødvendige cellefjæringen for å frø cellekulturkammeret (overflateareal på 6360 cm2) med 1 x 104 celler / cm2. Hell celleblandingen inn i cellekulturkammeret og roter forsiktig for å fordele cellene jevnt over hver monolayer (figur 1) og inkuber ved 37 °C, med 5 % CO2.
- I tillegg til cellekulturkammeret, plate en 15 cm plate med 1 x 104 celler / cm2 som referanse for samløp.
- Etter ~65-h inkubasjon, sjekk referanseplaten for konfluens-ideelt ~ 80% -90% confluent.
MERK: Forvarm komplett DMEM for å legge til cellekulturkammeret ved 37 °C.
Figur 1: Manøvrering av cellestabel for cellesåing og transfeksjon. For såing cellestakk, start med å fjerne en av luftehettene og helling i 1 L for forhåndsvarmet komplett DMEM med nødvendig mengde HEK293 celler (A). Fordel celler og medier jevnt ved å stramme både ventilhetter og ta med alle medier til hjørnet av cellestakken med en av ventilhettene og plasser den i det hjørnet (B), plasser cellestakken på siden (C), og vri deretter cellestakken 90° (D) slik at ventilasjonsportene er oppe (E). Senk cellestakken forsiktig til normal horisontal posisjon og sørg for at alle kamrene i cellestakken er fullstendig dekket av medier (F). Ved transfekting, skru av begge ventilasjonshettene og hell sakte ut gamle medier i en avfallsteril avfallsbeholder for jevn strømning for ikke å forstyrre monolayeren til cellene (G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Forbered polyetylenimin (PEI)/DNA-blanding med et konsentrasjonsforhold på 3:1 (m/w).
- Forbered DNA-blandingen i et 50 ml konisk rør ved å tilsette 475 μg pTrangen og 1425 μg pHelper til 40 ml redusert serummedium for å skape et 3:1-forhold mellom pHelper:pTrangene.
MERK: PEI/DNA-blandingskalkulatoren finner du ved hjelp av tabell 2. - Tilsett 5,7 ml PEI (1 g/l) til det reduserte serummediet og DNA-blandingen dråpevis. Deretter virvel kort og inkubere i 10 min ved romtemperatur.
MERK: Når PEI/DNA inkuberer ved romtemperatur, blir det litt overskyet.
- Forbered DNA-blandingen i et 50 ml konisk rør ved å tilsette 475 μg pTrangen og 1425 μg pHelper til 40 ml redusert serummedium for å skape et 3:1-forhold mellom pHelper:pTrangene.
- Etter 8 min PEI/DNA-inkubasjon fjerner du mediet fra cellekulturkammeret.
MERK: Sørg for å løsne begge de oransje hettene for å opprettholde en jevn strøm av medier for å unngå løsrlydning av celler. - Tilsett PEI/DNA i 1 L forforvarmet fullstendig DMEM, og hell blandingen langsomt inn i cellekulturkammerporten. Fordel væsken jevnt til alle radene (figur 1) og inkuber i 72 timer ved 37 °C, med 5 % CO2.
2 Høsting av AAV og kjemisk lysis av de transfekterte HEK293-cellene
- Rist cellekulturkammeret kraftig for å løsne cellene til mediene virker overskyet fra løsnede celler og hell i fire 500 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger rørene ved 18.000 x g i 30 min ved 4 °C for å pellet cellene. Hell den klargjorte supernatanten i 1 L polyetylentereftalatkopolyserflaske (PETG).
MERK: Hvis man ikke har tilgang til en høyhastighets sentrifuge, sentrifuge ved 12.000 x g i 40 min. De pelleterte cellene er kanskje ikke faste med denne hastigheten og vil gli som å helle ut supernatant. - Resuspend cellepellets i 500 ml sentrifuge rør med 50 ml lysis buffer og inkubere i 60 min ved 37 °C.
- Sentrifuger rørene på 18 000 x g i 30 minutter, og overfør deretter supernatanten til den samme 1 L PETG-flasken. Kast det pelleterte celleavfallet.
MERK: Rens den klargjorte supernatanten umiddelbart og oppbevar den ved 4 °C i opptil 72 timer. Oppbevars ved -80 °C ved lengre lagring. Må ikke oppbevars ved -20 °C.
3 AAV Vektor rensing ved hjelp av heparin affinitet kromatografi
- Fjern råoljelyset fra -80 °C og la det stå ved 4 °C over natten for å tine. Når det er tint, bruk et 0,22 μM filter for å filtrere rålyset.
- For å passivisere sentrifugalkonsentratoren, tilsett 4 ml filterforbehandlingsbuffer til en sentrifugalkonsentrator for hver heparinsepharosekolonne som brukes. Passiver sentrifugalkonsentratoren ved romtemperatur i 2-8 timer. Definer passivisering rett før rensetrinnene.
- Sett opp slangen og pumpen (Figur 2).
