Summary
该协议描述了一种快速而简单的方法，使用工程化的 大肠杆菌 菌株生产细菌裂解物以实现无细胞基因表达，并且只需要标准的实验室设备。
Abstract
无细胞基因表达提供了生物学的力量，而没有生物体的并发症。尽管存在许多这样的基因表达系统，但大多数购买和/或需要特殊设备和精细磨练的专业知识才能有效生产。该协议描述了一种生产细菌无细胞裂解物的方法，该裂解物仅使用标准实验室设备并且需要最少的处理， 支持高水平的基因表达。该方法使用大肠杆菌菌株产生不影响生长的内溶素，但在简单的冻融循环后有效地裂解收获的细胞沉淀。唯一需要的进一步处理是短暂的孵育，然后离心以清除细胞碎片的自溶物。动态基因回路可以通过收获前细胞中ClpX蛋白酶的异源表达来实现。缺乏lacZ基因的大肠杆菌菌株可用于使用比色法或荧光读数的高灵敏度，无细胞生物传感应用。整个方案只需要8-9个小时，从接种到完成只需要1-2个小时的动手劳动。通过降低获得无细胞裂解物的成本和时间，该方法应提高各种应用中无细胞基因表达的可负担性。
Introduction
与使用活细胞1，2，3，4相比，无细胞裂解物中的基因表达有几个优点。裂解物可以很容易地进行生物化学修饰，并用于可能对活细胞有害或不可能实现的条件下。基因表达回路不必与宿主生物过程竞争或竞争，测试新的遗传回路就像添加DNA一样简单。由于这些原因，无细胞基因表达已经找到了各种应用，从生物传感器5，6到快速原型合成基因电路7，8到发育中的人造细胞9。大多数无细胞基因表达利用经过高度处理的细胞裂解物，通常需要漫长而复杂的实验方案，专用设备和/或敏感步骤，这可能导致使用者和批次之间的显着差异10，11。
本文描述了一种简单、有效的无细胞裂解物生产方法，该方法需要最少的处理和专业知识（图1A）12。该方法依赖于大肠杆菌细胞，这些细胞被设计为在简单的冻融循环后裂解。细胞从噬菌体λ中表达一种内溶解素，该内溶蛋白会降解细胞壁。随着细胞的生长，这种内溶蛋白保留在细胞质中，与细胞壁隔离。然而，一个简单的冻融循环会破坏细胞质膜，将内溶蛋白释放到周质中，在那里它会降解细胞壁，从而导致快速细胞裂解。该协议只需几个小时的动手工作即可完成，只需要一个冰箱，一个能够30，000×克的离心机（以获得最佳结果;可以使用较低的速度，更小心地不要干扰沉淀），一个涡旋混合器和一个简单的缓冲溶液。功能性裂解物甚至可以通过冷冻干燥细胞并原位再水化来产生 。然而，这种方法产生活性较低的裂解物，可能是由于剩余的细胞碎片。
裂解物对无细胞基因表达具有高度活性，并且可以根据最终用途以各种方式增强。通过使用标准离心浓缩器浓缩裂解物，可以进一步提高蛋白质合成速率。通过添加纯化的GamS蛋白，可以保护线性DNA免于降解。蛋白质降解是振荡等更复杂的电路动力学所必需的，可以通过在产生自洽物的菌株13中共表达ClpX六聚体来实现。最后，通过使用缺乏lacZ的自溶物菌株来启用基于 LacZ的视觉读数。总体而言，该方法可产生高活性的无细胞裂解物，适用于广泛的应用。
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Protocol
1. 准备培养基和缓冲液。
- 准备 2xYTPG 培养基。
- 将62克2xYT粉末，5.99克磷酸钾单碱，13.93克磷酸氢钾和去离子水混合至2升。
- 在液体循环上高压灭菌，暴露时间为30分钟14。
- 从1.1.2到400mL的2xYTP培养基，加入7.2g D-葡萄糖（葡萄糖）并混合直至溶解。
- 通过0.2μm过滤器进行过滤灭菌。
- 准备 S30A 缓冲液。
- 混合Tris-HCl（pH 7.7，50 mM终浓度），谷氨酸钾（60 mM终浓度）和谷氨酸镁（14 mM终浓度）。
- 使用10 M KOH将pH值调节至7.7。
- 准备解决方案 1（请参阅表 1）。
- 将4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）重悬于2毫升水中。
- 使用KOH将pH值调节至8.0。
- 添加 表 1中的所有其他组件。
- 使用10 M KOH将pH值调节至7.6。过滤灭菌。
- 制备2.5x预混液（见表2）。
- 混合 表2中的所有组分。
- 使用KOH将pH值调节至7.5。
