Summary
Studien beskriver en protokoll for å lage store (μg-mg) mengder DNA for proteinscreeningskampanjer fra syntetiske genfragmenter uten kloning eller bruk av levende celler. Den minimale malen er enzymatisk fordøyd og sirkulærisert og deretter forsterket ved hjelp av isotermisk rullesirkelforsterkning. Cellefrie uttrykksreaksjoner kan utføres med det ubetenkne produktet.
Abstract
Denne protokollen beskriver utformingen av en minimal DNA-mal og trinnene for enzymatisk forsterkning, noe som muliggjør rask prototyping av analysebare proteiner på mindre enn 24 timer ved hjelp av cellefritt uttrykk. Etter å ha mottatt DNA fra en leverandør, blir genfragmentet PCR-forsterket, kuttet, sirkulærisert og kryobanket. En liten mengde av det bankede DNA-et fortynnes og forsterkes deretter betydelig (opptil 106x) ved hjelp av isotermisk rullesirkelforsterkning (RCA). RCA kan gi mikrogrammengder av den minimale uttrykksmalen fra picogramnivåer av startmateriale (mg nivåer hvis alt startende syntetisk fragment brukes). I dette arbeidet resulterte en startmengde på 20 pg i 4 μg av sluttproduktet. Det resulterende RCA-produktet (concatemer av den minimale malen) kan legges direkte til en cellefri reaksjon uten rensetrinn. På grunn av at denne metoden er helt PCR-basert, kan den muliggjøre fremtidig screeninginnsats med høy gjennomstrømning når den kombineres med automatiserte væskehåndteringssystemer.
Introduction
Cellefritt genuttrykk (CFE) har dukket opp som et kraftig verktøy med mange applikasjoner. Slike anvendelser inkluderer sykdomsdeteksjon1,2,3,4,5,6, mikronæringsstoff og liten molekyldeteksjon7,8,9,10,11,12, bioproduksjon13,14,15,16,17 ,18, utdanning19,20,21, produksjon av vanskelige proteiner17,22,23,24,25,26,27og variantscreening23,28,29,30,31,32 ,33. Dette skyldes den åpne naturen til cellefrie systemer og fleksibiliteten de gir. Mange flotte gjennomgangsartikler tilbyr historisk utdanning og fremtidige perspektiver på teknologien34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
En typisk cellefri reaksjon består av tre hovedkomponenter: celleekstrakt, energimiks og genetisk mal. Aktiv celle ekstrakt inneholder alle nødvendige maskiner for transkripsjon og oversettelse (TXTL) og kan behandles på en rekke måter36. Glykolytiske mellomprodukter, elektrolytter, aminosyrer og kofaktorer i energimiksen støtter TXTL-prosessen. Det er en viktig kilde til variasjon i cellefrie eksperimenter45 og kan tilberedes på mange måter34,46. Utarbeidelse av den genetiske malen har sett færre forbedringer siden tradisjonelle kloningsmetoder resulterer i plasmider med gode uttrykksegenskaper. Ulempen med disse tradisjonelle metodene er behandlingstiden og mengden biologisk kompetanse som trengs for å konstruere og forplante dem. Nylig optimalisering innsats har resultert i enkle 24-timers arbeidsflyter for celle ekstrakt forberedelse47,48 som kan utføres parallelt med energi blanding forberedelse49,50. Tradisjonell kloning legger imidlertid til flere dager på CFE-prototypingstidslinjen (Tabell 1)23. Raskt forsterkede PCR-produkter fra det kommersielle genfragmentet kan brukes direkte51, men dette begrenser antall prototypingseksperimenter da bare 1 μg DNA produseres, noe som tilsvarer omtrent fem reaksjoner (tradisjonelle 15 μL volumer). Med disse ekstra trinnene for sirkularisering og isotermisk forsterkning er det mulig å få større enn milligram mengder DNA (~5000 reaksjoner for 1 mg). Dette øker dramatisk antall tester som kan gjøres i høy gjennomstrømningsscreening av proteiner eller kombinatoriske enzymnettverk (cellefri metabolsk engineering); Det gir også mulighet for effektiv bevaring av det lineære malbiblioteket som dna med høy konsentrasjon. Videre vil en økt mengde mal være nødvendig for å prototype større mengder protein som trengs for materialvitenskapelige applikasjoner (proteinbaserte fibre og hydrogeler). Noen begrensninger ved lineære maler kan overvinnes ved å bruke et utdrag fra BL21 DE3 Star eller bruke nylig oppdagede metoder for å beskytte lineære maler mot nedbrytning52,53,54. Dette tar imidlertid ikke for seg å ha begrensede lagre av leverandørprodusert DNA for PCR-forsterkning eller spørsmålet om biologisk ekspertise og utstyr som trengs for kloning.
