Summary

토끼 모델의 절연 폐 관류 시스템

Published: July 15, 2021
doi:

Summary

고립 된 토끼 폐 제제는 폐 연구에서 금 표준 도구입니다. 이 간행물은 기도 반응성, 폐 보존 및 폐 이식 및 폐 부종의 전임상 연구에 관여하는 생리적 및 병리학 적 메커니즘의 연구를 위해 개발 된 기술을 설명하는 것을 목표로합니다.

Abstract

고립 된 폐 관류 시스템은 폐 연구에서 널리 사용되어 미세 및 거시적으로 폐의 내부 작동을 해명하는 데 기여했습니다. 이 기술은 순환 물질 과 흡입 또는 perfused 물질의 효과 사이의 상호 작용을 포함하여 대사 활동 과 호흡 기능을 측정하여 폐 생리학 및 병리학의 특성화에 유용합니다. 시험관 내 방법은 조직의 슬라이스 및 배양을 포함하지만, 고립 된 전 생체 폐 관류 시스템은 환기 및 관류를 재현하면서 지속적인 생리 적 기능의 연구를 가능하게하는 완전한 기능성 기관과 함께 작동 할 수 있습니다. 그러나 중앙 내분과 림프 배수의 부재의 효과는 여전히 완전히 평가되어야한다는 점에 유의해야합니다. 이 프로토콜은 실험 실험실 동물로부터 폐와 심장의 수술 추출 및 캐니언화에 이어 분리된 폐 장치의 조립을 설명하고 데이터의 관류 기술 및 신호 처리를 표시하는 것을 목표로 합니다. 격리된 폐의 평균 생존가능성은 5-8h 사이입니다. 이 기간 동안 폐 모세관 투과성이 증가하여 부종과 폐 손상을 유발합니다. 보존된 폐 조직의 기능은 시간이 지남에 따라 폐 부종의 정도를 결정하는 데 사용되는 모세관 여과 계수(Kfc)에 의해 측정됩니다.

Introduction

브로디와 딕슨은 1903 전 생체폐 관류 시스템을 처음 설명했다. 그 이후로 폐의 생리학, 약리학, 독성학 및 생화학을 연구하기위한 금 표준 도구가되었습니다2,3. 이 기술은 폐 이식의 생존가능성을 평가하고 히스타민, 아라키도니아산 대사산물 및 물질 P와 같은 염증 성 중재자의 효과뿐만 아니라 기관지 수축, 천자 수축 및 폐 적 부종과 같은 폐 현상 동안의 상호 작용을 결정하는 일관되고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 고립 된 폐 시스템은 일반 순환에서 생물 발생 아민의 제거에 폐의 중요한 역할을 공개하는 중요한 기술이었다4,5. 또한, 시스템은 폐 계면 활성제6의 생화학을 평가하는 데 사용되었습니다6. 지난 수십 년 동안, 전 생체 폐 관류 시스템은 폐 이식 연구를위한 이상적인 플랫폼이되었다7. 2001년 Stig Steen의 한 팀은 19세 기증자의 폐를 재조정하기 위해 이 시스템을 사용하여 전 생체 폐 관류 시스템의 첫 임상 적용을 설명했는데, 이 기구는 부상으로 인해 이식 센터에 의해 처음 거부되었습니다. 왼쪽 폐는 65분 동안 수확되고 퍼프되었습니다. 그 후, 그것은 성공적으로 COPD8와 70 세의 남자로 이식되었다. 전 생체 내 관류를 사용하여 폐 재조절에 대한 추가 연구는 부상당한 기증자 폐9,10을 평가하고 치료하기 위해 확장 된 폐 관류를위한 토론토 기술을 개발하도록 주도했습니다. 임상적으로, 전 생체 폐 관류 시스템은 표준 기준 기증자10에 대하여 위험 또는 결과에 있는 중요한 다름을 제시하고, 취급하고 표준 표준 기증자 폐를 재조정하여 기증자 풀을 증가하는 안전한 전략인 것을 보여주었습니다.