- Plasser slangen i en peristaltisk pumpe og kjør 20 ml 1 M NaOH. Deretter kjører du 50 ml molekylært vann, og kjører deretter 50 ml basal DMEM.
- Fest 5 ml heparinsepharosekolonne til slangen og kjør 25 ml basal DMEM for å fjerne konserveringsmiddelet.
- Kjør 0,2 μM av den filtrerte råoljen lysat gjennom kolonnen med en strømningshastighet på 1-2 dråper / s.
Figur 2: Sett opp for peristaltisk pumpe for AAV-rensing. Kjør slangen fra råoljelyset, gjennom den peristaltiske pumpen og inn i heparinmatrisekolonnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
MERK: Pass på at du ikke innfører bobler eller lar søylen gå tørr, da dette vil kompromittere kolonnen og forhindre elution av AAV. Kast søylen hvis den går tørr og bruk en ny kolonne for resten av rå lysat.
- Legg alt råoljelyset på heparinsøylen og bruk følgende løsninger for å vaske kolonnen.
- Vask med 50 ml 1x Hanks balanserte saltløsninger (HBSS) uten Mg2+ og Ca2+.
- Vask med 15 ml 0,5 % N-Lauroylsarcosin i HBSS uten Mg2+ og Ca2+.
- Vask med 50 ml HBSS uten Mg2+ og Ca2+.
- Vask med 50 ml HBSS med Mg2+ og Ca2+
- Vask med 50 ml 200 mM NaCl/HBSS med Mg2+ og Ca2+.
- Elute 5 x 5 ml (totalt 25 ml) med 300 mM NaCl/HBSS med Mg2+ og Ca2+ og merk elutionene som E1-E5 (hver elution er på 5 ml).
- Konsentrere viruset ved hjelp av en sentrifugalkonsentrator
- Snurr sentrifugalkonsentratoren som inneholder forbehandlingsbufferen på 900 x g i 2 minutter. Kast gjennomstrømningen.
- Vask sentrifugalkonsentratorfilteret med 4 ml HBSS med Mg2+ og Ca2+ og sentrifuge ved 1000 x g i 2 minutter; kast gjennomstrømningen.
- Tilsett elution E2 i sentrifugalkonsentratoren. Spinn på 1000 x g i 5 min og kast gjennomstrømningen.
- Fullfør tilsetningen av E2 og tilsett deretter E3 i sentrifugalkonsentratoren og spinn ved 1000 x g i 5 minutter til det konsentrerte viruset er ca. 1 ml.
MERK: Unngå sentrifugering av vektoren slik at volumet er under filternivået. Ikke konsentrer E1, E4 eller E5 i sentrifugalkonsentratoren, da de inneholder svært lite eller ingen vektor og inneholder forurensninger. - Fjern det konsentrerte viruset fra sentrifugalkonsentratoren ved hjelp av en p200 filtrert spiss og legg den i et sterilt sentrifugerør på 1,5 ml.
- Skyll sentrifugalkonsentratoren med 200 μL HBSS med Mg2+ og Ca2+ for å løsne eventuell gjenværende AAV fra filteret. Pipette opp og ned kraftig flere ganger (for ~ 30 s) for å løsne ethvert virus som sitter fast i membranen og plassere i 1,5 ml sentrifugerøret med resten av viruset. Bland røret godt.
- Aliquot 5 μL for DNA-ekstraksjoner og lagre renset vektor ved -80 °C.
- Vask kolonnen med 25 ml 2 M NaCl. Videre bruk 25 ml 0,1% Triton X-100, forvarmet til 37 °C for å vaske kolonnen. Deretter vasker du kolonnen med 50 ml steril dH2O, og vask deretter med 25 ml 20% etanol.
- Forsikre deg om at kolonnemembranen er fullstendig mettet i 20% etanol, da dette er lagringsløsningen. Forsegle kolonnen med plugger som følger med, og oppbevar den ved 4 °C.
- Oppbevar slangen i 1 M NaOH.
MERK: Hvis de rengjøres riktig, kan heparinsepharose-kolonner brukes på nytt opptil fem ganger.
4 AAV genomisk DNA-ekstraksjon
- Klargjør reaksjonsblandingen som er nevnt i tabell 3 i et PCR-rør for DNase-behandling.
| Komponent | Volum |
| Renset AAV vektor | 5 μL |
| 10x DNase-buffer | 2 μL |
| DNase | 1 μL |
| ddH2O | 12 μL |
| Endelig volum | 20 μL |
Tabell 3: DNase behandling master mix formel. Anbefalte komponenter og volumer som kreves for DNase-behandling av AAV-virusvektorer under DNA-ekstraksjon.
- Virvel PCR-røret for å blande og pulsere PCR-røret for å spinne ned innholdet.
- Bruk en termocycler, inkuber ved 37 °C i 20 minutter etterfulgt av 75 °C i 15 minutter for å varme opp DNase.
- Tilsett 5 μL proteinase K.
