Summary
本文介绍了一种使用光学透明硅胶窗口进行长期活体内成像的方法，该窗口可以直接粘附在感兴趣的组织/器官和皮肤上。这些窗户比目前在该领域使用的其他窗户更便宜，用途更广，手术插入对动物造成有限的炎症和痛苦。
Abstract
活体显微镜 （IVM） 能够以单细胞分辨率可视化细胞运动、分裂和死亡。通过手术插入的成像窗口进行IVM特别强大，因为它允许在数天至数周内纵向观察同一组织。典型的成像窗口包括一个玻璃盖玻片，该盖玻片位于缝合到小鼠皮肤的生物相容性金属框架中。这些窗户会干扰小鼠的自由运动，引起强烈的炎症反应，并且由于玻璃破碎或缝合线撕裂而失效，其中任何一个都可能需要安乐死。为了解决这些问题，从聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜中开发了用于长期腹部器官和乳腺成像的窗口，PDMS是一种以前用于颅骨成像窗口的光学透明硅胶聚合物。这些窗口可以直接粘在组织上，减少插入所需的时间。PDMS是灵活的，随着时间的推移，有助于其在小鼠中的耐久性 - 已经测试了长达35天。纵向成像是在不同会话期间对同一组织区域进行成像。在窗户内嵌入了一个不锈钢网格，以定位同一区域，从而可以在相同的位置可视化动态过程（如乳腺内卷积），相隔数天。该硅胶窗口还允许监测单个播散性癌细胞随时间发展成微转移瘤。本研究中使用的硅胶窗户比金属框架玻璃窗户更容易插入，并且会引起成像组织的有限炎症。此外，嵌入式网格允许在重复的成像过程中直接跟踪相同的组织区域。
Introduction
活体显微镜（IVM）是麻醉动物组织的成像，可以深入了解完整组织中细胞分辨率下生理和病理事件的动力学。该技术的应用差异很大，但IVM在癌症生物学领域发挥了重要作用，有助于阐明癌细胞如何侵入组织和转移，与周围的微环境相互作用，并对药物1，2，3作出反应。此外，IVM 通过提供与 离体 分析方法（例如流式细胞术）相辅相成的见解，成为促进对控制免疫反应的复杂机制理解的关键。例如，活体成像实验揭示了免疫功能的细节，因为它们与细胞迁移和细胞 - 细胞接触有关，并提供了一个平台来量化响应损伤或感染的时空动力学4，5，6，7。其中许多过程也可以通过组织学染色进行研究，但只有IVM允许跟踪动态变化。事实上，虽然组织学切片提供了给定时间组织的快照，但活体成像可以随着时间的推移跟踪同一组织内的细胞间和亚细胞事件。特别是，荧光标记的进展和分子报告基因的发展使分子事件与细胞行为相关，例如增殖，死亡，运动性以及与其他细胞或细胞外基质的相互作用。大多数IVM技术都基于荧光显微镜，由于光散射，这使得更深层组织的成像具有挑战性。因此，感兴趣的组织通常需要通过通常侵入性和终末期手术进行手术暴露。因此，根据器官部位的不同，组织可以连续成像一段时间，从几个到40小时8不等。或者，手术插入永久性成像窗口允许在几天到第7，9周的时间内按顺序对同一组织进行成像。
新型影像学窗口的开发已被强调为进一步改进活体成像方法的技术需求10.典型的活体成像窗口是一个金属环，其中包含用缝合线11固定在皮肤上的玻璃盖玻片。干扰自由运动，渗出物的积聚以及对玻璃盖玻片的损坏是使用此类窗户的常见问题。此外，原型窗口需要专门的生产，外科手术可能需要广泛的培训。为了解决这些问题，聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一种有机硅聚合物，其先前已用于颅窗中用于大脑12的长期成像，被改编用于腹部器官和乳腺成像。在这里，介绍了生成基于PDMS的硅胶窗口的详细方法，包括如何将窗口投射到不锈钢网格周围，以便为相同组织区域的重复成像提供特征。此外，还描述了一种将窗户插入腹部器官或乳腺的简单，无缝合的外科手术。这种新方法克服了目前使用的成像窗口的一些最常见问题，并增加了纵向活体腔内成像的可及性。
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Protocol
所有描述的程序均按照冷泉港实验室外科指南进行，并已获得冷泉港实验室机构动物护理和使用委员会的批准。
1.铸造硅胶窗
- 通过将基弹性体和固化剂以10：1（v / v）的比例混合来制备有机硅聚合物（PDMS）。
- 通过在无菌，光滑的表面上沉积少量PDMS来铸造窗口，并将体积面积比调整为所需的厚度。
注意：在24孔板盖的盖子上使用200mg聚合物溶液进行直径为22 mm的圆，可以在窗口坚固性和光学清晰度之间取得良好的平衡。 - 可选：为了为相同组织区域的重复成像提供标志，在PDMS位于所需的铸造表面上后，将不锈钢网格轻轻按压到硅胶中。
- 要去除气泡，请将涂层表面置于真空干燥器中45分钟以对聚合物进行脱气。
- 在80°C的烤箱中固化硅胶窗口45分钟。
- 在模具边缘划上聚合物，然后用镊子从用于铸造的表面轻轻剥离固化的窗口。
- 手术前，通过高压灭菌对窗户进行灭菌。
2. 准备鼠标以插入硅胶窗口
- 使用4%（v / v）异氟醚在诱导室中麻醉小鼠。将小鼠移动到手术台上的加热垫上，将小鼠放在麻醉鼻罩中，并将异氟醚浓度降低至2%，以便在整个手术过程中进行维护。
- 通过捏住后肢的脚趾来检查麻醉的深度。在鼠标处于非活动状态且未显示脚趾捏合反射反应之前，请勿继续操作。
- 在眼睛上涂抹眼部润滑剂，以防止眼睛干燥并防止创伤。
- 皮下注射先发制人镇痛（丁丙诺啡0.05mg / kg）。
- 剃除手术部位，用脱毛膏完全去除毛发。
- 连续3次使用聚维酮碘溶液（10%v / v）和乙醇（70%v / v）以防止手术部位感染。
3.插入腹腔窗口用于肝脏成像;适用于其他腹部器官（图1）
- 将鼠标置于仰卧位。
- 使用无菌剪刀和镊子从xiphoid过程向下3毫米开始做一个10毫米的切口。
- 沿中线去除1-1.5厘米2 厘米的皮肤。
- 使用第二对无菌剪刀和镊子去除腹膜的一部分，该部分略小于皮肤部分。
- 可选：为了观察肝脏的较大部分，使用用无菌盐水润湿的无菌棉签将肝脏从隔膜向下推，露出连接肝脏和隔膜的恶性韧带。切断韧带，注意不要切开下腔静脉。
- 用31G注射器取出手术粘合剂，将其少量涂在要成像的区域边缘周围的肝脏表面上。这种粘合剂形成圆形密封，使中心区域完好无损，便于成像。
注意：将粘合剂限制在成像区域周围形成圆形图案的小液滴上。与粘合剂直接接触的组织无法成像。在应用粘合剂之前，没有必要干燥组织。
注意：任何氰基丙烯酸酯基粘合剂都可以成功用于此程序。手术粘合剂确保无菌。对于终端程序，通用超级胶水会产生良好的效果。 - 使用镊子定位窗口并将其牢固地固定在肝脏上，直到粘合剂干燥（约2分钟）。
- 将窗的边缘折叠在腹膜下。
- 使用注射器，将少量手术粘合剂沉积在窗的边缘，这些边缘现在位于腹膜下方。用镊子向下推腹膜，将其固定在窗户上。
- 同样，将少量手术粘合剂沉积在腹膜上，然后用镊子向下推至皮肤以将其固定在腹膜上。
注意：如果执行正确，现在可以通过窗户看到肝脏组织的圆形区域。 - 在窗户边缘周围涂上胶水，形成一个边缘，有助于防止皮肤在窗户上长回来。
注意：如果使用无菌手术技术进行手术，并且在插入之前对窗户进行消毒，则用手术粘合剂密封伤口足以避免感染。然而，在手术插入或不完美的闭合过程中未能遵循适当的无菌技术可导致明显的或亚临床感染和组织干燥。
4.在肝脏中插入侧窗进行成像;与门静脉中同时注射癌细胞兼容（图2）
- 将鼠标放在左侧侧卧位
- 使用无菌剪刀和镊子在肋弓下方3毫米的右侧侧翼切开10毫米的切口。
- 取下1厘米2 段皮肤。
- 使用第二对无菌剪刀和镊子去除腹膜的一部分，该部分略小于皮肤部分。
- 用31G注射器取出手术粘合剂，将其少量涂在要成像的区域边缘周围的肝脏表面上。
注意：将粘合剂限制在成像区域周围形成圆形图案的小液滴上。与粘合剂直接接触的组织无法成像。
注意：任何氰基丙烯酸酯基粘合剂都可以成功用于此程序。手术粘合剂确保无菌。对于终端程序，通用超级胶水会产生良好的效果。 - 使用镊子定位窗口并将其牢固地固定在肝脏上，直到粘合剂干燥（约2分钟）。
- 将窗的边缘折叠在腹膜下。
- 使用注射器，将少量手术粘合剂沉积在窗的边缘，这些边缘现在位于腹膜下方。用镊子向下推腹膜，将其固定在窗户上。
- 同样，将少量手术粘合剂沉积在腹膜上，然后用镊子向下推至皮肤以将其固定在腹膜上。
注意：如果执行正确，现在可以通过窗户看到肝脏组织的圆形区域。 - 在窗户边缘周围涂上胶水，形成一个边缘，有助于防止皮肤在窗户上长回来。
- 如果需要门静脉注射：
- 将鼠标置于仰卧位。
- 从皮肤中的xiphoid过程开始做一个10毫米的切口。
- 使用第二对无菌剪刀和镊子，在腹膜上切开10毫米。
- 将两根棉签浸入无菌盐水中。
- 使用棉签轻轻地将肠道拉到用无菌盐水润湿的无菌纱布上，注意不要扭曲或以其他方式扰乱方向。
- 继续将肠道从腹腔移开，直到在腹部右侧可见门静脉。
- 将31-33 G针5-7mm尾部插入门静脉进入肝脏的入口点，确保在血管内而不是通过血管。
- 缓慢注射癌细胞（重悬于100μL无菌PBS中）。
注意：对于该实验，阿穆林胰腺癌细胞系（例如，KPC-BL / 6-1199）可以在完整的DMEM培养基中培养，并在100μL无菌PBS中注射1×105 个细胞。 - 为了防止出血，在拔出针头后立即用一小块手术海绵对注射部位施加轻柔的压力1-2分钟。
- 释放压力后，监测部位1-2分钟以确保止血。
- 使用湿润的棉签，按照器官的生理方向将肠道返回到腹腔中。
- 使用无菌镊子，将窗口立即插入腹膜下方，在小鼠腹腔的左侧。
- 用4-0丝缝合线缝合，用7毫米不锈钢缠绕夹钉住中线切口。
- 将鼠标移动到左侧侧卧位
- 使用无菌剪刀和镊子在肋弓下方3毫米处通过皮肤在右侧侧翼切开10毫米的切口。
- 切口周围1 cm2 的皮肤。
- 使用第二对无菌剪刀和镊子去除腹膜的一部分，该部分略小于皮肤部分。
- 将窗口拉到肝脏上，然后将其粘合到位，如步骤4.8-4.10所述。
5.在胰腺中插入用于成像的窗口（图3）
- 将鼠标放在右侧的侧卧位。
- 使用无菌剪刀和镊子在肋弓下方3毫米的左侧侧翼切开10毫米的切口。
- 切口周围1 cm2 的皮肤。
- 使用第二对无菌剪刀和镊子去除腹膜的一部分，该部分略小于皮肤部分。
- 使用浸泡有无菌盐水的无菌棉签，轻轻拉动脾脏以观察胰腺。继续用湿润的棉签重新定位胰腺，使更多的表面积通过切口可见。
注意：在这一点上，如果胰腺癌细胞是实验设计的一部分，则可以将其原位注射到胰腺中。 - 用31 G注射器取出手术粘合剂，将其少量涂抹在要成像的区域边缘周围的胰腺表面上。
注意：将粘合剂限制在成像区域周围形成圆形图案的小液滴上。与粘合剂直接接触的组织无法成像。 - 使用镊子定位窗口并将其牢固地固定在胰腺上，直到粘合剂干燥（约2分钟）。
- 将窗的边缘折叠在腹膜下。
- 使用注射器，将少量手术粘合剂沉积在窗的边缘，这些边缘现在位于腹膜下方。用镊子向下推腹膜，将其固定在窗户上。
- 同样，将少量手术粘合剂沉积在腹膜上，然后用镊子向下推至皮肤以将其固定在腹膜上。
注意：如果执行正确，现在应该通过窗口可以看到胰腺组织的圆形区域。 - 在窗户边缘周围涂上胶水，形成一个边缘，有助于防止皮肤在窗户上长回来。
6.将窗口插入乳腺进行成像（图4）
- 将鼠标放在仰卧位上。
- 使用无菌剪刀和镊子在其中一个腹股沟上做一个 10 毫米的切口。
- 去除乳腺上方0.5 cm2 的皮肤。
- 使用第二把无菌剪刀，通过将剪刀在两个表面之间展开以破坏粘附，小心地将乳腺与皮肤分开。
注意：为了便于腹股沟乳腺区域的成像，请注意剖析乳腺上方但优于后腿的一部分皮肤，因此窗口不会限制小鼠的活动性。 - 用31 G注射器取出手术粘合剂，将其少量涂在要成像区域边缘周围的乳腺表面上。
注意：将粘合剂限制在成像区域周围形成圆形图案的小液滴上。与粘合剂直接接触的组织无法成像。 - 使用镊子定位窗口并将其牢固地固定在乳腺上，直到粘合剂干燥（约2分钟）。
注意：如果操作正确，现在可以通过窗户看到乳腺组织的圆形区域。 - 将窗口的边缘折叠在皮肤下。
- 使用注射器，将少量手术粘合剂沉积在现在皮肤下方的窗户边缘上。用镊子向下推皮肤，将皮肤固定在窗户上。
- 在窗户边缘周围涂上胶水，形成一个边缘，有助于防止皮肤在窗户上长回来。
7. 术后恢复
- 将小鼠放在具有充足筑巢材料的清洁回收笼中，确保笼子的一部分放在加热垫上。
- 持续监视鼠标，直到它有意识和移动。
- 如果需要，在先发制人的剂量后12小时提供额外剂量的镇痛药。
注意：额外的镇痛通常是不必要的，但如果老鼠表现出痛苦的迹象（如驼背，皮毛凌乱或对食物失去兴趣），请咨询兽医。在手术后的前3天每天监测小鼠的感染或其他不良反应的迹象。不到2%的小鼠需要兽医关注或安乐死，通常是由于窗户的部分脱离。重要的是要注意，对于具有腹侧肝脏成像窗口的雄性小鼠，小鼠之间的战斗可导致窗口脱离。通过单独容纳小鼠可以避免这种情况。
8. 透过窗户成像
- 使用4%（v / v）异氟醚在诱导室中麻醉小鼠。
- 在眼睛上涂抹眼部润滑剂，以防止眼睛干燥并防止创伤。
- 将鼠标从诱导室移动到显微镜载物台。将小鼠置于麻醉鼻罩中，并将异氟醚浓度降低至约1-1.5%，以便在整个成像过程中维持麻醉。
- 将压力垫传感器放在鼠标下方以监测呼吸频率，并使用软手术胶带将鼠标固定到舞台上。
- 插入直肠温度计，在整个成像过程中监测体温。
- 打开加热垫，密切监测鼠标，确保体温不超过37°C。
- 利用软件来监控鼠标的呼吸频率。最佳速率约为 1 次呼吸/秒。根据需要调整麻醉。
- 在每次成像之前，用浸有70%乙醇（v / v）的棉签轻轻擦拭窗口，以清洁任何残留的镜头浸入介质和碎屑。
- 使用水浸透镜时，将超声波凝胶涂在窗户上，避免气泡。
注意：也可以使用蒸馏水，但在成像过程中可能需要重新涂抹。 - 要找到成像的最佳深度，首先，找到网格并将其放在焦点上。
- 通过将网格的底部设置为 0 来确定近似的组织成像深度。此信息对于在后续成像会话中定位相应的 z 平面是必需的。
- 要在多个成像会话中识别同一位置，请使用网格上的方块作为参考点。在成像过程中，请注意网格的方向和网格内每个视场的位置（例如，从顶部开始第 2行，从左侧开始第 4个正方形）。
- 在连续的成像会话期间，使用网格导航回特定的网格区域，从而成像字段。
- 每次成像后，用浸有70%乙醇（v / v）的棉签轻轻擦拭窗户，去除任何残留的镜头浸入介质和碎屑。
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Representative Results
通过成像窗口的活体成像可用于在数小时至数周内以单细胞分辨率观察，跟踪和量化各种细胞和分子事件。成像窗口的理想特征包括：a）对小鼠健康和组织生理学的影响有限;b） 耐久性;c） 插入简单;d）清晰的标记，用于重复成像同一区域。结果是一个多功能的惰性硅胶窗口，易于生产和插入，并且可以配备网格，以在多个成像会话的范围内定位相同的视场。
该窗口由PDMS制成，PDMS是一种廉价，灵活且透明的材料。窗户可以铸造大多数实验室广泛购买的耗材。出于这些目的，已经蚀刻在市售24孔板盖子上的圆形模具（直径22 mm）工作良好。通过改变单位面积使用的聚合物量，可以调整窗口的厚度。为了记录窗口厚度对成像分辨率的影响，对40nm荧光微球进行了点扩散函数（PSF）分析，以比较通过不同厚度的PDMS窗口进行的成像与通常用于活体内成像窗口（0.17mm厚）的玻璃盖玻片。为了复制用于活体成像的设置，PSF成像使用相同的双光子显微镜和水浸透镜进行，并应用超声凝胶作为浸入介质。
通过PSF在侧平面中的拟合计算的信号强度的全半最大值全宽（FWHM）与使用100 mg PDMS铸造的PDMS窗口的玻璃相当（图5A，B）。与玻璃盖玻片相比，使用150-250 mg PDMS铸造的窗户的横向分辨率降低（图5A，B）。在z轴图像平面中，用100-200 mg聚合物铸造的PDMS窗口比玻璃盖玻片性能更好（图5C）。在用300 mg PDMS铸造的窗口中，光学清晰度丢失，使得测量不可靠（图5A-C）。FWHM值的X / Y比率在任何厚度的玻璃和PDMS之间都没有显着差异，尽管使用超声凝胶作为浸入介质的200-250mg聚合物浇注的窗口的比例明显偏离1（图5D）。然而，当使用水作为200mg的窗户铸件的浸渍介质时，与对称性的偏差要小得多。因此，在这种厚度下，由于聚合物中的像差引起的偏差可能是很小的。还收集了每个微球的峰值荧光强度值，并显示玻璃和PDMS的表现相当，尽管通过玻璃记录了最高的信号（图5I）。PDMS窗口的最佳厚度将取决于特定的应用和成像系统。对于大多数用途，对于直径为22 mm的圆形窗口，200 mg聚合物溶液是窗口坚固性和光学清晰度之间的最佳折衷方案。事实上，用小于200mg的窗户投射在光学上更清晰，FWHM值与玻璃相似，但在手术植入过程中偶尔会撕裂，而使用200mg（在>100只小鼠中）没有观察到窗口损伤的情况。
为了测量材料性能的这些差异，PDMS窗口（200 mg和150 mg）在1N / s的负载控制曲线下加载到伺服液压材料试验机中，直到材料失效（图5J）。力和位移值是在100 Hz的频率下测量的。然后使用方程将力-位移数据转换为应力-应变：
σ = F / A （1）
Ɛ = ΔL / L0 （2）
其中σ是应力（Pa），F是力（N），A是窗口的横截面积，Ɛ是应变，ΔL是位移，L0 是窗口的厚度。通过计算应力-应变曲线下的求和面积来确定材料的韧性。材料的韧性是指其在断裂前的塑性变形和吸收能量的能力- 这是植入窗户13的关键特性。与成像实验期间的观察结果一致，用200mg PDMS铸造的窗户比用150mg铸造的窗户具有显着更大的韧性（图5K），因此不易断裂。
接下来，通过提取应力 - 应变曲线的线性区域并使用胡克定律确定斜率，确定了200 mg的首选PDMS窗口的杨氏模量（E），并与标准玻璃盖玻片的模量进行了比较：
σ = EƐ （3）
杨氏玻璃窗的模量明显大于PDMS，这是预期的，因为玻璃在材料强度上比PDMS更刚性（图5L）。因此，尽管玻璃是一种基于其更大的杨氏模量的更坚固的材料，但200毫克PDMS窗口的更大韧性支持它们可以应用更长的时间，而不会有破裂的风险，并且需要第二次外科手术或安乐死。
硅胶窗的一个主要优点是多功能性。重要的是，手术插入窗户的程序可以很容易地根据不同的解剖位置进行定制。窗户可以用手术剪刀轻松调整尺寸，并且窗户粘在感兴趣的组织/器官表面和皮肤上，从而完全消除了对缝合线的需求，从而促进了对手术的适应。以这种方式成功插入窗户已经实现了肝脏，胰腺和乳腺（图6A-C）。特别是，开发了两种不同的方案来植入腹侧或侧窗进行肝脏成像。 图1 显示了插入腹窗的步骤。该过程可以适用于其他腹部器官，并将产生最大的可成像表面积。然而，除非需要大面积（>1 cm2）的可成像区域，否则优选在小鼠的右侧插入侧窗（图2）以减少运动伪影，例如，由于呼吸和蠕动。此外，插入侧向成像窗口的外科手术与门静脉中同时注射癌细胞相容，以实验模拟肝转移的发展。因此，当同一动物需要插入腹腔静脉注射和腹部成像窗口时，小鼠可以进行单个程序而不是两个单独的程序。类似的程序用于在小鼠左侧的胰腺上植入一个窗口（图3）。该窗口也可以插入皮下组织，即正常的乳腺，以及已经建立的自发性或原位移植的乳腺肿瘤（图4）。或者，癌细胞可以通过窗口注射到乳腺中，以纵向跟随原发性肿瘤的发展，因为针头可以刺穿PDMS膜而不会影响窗口的完整性。
由于重量轻且柔韧性低，硅胶窗不会干扰鼠标的移动性（影片1）。因此，硅胶窗户克服了与玻璃窗相关的主要障碍，例如易碎性，复杂的缝合以及对动物活动性的影响。相反，与硅胶窗户相关的主要限制是窗户下方上皮的再生。然而，当去除适量的皮肤并用胶水完全密封伤口时，再上皮化受到限制，并且成像可以长时间持续（测试长达35天， 图6D）。插入窗口后，可以纵向成像小鼠约一个月或直到手术粘合剂失效或发生再上皮化。每日影像学时间短（约 60 分钟）或频率较低但较长的影像学检查时间较为可取，以避免麻醉引起的不良反应。带有窗户的动物可以通过单光子或多光子共聚焦显微镜在任何活体内成像平台上使用标准程序进行成像（参见，例如，14）。在每次成像之前和之后，建议用浸有70%乙醇（v / v）的棉签擦拭窗户上的污垢和碎屑。
为了随着时间的推移跟踪相同的位置，不锈钢网格可以嵌入窗户内。 图7A 显示了此处使用的定制激光蚀刻网格的规格。用于透射电子显微镜的商用网格也适用于此应用。在铸造过程中，网格嵌入窗口内，并且在成像区域上肉眼（图7B）和通过显微镜的目镜都清晰可见（图7C）。由于窗口粘在器官表面，因此成像场相对于网格的位置是稳定的。在成像过程中，请注意网格的方向和成像的每个视场的网格内的位置（例如，从顶部开始第 2 行，从左侧开始第 4 个正方形）。接下来，在连续的成像会话期间，使用网格导航回特定的网格区域，从而导航回成像字段。
该网格还可用于在成像过程中对齐成像场，当组织由于呼吸或蠕动等原因而缓慢漂移时。在成像过程中，大多数具有刚性轮辋的成像窗口都可以固定在支架上，从而增加了成像区域的稳定性。由于柔性窗口不能直接稳定，因此使用手术胶带来稳定包含窗口的身体部分，并且成像区域以定义的间隔（通常每30分钟）重新对齐到相应的网格正方形或先前识别的组织特征点（例如血管特征点）的中心。在采集后阶段，通过基于检测到的组织模式重新对齐帧的代码（补充代码1-2），以数字方式执行视场微观偏移的进一步漂移校正。
为了验证窗口不会引起任何明显的全身不良反应，监测了接受过窗口植入和未经治疗的年龄匹配对照的动物的体重。在与手术相关的初始体重减轻后，大多数插入窗户的小鼠随着时间的推移继续增加体重，表明窗户插入具有良好的耐受性（图8A-C）。对于肝脏和乳腺窗口，正常体重在手术后5天内恢复。在胰腺上植入窗口后，术后恢复较慢，小鼠在14天内恢复到术前体重。这一观察结果与手术时与胰腺操作相关的预期效果一致。请注意，即使在体重减轻未达到人道终点阈值的情况下，未恢复术前体重的小鼠（占所有小鼠的<5%，以 图8B中的*所示的小鼠为例）通常从成像实验中审查。此外，与对照组相比，在窗口插入后的不同时间点确定的白细胞计数在几乎任何持窗小鼠中都没有改变，并且不会随时间而发生显着变化（图8D），这表明该窗口不会引起主要的全身炎症。
接下来，为了评估局部组织对窗口和胶水的反应程度，在手术插入窗口后，在3，14和28（乳腺窗口）或35天（肝脏和胰腺窗口）处对小鼠进行安乐死以进行组织学分析。对苏木精和曙红（H&E）染色肝脏切片的评估显示，对于大多数小鼠来说，在窗户下形成浅表（20-80μm），最小至轻度的囊膜肉芽组织形成（在第3天评估的3只小鼠中有2只，在第14天评估的3只小鼠中有2只）。这些病变是局灶性的（长度为1-3mm），大约对应于胶层的宽度（图8E）。35天后，大多数小鼠（在两个单独的实验中评估的6只中有4只）没有颗粒状组织，而少数（6只中的2只）具有中度局灶性包膜硬化症和脱脂症（深度为25-250μm）。有趣的是，在九只小鼠队列中，在窗口正下方的胰腺表面上没有观察到显着的病变（图8G）。然而，一些小鼠在胰腺中显示出萎缩的区域和腹部脂肪中的炎症（脂肪炎），这与操作诱导的损伤一致。对于乳腺，在窗口植入后的第3天，3只小鼠中有3只具有肉芽组织，使其产生沿着腺体表面可见的愈合切口或脂肪组织中的炎症反应;在第14天，评估的3只小鼠中有3只具有肉芽组织。这些病变再次是局灶性的，长度为1-3mm（图8I）。乳腺窗口安乐死小鼠术后28 d未出现明显的组织学异常。
该分析表明，该窗口不会损害所测试器官（肝脏，胰腺，乳腺）的整体生理结构。在肝脏和乳腺表面发现的反应性组织可能是对胶水的反应，并且仅限于与粘合剂直接接触的组织。在不暴露于胶水的区域中，可以很容易地发现正常组织与反应组织相邻（<100μm）（图8E，I），因此组织炎症不会干扰健康组织区域的成像。此外，组织反应可能是可逆的，因为大多数小鼠（9只小鼠中有8只，跨越所有组织位置）在晚期时间点（28或35天）没有显示出显着的病变，尽管如果没有对个体小鼠进行纵向测量，则很难直接确认组织反应消退。
还对CD45，CD68和髓过氧化物酶（MPO）进行多重免疫组织化学染色，以分别表征白细胞，单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞的浸润。在乳腺和肝脏中观察到与肉芽组织和脂肪炎相关的免疫细胞浸润的增加，但在胰腺中则不见（图8F，H，J）。 值得注意的是，这些变化可能是短暂的，因为免疫细胞浸润在最后一个时间点（乳腺窗口为28天，肝脏和胰腺窗口为35天）与未经治疗的对照组相当。
选择肝脏作为位点，以进一步表征窗口插入和成像是否使用成像引起显着的局部免疫浸润。为此，使用 c-fms-EGFP （MacGreen）小鼠15，其中骨髓细胞（主要是巨噬细胞）用绿色荧光蛋白标记。将肝窗植入三只 c-fms-EGFP 小鼠中，并在手术后的第1，3和5天使用网格定位相同的视野对它们进行成像。在窗口插入后，成像区域中存在的巨噬细胞数量不会随时间而发生显着变化（图8K）。
接下来，通过在细胞水平（即运动，增殖，细胞 - 细胞接触）和组织水平（即胰腺中的肿瘤生长，乳腺退化期间的免疫浸润和肝转移）上对窗口进行功能测试。胰腺不是一个容易接近的成像位置。为了证明如何利用该窗口来捕获该器官中的癌细胞动力学，在原位注射KPC-BL / 6-1199细胞的同时，将窗口插入六只C57BL / 6J小鼠的胰腺上，KPC-BL / 6-1199细胞是一种来自常用KPC（KrasLSL-G12D / + ;p 53LSL-R172H;KPC-BL/ 6-1199细胞的胰腺癌细胞系，Pdx1-Cre） 胰腺癌的基因工程小鼠模型。为了通过共聚焦显微镜观察，KPC-BL / 6-1199细胞被设计为表达多西环素诱导的增强GFP（iGFP-1199细胞）。注射后六天，将小鼠置于多西环素日粮中以触发胰腺癌细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达。 图9 显示了注射和窗口插入后第11天和第14天正位注射iGFP-1199细胞的小鼠的代表性图像。 影片2 显示了iGFP-1199肿瘤边缘，摘录了窗口插入后第11天的2小时成像过程，说明了使用硅胶窗口捕获胰腺中细胞膜投射动力学的能力。
硅胶窗口还可用于捕获随时间推移的动态免疫细胞浸润。为了说明这一点，乳腺窗口入哺乳期 ACTB - ECFP （ Tg （ CAG - ECFP ） CK6Nagy ） ; LysM-eGFP（Lyz2tm1.1Graf） 小鼠在断奶后立即进行。在这些小鼠中，所有细胞，但大多数高度上皮细胞，表达由β肌动蛋白启动子驱动的青色荧光蛋白（CFP），而骨髓细胞 - 主要是嗜中性粒细胞，但也有巨噬细胞 - 由溶菌酶M启动子驱动的eGFP标记。在窗口插入后的第2天和第4天，在乳腺退化过程中，当乳腺组织开始恢复到其怀孕前状态时，对小鼠进行成像。为ImageJ开发了两个宏来减少运动伪影并改善可视化，一个在4维活体内视频中对齐Z平面（补充代码1），另一个减少由于呼吸或其他运动伪影引起的摆动（补充代码2）。 图10 和 Movie 3A-C 显示了第2天和第4天在同一位置的重塑乳腺组织内的中性粒细胞浸润，说明了如何使用该窗口来监测和跟踪不同日子的免疫细胞浸润和运动。在 c-fms-EGFP 小鼠中进行了类似的实验， 骨髓细胞（主要是巨噬细胞）表达由c-fms启动子驱动的GFP（电影4）。
最后，该可定制窗口的相对较大的表面积允许观察罕见事件，例如静脉接种后肝转移的形成。为了证明这种现象，在门静脉注射时，用KPC-BL / 6-1199胰腺癌细胞组成表达核融合蛋白组蛋白组蛋白组蛋白2B-CFP（H2B-CFP）时，将肝窗插入C57BL / 6J小鼠中。随着时间的推移，监测了单个细胞和2-3个细胞的小簇在发育成微转移酶（>100个细胞）时的生长。 图10 显示了注射和窗口插入后第1，3，7和9天拍摄的代表性图像，并展示了从单细胞到微转移的进展。
所有图像和电影都是使用多光子显微镜收集的。使用ImageJ软件生成沿Z轴和X轴随时间变化的最大强度投影和电影对齐。然后使用Imaris软件编译对齐的图像和电影。
图1：在 肝脏上手术插入腹侧腹部成像窗口。 （A）漫画显示了与手术相关的结构的解剖位置。白色虚线框勾勒出图片中观察到的手术区域。（B）从剑突下方3毫米开始做一个切口，然后继续向下，以便沿着中线去除1-1.5厘米2 厘米的皮肤。（C）切除腹膜的较小部分。（D）恶性韧带（白色箭头）被切断，将肝脏向下推。注意：用无菌盐水润湿的棉签用于轻轻地操纵内脏器官。（E）使用注射器，在肝脏表面感兴趣区域周围的液滴中施加少量手术粘合剂。（F）将窗口定位并牢固地固定在肝脏上，直到粘合剂干燥（2分钟）。（G）窗户的边缘折叠在腹膜和皮肤下。（H）为了将窗户固定在腹膜上，在与阴影区域相对应的窗户表面上涂上粘合剂，然后将腹膜向下推到上面并将其粘合到位。皮肤同样粘在腹膜上。最后沿着红线沉积一圈胶水，以防止上皮在窗户上生长。（I）与（H）中相同的图像，没有标记显示小鼠准备进行术后恢复。用虚线勾勒的区域在 （J， K） 中放大。（J）在肝脏表面可见粘合剂液滴的痕迹（箭头）（K）与J中相同的照片，显示通过白色虚线勾勒的窗口可见的肝脏。肝脏表面的粘合剂液滴以红色勾勒出来。要成像的区域以白色轮廓显示。 请点击此处查看此图的大图。
图2：手术在肝右叶上插入一个窗口。 （A）漫画显示了与手术相关的结构的解剖位置。黑色虚线框勾勒出图片中观察到的手术区域。（B）将小鼠置于左侧侧卧位，从肋骨笼下方3mm开始切口，并取出约1 cm2 段皮肤。（C）切除腹膜的较小部分。（D）用湿润的棉签轻轻地将肝脏拉到肋骨笼下方。（E）使用注射器，在肝脏表面的液滴（白色箭头头）中施加少量手术粘合剂。（F）将窗口定位并牢固地固定在肝脏上，直到粘合剂干燥（2分钟）。（G）窗户的边缘折叠在腹膜和皮肤下。（H）为了将窗户固定在腹膜上，在窗户表面涂上与阴影区域相对应的粘合剂，然后将腹膜向下推到上面并将其粘合到位。皮肤同样粘在腹膜上。沿着红线还沉积了胶水的边缘，以防止上皮在窗户上生长。（I）在高放大倍率下，肝脏（由白色虚线勾勒）透过窗户可见。成像区域由嵌入在窗口中的网格（白色箭头）标记。 请点击此处查看此图的大图。
图3：手术 在胰腺上插入一个窗口。（A）漫画显示了与手术相关的结构的解剖位置。黑色虚线框勾勒出图片中观察到的手术区域。（B）将鼠标置于右侧侧卧位。通过剃光的皮肤（虚线）可以看到脾脏（C）从肋骨笼下方3mm开始切口，并去除约1 cm2 的皮肤。（D）切除腹膜的较小部分。（E）胰腺（白色箭头）用湿润的棉签轻轻定位在窗户的位置。（F）使用注射器，将少量手术粘合剂施加到脾脏以及胰腺（远离要成像的区域）。（G）将窗口定位并牢固地固定在胰腺上，直到粘合剂干燥（2分钟）。窗户的边缘折叠在腹膜和皮肤下。（H）为了将窗户固定在腹膜上，在与阴影区域相对应的窗户表面上涂上粘合剂，然后将腹膜向下推到上面并将其粘合到位。皮肤同样粘在腹膜上。沿着红线还沉积了胶水的边缘，以防止上皮在窗户上生长。（I）在高放大倍率下，胰腺（由白色虚线勾勒）透过窗户可见。成像区域由嵌入在窗口中的网格（白色箭头）标记。 请点击此处查看此图的大图。
图4：手术在腹股沟乳腺上插入一个窗口。 （A）漫画显示了与手术相关的结构的解剖位置。黑色虚线框勾勒出图片中观察到的手术区域。请注意，手术可以在第4或第5个乳腺上进行。（B）将小鼠置于无菌手术场上的仰卧位。 第 5 个 右（箭头）用作进行切口的标志。（C）做一个切口，将乳腺与上覆皮肤分开，并去除约1 cm2的皮肤。（D）使用注射器，在乳腺表面感兴趣区域周围的液滴中施加少量手术粘合剂。（E）将窗口定位并牢固地固定，直到粘合剂干燥（2分钟）。（F）使用镊子将窗口的边缘折叠在皮肤下。（G）为了将窗户固定在皮肤上，在与阴影区域相对应的窗口表面上涂上粘合剂，然后将皮肤向下推到上面并将其粘合到位。沿着红线还沉积了胶水的边缘，以防止上皮在窗户上生长。 （H）提供了一个植入第4个右乳腺小肿瘤的窗口的例子。用虚线勾勒的区域在（I）中以更高的放大倍率显示。（I）乳腺表面的粘合剂液滴以红色勾勒。要成像的区域以黑色轮廓显示。请点击此处查看此图的大图。
图 5：有机硅成像窗口具有良好的光学和材料特性。 (A–C为了测量点扩散功能并将PDMS窗口的成像特性与玻璃盖玻片的成像特性进行比较，通过不同厚度的PDMS窗口或玻璃盖玻片（#1.5厚度）对40nm黄绿色荧光微球进行成像16.使用超声凝胶作为浸入介质收集图像，以匹配活体内成像的条件。图解显示计算出的半最大值全宽 （FWHM） 在 （一个） X 轴， （B） Y 轴和 （CZ轴（平均±SD;n = 3 /组，使用两个或多个单独的窗口获取;单因子方差分析将所有PDMS窗口与玻璃进行比较，使用Dunnett的多重比较测试;仅指示显着差异）。(D） X 轴和 Y 轴中计算的 FWHM 值之间的比率 （A–B） 显示为沿 X 轴和 Y 轴的点源图像的对称性的度量，因此也是光学像差的度量。(E–G）微球通过三个单独的窗口成像，用200mg PDMS铸造（类似于用于活体内成像的窗口 图 9, 图 10, 图 11 和 电影 2, 电影 3, 电影 4）或三个玻璃盖玻片（#1.5厚度）测量点扩散功能。与活体成像示例相反，使用水作为浸泡介质收集用于这些计算的图像。图显示计算出的 FWHM 在 （E） X 轴， （F） Y 轴和 （GZ轴（平均±SD;n = 3/组，使用三个单独的窗口;曼-惠特尼试验，未检测到显著差异）。(H） 绘图显示计算的 FWHM 值在 X 轴和 Y 轴 （E–F).(我）图显示每个微球的峰值荧光强度（平均值±SD; n = 3 / 组;曼-惠特尼试验，未检测到显著差异）。所有图像均在960 nm的波长和3%的激光功率下收集。为每个微球收集100μm的z-stack，步长为0.6μm。图像帧设置为69 μm x 69 μm，分辨率为1022像素x 1022像素。使用斐济 - MetroloJ插件执行分析。(J为了测试材料性能，PDMS窗口被保持在张力下，并使用超级胶水固定在两个环形垫圈之间，以确保在机械测试期间的弹性响应。同样的程序用于微型盖板玻璃滑移，没有由于玻璃刚性而产生的张力。使用聚乳酸细丝3D打印由半球（直径6毫米）和圆柱挤出（直径4毫米，长度20毫米）组成的装载尖端。窗口在1 N / s的负载控制曲线下加载到伺服液压材料试验机中，直到材料失效。力和位移值是在100 Hz的频率下测量的。该图显示了设置的窗口测试，加载提示在窗口的中心应用。(K）图显示了通过使用MATLAB中的Trapz函数计算应力 - 应变曲线下的求和面积来确定的材料韧性（平均值±SEM;n = 3 /组，使用三个单独的PDMS窗口，每个厚度和玻璃盖玻片;单因子方差分析与Tukey的多重比较测试）。(L）图显示了从应力 - 应变曲线的线性部分确定的杨氏模量（SEM±平均值;n = 3 /组使用三个单独的PDMS窗口和玻璃盖玻片;使用韦尔奇校正的t检验）。 请点击此处查看此图的大图。
图6：硅胶窗口显示出高耐受性和寿命。（A）一只7周龄的雄性C57BL / 6J小鼠的代表性图像，其腹侧腹部成像窗口在窗口手术后11天没有网格。（B）一名7周龄男性C57BL / 6J小鼠的代表性图像，其胰腺成像窗口在窗口手术后14天包含网格。（C）一名12周龄女性C57BL / 6J c-fms-EGFP小鼠的代表性图像，其乳腺成像窗口在窗口手术后7天>包含网格。（D）在7周龄的男性c-fms-EGFP小鼠中拍摄的肝脏成像窗口（顶行）和成像（下排）在手术后第0天（手术后立即）和手术后35天。去除适量的皮肤并用胶水密封伤口可防止皮肤重新上睑化并将窗口向上和向外推，从而使器官能够长期成像。比例尺 = 30 μm。请点击此处查看此图的大图。
图 7：窗口内的网格允许跟踪相同的视野。 （一）激光切割不锈钢窗定制生产的详细规格。（B）嵌入成像窗口内的网格可以在肝脏上看到，窗口周围的胶水边缘清晰可见。（C）通过双光子显微镜的目镜观察窗户。在背景中可以看到来自肝脏的血管（红色）和绿色信号。 请点击此处查看此图的大图。
图 8： 对窗口插入的全身性和局部反应。 (A–C）监测7周龄C57BL / 6J雌性小鼠的体重，在窗口插入肝脏后28天（一个），胰腺（B） 或乳腺 （C).显示与未经治疗的年龄匹配小鼠相比的体重变化百分比。（*）表示小鼠没有恢复正常体重，因此会从成像实验中被审查。相同的对照鼠标显示在所有三个面板中，以便于与每种类型的窗口进行比较。(D）在手术后第3天，第14天和第28天（乳腺窗口）或35（肝脏或胰腺窗口）监测白细胞（WBC）计数。鼠标中WBC计数的正常范围由虚线表示。(E,G,我）苏木精和曙红染色来自未经治疗的对照（左）和7周龄的C57BL / 6J小鼠的组织切片，在将成像窗口（右）插入（E） 肝脏， （G） 胰腺，或（我）乳腺。(E,我在肝脏和乳腺表面（箭头）的离散位置可见浅表和局灶性肉芽病变，提示对胶水的反应。*指示的正常组织在肉芽病变附近的区域可见。在每个时间点（手术后第3天，第14天和第35天）评估3个对照组和3个具有肝窗的小鼠，除了在手术后第35天评估6只具有肝窗的小鼠。3只小鼠中有两只在第3天和第14天表现出肉芽组织。3只小鼠中有1只在第35天表现出肉芽组织。 在每个时间点（手术后第3天，第14天和第28天）评估三名对照组和三只具有乳腺窗口的小鼠。3只小鼠中有3只在第3天和第14天在乳腺脂肪组织中有肉芽组织或炎症反应。3只小鼠中的第0只在第28天表现出肉芽病变或炎症反应。(G）在胰腺中不可见明显的病变。在每个时间点（手术后第3天，第14天和第35天）评估三名对照组和三只具有胰腺窗口的小鼠。具有胰腺窗口的小鼠在任何时间点都没有肉芽组织。比例尺 = 500 μm （F,H,J）在未治疗的对照组和7周龄的C57BL / 6J小鼠的组织切片上进行多重免疫组织化学染色，在（F） 肝脏， （H） 胰腺或（J）乳腺。分别使用针对CD45，CD68和髓过氧化物酶（MPO）的抗体来标记白细胞，单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。CD45和CD68染色在同一切片上进行，而MPO染色则在同一组织的连续切片上进行。用HRP偶联二抗检测抗CD45抗体并首先成像，然后剥离发色原和二抗，并将载玻片与识别抗CD68的二抗一起孵育。使用斐济软件通过颜色阈值进行定量;跨抗体和组织调整参数。图将量化显示为每视场细胞计数（FOV）（SEM±平均值;n = 3 /组;Tukey多重比较检验的单因子方差分析;仅指示显着差异）。(K） 公头 C57BL/6J c-fms-EGFP 8-11周龄的小鼠在肝脏右叶上插入硅胶成像窗口。在每次成像之前立即静脉注射荧光标记的凝集素（100μL）。图像来自一只小鼠，在手术后第1，3和5天的同一网格位点上，在网格下方约200μm处。比例尺 = 30 μm。使用960nm的激发波长成像，激光功率为10%。血管呈红色。巨噬细胞以绿色（白色箭头）显示。代表三只成像小鼠。 请点击此处查看此图的大图。
图9：肿瘤可以在窗口插入后数周内的多个时间点可视化。 来自一名男性7周龄C57BL / 6J小鼠的代表性图像，在胰腺窗口插入时原位注射1.5 x 104 iGFP-1199胰腺癌细胞，并在窗口插入后的第11天和第14天成像。比例尺 = 30 μm。使用960nm的激发波长成像，激光功率为10%。代表6个成像小鼠。 请点击此处查看此图的大图。
图10： 正常乳腺退化期间免疫细胞浸润的动态变化。 使用嵌入成像窗口的金属网格，可以在正常组织重塑期间（例如乳腺退化期间）对相同位置进行成像。为了进一步评估硅胶窗口在监测免疫细胞浸润等动态变化方面的功能，一名12周龄的女性C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP;在 乳腺退化后的第2天和第4天对插入腹部乳腺的成像窗口的LysM-eGFP小鼠进行成像。中性粒细胞以绿色（白色箭头）显示。在开始成像前4小时通过注射中性粒细胞弹性蛋白酶荧光探针来观察中性粒细胞弹性蛋白酶活性，并显示为红色（或当与中性粒细胞共定位时为黄色）。上皮细胞呈蓝色。快照是沿 Z 轴（深度为 100–150 mm）的五幅图像的最大强度投影。图像来自 电影3A 和 3B，在下行图像上，仅显示CFP信号，并用红色虚线标记图像，以可视化两个不同时间点的组织内的相同位置。比例尺 = 30 μm。使用960 nm和1080 nm激发波长成像，激光功率分别为10%和15%。代表四只成像小鼠。 请点击此处查看此图的大图。
图11：癌症转移的形成可以随着时间的推移进行跟踪。 一名雄性C57BL / 6J 10周龄小鼠在窗口插入时通过门静脉注射1 x 105 KPC-BL / 6-1199胰腺癌细胞，表达核局部组蛋白H2B偶联青色荧光蛋白（H2B-CFP）。根据指示，在注射后24小时（第1天）和之后的三个时间点（最多9天）通过侧窗进行肝脏成像。注射后第1天和第3天可见的单个癌细胞用白色箭头表示。来自胶原纤维的二次谐波信号也在青色通道中可视化（黄色箭头）。图像来自每个不同时间点的同一鼠标。在300μm和350μm深度之间拍摄的单个z平面图像。比例尺 = 30 μm。使用880nm的激发波长成像。激光功率为8%。 代表三只成像小鼠。 请点击此处查看此图的大图。
电影1：硅胶想象g窗口在小鼠中具有良好的耐受性。 电影显示一只9周龄的男性C57BL / 6J小鼠在窗口插入后14天。小鼠不表现出任何与疼痛相关的标准行为（例如，梳理不良，闭眼或嗜睡）。代表六只记录的小鼠，并且与成功植入后观察到的100多只小鼠一致。 请点击此处下载此视频。
电影2：原位植入胰腺癌细胞的亚细胞成像。 将iGFP-1199细胞原位注射到男性7周龄C57BL / 6J小鼠的胰腺中，并在注射癌细胞和窗口插入后的第11天成像。该影片是沿 Z 轴的六幅图像的最大强度投影，并从 2 小时的成像周期中提取。时间戳 （h：min：s：ms）。代表六只成像小鼠。 请点击此处下载此视频。
电影3：ACTB-ECFP中免疫细胞浸润的变化 ;LysM-eGFP 小鼠在卷积过程中。母头 C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; 在骨髓细胞（主要在粒细胞中，但也在巨噬细胞中）中表达GFP的LysM-eGFP小鼠和在所有细胞中表达ECFP（但在上皮细胞中最高）在8周龄时繁殖。分娩后，幼崽被归一化为每只小鼠六只幼崽。分娩后第10天，对幼崽进行断奶，并插入腹部乳腺成像窗口。骨髓细胞以绿色出现;使用中性粒细胞弹性蛋白酶680 FAST探针在成像开始前4小时注射的中性粒细胞弹性蛋白酶活性以红色显示（当与嗜中性粒细胞共定位时将显示为黄色）;和上皮细胞呈蓝色。短片是沿 Z 轴（深度为 100–150 μm）的五幅图像的最大强度投影。 （A） 乳腺退化第2天影像学检查。比例尺 = 20 μm。使用960 nm和1080 nm激发波长成像，激光功率分别为10%和15%。（B） 乳腺退化第4天影像学检查。比例尺 = 20 μm。电影来自与电影3A相同的小鼠和组织区域 （C） 电影3B感兴趣区域的更高放大倍率，显示两个嗜中性粒细胞彼此相互作用以及乳腺的上皮细胞。在中性粒细胞迁移过程中，可以在前缘观察到瞬态膜突起的形成。时间戳 （h：min：s：ms）。代表四只成像小鼠。 请按此下载电影3A。 请按此下载电影3B。 请按此下载电影3C。
电影4： c-fms-EGFP 小鼠在退化过程中免疫细胞浸润的变化。 雌性C57BL / 6J c-fms-EGFP小鼠，具有GFP标记的巨噬细胞，在8周龄时繁殖。分娩后，将产仔数调整为每只小鼠六只幼崽。分娩后第10天，对幼崽进行断奶，并插入腹部乳腺成像窗口。这部电影是在卷积第1天（插入窗口后一天）获得的，突出了卷积过程中突出的巨噬细胞渗透。巨噬细胞以绿色出现，胶原纤维（二次谐波生成）以蓝色出现，血管以红色出现（Lectin-DyLight 594）。比例尺 = 20 μm。图像是沿 Z 轴（深度为 100–150 um）的五个图像的最大强度投影。使用960 nm和800 nm激发波长成像，激光功率分别为10%和15%。时间戳 （h：min：s：ms）。代表三只成像小鼠。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
活体内成像窗口是直接可视化细胞分辨率的生理和病理过程的重要工具，因为它们随着时间的推移而展开。所描述的用于在小鼠中投射和插入柔性硅胶成像窗口的新方法克服了当前使用的成像窗口的一些最常见问题（渗出，断裂和对正常移动性的干扰），为小鼠提供了额外的安全性，并增加了该技术的可访问性。
使用最广泛的成像窗口包括一个金属框架，里面装有玻璃盖玻片。使用这些原型窗口的一个主要障碍是固定金属环涉及费力的缝合程序，需要经过高级外科培训的人员。此外，制造框架成本高昂，需要专门的设备。PDMS 窗口克服了这两个问题。插入 PDMS 窗口的过程消除了拼接，显著降低了学习该技术的障碍。生产窗户的材料也很便宜，可以很容易地购买。此外，窗户的形状和手术过程都可以适应不同器官的成像，包括乳腺，肝脏，胰腺，脾脏和肠道。
虽然目前的活体成像窗口允许纵向成像通常持续几天，但几个常见问题限制了这些窗口长时间的使用。玻璃窗的重量和大小会干扰小鼠的自由运动，渗出物会积聚在窗户上。小鼠也会损坏玻璃盖玻片，导致伤口和感染。相比之下，这里描述的程序保持了对组织的相同水平的可及性，同时最大限度地减少了动物的痛苦。PDMS是一种安全，生物稳定的合成聚合物，广泛用于人类的生物医学应用，如药物输送装置，面部重建手术和乳房植入物。除了增加动物对窗户的耐受性之外，使用生物惰性材料而不是玻璃对于涉及免疫系统的研究尤为重要，其中局部炎症将是一种混杂效应。此外，一个主要的改进是消除了缝线，因为老鼠会咬住并拉扯它们，这可能导致金属框架的玻璃成像窗口脱落。这个问题通过新一代的窗户得到了部分解决，这些窗户的设计使针脚隐藏在凹槽9中。然而，后一种策略需要缝合钱包，这是一种复杂，容易出错的程序，通常会导致缝线被拉得太紧，导致组织坏死和疼痛。因此，将窗户粘合到位的能力构成了硅胶窗户方法的一大优势。此外，窗户由柔性，耐用的材料制成，重量可以忽略不计，这减少了其对动物运动的影响，正如之前在使用硅胶而不是金属来容纳玻璃盖玻片的窗户的比较中所评估的那样17。通过完全消除玻璃盖玻片，硅胶窗消除了金属框架和玻璃的问题。此外，窗口的柔韧性使其可以轻松插入，并减少了将刚性表面粘合到器官上所引起的应力，从而降低了对被观察的组织造成永久性损伤的风险。此外，由于窗口更容易插入和固定到位，因此整个过程花费的时间更少，从而限制了由于长时间麻醉而可能产生的副作用。对于肝脏的插入，手术时间的差异特别大，从金属框架窗口的45分钟到硅胶窗口的15分钟。事实上，虽然将金属框架插入肝脏需要解剖xiphoid过程（胸骨末端的软骨），这也是潜在的痛苦并引起持续炎症，但这种解剖对于插入硅胶窗口是不必要的。最后，本工作中介绍的成像窗口在可能的应用方面提供了额外的优势。例如，与玻璃窗不同，硅胶窗易于进入组织，因此癌细胞，荧光染料或药物可以直接通过窗口注射。
另一种基于PDMS的有机硅成像窗口适合于插入各种解剖位置，包括乳腺，最近被描述18。该窗口经过模制以产生形状和专用边缘，无需缝合或胶水即可快速植入窗口。相比之下，这里介绍的硅胶窗口不需要任何特殊的模具，重要的是，可以在手术过程中切割成形状，以适应解剖位置和单个小鼠。尽管本文描述的方案需要使用胶水，但这一附加要求允许腹部器官（包括肝脏和脾脏）的成像。此外，这里描述的硅胶窗口允许在窗口内嵌入不锈钢网格，这提供了参考地标。这些标志物可以随着时间的推移追踪相同的确切位置，并有助于在多个会话中重复成像同一部位（纵向成像），以研究需要数天至数周的过程，例如转移性病变的发展。
总之，开发了一种硅胶成像窗口，用于乳腺或腹部器官的纵向IVM。窗户光学透明，高度耐用且价格低廉。窗口插入程序的简单性降低了实施基于窗口的活体成像方法所需的技术技能。窗口对不同组织部位的适应性允许在大量的生物学研究中实施IVM。
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Disclosures
M.E.是Insmed，Inc.的 brensocatib 研究咨询委员会成员;Vividion Therapeutics， Inc.科学顾问委员会成员;Protalix， Inc.的顾问;D.A.T.是Mestag Therapeutics的联合创始人，也是科学顾问委员会成员，并持有Mestag Therapeutics，Leap Therapeutics，Surface Oncology和Cygnal Therapeutics的股份。其他作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢Rob Eifert在设计和优化激光切割不锈钢网格方面的帮助。这项工作得到了CSHL癌症中心（P30-CA045508）和美国国立卫生研究院（NIH）的医学博士基金（1R01CA2374135和5P01CA013106-49）的支持。CSHL和Northwell Health;汤普森家族基金会;游过美国;以及西蒙斯基金会向CSHL提供的赠款。M.S.得到了美国国家普通医学科学研究所医学科学家培训计划培训奖（T32-GM008444）和NIH国家癌症研究所的支持，奖项编号为1F30CA253993-01。L.M.由James S. McDonnell基金会博士后奖学金支持。J.M.A.是癌症研究所/欧文顿博士后奖学金（CRI奖#3435）的获得者。D.A.T.得到了Lustgarten基金会胰腺癌研究专用实验室和汤普森家庭基金会的支持。卡通是用 Biorender.com 创作的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows - Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
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| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
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