Abstract
Membraangebaseerde laterale flow immunochromatografische strips (ICS'en) zijn nuttige hulpmiddelen voor goedkope zelfdiagnose en zijn efficiënt toegepast op toxine-, fysiologische index- en klinische biomarkerdetectie. In dit protocol geven we een gedetailleerde beschrijving van de stappen om een snelle, gevoelige en kwantitatieve laterale-flow immunoassay te ontwikkelen (met AuNPs als marker en mAbs als probe). De procedure beschrijft de bereiding en karakterisering van colloïdaal goud, synthese van het AuNP-mAb-conjugaat, assemblage van de immunochromatografische strip en methodologisch onderzoek van de test. De resultaten toonden aan dat de laatste strips verder kunnen worden gebruikt voor de snelle en gemakkelijke zelfdiagnose van een klein molecuul, wat een alternatief hulpmiddel kan bieden bij de snelle en nauwkeurige analyse van fysiologische en biologische indices.
Introduction
Membraangebaseerde laterale flow immunochromatografische strips (ICS'en) zijn nuttige hulpmiddelen voor goedkope en snelle detectie. Het nitrocellulosemembraan als drager en colloïdaal goud als markers van immuunchromatografie snelle diagnostische reagentia zijn de meest gebruikte POCT-methode (point of care testing) en de testomvang van het project is breder. Van hun oorspronkelijke toepassing bij monitoring tijdens de zwangerschap, is hun gebruik uitgebreid tot het controleren van de bloedstollingstoestand1,2,myocardiale verwonding3,diergeneeskunde4,residuen van bestrijdingsmiddelen5,infectieziekten6 en medicijnconcentraties. Meer soorten monsters kunnen worden beoordeeld, waaronder urine, speeksel, volbloed, serum en andere lichaamsvloeistoffen7,8,9.
In de afgelopen jaren zijn tal van nieuwe assays ontwikkeld voor het detecteren van biomarkers bij de diagnose van aandoeningen, waaronder HPLC, UPLC, LC-MS en ELISA, die gevoelig en nauwkeurig, geloofwaardig en specifiek zijn. Deze methoden vereisen echter geavanceerde instrumentatie, complexe voorbewerking en tijdrovende behandelingen9. Daarom is het ontwikkelen van een snellere en handigere point-of-care diagnostische strategie voor de zelf- en real-time detectie van medicinale actieve verbindingen dringend10,11.
De populariteit van ICS'en, vooral voor veel voorkomende tests, wordt gedreven door hun gebruiksgemak, omdat ze geen professionals of uitgebreide instrumentale opstellingen vereisen12. Met andere woorden, mensen die geen speciale training hebben, kunnen strips of zelftests bedienen13. De resultaten van de test kunnen in 5 minuten worden verkregen, wat betekent dat deze kan worden gebruikt voor inspecties ter plaatse14. Bovendien kunnen volgens onze berekeningen de kosten van strips lager zijn dan 1 RMB15, wat betekent dat de tests goedkoop zijn om16te promoten . Vandaar dat de ICS een relatief nauwkeurig, eenvoudig en goedkoop wegwerpapparaat is. ICS'en op basis van colloïdaal goud17,18 worden ook toegepast bij snelle COVID-19-detectie.
Het principe van ICS is onder te verdelen in sandwich ICS en competitive ICS. Figuur 1A is een schematisch diagram van de sandwich ICS, die voornamelijk wordt gebruikt voor het detecteren van macromoleculaire stoffen zoals eiwitten, waaronder tumormarkers, ontstekingsfactoren en humaan choriongonadotrofine (HCG, antigeen in de vroege zwangerschap). Bij deze methode worden gepaarde antilichamen gericht op verschillende epitopen van het antigeen gebruikt en wordt het vanvangantilichaam als testlijn op het NC-membraan gedroogd. Gelabeld antilichaam wordt gedroogd op het geconjugeerde pad en secundair antilichaam wordt gebruikt als controlelijn.
Figuur 1B is een schematisch diagram van concurrerende ICS, dat voornamelijk wordt gebruikt om stoffen met kleine moleculen te detecteren (MWCO < 2000 Da). Het coatingantigeen wordt als testlijn op het NC-membraan gefixeerd en het gelabelde antilichaam wordt gedroogd op het geconjugeerde pad. Tijdens de detectie stromen het monster en het gelabelde antilichaam onder capillaire werking door de detectielijn en bindt het gecoate antigeen concurrerend vrij antigeen in het monster en ontwikkelt een rode kleur op de detectielijn.