- Bruk en termocycler, inkuber ved 50 °C i 60 minutter og deretter ved 95 °C i 30 minutter for å varme opp inaktiverer Proteinase K.
- Bruk et DNA-oppryddingssett for å fjerne potensielle forurensninger.
MERK: Dette trinnet ble utført ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig opprydingssett for blod og vev (Materialliste).- Tilsett 200 μL AL-buffer (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials) i PCR-røret som inneholder den DNase/Proteinase K-behandlede vektoren.
- Virvel PCR-røret og inkuber ved 56 °C i 10 minutter i en termosykler.
- Pipette væsken fra PCR-røret inn i en steril spinnkolonne som sitter i et oppsamlingsrør.
- Tilsett 200 μL 100% etanol i kolonnen og bland grundig ved virveling.
- Sentrifuge ved 6000 x g i 1 min og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 500 μL buffer AW1 (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials) i spinnkolonnen.
- Sentrifuge ved 6000 x g i 1 min og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 500 μL buffer AW2 (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials) i spinnkolonnen.
- Sentrifuge ved 15.000 x g i 3 min og kast gjennomstrømningen.
- Plasser spinnkolonnen i et sterilt 1,5 ml sentrifugerør og tilsett 200 μL buffer AE (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials) direkte til spinnkolonnemembranen.
- Inkuber ved romtemperatur i 1 min.
- Sentrifuge på 6000 x gi 1 min for å unndra seg DNA.
- Oppbevar DNA-et ved -20 °C.
5 Titrering av AAV vektorgenomer ved hjelp av kvantitativ polymerasekjedereaksjon og en Simian Virus 40 (SV40) sonde
MERK: Utfør alt qPCR-arbeid i en PCR-hette ved hjelp av filtrerte pipettespisser for å unngå ekstern DNA-forurensning. Hvis AAV-genomet ikke koder en SV40 polyA-sekvens, bruker du en sonde mot ITR som er beskrevet andre steder25. Sørg for at det plasmide DNA-et som er valgt som standard, inneholder SV40 polyA-sekvens.
- Klargjøring av lagerstandard
- Fortynn den plasmide DNA-standarden (pTransgene plasmid som inneholder SV40 polyA-sekvens) til en endelig konsentrasjon på 10 μg/μL og oppbevar ved -20 °C i 6 μL aliquots.
- Bestem kopinummeret som finnes i plasmid DNA-standard ved hjelp av følgende onlinekalkulator 26.
MERK: Bruk et plasmid-DNA som brukes til standarden produsert av en kommersiell leverandør for å sikre kvalitet og riktig konsentrasjon. Forbered en stor mengde standard (f.eks. 10 ml) for å gjennomføre brostudier når du går over til en nylig forberedt standard.
- Klargjør følgende reagensblanding som er nevnt i tabell 4 for både prøvene og standarden i et sentrifugerør på 1,5 ml.
MERK: Forbered tilstrekkelig overtak av master mix. Se tabell 5 for klargjørings-/sondesekvenser.
| Komponent | Volum |
| Universell qPCR-hovedmiks (2X) | 10 μL |
| Molekylært vann | 4,5 μL |
| 40x SV40 polyA primer/sonde | 0,5 μL |
| Endelig volum | 15 μL |
Tabell 4: qPCR master mix for AAV-titrering. Anbefalte komponenter og volumer kreves for qPCR av DNA ekstrahert fra AAV virale vektorer.
| Komponent | Sekvens |
| Fremoverprimer | 5'-AGCAATAGCATCACAAATTTCACACAA-3' |
| Omvendt primer | 5'-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3' |
| Sonde | /56-FAM/AGCATTTTT/Zen/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTGTC/3IABkFQ |
Tabell 5: Primersekvenser mot SV40 polyA DNA-sekvensen. Sekvenser av primere og sonde som brukes til qPCR-titrering, som binder seg til bestemte områder av AAV-virale vektorer som inneholder SV40 polyA-sekvensen.
- Pipette mesteren blandes opp og ned for å blande.
- Sett opp fortynningsplaten.
- Bruk en klar 96-brønnsplate for å forberede standard- og prøvefortynning, tilsett 45 μL molekylært vann til hver brønn i annenhver kolonne som starter med kolonne 1 (kolonne 1, 3, 5, 7, 9 og 11).
- Tilsett 5 μL av standarden til brønn A1 og pipette for å blande.
- Bruk en ny filtrert pipettespiss for å lage en 1/10 fortynning fra brønn A1 til B1.
- Fortsett en serie med 10 ganger fortynning nedover kolonnen til du når G1.
- Ikke legg til H1, da dette vil fungere som en negativ kontroll.
- Påfør den første prøven (S1) ved å legge den til brønn A3, og danner en 1/10 fortynning. Pipette denne blandingen og overfør 5 μLto brønn B3. Kast pipettespissen etter denne overføringen.
- Med en ny pipettespiss blander du løsningen i brønn B3 og danner en 1/100 fortynning. Overfør 5 μLof denne blandingen til brønn C3 og kast spissen etter overføringen.