Dette arbeidet presenterer en protokoll som er eksplisitt utformet for å øke mengden uttrykksmal som kan hentes fra små mengder leverandørproduserte genfragmenter (vanligvis 500-1000 ng lyofilisert pulver). Den beskrevne metoden krever ikke ferdighetene som er nødvendige for å utføre tradisjonell kloning i plasmider eller transformere og forplante seg i levende celler. Når en bruker mottar et genfragment i posten, kan han eller hun produsere nok maler for mange cellefrie reaksjoner ved å bruke isotermisk rullesirkelforsterkning (RCA) (figur 1)23. Selv om mengden DNA mottatt fra leverandøren kan være nok for begrenset screeninginnsats, blir den raskt utarmet, og gjenbruk av genfragmenter er tidkrevende og kostbart. Metoden er også spesielt godt egnet for gener som er giftige og vanskelige å klone i E. coli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Designe genfragmentet
MERK: Genfragmentet skal ha alle nødvendige genetiske elementer for transkripsjon/oversettelse, inkludert promotor, ribosombindingssted (RBS), start codon, genet av interesse og terminator. Selv om terminatoren ikke er nødvendig for en lineær uttrykksmal (LET), vil det være viktig hvis brukeren bestemmer seg for å sette inn sekvensen i en plasmid. Disse sekvensene ble løftet fra pJL1-sfGFP plasmid55 (gave fra Michael Jewetts laboratorium), som bruker en T7-promotør. I tillegg til disse nødvendige genetiske elementene, legges et begrensningsenzymkuttsted til seks basepar før promotoren (5' kuttsted) og ytterligere seks basepar etter terminatoren (3' kuttet sted), i dette tilfellet ved hjelp av HindIII (andre begrensningsenzymer kan brukes, men det er nyttig å standardisere sekvensene med ett høygjengivelsesbegrensningsenzym for å redusere antallet som trengs for å holde i biblioteket). Primer-nettsteder legges til ti basispar oppstrøms for 5's cut site og ti basepar nedstrøms for 3 'cut site, i dette tilfellet ved hjelp av standardiserte M13 primer sekvenser (primere er billige lagervarer). Begrensningen enzym sted og primere som brukes er etter brukerens skjønn. Brukeren må imidlertid sørge for at sekvensene ikke finnes andre steder i malen (ikke ønsker å opprette uønskede kutt eller områder for forsterkningsstart). Sekvensene for malene som brukes i dette arbeidet, er beskrevet i tilleggsmaterialet. Disse trinnene brukes til å endre fra denne basismalen.
- Bestem ønsket gen som skal uttrykkes og oppnå aminosyresekvensen eller den genetiske sekvensen hvis den har blitt uttrykt i E. coli.
- Hvis det er en aminosyresekvens, utfører du kodonoptimalisering for E. coli ved hjelp av ett av mange standard leverandørverktøy56. Hvis du bruker malen i tillegget, må du kontrollere at den optimaliserte sekvensen ikke har noen HindIII-begrensningsområder (AAGCTT). I tilfelle det gjør det, fortsett å optimalisere sekvensen til det ikke lenger er et hindiII-nettsted.
- Kopier sekvensen og lim den inn i den angitte malen for tilleggssekvens #1 der genet av interesse er angitt. Hvis du uttrykker sfGFP, bruker du tilleggssekvens #1 som den er. Hvis du uttrykker subtilisin, bruk Tilleggssekvens #2 som den er.
- Bestill den minimale malen og de nødvendige primerne fra den foretrukne DNA-syntesetjenesten.
2. Resuspending av genfragmentet og primerne
MERK: Ved mottak av genfragmentet, følg produsentens protokoller for resuspension eller bruk denne enkle guiden for å lage et DNA-lager.
- Sentrifuger røret (300 x g i 5 s) for å samle DNA-pelletsen nederst.
- Tilsett dobbelt destillert vann (ddH2O) for å lage en endelig konsentrasjon på 10 ng/μL DNA-mal.