Onlangs beschreven we de procedure van monoklonale antilichaamgeneratie tegen natuurlijke producten19. In dit werk ontwikkelden we een nieuwe laterale flow immunoassay op basis van de voorbereide anti-SSD mA20 voor snelle, on-site detectie. De resultaten geven aan dat de immunochromatografietest een onmisbaar en handig hulpmiddel is voor het detecteren van van natuurlijke producten afgeleide verbindingen.
Figuur 1 Schematisch diagram van de immunochromatografietest (A) Sandwich immunochromatografische teststrips. B)Indirect concurrerende immuunchromatografische teststrips. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al.,201821. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de Ethics Review Committee van de Beijing University of Chinese Medicine (goedkeuringsnummer 2017BZYYL00120).
1. Bereiding en karakterisering van colloïdaal goud
OPMERKING: Voor colloïdaal goudsynthese, aangezien colloïdaal goud gemakkelijk wordt geadsorbeerd aan de binnenwand van het vat en gevoelig is voor neerslag door onzuiverheden, moet het vat voor synthese en opslag van colloïdaal goud grondig worden gereinigd en gedrenkt in zuur (40 ml gedestilleerd water, 360 ml geconcentreerd zwavelzuur, 20 g kaliumdichromaat) of worden onderworpen aan oppervlaktepassiveringsbehandeling. Een citroenzuurreductiemethode werd gebruikt om colloïdaal goud te synthetiseren.
- Zet de magneetroerder aan en plaats de kolf (250 ml) op de mixer.
- Bereid respectievelijk 4% goudchloridezuuroplossing en 1% natriumcitraatoplossing.
- Voeg 120 ml gedestilleerd water toe aan een kolf met ronde bodem en verwarm het op een thermostatische magneetroerder tot de kook.
- Blijf koken en voeg snel 0,5 ml 4% chlooraurinezuur en 5 ml 1% natriumcitraat toe.
- Observeer de kleur van de oplossing. De lichtgele chlooraurinezuuroplossing kleurt wijn binnen enkele minuten rood.
- Blijf 10 minuten verwarmen, totdat de oplossing verandert van kleurloos naar transparant wijnrood.
- Schakel de stroom van de thermostatische magneetmenger uit, koel af tot kamertemperatuur en verplaats het mengsel naar een schone fles. Bewaren bij 4 °C.
- Bepaal de grootte en morfologie van de AuNP's door ultraviolette spectroscopie en TEM-beeldvorming.
OPMERKING: Verschillende maten colloïde gouddeeltjes voor verschillende toepassingen kunnen worden verkregen door het aandeel citraatnatrium en chlooraurinezuur te veranderen.
2. Synthese van AuNPs-mAb-conjugaat
OPMERKING: Aangezien antilichamen binden aan colloïdaal goud door elektrostatische adsorptie, hebben ladingen op het oppervlak van eiwitten en colloïdaal goud direct invloed op de bindingsintensiteit; daarom is de pH-waarde van de buffer een belangrijke factor die de stabiliteit van het antilichaam-colloïdaal goudconjugaat beïnvloedt. SSD en anti-SSD mAbs worden als voorbeelden gebruikt in dit protocol.
- Evaluatie van de pH van de koppeling
- Voeg 100 μL NaCl-oplossing (10% m/v) toe in acht buisjes.
- Stel de AuNP-oplossingen in bij pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 en 12 met 0,1 M K2CO3.
- Voeg 100 μL colloïdaal goudoplossing (pH aangepast 5-12) toe aan acht buisjes die NaCl bevatten.
- Laat de oplossingen na het mengen enkele minuten staan. Observeer de kleurverandering van elke buisoplossing en noteer de buis die rood blijft.
- Kies de pH-waarde met de minste toevoeging van K2CO3 en stabiele oplossingskleur als de optimale pH-waarde voor het bereiden van AuNP-mAb-conjugaten.
OPMERKING: Gebruik geen pH-meter omdat de sonde kan worden vernietigd door AuNPs.
- Evaluatie van de hoeveelheid antilichamen
- Voeg 100 μL NaCl-oplossing (10% m/v) toe aan acht buisjes.
