Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Yetişkin Zebra Balığı Kullanarak Öğrenme ve Bellek Çalışmalarında Bilişsel Değerlendirme için İlişkisel Bir Öğrenme Aracı Olarak Mekik Kutusu Tahlil

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62745
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

Summary

Öğrenme ve hafıza, gelişimsel, hastalığa bağımlı veya çevresel olarak indüklenen bilişsel bozuklukların incelenmesinde güçlü metriklerdir. Bilişsel değerlendirmelerin çoğu özel ekipman ve kapsamlı zaman taahhütleri gerektirir. Bununla birlikte, mekik kutusu tahlili, yetişkin zebra balığı bilişinin hızlı ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi için geleneksel bir jel kutusu kullanan ilişkilendirilebilir bir öğrenme aracıdır.

Abstract

Öğrenme ve hafıza bozukluğu da dahil olmak üzere bilişsel eksiklikler, çeşitli gelişimsel ve yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların ve travmatik beyin hasarının (TBI) birincil belirtisidir. Zebra balığı, gelişim sırasındaki şeffaflığı ve nörotrauma sonrasındaki sağlam rejeneratif yetenekleri nedeniyle önemli bir sinirbilim modelidir. Zebra balıklarında çeşitli bilişsel testler mevcut olsa da, hızlı olan bilişsel değerlendirmelerin çoğu ilişkisel olmayan öğrenmeyi inceler. Aynı zamanda, ilişkilendirilebilir öğrenme tahlilleri genellikle birden fazla gün veya hafta gerektirir. Burada, olumsuz bir uyaran (elektrik çarpması) kullanan ve minimum hazırlık süresi gerektiren hızlı bir ilişkilendirilebilir öğrenme testini açıklıyoruz. Burada sunulan mekik kutusu tahlilleri basittir, acemi araştırmacılar için idealdir ve minimum ekipman gerektirir. TBI'dan sonra, bu mekik kutusu testinin bilişsel eksikliği ve genç zebra balıklarından yaşlı zebra balıklarına iyileşmeyi tekrar tekrar değerlendirdiğini gösteriyoruz. Ayrıca, test anında veya gecikmiş belleği incelemek için uyarlanabilir. Hem tek bir TBI hem de tekrarlanan TBI olaylarının öğrenmeyi ve anında hafızayı olumsuz etkilediğini, ancak gecikmeli belleği etkilemediğini gösteriyoruz. Bu nedenle, mekik kutusunun tahlilinin bilişsel bozukluğun ilerlemesini ve iyileşmesini tekrar tekrar izlediği sonucuna varıyoruz.

Introduction

Öğrenme ve hafıza rutin olarak yaşlanma, nörodejeneratif hastalık veya yaralanma nedeniyle meydana gelen bilişsel bozukluk ölçümleri olarak kullanılır. Travmatik beyin yaralanmaları (DTİ'ler) bilişsel eksikliklerle sonuçlanan en yaygın yaralanmadır. TBİ'ler, frontotemporal demans ve Parkinson hastalığı1,2gibi çeşitli nörodejeneratif bozukluklarla ilişkileri nedeniyle artan bir endişe kaynağıdır. Ek olarak, bazı TBI hastalarında gözlenen artan beta-amiloid toplamaları, Alzheimer hastalığının gelişimi ile de ilişkili olabileceğini göstermektedir3,4. TBI'ler genellikle künt cisim travmasının sonucudur ve bir dizi şiddete yayılır5Hafif beyin yaralanmaları (miTBI) en yaygın olanıdır. Bununla birlikte, miTBI'ler genellikle rapor edilmemiş ve yanlış teşhis edilir, çünkü sadece kısa bir süre için küçük bilişsel bozukluklara neden olurlar ve yaralı bireyler genellikle tamamen iyileşir6. Buna karşılık, tekrarlanan miTBI olayları, genç ve orta yaşlı yetişkinlerde oldukça yaygın olduğu, zamanla birikebileceği için artan bir endişe olmuştur7, bilişsel gelişimi bozabilir ve nörodejeneratif hastalıkları şiddetlendirebilir1,2,3,4,5, orta veya şiddetli bir TBI yaşayan bireylere benzer8.