- Med en ny pipettespiss, pipette opp og ned løsningen i brønn C3 for å lage en 1/1000 fortynning. Kast spissen.
- Fortsett å fortynne prøver uten å legge til noen prøver i kolonne 2, 4, 6, 8, 10 eller 12.
- Når alle prøvene er fortynnet, bland innholdet i brønner i kolonne 1, og overfør deretter 20 μL til kolonne 2.
- Gjenta dette for kolonne 3, 5, 7, 9 og 11 for å opprette replikeringer av hver standard og prøvefortynning. Se figur 3 for plateoppsett.
MERK: Når du følger plateoppsettet i figur 3, vil prøver som fortynnes i rad G og H bare ha 1/10 og 1/100 fortynning.
Figur 3: Plateoppsett for qPCR AAV-titrering. Blå indikerer plasseringen av den serielle fortynning av standarden; grønn angir plasseringen av den negative kontrollen; lilla indikerer plasseringen av fortynning av prøvene. Hver standard, negativ eller prøve legges til i replikering. Et eksempel for konsentrasjonen av standarden er lagt til for å vise fortynningsserien av standarden, og plassering av prøvefortynning er lagt til sine respektive brønner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Titrering av SV40 polyA deteksjonsbasert qPCR
- Tilsett 15 μL qPCR master mix til hver brønn av en hvit-semi skjørt 96-brønns qPCR plate.
- Overfør 5 μL av hver prøve fra den klare 96-brønnsplaten til den hvite halvskjørte 96-brønns qPCR-platen.
- Bruk en flerkanals pipette for å sikre tilstrekkelig blanding av qPCR master mix og prøve.
- Forsegle platen med en tetningsfilm og sentrifuger qPCR-platen ved 1500 x g i 30 s.
- Kjør qPCR-reaksjonen på platebasert PCR-forsterknings- og deteksjonsinstrument i sanntid ved hjelp av de foreslåtte forholdene i tabell 6.
| Seksjon | Sykluser | Tid | Temperatur | Beskrivelse |
| Før inkubasjon | 1x | 5 min | 95 °C | DNA-denaturering. |
| Forsterkning | 38x | 15 s | 95 °C | Forsterkning av DNA. Innstillinger kan endres hvis du bruker alternative primere med forskjellige glødetemperaturer. |
| 60 s | 60 °C | |||
| Kjøling | 1x | 60 s | 40 °C | Plate kjøling. Slutt på løpetid. |
Tabell 6: Thermocycler-protokoll for hydrolyseprobebasert qPCR-titrering. Anbefalt termosirkuleringsprotokoll for bruk av sondebasert qPCR-titrering av DNA-ekstraherte rensede AAV-vektorer.
MERK: For qPCR AAV-titreringsregneark, se tabell 7.
- Dataanalyse for å bestemme AAV-genomkopinumre.
- Fyll ut regnearkdatacellene (Tabell 7A) med konsentrasjonsverdiene hentet fra qPCR-kjøringen for både standard- og prøvefortynning.
- Bruk konsentrasjonsverdier fra tabell 7A til å lage en standardkurve (Tabell 7B).
MERK: Standardkurven vises som en naturlig logaritme (y = a ln(x) + b) sammen med R2 effektivitet. En standardkurve må ha en effektivitet nær 100 % og R2 nær 1,0 (≥0,99). - Fyll ut hellingseffektiviteten ved å fylle ut denne onlinekalkulatoren 27.
MERK: En effektivitet mellom 90% -110% er akseptabel. Hvis effektiviteten til qPCR er utenfor dette området, kjører du qPCR på nytt. - Bruk konsentrasjonsverdier fra tabell 7A til å beregne gjennomsnittet av fortynningene for hvert utvalg og bestemme standardavviket for hvert utvalg (Tabell 7C).
MERK: Utelat fortynning fra prøver som er mer enn ett standardavvik unna gjennomsnittet av prøvefortynning. - Bruk gjennomsnittskonsentrasjonen av hver fortynning, multipliser med fortynningsfaktoren, og del deretter med fem for å få vektorgenomene (vg)/μL for hver prøve (Tabell 7C).
- Beregn vg/ml for hver prøve ved å multiplisere gjennomsnittet av hver prøves konsentrasjon med 80 000 (tabell 7C).
- Gjennomsnitt vg/ml for hver fortynning for å produsere den endelige vg/ml av hver prøve (Tabell 7C).