- Voeg 100 μL colloïdaal goudoplossing met optimale pH toe aan elke buis.
- Voeg de monoklonale antilichaamoplossingen (eiwitconcentratie 0,1 mg/ml-3,2 mg/ml) toe aan de bovengenoemde acht buisjes.
- Laat de oplossingen na het mengen enkele minuten staan. Observeer de kleurverandering van elke buisoplossing en noteer de buis die rood blijft.
- Kies de hoeveelheid antilichamen met de laagste concentratie mAb en stabiele oplossingskleur als de optimale hoeveelheid mAb voor het bereiden van AuNP-mAb-conjugaten.
- Bereid de resuspensiebuffer voor: voeg 1 M Tris-HCl (pH 8,8), 1% (w/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween 20 en 1% (v/v) PEG 20000 toe en meng goed.
- Synthese van AuNP-mAb-conjugaat
- Neem 10 ml colloïdaal goudoplossing en gebruik 0,1 M K2CO3 om de oplossing aan te passen aan de optimale pH-waarde.
- Voeg langzaam SSD mAbs toe in de juiste concentraties en schud gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer het mengsel bij 83 x g (1.000 tpm) gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het neerslag, dat onzuiverheden of neergeslagen colloïdaal goud bevat.
- Centrifugeer het mengsel bij 8.330 x g (10.000 tpm) gedurende 30 minuten bij 4 °C. Gooi het bovennatuurlijke en het neerslag is het colloïdaal goud-mAb-conjugaat.
- Voeg de resuspensiebuffer toe om de neerslag te dissociëren.
3. Montage van de Strip
OPMERKING: Voor latere flow-immunoassays zal de selectie en voorbehandeling van membraanmateriaal rechtstreeks van invloed zijn op de test, die moet worden onderzocht. De immunochromatografische strip bestaat uit een sample pad, een conjugaat pad, een nitrocellulose (NC) membraan, een absorberende pad en een PVC board(Figuur 1). Het membraanmateriaal moet worden gecontroleerd en geëvalueerd door stereomicroscopie om inhomogeniteit te elimineren.
- Plak het NC-membraan op een PVC-plaat op 2 cm van de rand van het zuigeinde van het bord.
- Voeg SSD-BSA (2 mg/ml) druppelsgewijs toe aan het NC-membraan (2 cm van de bovenrand) als testlijn (1 mm breed) en voeg geit-antimuis IgG (1,5 mg/ml) druppelsgewijs toe op het NC-membraan (2 cm van de onderrand) als controlelijn (1 mm breed). Controleer de hoeveelheid toegevoegd eiwit.
- Bevestig de absorberende pad aan de PVC-plaat boven het NC-membraan en overlap deze met het NC-membraan met 2 mm.
- Dompel het glasvezelmembraan onder in de AuNPs-mAb-geconjugeerde oplossing. Droog het natte membraan in een incubator bij 37 °C.
- Knip het glasvezelmembraan af tot 5 cm lang en 2 cm breed en gebruik het als een geconjugeerde pad.
- Plak de voorbehandelde geconjugeerde pad onder het NC-membraan. De lengte van overlap met het NC-membraan moet 0,1 cm zijn.
OPMERKING: Het glasvezelmembraan heeft een sterk vermogen om eiwitten te binden en vrij te geven. - Trim het fusion 3 membraan tot 1,8 cm lang en 3,5 cm breed en gebruik het als monsterpad.
- Plak het monsterkussen op het PVC-bord en overlap het met het geconjugeerde pad met 2 mm.
- Snijd de geassembleerde karton met behulp van een snijmachine in stroken van 3,5 mm breed en compact met behulp van een batch-lamineersysteem.
- Plaats ten slotte de teststrips in de schaal, verzegel ze in een aluminiumfoliezak met droogmiddel en bewaar ze uit de buurt van licht. De ICS'en zijn nu geassembleerd.
OPMERKING: Het bovenstaande is de laboratoriumprocedure. In de productie worden goudspuitapparatuur en cross-membraaninstrumenten gebruikt om goud te spuiten en de T- en C-lijnen te maken.
4. Kwantitatieve detectie
- Laat 50 μL monsteroplossing op het monstergat vallen om het chromatografieproces te observeren.