Zebra balığı (Danio rerio) nörobilimde, merkezi sinir sistemi boyunca kayıp veya hasarlı nöronları yenileme yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli konuları keşfetmek için yararlı bir modeldir9, 10,11,12,13. Sırt-iç bölgedeki arkipalumu içeren teleensefalonda da nöral rejenerasyon gösterilmiştir. Bu nöroanatomik bölge hipokampusa benzer ve muhtemelen balıklarda biliş ve insanlarda kısa süreli hafıza için gereklidir14,15,16. Ayrıca, zebra balığı davranışı kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş ve kataloglanmıştır17. Öğrenme, kısa bloklar halinde ve hızlı çürüme süresine dikkat ederek hızlı bir ilişkisel olmayan öğrenme biçimini temsil edebilecek18ürkünç yanıta alışkanlık da dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle çalışılmıştır19. T kutuları, artı labirentler ve görsel ayrımcılık20 , 21 gibi ilişkilendirilebilir öğrenmenin daha karmaşık testleri kullanılır, ancak genellikle zaman alıcıdır, günler veya haftalar süren hazırlık gerektirir ve sürü veya pozitif takviyeye dayanır. Burada, hem ilişkilendirilebilir öğrenmeyi hem de anında veya gecikmiş belleği değerlendirmek için hızlı bir paradigmayı açıklıyoruz. Bu mekik kutusu tahlilleri, künt kuvvet TBI'dan sonra bilişsel açıkları ve iyileşmeyi değerlendirmek için averatif bir uyaran ve negatif takviye şartlandırması kullanır. Hasarsız kontrol yetişkin zebra balıklarının (8-24 ay) mekik kutusundaki 20 denemede (<20 dakikalık değerlendirme) kırmızı ışıktan kaçınmayı tekrar tekrar öğrendiğini ve gözlemciler arasında yüksek derecede tutarlılık gösterdiğini gösteriyoruz. Ek olarak, mekik kutusunu kullanarak, yetişkin (8-24 aylık) genelinde öğrenme ve hafıza yeteneklerinin tutarlı olduğunu ve farklı TBI önemleri veya tekrarlanan TBI arasında önemli bozukluklarla bilişi test etmek için yararlı olduğunu gösteriyoruz. Ayrıca, bu yöntem, yetişkin zebra balıklarında bilişin sürdürülmesini veya kurtarılmasını etkileyen çok çeşitli hastalık ilerlemelerini veya ilaç müdahalelerinin etkinliğini izlemek için bir metrik olarak hızla kullanılabilir.

Burada, hem karmaşık ilişkilendirilebilir öğrenmeyi (bölüm 1) hem de belleği hem anında hem de gecikmiş bellek açısından inceleyebilen hızlı bir bilişsel değerlendirmeye öğretimsel bir genel bakış sunuyoruz. Bu paradigma, öğrenilen bir ilişkilendirilebilir bilişsel görevin kısa ve uzun vadeli hafızasının değerlendirilmesini sağlar (bölüm 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebra balıkları, Freimann Yaşam Bilimleri Merkezi'ndeki Notre Dame Zebra balığı tesisinde yetiştirildi ve bakımı yapıldı. Bu yazıda açıklanan yöntemler Notre Dame Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (Hayvan Refahı Güvence Numarası A3093-01) tarafından onaylanmıştır.

1. Mekik kutusu öğrenme paradigması (Şekil 1A)

NOT: Öğrenme paradigması, ilişkilendirilebilir öğrenme ile ilgili bilişin hızlı bir değerlendirmesini sağlar.