- Virvel løsningen på en middels innstilling for 5-10 s.
- Løs opp hele pelletsen ved å inkubere ved 50 °C i 20 minutter.
- Kort virvel igjen
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 s for å samle løsningen nederst på røret.
- Oppbevars ved -20 °C eller brukes i PCR.
- Forbered en 100 μM primer lager ved å resuspendere primerne i nukleasefritt vann. For å bestemme mengden vann som skal tilsettes, multipliser antall nanomoler av lyofilisert primer med 10. For eksempel, hvis røret inneholder 45 nM lyofilisert primer, tilsett 450 μL ddH2O og virvel løsningen.
- Oppbevar primerlagerløsningene ved -20 °C eller fortsett å utføre forsterkningen.
3. Forsterke genfragmentet via PCR
MERK: Bestem hvilket PCR-sett som er riktig for genet av interesse. Mindre gener (< 1000 kb) kan være mer mottagelige for en billigere Taq-polymerase, mens større gener (≥ 1000 kb) kan dra nytte av høy troskapspolymerase for å redusere feil. Det er viktig å merke seg at denne første PCR-forsterkningen ikke er nødvendig hvis brukeren ikke er opptatt av å bevare det første genfragmentet (Det gir flere forsøk på sirkularisering og tillater komparative studier av LET vs. RCA-produkt). Det er også viktig å merke seg at denne PCR forsterkede LET kan brukes direkte i reaksjoner; Som nevnt i innledningen, ville det imidlertid bare tillate et begrenset antall reaksjoner hvis de videre forsterkningstrinnene ble ignorert. Fordøyelse og ligasjon kan utføres på det gjenbrukte genfragmentet direkte57 (hvis man er sikker, trenger de ikke mer LET for å utføre ytterligere sirkulariseringsbestander). Hvis dette er tilfellet, hopper du over avsnitt 3 og fortsetter til avsnitt 4. Følg denne fremgangsmåten for å utføre PCR.
- Bruk 100 μM-lagrene fra trinn 2.8 for å lage 10 μM arbeidsløsninger. Mange PCR-settprotokoller krever 10 μM-løsninger av primere.
- Programmer den termiske syklisten til å utføre reaksjonen i henhold til settprodusentens protokoller. Ulike sett krever litt varierte sykkelparametere. For settet som er oppført i materialtabellen, er forholdene 94 °C for 30 s første denaturering; 30 sykluser på 94 °C i 30 s denaturering, 45 °C for 30 s primer annealing og 68 °C for 60 s forlengelse; med en endelig forlengelse ved 68 °C i 5 minutter; og til slutt en 10 °C ubestemt hold.
- Sørg for å velge riktig forlengelsestid (variabel avhengig av lengden på genet som skal forsterkes). Ha en forlengelsestid på 1 min for hver 1000 bp.
- Pass på at du angir riktig glødetemperatur for primerne. Bruk en online Tm-kalkulator som bruker begge primerne som innganger for å bestemme den beste glødetemperaturen58. En glødetemperatur på 45 °C er tilstrekkelig ved bruk av M13 primere.
- Når du bestemmer antall sykluser, se produsentens protokoll, men 30 sykluser vil oftest resultere i tilstrekkelig forsterkning.
- Hvis du utfører PCR, tiner og virveler dNTPene. Bruk PCR-bufferen som følger med i settet.
- I et enkelt PCR-rør kombinerer du alle settkomponentene som anvist i produsentens protokoll. For å sikre vellykket forsterkning, tilsett 1 μL resuspendert DNA-lager (trinn 2.6).
- Homogeniser blandingen forsiktig ved å virvelere på middels innstilling i 5-10 s. Alternativt pipette halvparten av volumet opp og ned 10-20 ganger til virvel.
- Utfør PCR-reaksjonen.
- Hvis PCR-protokollen ikke inkluderte et siste kjøletrinn, la reaksjonen avkjøles i 5 minutter ved 10 °C før du fjerner for å drive kondens til bunnen av røret.
- Rens reaksjonen ved hjelp av et PCR-oppryddingssett ved å følge leverandørens instruksjoner.
- I et 1,5 ml rør legger du til DNA-bindingsbuffer og PCR-prøve med et forhold på henholdsvis 5:1.