MERK: Brukeren må dele gjennomsnittskonsentrasjonen av hver fortynning med en faktor fem for å gjøre rede for 5 μL lastet inn i hver brønn for qPCR-løpet for å produsere konsentrasjonen i vg/μL. Faktoren på 80 000 står for overgangen fra hver prøves gjennomsnittlige konsentrasjonsverdi til vg/ml. For det første må gjennomsnittet av hver prøves konsentrasjonsverdi multipliseres med 2 for å gjøre rede for de enkeltstrengede genomene, da primersonden bare kvantifiserer positiv fornuft, enkeltstrenget DNA (ssDNA), og AAV-genomet eksisterer i et omtrentlig 1:1-forhold mellom positiv og negativ sans ssDNA25,28. Gjennomsnittet av hver prøves konsentrasjonsverdi må multipliseres x40 for å ta høyde for prøvefortynning fra 5 μL renset vektor (avsnitt 4.1) til 200 μL ekstrahert DNA (pkt. 4.6.12). Til slutt må gjennomsnittet av hver prøves konsentrasjonsverdi multipliseres x1000 for å konvertere fra vg/μL til vg/ml.
6 Vurdering av vektorkvalitet og renhet
- Kvalitetskontroll - Western Blot
- Forbered en 12% SDS PAGE gel.
- Utfør polyakrylamidgelelektroforese.
MERK: Last inn 6 x10 10 vg prøver per brønn. - Overfør proteinene til polyvinylliddifluoridmembran (PVDF).
- Blokkerer PVDF-membran
- Fjern membranen fra overføringsapparatet og skyll i 0,1% PBST for å fjerne løs akrylamid.
- Plasser membranen i blokkeringsløsning i minst 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
MERK: Blokkeringsbufferen kan suppleres ytterligere med 2% geitserum.
- Inkubasjon med primært antistoff
- Dekanter blokkeringsbufferen og tilsett det primære antistoffet, et monoklonalt antistoff mot en 1:200-mus ved en fortynning på 1:200.
- Inkuber over natten ved 4 °C.
- Dekanter det primære antistoffet og vask fem ganger med 0,1% PBST i 5 min ved romtemperatur med agitasjon.
- Inkubasjon med sekundært antistoff
- Dekanter vaskeløsningen og tilsett HRP-konjugert sekundært antistoff, fortynnet ved en 1:7500 i blokkeringsbuffer, og inkuber i 1 time ved romtemperatur med agitasjon.
- Dekanter det sekundære antistoffet og vask fem ganger med 0,1% PBST i 5 min ved romtemperatur med agitasjon.
- Utfør en sluttvask med PBS ved romtemperatur med agitasjon.
- Oppdag proteinene ved hjelp av forbedret chemiluminescent (ECL) substrat.
- Bilde av gelen for å visualisere virusproteinene (VP1, VP2 og VP3-underenheter) (Figur 4).
Figur 4: Vestlig blott som viser AAV-kapsidproteiner. Bane A; MW stige, Lane B; AAV6.2FF-hIgG01, bane C; AAV6.2FF-hIgG02, Kjørefelt D; AAV6.2FF-hIgG03 og Lane E; AAV6.2FF-hIgG04. 6 x 1010 vg av hver AAV6.2FF-hIgG ble lastet inn i sine respektive baner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Renhetskontroll - SDS PAGE og Coomassie Stain
- Klargjør SDS-PAGE gel og prøver som beskrevet fra trinn 6.1.1 og 6.1.2.
- Fest gelen i festeløsningen i 1 time eller over natten med mild agitasjon. Bytt festeløsning én gang i løpet av den første timen.
- Flekk gelen i fargingsoppløsning i 2-4 timer med mild agitasjon.
- Destain gelen med en destaining løsning. Fyll på destainingsløsningen flere ganger til bakgrunnen av gelen er helt destained (4-24 h).
- Oppbevar den destained gelen i en lagringsløsning.
- Bilde gelen for å visualisere alle proteiner farget av Coomassie farging løsning.
Figur 5: Coomassie-farget gel. Bane A; MW stige, Lane B; AAV6.2FF-hIgG01, bane C; AAV6.2FF-hIgG02, Kjørefelt D; AAV6.2FF-hIgG03, Kjørefelt E; AAV6.2FF-hIgG04, Lane F; AAV6.2FF-hIgG05 og Lane G; AAV6.2FF-hIgG06. 6 x 1010 vg av hver AAV6.2FF-hIgG ble lastet inn i sine respektive baner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Alternativ renhetskontrollanalyse - HEK293 vertscelleproteindeteksjon ELISA
- Utfør HEK293-vertscelleproteindeteksjon via ELISA i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Bruk fortynninger på 5 x 10-2 og 1 x 10-3 for rensede rAAV-prøver. Når TMB er lagt til brønnen, inkuberer du bort fra lys. Lineær regresjon kan ikke brukes til å analysere resultatene. - Utfør en punkt-til-punkt-analyse, kubisk spline- eller fireparameter logistisk tilpasningsmetode for å interpolere konsentrasjoner av ukjente og multiplisere med fortynningsfaktoren for å bestemme opprinnelig prøvekonsentrasjon.