  1. Her iki tarafa 45° açıyla eklenen 5 x 19 cm'lik akvaryum sınıfı pleksiglas parçası ile 30,5 x 19 x 7,5 cm jel kutusunu değiştirerek mekik kutusunu hazırlayın. Balıkların tankın ortasını ne zaman geçtiğini değerlendirmek için tankın yarı noktasını işaretleyen bir çizgi yapın (Şekil 1B).
  2. Mekik kutusuna 800 mL sistem suyu ekleyin. 1 L deiyonize RO suyunda 60 mg Instant Ocean eriterek bu suyu yapın. Suyu tankın ortasına kadar 5 cm derinliğe kadar doldurun.
    NOT: Her saat 28 °C'de veya 3 balığı test ettikten sonra taze sistem suyu ile değiştirin.
  3. Mekik kutusu tahlilinin yapılacağı karanlık bir odada bulunan sistem suyu içeren bir tutma tankına 2-3 balık yerleştirin.
    1. Karanlık odada, mekik kutusunun ortasına 1 balık yerleştirin, kapağı sabitleyin ve elektrotları bir güç kaynağına takın.
      NOT: Oda, alışma ve test sırasında mümkün olduğunca karanlık kalmalıdır.
  4. Balıkları 15 dakika boyunca mekik kutusuna alıştırın.
    NOT: Araştırmacı, balıkların araştırmacının varlığına uyum sağlamasına izin vermek için alışma süresi boyunca odada kalmalı veya testden önce geniş bir süre ile test odasına sessizce geri dönmelidir. Balık tankı serbestçe keşfettiğinde başarılı bir alışma düşünülebilir.
    1. Balık keşfedemezse, ilave 15 dakika boyunca alışmaya devam edin. Balık hala mekik kutusuna alışamazsa, balığı çıkarın. Bu balığı test etmek için kullanmayın.
  5. 800 lümenlik kırmızı lens el fenerini, alışmadan sonra balığın kapladığı taraftaki jel kutusu duvarından ~2 cm manuel olarak parlatın.
    NOT: Balık, platin telin yanında mekik kutusunun derin uçlarına yakın duvara yaslanıyorsa deneme başlatmayın.
  6. Işık uyaranını doğrudan balığın üzerine parlatın ve uyaranın sürekli görselleştirilmesini sağlamak için balığın herhangi bir yanal hareketini ışıkla manuel olarak takip edin (Şekil 1C). Aşağıdaki koşullardan biri yerine gelene kadar ışık uyaranını sağlamaya devam edin.
    1. Balık, 15 s ışık maruziyeti içinde tankın yarı noktasından geçerse izi başarılı olarak düşünün. Balık yarı noktayı geçtikten sonra, ışık uyaranını hemen durdurun(Şekil 1D).
    2. Balık kutunun yarı noktasından 15 s'de geçmezse izi başarısız olarak düşünün. Bu durumda, negatif bir şok uyaranı (20 mV:1 A) uygulamak için bir elektroforezi güç kaynağı kullanın 2 s Açık, 2 s Kapalı 15 s süre (maksimum 4 şok) veya balık kutunun yarı noktasını geçene kadar, bu noktada hem ışığı hem de negatif uyaranı sonlandırın.
  7. Balıkları 30 s dinlendirin ve 1.5-1.6.2 adımlarını tekrarlayın. Başarılı denemelerin (1.6.1) ve başarısız denemelerin (1.6.2) sırasının ayrıntılı bir kaydını tutun.
    NOT: Burada, öğrenmeyi art arda 5 başarılı denemenin tamamlanması olarak tanımladık. Öğrenme gösterildikten sonra, balık mekik kutusundan çıkarılmalı ve insanca ötenazi yapılmalıdır.

2. Bellek paradigması (Şekil 1A)

NOT: Bu paradigma, öğrenilen bir ilişkilendirilebilir bilişsel görevin kısa ve uzun vadeli hafızasının değerlendirilmesini sağlar.