- Overfør denne blandingen til spinnkolonnen og sentrifugen ved 16.000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 200 μL DNA-vaskebuffer i kolonnen og inkuber ved romtemperatur i 1 min.
- Sentrifuge i 1 min ved 16 000 x g og kast gjennomstrømningen.
- Gjenta trinn 2.8.3 og 2.8.4 uten 1 min inkubasjonstrinn.
- Sentrifuge i ytterligere 1-2 min ved 16 000 x g for å fjerne eventuell gjenværende buffer.
- Elute DNA i 46 μL ddH2O.
- Kvantifisere det rensede DNA-et ved hjelp av et spektrofotometer.
- Oppbevar det rensede DNA-et ved -20 °C eller gå videre til neste trinn.
4. Fordøyelse og sirkularisering
MERK: Ytterligere forsterkning kan oppnås ved å sirkularisere DNA etterfulgt av RCA. Fordøy DNA-et for å klargjøre malen for sirkularisering. Dette vil fjerne primersekvensene og skape klebrige ender i både 5' og 3' enden av malen. Fest disse endene på nytt via ligasjonsreaksjon.
- I et PCR-rør kombinerer du 5 μL av den nødvendige bufferen, 20 U hindIII og 45 μL av det rensede DNA-et fra trinn 3.8.
- Homogeniser forsiktig denne blandingen med en pipette.
- Inkuber blandingen i en termisk syklist i 15 min ved 37 °C.
- Varm opp hindIII ved å inkubere i 20 min ved 80 °C.
- La reaksjonen avkjøles til 10 °C før du fjerner for å drive kondens til bunnen av røret.
- Tilsett 5 μL T4-ligasebuffer og 800 U T4-ligaer til det nylig fordøyde DNA-et.
- Bruk T7 ligase, om ønskelig.
- Homogeniser forsiktig denne blandingen med en pipette.
- Inkuber blandingen i 1 time ved 25 °C for å utføre sirkulariseringsreaksjonen.
- Rens reaksjonen ved hjelp av et PCR-oppryddingssett ved å følge leverandørens instruksjoner. Bruk den samme protokollen som er beskrevet i trinn 3.8.
- Kvantifisere DNA-et ved hjelp av et spektrofotometer. De forventede verdiene er ~20 ng/μL.
- Oppbevars ved -20 °C eller går videre til neste trinn.
5. Isotermisk rullesirkelforsterkning
MERK: Rolling Circle-forsterkningen (RCA) kan utføres med et kommersielt sett eller med individuelt kjøpte komponenter. Å følge produsentens protokoll vil sikre en vellykket forsterkning. Sett inneholder vanligvis en prøvebuffer, reaksjonsbuffer og trådforskyvningspolymerase, for eksempel φ29 polymerase. Flere reaksjonsrør kan kombineres for å produsere en stor mengde DNA for cellefritt uttrykk (4 μg fra 20 pg startmateriale). Følgende protokoll fungerer effektivt.
- I et enkelt rør kombinerer du 20 μL av prøvebufferen, 20 μL av reaksjonsbufferen, 0,8 μL av enzymet og 1 μL av den sirkulære uttrykksmalen (CET) fra trinn 4.9.
MERK: Dette vil ha en total DNA-masse på ~ 20 ng, men RCA kan jobbe med picogrammengder, og dermed tillate fortynning av CET og ekstrem enzymatisk forsterkning hvis det er et betydelig behov for materiale i den høye gjennomstrømningsscreeningen. - Homogeniser blandingen med en pipette og aliquot 10 μL av blandingen i fire separate rør.
- Inkuber ved 30 °C i 4-18 timer.
- Varm opp enzymet ved å inkubere ved 65 °C i 10 minutter. Reduser temperaturen til 12 °C i 5 minutter for å oppmuntre til kondens nederst på røret.
MERK: Det er enklest å kombinere alle temperaturtrinn i en automatisert protokoll på en termisk syklist. - Fortynn den resulterende løsningen ved å tilsette 15 μL ddH2O til hvert rør.
- Kombiner alle rør og legg direkte til en cellefri reaksjon.
- Bruk eventuelt et PCR-oppryddingssett til å rense produktet og unngå det i 36 μL ddH2O for å kvantifisere. Kontroller at malkonsentrasjonen er ~100 ng/μL.