- 等分试样并在-80°C下冷冻。
注：20 μL反应使用8.9 μL预混料。
2. 准备细胞。
- 使用接种环将自体产物细胞划到含有50μg/ mL氨苄西林的LB琼脂平板上，并在37°C下生长（见注1）。
- 使用移液器吸头将单个菌落选入LB / 氨苄西林培养基的起始培养物中，并在37°C下生长过夜。
- 接种400 mL含有50μg/ mL氨苄西林的2xYTPG培养基和400μL发酵剂培养物，并在37°C下在1L锥形瓶中生长，以300rpm振荡。
- 使用分光光度计定期测量培养物在600nm（OD600）处的光密度，以读取具有1cm路径长度的光学比色皿。当OD600 超过1时，在测量前开始将培养物稀释5倍，以确保测量保持在典型实验室分光光度计的线性范围内。继续培养细胞，直到5倍稀释的培养物达到OD600 的0.3（对应于培养OD600 的1.5）。
3. 准备裂解液。
- 准备补充有2mM二硫代甲状腺素（DTT）的S30A缓冲液。将3 mL S30A缓冲液与6μLDTT储备溶液混合1 M.置于冰上以用于步骤3.7。
- 通过在室温下以1800×g离心15分钟来收获细胞。
- 通过倒出上清液并使用移液器除去任何残留的液体来丢弃上清液。
- 使用涡旋混合器将沉淀重悬于45mL冷（4-10°C）S30A缓冲液中。
- 称取空的50 mL离心管，将细胞转移到其中，并重复步骤3.2-3.3以洗涤细胞。
- 称量沉淀，减去空的50 mL管的重量。确保小心地吸出任何剩余的上清液，以确保准确测量沉淀重量。
注意：典型产量为来自400 mL生产培养物的〜1.3g细胞沉淀。 - 加入2体积的冷S30A缓冲液，补充有2mM二硫磷脂醇，即每1g细胞沉淀2mL缓冲液，并通过剧烈涡旋混合重悬细胞。
- 冷冻细胞。将含有细胞的50mL管置于-20°C或-80°C冰箱中，直到沉淀完全冷冻。
注意：冻结步骤是当天的良好停止点。 - 在室温水浴中解冻细胞。
- 剧烈涡旋2-3分钟。
- 在37°C下孵育45分钟，以300rpm振荡。
- 通过在透明离心管中以30，000×g在4°C下离心45分钟来清除重细胞碎片的样品。
注意：如果没有能够达到30，000 x g的离心机，请在21，000× g下离心45分钟，并在步骤3.13中格外小心，因为沉淀会不太紧凑。 - 小心地将上清液转移到带有移液管的新管中，尽可能避免干扰沉淀。如果转移的上清液被沉淀中的物质污染，请重复上一步。
- 将上清液转移到1.5mL离心管中，并以21，000×g（或台式离心机的最大速度）再次离心5分钟。
- 将清除的自溶物等分到所需体积中，小心避免任何剩余的沉淀，并在-80°C下冷冻或立即使用。
注：单个20 μL反应使用8 μL自体液。
4. 无细胞基因表达
注：自溶物现在已准备好用于任何所需的最终用途。以下是无细胞基因表达的示例标准方案。
- 对于20μL反应，在冰上混合8μL自体产物和8.9μL预混料。参见方案部分末尾关于谷氨酸镁和PEG 8000浓度优化的注释。
- 将DNA（例如，pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500）加入至终浓度为8 nM）、任何其他试剂和水至20 μL。
- 将反应置于384孔微孔板中，并使用读板仪测量荧光时间过程和/或终点。对于绿色荧光蛋白 （GFP），使用激发波长为 485 nm 和发射波长为 520 nm。
5. 协议修改
注意：对协议的以下修改使其能够为其他应用程序提供服务。
- 使用线性DNA模板的无细胞基因表达
- 执行第4节中的步骤，在加入线性DNA之前，用2.2μM纯化的GamS蛋白（如所述12表达和纯化）补充反应。
- 结合蛋白质降解的无细胞基因表达
- 在步骤2.1中，使用含有质粒pACYC-FLAG-dN6-His的自溶物细胞（见 材料表）。在所有生长培养基中，另外包括34μg/mL氯霉素。
- 在步骤2.3中，在生长培养基中加入40μM异丙基β-D-1-硫代乳糖吡喃糖苷（IPTG）以诱导质粒的表达。
- 重复步骤3.2-3.4（洗涤）两次（共三次洗涤），以确保完全去除氯霉素，这是一种翻译抑制剂。对于前两次洗涤（步骤3.4），用磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）代替S30A缓冲液。
- 在步骤4.2中，补充额外的3mM ATP（从100mATP的储备溶液中加入水中，pH 7.2）和4.5mM谷氨酸镁（在水中使用1M储备溶液）（最终浓度）以补偿ClpXP的高ATP使用，以及通过额外的ATP螯合镁。
- 使用基于LacZ的读数（包括比色法）的无细胞基因表达
- 在步骤2.1中，使用不天然表达LacZ的自溶物细胞（参见 材料表）。
- 或者，直接从冻干细胞中制备裂解物。
- 执行从 1.1 到 3.7 的所有步骤。
- 将8μL细胞悬浮液与8.9μL预混料混合。
- 加入质粒DNA（如果需要）、其他定制试剂和水，以达到20μL的最终体积。
- 将反应转移到384孔微孔板中并冷冻干燥。
注意：冻干样品可以储存长达一周，甚至可能更长时间。 - 要开始反应，请用18μL去离子水补充任何所需的DNA或其他试剂。
- 跟踪读板器中的荧光动态。
注1：自溶物细胞被设计为在冻融循环时裂解，因此在制造冷冻储备时使用冷冻保护剂尤为重要。我们将库存冷冻在24%重量/体积的甘油中，并将其储存在-80°C。
注2：镁离子和PEG 8000对裂解物性能至关重要。基于先前公布的数据，碱基2.5x预混料含有6 mM谷氨酸镁和4.8%重量/体积PEG 8000，在最终反应中分别变为2.4 mM和1.9%。用这里的方案制备的自溶物通常在最后反应中使用额外的5mMMg-谷氨酸盐和1.5%PEG 8000表现最佳。然而，这可以在额外的0-10 mM Mg谷氨酸盐和额外的0-3%PEG 8000（与碱性预混料相比）的范围内进行优化。为了用推荐的额外5 mM Mg谷氨酸盐和1.5%PEG 8000（最终浓度）制备预混料，将380μL预混料与4.75μL谷氨酸镁以1M混合，以40%重量/体积混合36.1μLPE 8000。
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Representative Results
通过使用自溶物从本构表达质粒中表达GFP，可以观察到具有代表性的结果，这里pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500，并在读板器中记录GFP荧光的时间过程（图1B）。质粒DNA的稀释系列即使在1 nM DNA下也有很强的表达。与市售裂解物相比，自溶物可以产生更大的总产量并实现更大的最大生产率，计算为GFP时间过程的时间导数（图1C，D）。有关使用此方法的其他结果，请参见Didovyk等人12。该协议的故障点相对较少;然而，如果自溶物没有充分清除细胞碎片，则可能获得次优结果。最佳结果还需要优化每批裂解物的PEG-8000和Mg2 +浓度（见注2）。
图1：代表性结果 （A）协议的可视化表示。（B） 来自 pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 的 GFP 表达示例在冻融自溶物中的时间过程。与商业参考裂解物（橙色，MYtxtl-70-960M来自MYcroarray）相比，由2个不同的研究人员使用30，000 x g离心机（蓝色和橙色）或20，000 x g离心机（紫色）在2个不同的实验室中制备的自溶物的最大GFP产量（C）和最大生产率（D）。所有误差线都是两个技术重复的平均绝对误差。此数字已从 12 修改。版权所有 2017 美国化学学会。缩写：GFP =绿色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 解决方案1：将水加入4毫升 | |
| 名字 | 重量（毫克） |
| 3-PGA | 386.4 |
| 断续器 | 52 |
| 营地 | 13.8 |
| 辅酶A | 11.2 |
| 断续器 | 28.4 |
| 亚叶酸 | 1.9 |
| GTP | 47.6 |
| 异丙酮 | 667.2 |
| 纳德 | 12.3 |
| 亚精胺 | 8.1 |
| tRNA | 11.2 |
| 双绞线 | 29.5 |
表 1：解决方案 1。解决方案 1 的组件。
| 2.5x 预混料 | |
| 试剂 | 体积（μL） |
| 氨基酸混合物各含24 mM，亮氨酸除外，其含量为20 mM | 2500 |
| 二硫代甲状腺素 （DTT） 在 100 mM | 100 |
| 谷氨酸镁在1 M | 25 |
| PEG-8000 在 40% 重量/体积 | 500 |
| 谷氨酸钾在2 M | 303 |
| 解决方案 1（请参阅表 1） | 714.3 |
表2：预混料。预混料解决方案的组件。
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Discussion
这里描述的方案产生用于无细胞基因表达的高活性细菌裂解物。关键是使用携带质粒pAD-LyseR的细胞，其以胞质方式表达lambda噬菌体内溶蛋白。这些细胞被增强以在内膜的通透性下裂解自身，允许内溶蛋白进入细胞壁，该方法通过简单的冻融循环实现。由于细胞有效地裂解自身，因此该产物被称为自溶物。细胞裂解后，仅剩的步骤是孵育和离心以清除细胞碎片的自溶物。
与其他生产细菌裂解物的方法相比，这种方法非常简单和快速，但它不会牺牲裂解物的质量。接种生产培养物后8-9小时内即可完成实验方案，只需1-2小时的人工操作。唯一推荐的不是分子生物学实验室完全标准的设备是能够达到30，000× 克的离心机。然而，即使使用低速离心机也可以生产出质量相当的自溶物（图1C，D）;用户只需要更小心地从沉淀中取出裂解物，也许留下稍微多一点的液体以确保样品清洁。这种简单性不仅仅是一个方便的问题，而是一个政治问题。不太复杂的实验方案往往会产生更可重复的结果，当用不同的手进行时，变化较小。在步骤5.4中提出的修饰，其中细胞与所有其他试剂一起冷冻干燥，提出了一种更简单的方案，尽管蛋白质生产产量降低。值得注意的是，在这种修饰中，跳过了清除细胞碎片裂解物的离心步骤，这进一步减少了处理劳动力;然而，剩余的碎片减少了裂解物12的表达。
近年来，已经发表了许多生产无细胞裂解物的方法，最近由Cole等人总结15。这些研究探索了细胞类型，生长条件，裂解方法和后处理的各种策略。大多数其他裂解方法都需要专门的设备，例如法国压榨机，均质机，珠子搅拌器或超声仪。Fujiwara和Doi省略了这种设备，转而支持类似于这里描述的冻融循环，除了他们通过用溶菌酶处理细胞而不是表达内溶素16来使细胞易感裂解。虽然这大致与这里描述的方案一样简单，但溶菌酶处理的细胞必须在脆弱状态下洗涤，而不会过早破坏它们，这可能需要实验技巧并引入变异性的来源。
除裂解物外，无细胞基因表达还需要含有能量源、RNA和蛋白质单体以及其他小分子的预混溶液。预混料配方在17日之前被描述和优化，并进行了一些修改。这里使用的预混料含有约4倍浓度的氨基酸，以及额外的谷氨酸镁和PEG 8000，分别对应于7.5mM和3.5%重量/体积的最终反应浓度。最佳结果可能需要为每批新裂解物调整补充谷氨酸镁和PEG 8000浓度，尽管上述浓度始终产生良好的结果（见注2）。独特的应用可能需要重新优化这些浓度，例如，当使用ClpX补充的裂解物13时。
用于生产无细胞裂解物的标准 大肠杆菌 菌株是BL21-Gold（DE3）。含有自溶质粒pAD-LyseR的这些细胞的衍生物已沉积在菌株和质粒储存库中（见 材料表）。此外，还有一种缺乏基因组 lacZ 的衍生物，可显着减少使用基于LacZ的输出的电路的背景，以及用于纯化GamS蛋白的表达质粒pAD-GamS，该蛋白可以保护线性DNA免受降解。这些细胞菌株和质粒应该可用于无细胞基因表达中的各种应用。
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Disclosures
J.H.是GenCirq Inc.的联合创始人，该公司专注于癌症治疗。他是董事会成员，并拥有GenCirq的股权。
Acknowledgments
作者感谢Zachary Sun和Richard Murray（加州理工学院）提供了质粒P_araBAD-gamS，并感谢Kaeko Kamei（京都工业大学）提供了高速冷却离心机。这项工作得到了美国国立卫生研究院和ARO MURI计划的资助，并得到了日本文部科学省优秀青年研究人员领先倡议的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