  1. Eğitim Dönemi
    1. Mekik kutusuna 800 mL sistem suyu ekleyin. 1 L deiyonize RO suyunda 60 mg Instant Ocean eriterek bu suyu yapın. Suyu tankın ortasına kadar 5 cm derinliğe kadar doldurun.
      NOT: Su, her saat 28 °C'de veya 3 balık test edildikten sonra tatlı sistem suyu ile değiştirilmelidir.
    2. Mekik kutusu testinin yapılacağı karanlık bir odada bulunan, sistem suyu içeren bir tutma tankına 2-3 balık yerleştirin.
    3. Karanlık odada, mekik kutusunun ortasına 1 balık yerleştirin, kapağı sabitleyin ve elektrotları bir güç kaynağına takın.
      NOT: Oda, alışma ve test sırasında mümkün olduğunca karanlık kalmalıdır.
    4. Balıkları 15 dakika boyunca mekik kutusuna alıştırın.
      NOT: Araştırmacı, balıkların araştırmacının varlığına uyum sağlamasına izin vermek için testden önce geniş bir süre boyunca odada kalmalı veya test odasına sessizce geri dönmelidir. Balık tankı serbestçe keşfederken başarılı bir alışma belirleyin.
    5. Balık keşfedemezse, ilave 15 dakika boyunca alışmaya devam edin. Balık hala mekik kutusuna alışamazsa, balığı çıkarın ve test için kullanmayın.
    6. Başarılı bir alışmadan sonra, jel kutusu yan duvarından ~ 2 cm uzaklıktaki 800 lümenlik kırmızı lens el fenerini, balık tarafından işgal edilen mekik kutusunun yanına manuel olarak parlatın.
    7. Işık uyaranını doğrudan balığın üzerine parlatın ve uyaranın balık tarafından sürekli görselleştirilmesini sağlamak için balığın herhangi bir yanal hareketini ışıkla takip edin.
    8. Işık balık üzerinde parlarken, aynı anda 2 s Açık, 15 s için 2 s Kapalı (maksimum 4 şok) veya balık kutunun yarı noktasını geçene kadar ters şok uyaranını (20 mV:1 A) uygulayın. Bu başarıldıktan sonra, hem ışığı hem de olumsuz uyaranı sonlandırın.
      NOT: Balığın 30 s dinlenmesine izin verin, ardından 25 yineleme için 2.1.6-2.1.8 adımını tekrarlayın (Şekil 1A).
  2. İlk test
    1. Eğitim süresini takip eden balıklara 15 dakika dinlenmeye izin verin. Onları mekik kutusundan çıkarmayın. Bu dinlenme süresinin hemen ardından, her denemeyi kesinlikle başarılı/başarısız olarak kaydederek ilk bellek saklamayı sınayın.
    2. Sadece ışık uyaranını 15 s'ye kadar uygulayın ve yanıtları aşağıdaki gibi kaydedin.
      1. Balık, ışık uyaranını başlattıktan sonra 15 s içinde mekik kutusunun yarı noktasından geçerse denemeyi başarılı bir şekilde düşünün. Balık yarı noktayı geçtiğinde ışık uyaranını hemen durdurun.
      2. Balık, hafif uyaranı başlattıktan sonra mekik kutusunun 15 s'lik yarı noktasından geçmezse denemenin başarısız olduğunu düşünün. Işık uyaranını 15 sn sonra durdurun.
        NOT: İlk test sırasında, başarısız bir denemenin ardından olumsuz bir uyaran uygulanmaz.
    3. Denemeler arasında 30 s dinlenme süresi olan 2.2.2 adımını tekrarlayın ve 25 deneme boyunca başarılı denemeler (2.2.2.1) ve başarısız denemeler (2.2.2.2) kaydedin. Bu değer her balık için ayrı bir referans görevi görecektir.
  3. Anında bellek
    1. Tercih edilen hasar paradigması (örneğin, değiştirilmiş Marmarou ağırlık düşüşünü kullanarak künt kuvvet travması) ile ilk test döneminin hemen ardından yaralanmaya neden olan yaralanmaya neden olan. Kolay bir tanımlama için balıkları ayrı ayrı barındır. İlk test değerlerini kaydedin ve balıkları hayvan tesisine iade edin.
      NOT: Balıklar daha önce açıklandığı gibi künt kuvvet TBI ile yaralandı22.
    2. İlk testten sonra 2-3 hasarsız veya TBI balığını 4 saat ve/veya yaralanma sonrası (veya söz konusu deneysel zaman diliminde) hayvan tesisinden toplayın. Tüm balıkları karanlık odada sistem suyu içeren ayrı tanklarda tutun.
    3. Balıkları mekik kutusunun ortasına (1.1'de açıklandığı gibi sistem suyuyla hazırlanmış), her seferinde bir balık yerleştirin ve kapağı sabitleyin. Güç kaynağını takın ve balığın 15 dakika boyunca alışmasına izin verin.
    4. Alışmayı takiben, yalnızca 15 s'ye kadar ışık uyaranı uygulayarak anında belleği değerlendirin (kesinlikle geçirin/başarısız olun) ve yanıtları aşağıdaki gibi kaydedin.
      1. Balık 15 s test süresi içinde kutunun yarı noktasından geçerse denemenin başarılı olduğunu düşünün. Yarı noktayı geçtikten sonra ışık uyaranını sonlandırın.