6. Cellefri reaksjon
MERK: Utfør cellefritt uttrykk ved å kombinere energibuffer, ekstrakt og RCA-mal. En typisk cellefri reaksjon ved hjelp av PANOx-SP-energibufferen består av 1,2 mM ATP, 0,85 mM hver av GMP, UMP, og CMP, 30 mM fosfoenolpyruvat, 130 mM kaliumglutamat, 10 mM ammoniumglutamat, 12 mM magnesiumglutamat, 1,5 mM spermidin, 1 mM putrescine, 34 μg/ml folinsyre, 171 μg/ml E. coli 2 mM hver av 20 umerkede aminosyrer, 0,33 mM NAD, 0,27 mM Koenzym A (CoA), 4 mM kaliumoksalat, 57 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24% volum av E. coli-ekstraktet og variable mengder DNA23,49. Reaksjonsvolumet kan variere, men 15 μL reaksjoner kan spare på reagensbruk og er små nok til bruk i en 384 svartvegget mikroplate49,50.
- Hvis du uttrykker et fluorescerende protein som sfGFP, klargjør du en plateleser for å lese ved ønsket eksitasjon / utslipp, temperatur og agitasjon.
- Ved bruk av en 384-brønnsplate, aliquot 60 μL H2O i brønnene som grenser til en tom prøvebrønn for å opprettholde fuktighet og redusere kanteffekten.
- Legg de forskjellige nødvendige komponentene i et rør for hver prøve. Legg til nok til å utføre triplikater. Replikeringer i platen kan bidra til å identifisere årsaker til variasjon.
- Tilsett ekstraktet, energibufferen og deretter DNA-et.
- Fortynn til det endelige ønskede volumet med ddH2O.
- Bland denne løsningen grundig ved å pipettere halvparten av løsningsvolumet opp og ned 10-20 ganger.
- Overfør reaksjonsblandingen i 15 μL aliquots til de ønskede brønnene i mikrotiterplaten.
- Forsegle platen med en fargeløs tetningsfilm for å opprettholde fuktighet og forhindre fordampning.
- Plasser den forseglede platen i plateleseren og la reaksjonen fullføres.
- Hvis du uttrykker et protein som ikke har evnen til å bli overvåket live, bruk et annet temperaturkontrollert apparat som en termoblokk for å inkubere platen.
7. Subtilisin analyse
MERK: Hvis du uttrykker subtilisin BPN'-genet (SBT(n)) i tilleggssekvens #2, følger du denne protokollen for å analysen av aktiviteten.
- Forbered en 10 μM lagerløsning av N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilid i dimetylformamid (DMF).
- Still inn en plateleser for å måle absorbans ved 410 nm hver 20 s i 10 minutter mens du opprettholder en temperatur på 25 °C.
- I en flat bunn, fargeløs 96-brønnsplate, aliquot 94 μL ddH2O og 1 μL N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilid fra trinn 7.1.
- Tilsett 5 μL av den ferdige cellefrie reaksjonen fra trinn 6.7 og les ved hjelp av en plateleser satt til protokollen som er beskrevet i trinn 7.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttrykk for sfGFP fra RCA-maler var sammenlignbart med pJL1-plasmidet ved bruk av bare 0,30 μL unyttifisert RCA DNA i en 15 μL reaksjon (Figur 2A). Faktisk ser det ut til at dobling og tredobling av malmengden ikke gir noen fordel i BL21 DE3 Star-ekstrakt, noe som tyder på allerede mettede nivåer av malen på 0,30 μL per reaksjon. Omvendt ser det ut til å være en fordel å øke mengden RCA-mal når den legges til celleekstrakt hentet fra SHuffle-stammen (Figur 2B)28. For noen proteiner kan resultatene observeres veldig raskt, noe som komprimerer hele arbeidsflyten (forsterkning og analyse) til under 24 timer. Noen proteiner krever imidlertid lavere temperatur eller har langsommere foldetider, noe som vil øke tiden til resultatene er oppnådd, men vil påvirke arbeidsflyten som presenteres her. Dette kan observeres når du uttrykker subtilisin (SBT(n)) der analysen etter 4 timers uttrykk ikke var lang nok for SBT(n) modning (Figur 3A, eksempel på et mislykket resultat). Hvis du lar reaksjonen fortsette til 16 timer, kan det føre til påvisbare nivåer av SBT(n) (figur 3B). Denne forbedringen kan være temperaturavhengig, som observert i litteraturen der optimaliserte temperaturforhold ble utforsket59,60.