- Utfør HEK293-vertscelleproteindeteksjon via ELISA i henhold til produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversettelse fra små gnagermodeller til større dyremodeller og eventuell klinisk anvendelse utgjør en betydelig utfordring på grunn av den store mengden AAV som kreves for å transdusere større dyr og oppnå terapeutiske effekter. For å sammenligne transduksjonseffektiviteten til den rasjonelt utformede AAV6.2FF-kapsiden, har tidligere vist en 101 ganger økning i transduksjonseffektivitet i murine muskelceller sammenlignet med AAV63, mus, hamstere og lam ble alle administrert AAV6.2FF som uttrykker et menneskelig monoklonalt antistoff (hIgG). AAV6.2FF-hIgG-uttrykkende vektor inneholdt en CASI-promotor4, et Woodchuck hepatittvirus etter transkripsjonsregulerende element (WPRE) og en SV40 polyA-sekvens. Seks uker gamle kvinnelige BALB/c (n = 4) mus ble intramuskulært (IM) administrert 1 x10 11 vg AAV6.2FF-hIgG i 40 μL, og blod ble samlet inn på dag 0, 7, 14, 21 og 28 etter AAV-administrasjon for hIgG-overvåking. Fire uker gamle syriske hamstere (to kvinner og to menn) ble IM administrert 1 x 1012 vg AAV6.2FF-hIgG i 40 μL, og blod ble samlet ukentlig for å overvåke for hIgG uttrykk. Til slutt ble 10-dagers mannlige Dorset lam (n = 3) IM administrert 1 x1013 vg / kg AAV6.2FF-hIgG i to til tre 1 ml injeksjoner i rumpa. Ukentlig blodoppsamling ble fullført av jugularblødninger og hIgG ble overvåket ukentlig i 28 dager. Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care Committee ved University of Guelph.
Mus IM administrert 5 x 1012 vg/kg AAV6,2FF-hIgG uttrykt mellom 171-237 μg/ml hIgG i serumet etter dag 28 etter administrering (Figur 6). Hamsters IM administrert 2 x 1013 vg/kg AAV6.2FF-hIgG uttrykte mye høyere nivåer enn musene, med serum hIgG nivåer på 495-650 μg /ml ved dag 28 etter administrering. Til slutt uttrykte sau IM 1 x 1013 vg/kg serum hIgG-nivåer på 21-46 μg/ml ved dag 28 etter administrering. På tvers av alle dyremodeller så ikke vektoren ut til å hindre noen helseindekser, for eksempel vekt, som beviste sikkerheten og kvaliteten på de produserte vektorene. Det er velkjent at AAV-mediert monoklonalt antistoff (mAb) uttrykk varierer betydelig avhengig av arten og mAb. Så vidt forfatterne vet, er det ingen rapporter om AAV-mAb-uttrykk i eggstokkarter, og det er derfor ingen målestokk for forventede uttrykksnivåer. Det er bemerkelsesverdig at sauene i denne studien doblet seg i vekt i løpet av den 28-dagers etterinjeksjonsperioden, og at dyrene i figur 6 alle ble transdusert med forskjellige AAV-mAbs og dermed ikke kan sammenlignes.
Figur 6: Intramuskulær levering av AAV6.2FF-hIgG fører til vedvarende serum hIgG-uttrykk hos mus, hamstere og sauer. Kvinnelige BALB/c mus (n = 4) ble IM administrert 5 x 1012 vg/kg AAV6,2FF-hIgG, Syriske hamstere (2 menn, 2 kvinner), ble IM administrert 1 x 1013 vg/kg AAV6.2FF-hIgG, og 10 dager gamle mannlige Dorset lam (n = 3) ble IM administrert 1 x 1013 vg/kg. Serum ble overvåket for hIgG-uttrykk over en periode på 28 dager. Data representeres som gjennomsnittet ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Transfeksjon av cellekulturkammeret | |||||
| Protokoll | |||||
| 1. La DNA, OptiMEM og PEI varme opp til romtemperatur før transfeksjon | |||||
| 2. Skriv inn antall cellestakker som skal transfekeres (ingen overtak kreves) | |||||
| 3. Forsikre deg om at DNA-konsentrasjonene er riktige, da dette vil endre volumene som kreves | |||||
| Antall cellekulturkamre | 1 | ||||
| Konsentrasjon av transgene plasmid | 1 | mg/ml | |||
| Konsentrasjon av pDGM6,2FF plasmid | 1 | mg/ml | |||
| Mengde per cellekulturkamre | Transfection Mastermix | ||||
| OptiMEM | 48.1 | Ml | 48.1 | Ml | |
| 1:3-forhold pTransgene:pHelper | pTransgene | 475 | μg | 475 | μL |
| pHelper | 1425 | μg | 1425 | μL | |
| 4. Legg til nødvendige volumer av OptiMEM og plasmid DNA til et 50 ml konisk rør | |||||
| 5. Inverter 10 ganger for å blande | |||||
| 3:1 PEI:DNA-forhold | PEI Maks | 5.7 | Ml | 5.7 | Ml |
| 6. Legg den nødvendige mengden PEI til 50 ml-røret som inneholder OptiMEM og plasmid DNA | |||||
| 7. Lukk 50 ml rør og virvel og snu 3–5 ganger for å blande. | |||||
| 8. Still inn en timer i 10 min for PEI-kompleksene for å inkubere | |||||
| 9. Flytt cellestakker som skal transfekeres til BSC | |||||
| 10. Etter 10 min, hell trasnfeksjonsblandingen i en oransje port. | |||||
| 11. Bland væske forsiktig i hele cellestakken | |||||
| 12. Returner den transfekterte cellestakken til inkubatoren, noe som sikrer lik volum på hvert lag | |||||
| 13. Høst cellekulturkammer 72 timer senere | |||||
Tabell 2: Transfeksjonskalkulator for cellekulturkammer. Interaktivt regneark for å bestemme riktig konsentrasjon av pTransgene, pHelper og PEI for transfeksjon av cellekulturkammeret.