      2. Balık, ışık uyaranını başlattıktan sonraki 15 s içinde kutunun yarı noktasından geçmezse denemenin başarısız olduğunu düşünün. 15 s süre bittikten sonra ışık uyaranını sonlandırın.
        NOT: Bu yaralanma sonrası test sırasında, başarısız bir denemeden sonra olumsuz şok uyaranı uygulanmaz.
    5. Denemeler arasında 30 s dinlenme süresi olan 2.3.4 adımını tekrarlayın ve 25 denemede başarılı denemelerin (2.3.4.1) ve başarısız denemelerin (2.3.4.2) sayısını kaydedin.
    6. Denklemi kullanarak ilk test döneminin yaralanma sonrası başarılı denemelerindeki yüzde farkını hesaplayın:
      Equation 1
  4. Gecikmiş bellek
    1. İlk test değerlerinin kolay tanımlanması ve kaydedilmeleri için ayrı ayrı barındırılan balıkları, ilk test döneminin hemen ardından hayvan tesisine iade edin.
    2. İlk test ve yaralanma ile/veya gecikmiş bellek testi arasında balıklara 4 gün (veya söz konusu deneysel zaman dilimi) izin verin.
    3. Tercih edilen hasar paradigması tarafından yaralanmaya neden (künt cisim travmasına neden olmak için değiştirilmiş Marmarou ağırlık düşüşü gibi). İlk test değerlerinin kolay tanımlanması için balıkları ayrı ayrı barındırın ve balıkları hayvan tesisine iade edin.
      NOT: Balıklar daha önce açıklandığı gibi künt kuvvet TBI ile yaralandı22.
    4. İlk testten sonra 2-3 hasarsız veya TBI balığını 4 saat ve/veya yaralanma sonrası (veya söz konusu deneysel zaman diliminde) hayvan tesisinden toplayın.
    5. Tüm balıkları sistem suyu içeren tek tek tanklarda karanlık odada tutun ve mekik kutusunun ortasına birer birer yerleştirin (1.1'de açıklandığı gibi sistem suyuyla hazırlanmış), kapağı sabitleyin, güç kaynağını takın ve balıkların 15 dakika alışmasına izin verin.
    6. Alışmayı takiben, yalnızca 15 sn'ye kadar ışık uyaranı uygulayarak anında belleği değerlendirin (kesinlikle geçirin/başarısız olun) ve aşağıdaki yanıtları kaydedin:
      1. Balık 15 s test süresi içinde kutunun yarı noktasından geçerse izi başarılı düşünün. Yarı noktayı geçtikten sonra ışık uyaranını sonlandırın.
      2. Balık, ışık uyaranını başlattıktan sonra 15 s içinde kutunun yarı noktasından geçmezse izi başarısız olarak düşünün, ışık uyaranını sonlandırın.
        NOT: Bu yaralanma sonrası test sırasında, başarısız bir denemenin ardından olumsuz bir şok uyaranı uygulanmaz.
    7. Denemeler arasında 30 s dinlenme süresi olan 2.4.6 adımını tekrarlayın ve 25 denemede başarılı denemelerin (2.4.6.1) ve başarısız denemelerin (2.4.6.2) sayısını kaydedin.
    8. Denklemle ilk test dönemine yaralanma sonrası başarılı denemelerdeki yüzdelik farkı hesaplayın:
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokolde ve şematikte özetlenen öğrenme paradigması (Şekil 1), ilişkilendirilebilir öğrenme ile ilgili olarak bilişin hızlı bir değerlendirmesini sağlar. Buna ek olarak, bu paradigma, öğrenmeyi ardışık 5 pozitif denemenin tekrarlanan ve tutarlı bir gösterimi olarak tanımlayarak yüksek bir sıkılığa sahiptir. Bu paradigma, çeşitli yaşlar ve yaralanmalar için de geçerlidir. 8 aylık (genç yetişkin), 18 aylık (orta yaşlı yetişkin) ve 24 aylık (yaşlı yetişkin) hasarsız balıklar, kırmızı ışıktan kaçınma davranışını öğrenmek için benzer sayıda deneme gerektiriyordu (Hasarsız 8 m: 15.28 ± 4.92 deneme, 18 m: 17,66 ± 5,5 deneme, 24 m: 16,2 ± 4,79 deneme, 8 m ile 18 m p=0,92, 8 m vs. 24 m p=0,98, 18 m ile 24 m p=0,97, Şekil 2A). Ayrıca şiddetli bir künt-cisim travmatik beyin hasarı (sTBI) modeli22 kullandık ve farklı yaşlardaki balıkların yaralanma sonrası 1-5 gün boyunca testte ustalaşmak için benzer sayıda deneme gerektirdiğini gözlemledik (dpi; 8 m vs 18 m, p=0.09, 8 m vs 24 m, p=0.96, 18 m vs 24 m, p=0.12, Şekil 2A). STBI'yi takip eden 1. günde, her yaştan balık (8, 18 ve 24 m) davranışı öğrenmek için benzer sayıda deneme gerektiriyordu (8 m: 73.3 ± 9.45 deneme, 18 m: 79,33 ± 6,35 deneme, 24 m: 68,25 ± 6,65 deneme, 8 m vs. 18 m p=0,71, 8 m vs. 24 m p=0,76, 18 m vs. 24 m p=0,28, Şekil 2A) ve hepsi hasarsız kontrollerden önemli ölçüde daha büyüktü (s<0.01). Toplu olarak, bu veriler mekik kutusunun yaş aralıklarındaki yaralanmaya bağlı bilişsel açıkları incelemek için kullanılabileceğini ve yetişkin zebra balıklarının künt kuvvet yaralanmasını takiben bilişsel olarak iyileşebileceğini göstermektedir.