고립 된 폐 관류 시스템의 주요 장점은 실험 파라미터가 인공 실험실 설정에서 생리 적 기능을 보존하는 완전한 기능성 기관에서 평가 될 수 있다는 것입니다. 더욱이, 폐 기계 환기의 측정 및 조작을 통해 기도 저항, 총 혈관 저항, 가스 교환 및 부종 형성과 같은 폐 생리학의 구성 요소를 분석할 수 있으며, 이는 현재까지 실험실 동물에 대한 생체 내에서 정확하게 측정할 수 없다2. 특히, 폐가 침투되는 용액의 조성은 완전히 조절될 수 있으며, 추가 연구를 위해 관류로부터 실시간으로 그 효과를 평가하고 샘플 수집을 할 수 있게 한다11. 고립 된 폐 시스템으로 일하는 연구원은 기계적 환기가 폐 조직의 붕괴를 유발하여 유용한 시간을 단축한다는 것을 명심해야합니다. 기계적 파라미터의 이러한 점진적 낙하는 실험4의 시간 동안 때때로 폐를 과열하여 현저하게 지연될 수 있다. 여전히, 준비는 일반적으로 8 시간 이상 지속될 수 없습니다. 전 생체 폐 관류 시스템에 대한 또 다른 고려 사항은 중추 신경계 조절 및 림프 배수의 부재입니다. 그들의 부재의 효력은 아직 완전히 이해되지 않으며 잠재적으로 특정 실험에 있는 편견의 근원이 될 수 있습니다.

고립 된 폐 관류 시스템 기술은 높은 수준의 일관성과 재현성을 가진 토끼 모델에서 수행 될 수있다. 이 작품은 멕시코 시티의 인스티투토 나시오날 드 엔페르메다데스 호흡증에서 토끼 모델을 위해 개발된 전 생체 내 외 외 폐 관류 기술의 구현을 위한 기술적 및 외과 적 절차를 설명하고, 통찰력을 공유하고이 실험 모델의 적용에 중요한 단계에 대한 명확한 가이드를 제공하려고합니다.

Protocol

토끼 모델의 고립 된 관류 시스템은 Instituto Nacional 드 Enfermedades 호흡증선의 기관지 과잉 반응 연구소에서 널리 사용되었습니다. 이 프로토콜에는 대략 무게가 2.5-3kg인 뉴질랜드 토끼가 포함됩니다. 모든 동물은 실험실 동물에 대한 공식 멕시코 지침 (NOM 062-ZOO-1999)과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (8 판, 2011)에 따라 표준 vivarium 조건 및 광고 리비툼 공급에 보관되었습니?…

Representative Results

고립 된 폐 관류 시스템은 생검에 대한 장기 조작, 관류에서 샘플 수집 및 생리 적 매개 변수의 실시간 데이터 수집을 허용합니다. 고립 된 시스템은 다른 기능과 폐 현상을 포함 하는 많은 가설을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다., 신진 대사와 효소 활동에서 부 종 형성 및 폐 이식에 대 한 보존 기간. 도 1은 환기 시스템 및 계산된 데이터 수집과 함께…

Discussion

이 연구는 폐 생리학 연구에서 필수적인 기술인 고립된 폐 관류 시스템의 일반적인 견해를 표시합니다. 고립 된 폐 관류 시스템은 그것의 사용에 있는 다재다능성의 큰 정도를 제공하고 가설의 넓은 범위의 시험에서 관련있는 몇몇 매개변수의 평가를 허용합니다15. 고립 된 폐 시스템은 지난 10 년 동안 장기 별 평가를위한 관련성을 더욱 확립하고 중년 줄기 세포16</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 이 원고를 쓰는 베티나 소머 세르반테스 박사와 키치아 엘레나 라라 사폰트가 일러스트레이션을 지원해 준 것에 대해 감사를 표하고 싶습니다.

Materials

2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder sigma 3912 500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O. JT Baker 10035-04-8
Cryogenic vials Corning 430659 2 mL
D-glucosa, C6H12O6. sigma G5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC grade Caledon
Falcon tubes 14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range Hugo Sachs Elektronik (HSE) 59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz Hugo Sachs Elektronik (HSE) 59-9703
Heparin PISA 5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U) Alltech 98121213 150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe Filter Millex SLLGR04NL 4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O JT Baker 10034-99-8
Microcentrifuge Tube Corning 430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium) PISA Q-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7 Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter Module Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-1755
Potassium chloride, KCl. JT Baker 3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 JT Baker 7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate) PISA Q-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCP Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-2806
Snap Cap Microcentrifuge Tube Costar 3620 1.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3 sigma S6014
Sodium chloride, NaCl. sigma S9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubes Masterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm Hugo Sachs Elektronik (HSE) 73-4163

References

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Cite This Article
Pacheco-Baltazar, A., Arreola-Ramírez, J. L., Alquicira-Mireles, J., Segura-Medina, P. Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model. J. Vis. Exp. (173), e62734, doi:10.3791/62734 (2021).

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