Tabell 7: AAV Titreringskalkulator. Interaktivt regneark for å bestemme endelig konsentrasjon av AAV-prøver fra qPCR, uttrykt som vg/ml. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Produksjonen av rekombinante AAV-vektorer (rAAV) som er beskrevet i dette dokumentet, bruker vanlige materialer, reagenser og utstyr som finnes i de fleste forskningslaboratoriene og anleggene for molekylærbiologi. Dette papiret gjør det mulig å produsere in vitro og in vivo grade rAAV av høy kvalitet av leseren. Fremfor alt er denne protokollen for rAAV-produksjon, sammenlignet med mer kjedelige protokoller som involverer cesiumkloridrensing, effektiv og unngår bruk av ultracentrifugation. Når HEK293-celler er transfektert, er renset AAV klar til bruk innen 5 virkedager.
Under rAAV produksjon og rensing prosessen, mange trinn kan påvirke renheten og endelige titer av vektoren. Det første og mest kritiske trinnet er helsen til HEK293-cellene, som har en direkte effekt på vektortitren. Bruken av HEK293-celler i motsetning til andre celletyper eller systemer, for eksempel HEK293T-celler, er fordelaktig ved at HEK293-celler har større evne til å følge plastbelegget på plater og celler som skaper robuste cellenettverk for kontinuerlig cellevekst. Det anbefales å overvåke celler for mykoplasmaforurensning og for å unngå å passere HEK293-celler forbi ~ 40 passasjer eller når doblingstiden ser ut til å avta, da dette vil føre til lavere AAV-utbytter. Videre er bekreftende celler omtrent 80% konfluensa før transfeksjon sikrer at cellene ikke er for sparsomme eller overgrodde. Når det gjelder transfeksjonskomponentene, anbefales bruk av plasmid DNA av høy kvalitet (f.eks. kommersielt tilberedt plasmid-DNA) på det sterkeste for å sikre at DNA forblir i løsning og samhandler riktig med kjemiske transfeksjonsleveringskomponenter, for eksempel PEI. Til slutt har transfeksjonsreagensen en betydelig innvirkning på rAAV-utbytter. Her brukes PEI som transfeksjonsagent. PEI er en stabil kationisk polymer som leverer eksogent DNA til kjernen av celler gjennom produksjon av plasmidpolymerkomplekser, som deretter tas opp av celler og trafikkeres til kjernen gjennom vertscelleprosesser29. PEI-baserte transfeksjoner er raske og enkle sammenlignet med andre metoder for DNA-levering, inkludert kalsiumfosfat eller lipofektamin. Forholdet mellom PEI:DNA må imidlertid optimaliseres.
Bruken av cellebunker i motsetning til tradisjonelle tilhengerplater gir en mer praktisk og konsistent metode for produksjon av rAAV. Cellestakker innebærer mindre teknisk manipulering under transfeksjon, noe som reduserer mulig løsrivelse av celler fra tilhengermonolayeren, noe som gir sterkere cellenettverk og bedre produksjon av rAAV. Etter transfeksjon er samlingen av supernatant og lysis av celler effektiv og konsistent. For å høste rAAV fra celler er fysiske cellelysmetoder som frysetining ineffektive og inkonsekvente, da det ikke er mulig å sikre at alle cellene blir lysnet. Her er en kjemisk lysisprosedyre beskrevet. Bruken av kjemisk lysisbuffer sikrer at alle cellene blir utsatt for lysismiddelet ved en bestemt konsentrasjon, samt tilsetningsstoffer som proteasehemmer for å forhindre kapsid nedbrytning. Denne metoden lyser mer konsekvent celler som gir en mer effektiv høsting av rAAV. Videre eliminerer pelletering og fjerning av cellulært rusk mulige forurensninger fra rålyset, noe som kan øke tiden og kostnaden ved filtrering av lysat før rensing.