Tekrarlanan miTBI olayları bilişsel işlevi giderek daha fazla bozabildiğinden, tekrarlayan TBI kullanarak doza bağlı ilerlemeyi izlemek için mekik kutusu testini bir metrik olarak kullandık. Bu tahlil, farklı süreler boyunca her gün tekrarlanan bir miTBI künt kuvvet yaralanması22'nin ardından öğrenmeyi değerlendirmek için kullandık. Daha önce de gözlemlendiği gibi, hasarsız balıklar, 16,4 ± 3,5 denemede ardışık 5 pozitif deneme elde ederek mekik kutusuna hızla hakim oldu (Şekil 2B). Tek bir miTBI'yi takip eden bir gün, balıklar davranışı öğrenmek için deneme sayısında önemli bir artış gösterir (40.25 ± 12.65 deneme, s<0.05, Şekil 2B). Bu açık 2 miTBI olayına (48 ± 14.9 deneme) sonra arttı ve 3 miTBI yaralanmasından sonra daha da yükseldi (56.63 ± 12.75 deneme, Şekil 2B). Ek olarak, tekil bir yaralanma alan miTBI balıkları ile 3 yaralanma arasında bilişsel bozuklukta önemli bir artış gözlemledik (s<0.05).

Ayrıca, ani ve gecikmiş bellek paradigmaları için protokolü kullanarak tekrarlanan miTBI olaylarının ardından belleğin nasıl etkilendiğini inceledik (Şekil 1A). Naif hasarsız balıklara bir eğitim süresi ve ilk test süresi verildi, daha sonra balıkların bir kısmı anında hafıza için yaralandı ve diğerleri gecikmiş belleğe erişmek için 4 gün boyunca balık tesisine geri döndü (Şekil 2C). Hasarsız balıklar, ilk test dönemine göre hem anında hafızada (%6,22 ± %4,7) hem de gecikmeli bellekte (%6,13 ± %5,57) başarılı denemelerin yüzdelik farkının yüzdesinde hafif bir artış göstermektedir. Daha sonra birden fazla künt kuvvetteki TBI olayının hafıza üzerindeki etkisini inceledik. MiTBI'yi takiben hemen bellekte önemli eksiklikler gözlendi, ancak gecikmeli bellekte değil. Tek bir miTBI'nin ardından, balıklar hasarsız balıklara kıyasla önemli ani hafıza açıkları (%-26,77 ± %8,93) gösterdi (s<0,0001, Şekil 2C). Bu eğilim, hem 2x miTBI (%-37.42 ± %10.01) hem de 3x miTBI (%-39.71 ± %11.39) sonrasında artan açıklarla artarak devam etti. Ayrıca, tek (1x) miTBI ve 3x miTBI (p<0.05, Şekil 2C)ile tedavi edilen balıklar arasında benzer bir doz etkisi gözlemledik. Bu veriler, yaralanmaların sayısının artmasıyla miTBI balıklarında öğrenmenin ve hafızanın azaldığını, açığın önemli ölçüde arttığını ve yukarıda açıklanan mekik kutusu tahlil ve protokollerinin bu farklılıkları tespit edecek kadar hassas olduğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Mekik Kutusu Tahlil. (A) Bilişsel değerlendirme için öğrenme ve bellek paradigmalarına öğretimsel genel bakış. (B) Mekik kutusu testi için dönüştürülmüş büyük bir DNA jel kutusunun şeması. (C,D) Denemeler sırasında uyaran uygulamasının grafiksel gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Zebra balığı, künt kuvvet TBI'sını takiben bilişsel eksiklikler gösterir. (A) STBI'dan sonra, 8, 18 ve 24 aylık zebra balıkları, yaş grupları arasında önemli ölçüde farklı olmayan öğrenme açıkları sergiler. Mekik kutusu paradigmasını öğrenmek için yapılan deneme sayısında yaşla eşleşen kontrollere kıyasla önemli artışlar 1 dpi'de 4-5 dpi hasarsız seviyelere geri dönerken gözlendi. (B,C) Tekrarlanan miTBI balıkları hem öğrenme (B) hem de hafıza (C) açıklarını doza bağlı bir şekilde gösterdi. Ortalama ± SEM A ve Bolarak çizilirken, ortalama ± Standart sapma Colarak çizilir. Her üç grafik üzerindeki her veri noktası tek bir yetişkin zebra balığı temsil eder. İstatistiksel analizler Tek Yönlü veya İki Yönlü ANOVA ve ardından Tukey post-hoc testi ile gerçekleştirildi. # s<0.05, ## s<0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bilişsel bozukluk yaşam kalitesini önemli ölçüde ve olumsuz yönde etkileyebilir. Nüfus genelinde beyin sarsıntıları ve travmatik beyin yaralanmalarının görünürlüğünün ve oluşumunun artması nedeniyle, bilişsel bozulmaya nasıl neden olduklarını ve hasarın nasıl en aza indirilebileceğini veya tersine çevrilebileceğini anlamak önemlidir. Bu nedenlerle bilişsel düşüş için test edilebilen model organizmalar bu çalışmalarda kritik bir rol oynamaktadır. Kemirgenler uzun zamandır nörobehavior ve bilişi araştırmak için birincil model olmuştur, ancak zebra balığı, gelişimsel, yaşa bağlı ve edinilmiş bilişsel açıkları araştırmak için çok sayıda farklı davranışa sahip yararlı bir model olarak ortaya çıkmıştır17,20,23,24,25,26. Bilişi değerlendirmek için çeşitli yöntemler alışkanlık şeklinde tek boyutlu öğrenmeden karmaşık öğrenme ve mekansal hafızaya, yeni nesne ve konum tanımaya ve karar verme18 , 19, 20,21,27,28' e kadar kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu bilişsel testler ilişkisel olmayan bilişi test etmekle sınırlıdır veya testler yapılmadan önce karmaşık bir kurulum, ekipmana finansal yatırım veya kapsamlı bir zaman taahhüdü gerektirir. Buna karşılık, mekik kutusu ve burada açıklanan öğrenme ve hafıza paradigmaları, uygun maliyetli, hızlı bir şekilde değerlendirilen ve acemi bir araştırmacı tarafından kolayca kullanılan karmaşık bir ilişkilendirilebilir öğrenme tahlili kullanır. En önemlisi, diğer bilişsel testlerle tutarlı olarak, testimiz hasarsız balıkların ilişkisel görevi hızla öğrendiğini ve görevi günler sonra aralıklı eğitim olmadan hafızaya alabileceğini göstermektedir29.