OPMERKING: Als gevolg van de capillaire werking die door het absorberende pad wordt aangedreven, migreert de monsteroplossing naar het andere uiteinde van de strip. Wanneer de monsteroplossing het geconjugeerde pad bereikt, reageert de SSD (antigeen) in het monster met de AuNPs-mAb die vooraf op de pad is geladen. Wanneer de oplossing migreert en de T-lijn bereikt, kan de AuNPs-mAb zonder SSD selectief worden vastgelegd door SSD-BSA (antigeen-carrier eiwitconjugaat), weergegeven als een rode kleur op de T-lijn. Vervolgens migreert de oplossing naar de C-lijn, waar de AuNPs-mAb worden gevangen door geiten-anti-muis IgG in de regio, waardoor ze als een rode kleur op de C-lijn worden weergegeven. - Analyseer de strips met een draagbare striplezer. De machine kan de verhouding van de testlijn tot de besturingslijn (T/C) leveren.
- Evalueer de specificiteit, gevoeligheid, herhaalbaarheid en stabiliteit van de ICS-test.
OPMERKING: Bij kwalitatieve detectie geeft één rode lijn een positief resultaat aan (controlelijn). Twee rode lijnen geven een negatief resultaat aan (test- en controlelijnen). Als de controlelijn niet aanwezig is, wordt de test als ongeldig beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering van colloïdaal goud
De bereide colloïdaal goudoplossingen waren claret rood. TEM-analyses werden gebruikt om de morfologie en vorm van AuNPs te bepalen (Figuur 2A-D). Figuur 2A en figuur 2B laten zien dat de deeltjes veelvlakkvormig zijn en gelijkmatig verdeeld. De gemiddelde diameter van AuNP's bleek ongeveer 14 nm te zijn(figuur 2C). Een hoge resolutie TEM (HRTEM) afbeelding van AuNP's wordt getoond in Figuur 2D en Figuur 2E. De HRTEM-afbeelding van een individuele AuNP toont een continu franjepatroon met een afstand van 0,117 nm. De UV-vis absorptiepieken van de vijf gouden colloïdale oplossingen waren 518 nm, 521 nm, 524 nm, 534 nm en 540 nm, waaruit bleek dat de deeltjesgrootte licht toenam met afnemend natriumcitraat (figuur 2F).
Figuur 2 Karakterisering van colloïdaal goud. (A) TEM-afbeelding van AuNPs (100.000× vergroting). (B) TEM-afbeelding van AuNP's (500.000× vergroting). (C) De grootteverdeling van AuNP's. Zoals te zien is op de TEM-afbeelding, varieerden de diameters van de AuNP's van 10 nm tot 18 nm, met een gemiddelde diameter van ongeveer 14 nm. (D, E) Hoge resolutie TEM (HRTEM) afbeelding van AuNP's. De HRTEM-afbeelding van een individuele AuNP toont een continu franjepatroon met een afstand van 0,117 nm. (F) UV-vis absorptiespectra van verschillende AuNP's variërend van 10 nm tot 18 nm. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al.,201821. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Evaluatie van de peilstokken
Gevoeligheid van het ICS
Om de gevoeligheid van ICS te bepalen, werden immunochromatografische strips gebruikt om een verscheidenheid aan verschillende concentraties SSD (150.000, 60.000, 12.000, 2400, 480 en 96 ng / ml) standaardmonsters te detecteren(figuur 3A). Dubbel gedestilleerd water werd gebruikt als controle. In het kwantitatieve experiment werden de strips gescand door een JY1502GS draagbare ICS-lezer(figuur 3B-C). De lineaire regressievergelijking was y = −0,113ln(x) + 1,5451, met een correlatiecoëfficiënt (R2) van 0,983 (figuur 3D). Het vertoonde een goede lineariteit bij 96 ng / ml tot 150 μg / ml. De IC50-waarde was 10,39 μg/ml. In het kwantitatieve experiment werd voorgesteld dat de optimale testtijd 10 minuten was.