Selv om rAAV kan være til stede i høye mengder i rålyse, kan handlingen med å fange og rengjøre rAAV variere mellom ulike rensemetoder, for eksempel cesiumklorid gradienter. Her gir bruk av heparin sepharose affinitet kromatografi rensing en rask og enkel metode for vektorrensing som resulterer i ultrapure virus og krever ikke gradient ultracentrifugation. Imidlertid inneholder ikke alle AAV-serotyper heparinbindingsdomener, så for de serotypene vil denne renselsesmetoden ikke være hensiktsmessig. Mens for eksempel AAV2 og AAV6 binder heparinsulfat, binder ikke AAV4 og AAV530. Selv om denne metoden ikke er universell, er den effektiv og enkel for de capsidene som binder heparinsulfat. I motsetning til ultra-sentrifugeringsgradienter som jodxanol, er alle rAAV-partikler bundet til membranen i kolonnen til de blir unngått ved hjelp av høye saltkonsentrasjonsvasker, og unngår problemer som blanding av gradienter og ferdighet som trengs for å gjenopprette fraksjoner fra gradienten. Elution gjennom høye saltkonsentrasjonsvasker gir mulighet for kontrollert og presis elution av viruset i fraksjoner som kan konsentreres ytterligere. Bare konsentrere visse brøkdeler av det rømte viruset fjerner ytterligere potensielle forurensninger mens du gjenoppretter >97% av det rømte viruset. En begrensning av heparin sepharose affinitet kromatografi rensing er at den ikke skiller mellom tomme og fulle partikler. Ytterligere analytiske ultracentrifugation trinn må innlemmes for å fjerne tomme capsids31.
qPCR er en kostnadseffektiv og rask metode for å bestemme antall vektorgenomer i en AAV vektor prep. Selv om qPCR er en sensitiv kvantifiseringsmetode, gir den ingen informasjon om antall smittsomme partikler i prep. Dessuten kan følsomheten til denne analysen føre til variasjon, da tekniske feil under pipettering kan føre til variasjon mellom analysene. For ethvert eksperiment som innebærer å sammenligne forskjellige AAV-vektorer, er det derfor viktig at vektorene titreres på samme qPCR-plate. Til tross for disse begrensningene er qPCR den mest nøyaktige metoden utviklet for titering av AAV og er for tiden den mest brukte og aksepterte metoden for kvantifisering av AAV-vektorer32. Bruken av en primer/sonde som binder seg til SV40 polyA av et rAAV-genom er basert på det faktum at denne sekvensen er bevart på tvers av mange AAV-genomplasmider konstruert i laboratoriet. I tillegg til å velge en konservert sekvens blant leserens rAAV-genomplasmider, kan qPCR-sonder utformes for alle deler av rAAV-genomet, inkludert, men ikke begrenset til, promotører, transgenes eller posttranskripsjonelle faktorer.
Vurdering av renheten og kvaliteten på AAV-produktet er et viktig skritt i produksjonsprosessen. Western blotting kan brukes til å oppdage VP1, VP2 og VP3 strukturelle proteiner som utgjør capsid av AAV, samt eventuelle endrede former for VP. VP1, VP2 og VP3 er vanligvis til stede i forholdet 1:1:10, men dette kan variere fra 1:1:5 til 1:1:20 avhengig av serotypen. Derfor er det viktig å bestemme forholdet for hvert system empirisk, spesielt fordi N-terminalområdet til VP1 har vist seg å være viktig for infektivitet og transduksjon33. SDS-PAGE kombinert med Coomassie-farging er en ganske grei metode for å oppdage VP1, VP2 og VP3, samt være vert for celleproteinforurensninger. Bruken av fluorescerende proteinflekker som SYPRO Ruby tilbyr høyere følsomhetsdeteksjon av vertscelleproteinforurensninger enn Coomassie; Imidlertid har ikke alle laboratorier tilgang til bildeutstyret som kreves for å visualisere gelen. Til slutt kan kommersielle ELISAer brukes til å kvantifisere vertscelleproteinforurensninger i AAV-vektorer produsert i HEK293-celler.
Denne protokollen gir en grundig oversikt over å produsere høy titer, høy renhet rAAV for serotyper som binder seg til heparin. I den representative resultatseksjonen viser bruken av romanen AAV6.2FF som uttrykker hIgG i en rekke dyremodeller sikkerheten og effektiviteten til denne rAAV in vivo. Selv om AAV6.2FF-vektoren ble administrert IM, kan disse høykvalitets, høy renhetsvirusene administreres via en rekke forskjellige ruter in vivo, som mulige inflammatoriske forurensninger, for eksempel vertscelleprotein, har blitt eliminert gjennom våre renseprosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sarah K. Wootton er oppfinner på et amerikansk patent US10806802B2 for AAV6.2FF capsid.
Acknowledgments
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas og Jacob G. E. Yates var mottakere av Ontario Veterinary College Student Stipends samt Ontario Graduate Scholarships. Amira D. Rghei var mottaker av et Mitacs Accelerate Studentship. Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (#66009) og et Collaborative Health Research Projects (NSERC partnered) stipend (#433339) til SKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
- FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
- Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
- Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
- Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
- Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
- Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
- Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
- Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
- Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
- van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
- Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
- Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
- qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
- Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).