Figur 1: Et representativt skjema for den minimale genetiske malen og prosessen den gjennomgår etter det første PCR-forsterkningstrinnet. Malene fordøyes med HindIII, sirkulariseres med T4-ligaer, og forsterkes ytterligere med φ29 polymerase for å skape store concatemers. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Resultater av cellefrie reaksjoner med unyttifisert 5 nM plasmid (pJL1), 5 nM lineær mal (LET) og varierende konsentrasjoner av uoppgjort RCA. RCA #1, #2 og #3 inneholdt henholdsvis 0,3 μL, 0,6 μL og 0,9 μL (henholdsvis) uoppgjort RCA-produkt i en 15 μL reaksjon inkubert ved 30 °C (n = 3). Feilfelt representerer ± 1 SD fra gjennomsnittet. Y-aksen er fluorescens, og x-aksen er tiden som har gått under reaksjonen. Kinetikken til sfGFP-uttrykket er representert i (A) BL21 DE3 Star og (B) T7 SHuffle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cellefrie reaksjoner med 5 nM SBT(n) LET og varierende konsentrasjoner av uoverensifisert RCA-produkt. RCA ng og pg tilsvarer konsentrasjonen av DNA som brukes til å utføre rullende sirkelforsterkning. Unyttifisert RCA-produkt ble brukt i en 15 μL reaksjon inkubert ved 30 °C (n = 3). Feilfelt representerer ± 1 SD fra gjennomsnittet. Y-aksen er absorbansen ved 410 nm, og x-aksen er tiden som har gått i analysen. Det ble utført reaksjoner for (A) 4 h og (B) 16 h. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kloning metode | |
| PCR | 2 -4 timer |
| Plasmid fordøyelse | 35 min |
| Ligation | 1 t |
| Transformasjon | 2 timer |
| Inkubasjon over natten | 16 timer |
| Sekvensering | 24 - 48 timer |
| Glyserol Lager Prep | 16 timer |
| Vekst og rensing | 16 timer |
| Total tid | 46 - 72 timer |
| RCA-metode | |
| PCR | 2 - 4 timer |
| Fordøyelse | 35 min |
| Ligation | 1 t |
| RCA | 4 - 18 timer |
| CFE | 4 - 16 timer |
| Total tid | 12 - 40 timer |
Tabell 1: En sammenligning av tidslinjen mellom en forenklet tradisjonell kloningsprotokoll og RCA-protokollen som dekkes her .
Tilleggsfil: Tilleggsfilen viser sekvensene. Sekvens #1 er sfGFP (999 basispar) og sekvens #2 er subtilisin BPN' (1344 bp). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genet av interesse kan være ethvert ønsket protein, men det er best å starte med et fluorescerende protein som en praktisk reporter for sanntids- eller sluttpunktavlesning på en brønnplateleser for nye adoptere av denne metoden. For nye proteinsekvenser, kopier aminosyresekvensen av ønsket protein og lim det inn i ønsket codonoptimaliseringsverktøy61,62. Det er vanligvis mange tilgjengelige organismer og stammer av E. coli i codonoptimaliseringsverktøyet, men å velge det generelle Escherichia coli-alternativet vil være egnet. Etter optimalisering dobbeltsjekker du genet for å sikre at det tidligere valgte kuttestedet og primersekvensene ikke er til stede. I så fall kan sekvensen optimaliseres til sekvensene ikke lenger er til stede. I noen situasjoner kan det være nødvendig å erstatte HindIII-kuttede nettsteder med et annet begrensningssted hvis gjentatt optimalisering konsekvent resulterer i et internt HindIII-kuttsted. Det er best å bruke samme kuttsted så ofte som mulig for å holde prosessen standardisert og redusere kostnadene ved å holde flere begrensningsenzymer tilgjengelig.
Før du begynner å forsterkninger, velger du PCR-settet som passer best til LET. En LET med < 1000 basepar kan forsterkes med en enkel Taq-polymerase, mens en LET med ≥ 1000 basepar kan kreve en polymerase med høyere gjengivelse63. Sett opp protokollen for forsterkning i henhold til kit produsenten og glødetemperaturen til de ønskede primerne. Glødetemperaturen er avgjørende for en vellykket forsterkning. En generell tommelfingerregel er å velge en glødetemperatur som er 5 °C lavere enn primernes Tm. Det er gratis online verktøy som vil gi en optimalisert glødetemperatur basert på sekvensen av primerne58. Å bruke riktig glødetemperatur er avgjørende for å produsere DNA-mal av høy kvalitet.