Figuur 3 Karakterisering van de laterale-flow immunoassay voor SSD. (A) Foto's van resultaten voor standaardoplossingen met verschillende concentraties SSD getest met behulp van het ICS. (B) Foto van de gematchte colloïdaal goudscan. (C) De intensiteitspatronen van de test- en controlelijnen gescand door het colloïdaal gouden kwantitatieve instrument. (D) Standaardcurve van icELISA voor SSD-bepaling met behulp van de ICS. De regressievergelijking is y = −0,113ln(x) + 1,5451, met een correlatiecoëfficiënt (R2) van 0,983. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al.,201821. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Specificiteit van het ICS
De specificiteit van de ICS werd getest door de kruisreactiviteit met SSD-vergelijkbare verbindingen te evalueren. Tabel 1 toont de kruisreactiviteit van ICS met SSD-gerelateerde verbindingen. Het is duidelijk te zien dat de ICS alleen een lage kruisreactiviteit met SSa had en geen kruisreactie had met andere verbindingen, waaronder SSc, SSb1 of SSb2 (tabel 1), wat aangeeft dat de bereide ICS een hoge specificiteit heeft.
| Monsters | een ICS | bicELISA |
| (%) | (%) | |
| Ssd | 100 | 100 |
| Ssa | 4.30% | 4.97% |
| SSb1 | <0,09 | <0,09 |
| SSb2 | <0,09 | <0,09 |
| Ssc | <0,09 | <0,09 |
Tabel 1. Kruisreactiviteit van verbindingen gemeten door ICS en icELISA. De specificiteit van het ICS werd geëvalueerd door ICS (a) en icELISA (b). Deze tabel is aangepast van Zhang et al.,201821.
Herstelpercentage
Zoals weergegeven in tabel 2was het gemiddelde herstelpercentage 102,05% (gemiddelde ± SD, n = 3). Op basis van de nauwkeurigheid en consistentie was deze test voldoende betrouwbaar voor de bepaling van SSD in biologische monsters.
| SSD-concentratie | Door het testsysteem vastgestelde SSD-concentratie (ng/ml) | Herstel (%) |
| (ng/ml) | ||
| 100 | 135,72 ± 61,97 | 135,72 ± 61,97 |
| 1000 | 926,59 ± 114,24 | 92,66 ± 11,42 |
| 10000 | 11128,16 ± 745,75 | 111,28 ± 14,12 |
Tabel 2. Herstelsnelheid van SSD. Gegevens zijn de gemiddelde ± SD van drievoudmonsters bij elke piekconcentratie van SSD. Het percentage herstel is als volgt berekend: terugvordering (%) = gemeten bedrag/bedrag × 100%. Deze tabel is aangepast van Zhang et al.,201821.
Stabiliteitsanalyse van de ICS-test
Om de stabiliteit van de ICS te evalueren, werden de teststrips die 8 en 16 weken werden bewaard getest en vergeleken met de nieuw voorbereide strips. Tabel 3 laat zien dat de resultaten van de opgeslagen en nieuw bereide strips voor de negatieve en positieve monsters in wezen ongewijzigd waren, wat aangeeft dat het ICS ten minste enkele maanden bij kamertemperatuur kan worden bewaard en geschikt is voor grootschalige promotie en toepassing.
| RSD % | |||
| SSD (ng/ml) | 1 dageen | 4 wekenb | 8 wekenc |
| 125 | 2.41 | 3.11 | 3.51 |
| 250 | 2.52 | 4 | 3.52 |
| 500 | 2.44 | 3 | 5.2 |
| 1000 | 3.12 | 2.71 | 4.5 |
Tabel 3. Variaties tussen ICS gebruikt voor de analyse van SSD. aDe waarden geven variantiecoëfficiënten aan voor drievoudmonsters op 3 verschillende stroken die 1 dag na de vervaardiging worden gebruikt. b De waarden geven variantiecoëfficiënten aan voor drievoudmonsters op 3 verschillende stroken die worden gebruikt na 4 weken te zijn bewaard. c De waarden geven variantiecoëfficiënten aan voor drievoudmonsters op 3 verschillende stroken die worden gebruikt na 8 weken te zijn bewaard. Deze tabel is aangepast van Zhang et al.,201821.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk presenteren we een protocol voor de bereiding van mAbs tegen van natuurlijke producten afgeleide kleine moleculen. De essentiële stappen en de zaken die aandacht nodig hebben in de procedure zijn geschetst en we hebben het nut van dit protocol aangetoond met behulp van het kleine molecuul SSD als voorbeeld. Voorbeeldspectra, TEM-beelden, kwantitatieve resultaten en methodologisch onderzoek worden weergegeven in representatieve gegevens. Daarom hebben we aangetoond dat de colloïdaal goudproductie, AuNP-mAb-conjugatie en stripassemblagestrategie die hier wordt gepresenteerd, resulteren in de creatie van een nieuwe immunoassay die kan worden gebruikt om het doelmolecuul snel te detecteren.
Immunochromatografische strips zijn eenvoudig te bedienen en de reactie is zeer snel. Er is slechts 50 μL monster nodig en de detectie is binnen 5 minuten voltooid. Daarentegen vereist de ELISA-methode, die ook een immunoassay is, enkele uren, inclusief meerdere wasbeurten en lange incubaties. Meerdere wasbeurten en lange incubatietijden kunnen de niet-specifieke reactie van de monstermatrix effectief verwijderen om de signaal-ruisverhouding en de gevoeligheid te verbeteren door de signaalwaarde te verhogen. Dit betekent dat het anti-interferentie vermogen en de optimalisatietechnologie van tomografisch papier de belangrijkste problemen zijn die in deze studie moeten worden opgelost. Technologische optimalisaties kunnen op verschillende manieren worden bereikt. Selecteer geschikte materialen voor het monsterkussen en het geconjugeerde pad. De lengte van het monsterkussen werd op de juiste manier vergroot om het voorbehandelingsvermogen van het monster effectief te verbeteren. Hoge pH, hoge ionische sterkte en hoge buffercapaciteit van materiaalvoorbehandeling kunnen worden gebruikt om beïnvloedende factoren zoals de antigeen-antilichaamrespons van de pH-waarde van het biologische monster te voorkomen. Aangezien de voorwaardelijke instelling van "drie hoog" de binding van antilichamen kan verstoren, moet deze uitgebreid worden overwogen.
Bovendien is het ook belangrijk op te merken dat een monoklonaal antilichaam (mAb) de sonde op de strip is. Daarom is deze procedure geassocieerd met de gevoeligheid van de mAb. De mAb die we hebben toegepast, is voorbereid in ons vorige werk17, en mAb-productie kan worden vermeld in onze vorige publicatie19.
Colloïdale op goud gebaseerde immunochromatografische strips zijn veel gebruikte strips omdat ze goedkoop zijn en handige detectie bieden. Deze methode heeft echter zijn eigen beperkingen en stabiliteitsproblemen. De signaalsterkte van AuNP's is lager dan die van fluorescerende kleurstoffen, colloïdaal koolstof en andere markers, wat betekent dat de gevoeligheid beperkt is. Bij blootstelling aan lucht veranderen de AuNP's van wijnrood naar paars, wat een verandering in de grijswaarde zal veroorzaken en de kwantitatieve detectie zal beïnvloeden. Vandaar dat er verschillende gemodificeerde immunochromatografische strips zijn ontstaan, en we hebben ook quantum dot-gelabelde fluorescerende strips22 en op IgY gebaseerde immunochromatografische strips23voorbereid , die vergelijkbare procedures voor productie hebben.
Immunoassays op basis van membraan zijn op grote schaal gebruikt in klinische indicatoren, infectieziekten, residuen van bestrijdingsmiddelen en monitoring van de concentratie van geneesmiddelen. In dit protocol hebben we ons gericht op de voorbereiding van een op AuNP gebaseerde methode voor natuurlijke producten met kleine moleculen. Deze procedure fungeert als een sjabloon voor de ontwikkeling van verschillende doelimmunoassays die effectief kunnen worden gebruikt als analytische hulpmiddelen voor de evaluatie en kwaliteitscontrole van natuurlijke producten.
Dit werk biedt een gedetailleerd protocol voor de ontwikkeling van laterale-flow immunoassays op basis van immuunchromatografische strips voor gebruik bij de snelle, gevoelige en kwantitatieve detectie van kleine moleculen. Deze procedure omvat de bereiding van colloïdaal goud, synthese van AuNP-mAb-conjugaten, assemblage van de strip en methodologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Speciale Fondsen voor Fundamenteel Onderzoek fondsen van instellingen voor hoger onderwijs verbonden aan centrale afdelingen. We waarderen de steun van classical prescription basic research team van de Beijing University of Chinese Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
References
- Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
- Chang, H. -F., Wang, J. -Q., Wang, B., Deng, A. -P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
- Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
- Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
- Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for 'quality-control' assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
- Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
- Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. Guo, H., et al. , US20040184954A1 (2003).
- Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
- Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
- Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
- Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
- Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
- Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
- Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
- Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
- Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
- Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
- Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