Tahlillerin uyarlanabilirliği, hastalığın ilerlemesi veya mekanistik müdahalelerin bir ölçüsü olarak öğrenme ve hafızanın çeşitli zaman noktalarını araştırmak için yollar sağlar. Tahlilin iki temel özelliği vardır. İlk olarak, yöntem basittir. Test hızlı bir şekilde kurulur ve başarılı ve başarısız denemelerle ilgili net ve belirgin son noktalara sahiptir ve bu da onu bir dizi araştırmacı için erişilebilir hale getirir. Bu tahlilin basitliği nedeniyle mekik kutusunu başarıyla kullanmak için çok az sorun giderme gerektiğini gördük. İkincisi, test, esneklik veya çok sayıda balığı tek bir günde hızlı bir şekilde inceleme yeteneği sağlayan diğer bilişsel sınavlara kıyasla son derece hızlıdır. Öğrenmeyi değerlendirme süresi en az 19,75 dk'dır( Şekil 1 ), balıkların mekik kutusuna alışması için 15 dakika gerekir (tank keşfi ile belirlenir), ardından tek bir başarısız deneme (15 s hafif uyaran, 15 s nefret uyaranı, denemeler arasında 30 s) ve 5 anında ve ardışık pozitif deneme (<15 s hafif uyaran). Uygulamada, hasarsız balıkların 6-30 deneme (19,75 dk-43,75 dk) gerektirdiğini, aşırı durumlarda ise (ağır künt cisim travmasını takiben) en ciddi açıkların 100 deneme (113,75 dk) gerektirebileceğini gözlemledik. Bellek çalışmaları da hızla yapılmaktadır. Protokol ana hatlarını izleyerek, alışma, eğitim ve ilk test için gereken minimum süre 67,5 dk'dır (15 dakika alışma, 15 s için 25 ışık ve şok yinelemesi, denemeler arasında 30 s dinlenme ve olumsuz uyaranlar olmadan ilk test için tekrar). Acil veya gecikmiş belleği yeniden test etmek, yaralanma, tedavi veya bilişsel açık ne olursa olsun, sadece 33,75 dk (15 dk alışma, 15 s için sadece ışık uyaranının 25 yinelemesi ve denemeler arasında 30 s dinlenme) gerektirir.