Cellefritt genuttrykk har sett en renessanse de siste årene på grunn av sin hastighet, enkelhet og nytte for syntetisk biologi prototyping. Dette arbeidet har skissert en metode for å øke hastigheten og enkelheten når du tester et stort bibliotek med nye, funksjonelle proteiner. Selv om tradisjonelle kloningsmetoder kan ta dager eller uker, kan denne protokollen gjøres på mindre enn 24 t. Tabell 1 skisserer typiske tidsintervaller for både tradisjonell kloning og RCA-protokollen. Vær oppmerksom på at kloningsprotokollen er forenklet, og noen valgfrie trinn er utelatt, for eksempel gelisolasjon. Tabell 1 refererer også bare til de vanlige begrensningsfordøyetidsprotokollene. det er mange andre kloningsmetoder, men disse krever en lignende tid. Det øvre området av denne enzymatiske forsterkningsprotokollen krever mindre tid enn det nedre området av kloningsmetoden, spesielt når du vurderer en 8-timers arbeidsdag. Dette skyldes i stor grad fjerning av overnatting inkubasjoner og mangel på sekvensering bekreftelse. RCA-protokollen er helt basert på PCR og RCA, som krever mindre spesialiserte ferdigheter enn tradisjonelle klonings-, transformasjons- og cellekulturteknikker. Denne metoden gjør cellefritt uttrykk tilgjengelig for laboratorier som ikke har tidligere erfaring med kloning eller tilgang til kapital som er nødvendig for å transformere og dyrke celler. Denne metoden er også godt egnet for prosjekter som fokuserer på cytotoksiske proteiner, hvor kloning og forplantning av genene med tradisjonell kloning er vanskelig på grunn av toksisitet i levende celle. Denne RCA-protokollen er også i stand til å forsterke svært små mengder sirkulært DNA (picograms of DNA) til nivåene som er nødvendige for CFE. I figur 3Bble den sirkulære SBT(n)-malen fortynnet til 20 ng/μL og 20 pg/uL før RCA. Mens de observerte nedbrytningshastighetene var forskjellige, resulterte begge reaksjonene i samme mengde substratforringelse innen 10 minutter. Den foreslåtte metoden er ikke ment å erstatte kloning; plasmidforplantning kan produsere mengder DNA for ikke-giftige gener som ikke kan matches. Snarere er dette et praktisk prototypingsverktøy i en massiv bibliotekscreeningsfase (enzymatiske trinn er egnet til automatisering med standard væskebehandling) som vil bidra til å identifisere hvilke sekvenser som skal klones for arkivering og videre forplantning.
Når du designer en cellefri reaksjon, er det mye fleksibilitet, men det er noen faktorer som må tas i betraktning for å sikre suksess. Mindre reaksjoner har et større forhold mellom overflate og volum, noe som er flott for gassutveksling, men reaksjonen må helt dekke bunnen av brønnen for nøyaktige fluorescensmålinger. Temperaturen på reaksjonen kan også variere avhengig av genet av interesse59. Det er flere valg for brukere når det gjelder valg av energibuffer34,46. Noen oppskrifter er dyrere enn andre, men beslutningen overlater seg til brukeren. Det er også mange potensielle kilder for E. coli extract36. Brukere bør gjøre seg kjent med produksjonsprotokoller for ekstrakter og bestemme hva som er best for deres formål28,48,50,64,65,66,67.
Når du bruker RCA til å forsterke maler for cellefritt uttrykk, er valget av bakteriestamme svært viktig. Uttrykksprofilen har en tendens til å være bedre enn for lysdioder. Den populære BL21 DE3 Star-stammen håndterer dette godt, med RCA som presterer ~ 1,4 ganger bedre enn LET og pJL1-plasmidet som presterer ~ 1,2 ganger bedre enn den beste RCA-konsentrasjonen (Figur 2A). På den annen side viser noen stammer malforringelse og fungerer dårlig på grunn av tilstedeværelsen av innfødte nukleaser23,28. I dette tilfellet ser det ut til at SHuffle-stammen drar nytte av en økt RCA-mal. Tidligere litteratur har vist at SHuffle ekstrakt ikke fungerer bra med PCR-produkter, men den høyeste konsentrasjonen av unyttifisert RCA-produkt som brukes i denne studien utkonkurrerte pJL1 plasmid (Figur 2B). Uttrykket av funksjonell SBT(n) (Figur 3) er et eksempel på et cytotoksisk protein som er praktisk laget av cellefritt, men vanskelig å prototype i levende celler på grunn av toksisitet (ute av stand til å klone denne uttrykksmalen i plasmid og forplante seg i E. coli). I motsetning til sfGFP kan ikke SBT(n)-aktivitet observeres etter bare 4 timer uttrykk (figur 3A). Signalet kan påviselig etter 16 timers uttrykk og modning (Figur 3B). Det uoppnavnede DNA-et som ble brukt i disse eksemplene kom fra 100 μL, som var fire 10 μL RCA-reaksjoner fortynnet og kombinert. Denne ene aksjen kan støtte 333 cellefrie reaksjoner hvis den bare bruker 0,30 μL per reaksjon.
Kompatibiliteten til RCA-maler med CFE må utforskes videre med forskjellige ekstrakter. Potensielle komplikasjoner med lineære produkter kan lindres ved å legge til korte oligos som inneholder E. coli chi-sekvensen eller GamS-proteinet52,53. Litteratur antyder at tilsetning av chi oligos kan gi større beskyttelse til lineære maler enn GamS-proteinet53. Hvis du bruker et ekstrakt som er kjent for å gi lave utbytter fra lineære maler, bør brukeren analysere kostnadene for hvert beskyttelsesmiddel og bruke det som passer best til deres formål. En annen begrensning er manglende evne til å konvertere RCA-malkonsentrasjoner til molaritet på grunn av arten av den resulterende concatemeren. Dette betyr at man kan legge til samme antall minimale maler basert på masse, men de vil ha varierende konatemerlengder, noe som kan påvirke uttrykksnivåene. Forfatterne har ikke funnet at dette er et problem i screening/prototyping, da de gjennomsnittlige uttrykksnivåene fra hver brønn er de samme (lav varians), men kan være et problem hvis de uttrykker seg i mindre volumer (f.eks. mikrodråper).
Cellefritt genuttrykk har potensial til å bli brukt som et betydelig verktøy i arbeidsflytene for proteinprototyping og design-build-test. Imidlertid er de fleste cellefrie uttrykksarbeidsflyter fortsatt avhengige av tradisjonelle plasmider som den genetiske malen. Dette bremser prosessen og holder cellefritt uttrykk fra å bli utnyttet i sin fulle grad for screening / prototypingsformål. Forsterkende maler og deretter utføre RCA kan raskt produsere nok genetiske maler for mange reaksjoner, produsere nok protein for nedstrøms karakterisering og funksjonell testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nigel Reuel sitter i det vitenskapelige rådgivende styret i BigHat Biosciences Inc., et selskap som bruker cellefrie systemer for utforming av antistoffer.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner NIH 1R35GM138265-01 og NSF 2029532 for delvis støtte til dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alaline | Formedium | DOC0102 | |
| Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
| Arginine | Formedium | DOC0106 | |
| Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
| Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
| CMP | Sigma | C1006 | |
| Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
| Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
| DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
| Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
| Gene Fragment | IDT | ||
| Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
| Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
| Glycine | Formedium | DOC0138 | |
| GMP | Sigma | G8377 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HindIII-HF | NEB | R3104L | |
| Histidine | Formedium | DOC0142 | |
| Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
| Leucine | Formedium | DOC0154 | |
| Lysine | Formedium | DOC0158 | |
| Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
| Methionine | Formedium | DOC0166 | |
| Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
| Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
| Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
| NAD | Sigma | N8535 | |
| NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
| PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
| Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
| Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
| Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
| Proline | Formedium | DOC0174 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Serine | Formedium | DOC0178 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
| TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
| Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
| Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
| Threonine | Formedium | DOC0182 | |
| Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
| Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
| UMP | Sigma | U6375 | |
| Valine | Formedium | DOC0194 |
References
- Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), Oxford, England. (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
- Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
- Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
- Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
- Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
- Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
- Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
- Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
- Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
- Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
- Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
- Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
- Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
- Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
- Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
- Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
- Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
- Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
- Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
- Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
- Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
- Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Addgene: pJL1. , Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021).
- IDT Codon Optimization Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021).
- Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
- New England Biolabs Tm Calculator. , Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
- Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
- Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
- Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
- Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).