Nörobehavior değerlendirirken, çeşitli paradigmalar pozitif veya olumsuz uyaranları kullanır. Genellikle klasik T-box labirentlerinde kullanılan gıda veya sosyal etkileşim şeklindeki olumlu uyaranlar, öğrenilen bir görevin güçlü bir yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ancak, pozitif ilişkiyi kullanan tahliller bunu zaman pahasına yapar. Buna karşılık, olumsuz bir uyarana yanıt olarak koşullandırma hızlı bir ilişki ve güçlü bir davranışsal yanıt sağlarken, olumsuz uyaran pahasınadır. Hasarsız balıklar genellikle mekik kutusunu hızlı bir şekilde öğrenirler ve bu nedenle minimum sayıda şoka maruz kalırlar ve sonuç olarak herhangi bir olumsuz olay yok gibi görünür. Bununla birlikte, nörolojik olarak tehlikeye atılmış ve ciddi bilişsel eksikliklere sahip balıklar (TBI), önemli sayıda deneme ve elektriksel şok gerektirir. Bu çoklu şokların zaman zaman tonik-klonik nöbetlerle sonuçlendiği gözlenmiştir. Mekik kutusundayken tonik-klonik nöbet geçiren balıklar derhal çıkarılmalı ve etik olarak ötenazi yapılmalıdır. Ötenazili balıklar için nöbet olayına kadar olan tüm denemeler herhangi bir istatistiksel analizde hariç tutulmalıdır. Ayrıca, nörolojik olarak hasar görmüş bir konuya elektrik çarpmasının, mekik kutusundan kaynaklanan ve olmayan hasarlı balıklar arasında istenmeyen farklılıklar getirebileceğini belirtmek gerekir. Bu nedenle, nörobehavior değerlendirmesi için maruz kalan tüm balıkların başka bir nicel metrik (serum biyobelirteç, IHC vb.) için kullanılmaması gerektiğini öneriyoruz. Bu öğrenme yönteminin görsel bir uyarana dayandığını ve sonuçları şaşırtacağı için görsel devreleri tehlikeye atabilecek hasarlar için uygun olmadığını anlamak da önemlidir.

Sonuçlarımız, künt kuvvet TBI'ı takiben zebra balıklarının, mekik kutusu testinde ilişkilendirilebilir bir görevde ustalaşmak için daha fazla denemeyle sonuçlanan hızlı bir bilişsel açık sergilediğini göstermektedir. Benzer acil açıklar TBI kemirgen modellerinde görülür, ancak bu açıklar azalabilir, genellikle devam eder ve önemli30. Buna karşılık, zebra balığı yaralanmayı takip eden 7 gün içinde bilişsel iyileşme gösterir. Yetişkin zebra balıklarının rejeneratif kapasitesi, teleensefalonun ventrikül / subventriküler bölgelerinde bilinen nörojenik nişler ile9,10,11 , 12 , 13,14 , 15,iyi belgelenmiştir. TBI'ı takip eden tahlillerimizde gözlenen bilişsel iyileşme, bu nörojenik nişlerin uyarılıp uyarılmazsa ve doku ve bilişsel iyileşmede rol oynayıp oynamadığını belirlemek için gerekli sınavlar hakkında fikir vermektedir.

Sonuç olarak, mekik kutusu ilişkilendirilebilir öğrenme ve hafıza açısından bilişin hızlı bir değerlendirmesini sağlar. Tahlil minimal ve manastır ekipmanı kullanır ve teknik olarak basittir. Gelecekteki uygulamalar, nörolojik olarak hakarete uğramış balıklara nöroproteksyonun yanı sıra diğer yaralanma paradigmaları veya nörodejeneratif modellerle ilgili genetik ve farmakolojik müdahaleleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, hyde laboratuvar üyelerine düşünceli tartışmaları için ve zebra balığı bakımı ve bakımı için Freimann Yaşam Bilimleri Merkezi teknisyenlerine teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma Notre Dame Üniversitesi Zebra Balığı Araştırmaları Merkezi, Notre Dame Üniversitesi Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp Merkezi tarafından desteklendi ve NIH R01-EY018417 Ulusal Göz Enstitüsü (DRH), Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı (JTH), LTC Neil Hyland Notre Dame Bursu (JTH), Özgürlük Bursu Nöbetçileri (JTH) ve Pat Tillman Bursu (JTH). Şekil 1 BioRender.com ile yapılmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flashlight Ultrafire 9145
Instant Ocean Instant Ocean SS15-10
Large DNA Gel Box Fisher Scientific FB-SB-1316 Shuttle Box
Power Supply Fisher Scientific FB-105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
  2. Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
  3. Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
  4. Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
  5. Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
  6. Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L. The epidemiology of traumatic brain injury. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 25, 72-80 (2010).
  7. Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
  8. GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
  9. Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
  10. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
  11. Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
  12. Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
  13. Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
  14. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
  15. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
  16. Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
  17. Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  18. Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
  19. López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
  20. Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
  21. Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
  22. Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  23. Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
  24. Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
  25. Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
  26. Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V. Cognitive aging in zebrafish. PloS One. 1 (1), 14 (2006).
  27. Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
  28. Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
  29. Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
  30. Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
  31. Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  32. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).

Tags

Nörobilim Sayı 173 zebra balığı yenilenme travmatik beyin hasarı künt travma öğrenme hafıza
Yetişkin Zebra Balığı Kullanarak Öğrenme ve Bellek Çalışmalarında Bilişsel Değerlendirme için İlişkisel Bir Öğrenme Aracı Olarak Mekik Kutusu Tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hentig, J., Cloghessy, K., Hyde, D.… More

Hentig, J., Cloghessy, K., Hyde, D. R. Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (173), e62745, doi:10.3791/62745 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter