Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Langsgående intravital billeddannelse gennem klare silikonevinduer

Published: January 5, 2022 doi: 10.3791/62757
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4,5, 1, 1,6, 7,8, 9, 1, 1, 1, 8, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

En tilgang præsenteres her til langsigtet intravital billeddannelse ved hjælp af optisk klare silikonevinduer, der kan limes direkte på vævet / organet af interesse og huden. Disse vinduer er billigere og mere alsidige end andre, der i dag anvendes i marken, og den kirurgiske indsættelse forårsager begrænset betændelse og angst for dyrene.

Abstract

Intravital mikroskopi (IVM) muliggør visualisering af cellebevægelse, deling og død ved enkeltcelleopløsning. IVM gennem kirurgisk indsatte billedvinduer er særligt kraftfuldt, fordi det tillader langsgående observation af det samme væv over dage til uger. Typiske billedvinduer består af et glasdæksler i en biokompatibel metalramme sutureret til musens hud. Disse vinduer kan forstyrre musenes frie bevægelighed, fremkalde en stærk inflammatorisk reaktion og mislykkes på grund af knust glas eller revne suturer, hvoraf nogen kan nødvendiggøre eutanasi. For at løse disse problemer blev vinduer til langsigtet abdominal organ- og brystkirtelbilleddannelse udviklet fra en tynd film af polydimethylsiloxan (PDMS), en optisk klar silikonepolymer, der tidligere blev brugt til kraniale billeddannelsesvinduer. Disse vinduer kan limes direkte på vævene, hvilket reducerer den tid, der er nødvendig for indsættelse. PDMS er fleksibelt og bidrager til dets holdbarhed hos mus over tid - op til 35 dage er blevet testet. Langsgående billeddannelse er billeddannelse af det samme vævsområde under separate sessioner. Et gitter i rustfrit stål blev indlejret i vinduerne for at lokalisere det samme område, hvilket tillod visualisering af dynamiske processer (som brystkirtelindvikulation) på de samme steder med dages mellemrum. Dette silikonevindue tillod også overvågning af enkeltformidlede kræftceller, der udviklede sig til mikrometastaser over tid. Silikonevinduerne, der anvendes i denne undersøgelse, er enklere at indsætte end metalindrammede glasvinduer og forårsager begrænset betændelse i det afbildede væv. Desuden giver indlejrede gitre mulighed for ligetil sporing af den samme vævsregion i gentagne billeddannelsessessioner.

Introduction

Intravital mikroskopi (IVM), billeddannelse af væv hos anæstesiiserede dyr, giver indsigt i dynamikken i fysiologiske og patologiske hændelser ved cellulær opløsning i intakte væv. Anvendelserne af denne teknik varierer meget, men IVM har været medvirkende til kræftbiologiområdet for at hjælpe med at belyse, hvordan kræftceller invaderer væv og metastaserer, interagerer med det omgivende mikromiljø og reagerer på lægemidler 1,2,3. Derudover har IVM været nøglen til at fremme forståelsen af de komplekse mekanismer, der styrer immunresponser ved at give indsigt, der supplerer ex vivo-profileringsmetoder (f.eks. Flowcytometri). For eksempel har intravitale billeddannelseseksperimenter afsløret detaljer om immunfunktioner, da de vedrører cellemigration og celle-cellekontakt og har tilbudt en platform til at kvantificere spatiotemporal dynamik som reaktion på skade eller infektion 4,5,6,7. Mange af disse processer kan også studeres gennem histologisk farvning, men kun IVM tillader sporing af dynamiske ændringer. Faktisk, mens en histologisk sektion giver et øjebliksbillede af vævet på et givet tidspunkt, kan intravital billeddannelse spore intercellulære og subcellulære begivenheder inden for det samme væv over tid. Især fremskridt inden for fluorescensmærkning og udvikling af molekylære reportere har gjort det muligt at korrelere molekylære hændelser med cellulær adfærd, såsom proliferation, død, bevægelighed og interaktion med andre celler eller den ekstracellulære matrix. De fleste IVM-teknikker er baseret på fluorescensmikroskopi, hvilket på grund af lysspredning gør billeddannelse af dybere væv udfordrende. Vævet af interesse skal derfor ofte udsættes kirurgisk med en ofte invasiv og terminal procedure. Afhængigt af organstedet kan vævet således afbildes kontinuerligt i en periode, der varierer fra nogle få til 40 timer8. Alternativt tillader den kirurgiske indsættelse af et permanent billeddannelsesvindue billeddannelse af det samme væv sekventielt over en periode på dage til uge 7,9.

Udviklingen af nye billedbehandlingsvinduer er blevet fremhævet som et teknologisk behov for yderligere at forbedre intravital billeddannelsesmetoder10. Det prototypiske intravitale billeddannelsesvindue er en metalring, der indeholder et glasdæksler, der er fastgjort til huden med suturer11. Indgreb i den frie bevægelighed, ophobning af ekssudat og beskadigelse af glasdæksedlen er almindelige problemer, der ses ved brug af sådanne vinduer. Desuden kræver det prototypiske vindue specialiseret produktion, og den kirurgiske procedure kan kræve omfattende træning. For at løse disse problemer blev polydimethylsiloxan (PDMS), en silikonepolymer, som tidligere har været anvendt i kranievinduer til langvarig billeddannelse i hjernen12, tilpasset til brug i abdominal organ- og brystkirtelbilleddannelse. Her præsenteres en detaljeret metode til generering af PDMS-baserede silikonevinduer, herunder hvordan man støber vinduet rundt om et rustfrit stålgitter for at give landemærker til gentagen billeddannelse af de samme vævsområder. Desuden beskrives en simpel, stingfri kirurgisk procedure til indsættelse af vinduet over abdominale organer eller brystkirtlen. Denne nye tilgang overvinder nogle af de mest almindelige problemer med aktuelt anvendte billedvinduer og øger tilgængeligheden af langsgående intravital billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle beskrevne procedurer blev udført i overensstemmelse med Cold Spring Harbor Laboratory Surgical Guidelines og var blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Cold Spring Harbor Laboratory.

1. Støbning af silikonevinduet

  1. Silikonepolymeren (PDMS) fremstilles ved at blande baseelastomeren og hærdningsmidlet i forholdet 10:1 (v/v).
  2. Støbt et vindue ved at deponere en lille mængde PDMS på en steril, glat overflade og juster volumen-til-areal-forholdet til den ønskede tykkelse.
    BEMÆRK: Brug af 200 mg polymeropløsning til en cirkel med en diameter på 22 mm på låget på et låg med en brøndplade resulterer i et godt kompromis mellem vinduessturdiness og optisk klarhed.
  3. Valgfrit: For at give landemærker til gentagen billeddannelse af de samme vævsområder skal du let trykke et gitter i rustfrit stål ind i silikonen, efter at PDMS er på den ønskede støbeoverflade.
  4. For at fjerne luftbobler skal du placere den belagte overflade i en vakuumtørrer i 45 minutter for at afgasse polymeren.
  5. Hærd silikonevinduerne i en ovn ved 80 °C i 45 min.
  6. Scor polymeren ved formens kanter og skræl forsigtigt de hærdede vinduer fra overfladen, der bruges til støbning med tang.
  7. Før operationen steriliseres vinduerne ved autoklavering.

2. Klargøring af musen til indsættelse af silikonevinduet

  1. Anæstesi musen i et induktionskammer ved hjælp af 4% (v / v) isofluran. Flyt musen til en opvarmningspude på det kirurgiske bord, læg musen i anæstesi næsemasken, og sænk isoflurankoncentrationen til 2% for vedligeholdelse under hele operationen.
  2. Kontroller dybden af anæstesi ved at klemme tæerne på bagbenene. Fortsæt ikke, før musen er inaktiv og ikke viser tåklemmerefleksrespons.
  3. Påfør oftalmisk smøremiddel på øjnene for at forhindre dem i at tørre og forhindre traumer.
  4. Administrere forebyggende analgesi (buprenorphin 0,05 mg/kg) subkutant.
  5. Barber det kirurgiske sted og fjern håret helt med en hårfjerningscreme.
  6. Påfør povidon-jodopløsning (10% v / v) og ethanol (70% v / v) fortløbende 3x for at forhindre infektion på operationsstedet.

3. Indsættelse af et ventralt vindue til billeddannelse i leveren; kan tilpasses til andre abdominale organer (figur 1)

  1. Placer musen i liggende stilling.
  2. Lav et 10 mm snit, der starter 3 mm ned fra xiphoid-processen ved hjælp af steril saks og tang.
  3. Fjern en 1-1,5 cm2 sektion af huden langs midterlinjen.
  4. Brug et andet par sterile sakse og tang til at fjerne en del af bughinden, der er lidt mindre end hudsektionen.
  5. Valgfrit: For at visualisere en større del af leveren skal du bruge sterile vatpinde fugtet med sterilt saltvand til at skubbe leveren ned fra membranen, der afslører det falciforme ledbånd, der forbinder leveren med membranen. Afbryd ledbåndet og pas på ikke at skære den ringere vena cava.
  6. Træk kirurgisk klæbemiddel tilbage med en 31 G sprøjte, påfør en lille mængde af det på overfladen af leveren omkring kanterne af det område, der skal afbildes. Dette klæbemiddel skaber en cirkulær tætning, der efterlader midterområdet intakt til billeddannelse.
    FORSIGTIG: Begræns klæbemidlet til små dråber, der danner et cirkulært mønster omkring billedbehandlingsområdet. Væv, der umiddelbart er i kontakt med klæbemidlet, kan ikke afbildes. Det er ikke nødvendigt at tørre vævet, før klæbemidlet påføres.
    BEMÆRK: Eventuelle cyanoacrylatbaserede klæbemidler kan anvendes med succes til denne procedure. Kirurgisk klæbemiddel sikrer sterilitet. Til terminalprocedurer giver superlim til alle formål gode resultater.
  7. Placer vinduet ved hjælp af tang, og hold det fast mod leveren, indtil klæbemidlet er tørret (~ 2 minutter).
  8. Fold vinduets kanter under bughinden.
  9. Med en sprøjte deponeres en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på kanterne af vinduet, der nu er under bughinden. Skub ned på bughinden med tang for at fastgøre den til vinduet.
  10. På samme måde skal du deponere en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på bughinden, før du skubber ned på huden med tang for at fastgøre den til bughinden.
    BEMÆRK: Hvis det udføres korrekt, skal et cirkulært område af levervæv nu være synligt gennem vinduet.
  11. Påfør lim rundt om vinduets kanter for at skabe en kant, der hjælper med at forhindre huden i at vokse tilbage over vinduet.
    FORSIGTIG: Hvis proceduren udføres ved hjælp af sterile kirurgiske teknikker, og vinduet steriliseres inden indsættelse, er forsegling af såret med kirurgisk klæbemiddel tilstrækkeligt for at undgå infektioner. Manglende overholdelse af korrekte aseptiske teknikker under kirurgisk indsættelse eller ufuldkommen lukning kan imidlertid føre til åbenlys eller subklinisk infektion og udtørring af vævet.

4. Indsættelse af et sidevindue til billeddannelse i leveren; kompatibel med samtidig injektion af kræftceller i portalvenen (figur 2)

  1. Placer musen på venstre laterale decubitusposition
  2. Lav et 10 mm snit på højre flanke 3 mm under kostalbuen ved hjælp af steril saks og tang.
  3. Fjern en 1 cm2 sektion af huden.
  4. Brug et andet par sterile sakse og tang til at fjerne en del af bughinden, der er lidt mindre end hudsektionen.
  5. Træk kirurgisk klæbemiddel tilbage med en 31 G sprøjte, påfør en lille mængde af det på overfladen af leveren omkring kanterne af det område, der skal afbildes.
    FORSIGTIG: Begræns klæbemidlet til små dråber, der danner et cirkulært mønster omkring billedbehandlingsområdet. Væv, der umiddelbart er i kontakt med klæbemidlet, kan ikke afbildes.
    BEMÆRK: Eventuelle cyanoacrylatbaserede klæbemidler kan anvendes med succes til denne procedure. Kirurgisk klæbemiddel sikrer sterilitet. Til terminalprocedurer giver superlim til alle formål gode resultater.
  6. Placer vinduet ved hjælp af tang, og hold det fast mod leveren, indtil klæbemidlet er tørret (~ 2 minutter).
  7. Fold vinduets kanter under bughinden.
  8. Med en sprøjte deponeres en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på kanterne af vinduet, der nu er under bughinden. Skub ned på bughinden med tang for at fastgøre den til vinduet.
  9. På samme måde skal du deponere en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på bughinden, før du skubber ned på huden med tang for at fastgøre den til bughinden.
    BEMÆRK: Hvis det udføres korrekt, skal et cirkulært område af levervæv nu være synligt gennem vinduet.
  10. Påfør lim rundt om vinduets kanter for at skabe en kant, der hjælper med at forhindre huden i at vokse tilbage over vinduet.
  11. Hvis der kræves en portalveneinjektion:
    1. Placer musen i liggende stilling.
    2. Lav et 10 mm snit, der starter ned fra xiphoid-processen i huden.
    3. Brug et andet par sterile saks og tang til at lave et 10 mm snit i bughinden.
    4. Dyp to vatpinde i sterilt saltvand.
    5. Brug vatpindene til forsigtigt at trække tarmen på sterilt gasbind fugtet med sterilt saltvand, og pas på ikke at vride eller på anden måde forstyrre orienteringen.
    6. Bliv ved med at forskyde tarmen fra bughulen, indtil portalvenen er synlig på højre side af maven.
    7. Indsæt en 31-33 G nål 5-7 mm kaudal til indgangsstedet for portalvenen i leveren, og sørg for at fortsætte i blodkarret og ikke gennem det.
    8. Injicer langsomt kræftcellerne (resuspended i 100 μL steril PBS).
      BEMÆRK: Til dette forsøg kan amurin bugspytkirtelkræftcellelinje (f.eks. KPC-BL / 6-1199) dyrkes i komplette DMEM-medier og 1 x 105 celler injiceres i 100 μL steril PBS.
    9. For at forhindre blødning skal du straks efter tilbagetrækning af nålen lægge et blidt tryk på injektionsstedet med et lille stykke kirurgisk svamp i 1-2 minutter.
    10. Når trykket er frigivet, skal du overvåge stedet i 1-2 minutter for at sikre hæmostase.
    11. Ved hjælp af fugtede vatpinde skal tarmene returneres i bukhulen efter organets fysiologiske orientering.
    12. Brug sterile tang til at indsætte vinduet straks under bughinden på venstre side af musens bughule.
    13. Sutur med 4-0 silkesuturer og hæfte midterlinjesnittet med 7 mm sårklemmer i rustfrit stål.
    14. Flyt musen til venstre lateral decubitus position
    15. Lav et 10 mm snit på højre flanke 3 mm under kostalbuen gennem huden ved hjælp af steril saks og tang.
    16. Fjern en 1 cm2 sektion af huden omkring snittet.
    17. Brug et andet par sterile sakse og tang til at fjerne en del af bughinden, der er lidt mindre end hudsektionen.
    18. Træk vinduet på plads over leveren, før du limer det på plads, som beskrevet under trin 4.8-4.10.

5. Indsættelse af vinduet til billeddannelse i bugspytkirtlen (figur 3)

  1. Placer musen på højre laterale decubitusposition.
  2. Lav et 10 mm snit på venstre flanke 3 mm under kostalbuen ved hjælp af steril saks og tang.
  3. Fjern en 1 cm2 sektion af huden omkring snittet.
  4. Brug et andet par sterile sakse og tang til at fjerne en del af bughinden, der er lidt mindre end hudsektionen.
  5. Brug sterile vatpinde gennemblødt med sterilt saltvand, træk forsigtigt i milten for at visualisere bugspytkirtlen. Fortsæt med at omplacere bugspytkirtlen med de fugtede vatpinde for at gøre mere overfladeareal synligt gennem snittet.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt kan kræftceller i bugspytkirtlen ortotopisk injiceres i bugspytkirtlen, hvis det er en del af det eksperimentelle design.
  6. Træk kirurgisk klæbemiddel tilbage med en 31 G sprøjte, påfør en lille mængde af det på overfladen af bugspytkirtlen omkring kanterne af det område, der skal afbildes.
    FORSIGTIG: Begræns klæbemidlet til små dråber, der danner et cirkulært mønster omkring billedbehandlingsområdet. Væv, der umiddelbart er i kontakt med klæbemidlet, kan ikke afbildes.
  7. Placer vinduet ved hjælp af tang, og hold det fast mod bugspytkirtlen, indtil klæbemidlet er tørret (~ 2 minutter).
  8. Fold vinduets kanter under bughinden.
  9. Med en sprøjte deponeres en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på kanterne af vinduet, der nu er under bughinden. Skub ned på bughinden med tang for at fastgøre den til vinduet.
  10. På samme måde skal du deponere en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på bughinden, før du skubber ned på huden med tang for at fastgøre den til bughinden.
    BEMÆRK: Hvis det udføres korrekt, skal et cirkulært område af bugspytkirtelvæv nu være synligt gennem vinduet.
  11. Påfør lim rundt om vinduets kanter for at skabe en kant, der hjælper med at forhindre huden i at vokse tilbage over vinduet.

6. Indsættelse af vinduet til billeddannelse i brystkirtlen (figur 4)

  1. Placer musen på liggende stilling.
  2. Lav et 10 mm snit medial til en af de inguinale brystvorter ved hjælp af steril saks og tang.
  3. Fjern en 0,5 cm2 sektion af huden over brystkirtlen.
  4. Brug et andet par sterile sakse til forsigtigt at adskille brystkirtlen fra huden ved at sprede saksen mellem de to overflader for at forstyrre vedhæftningen.
    BEMÆRK: For at lette billeddannelsen af det indinale brystkirtelområde skal du være forsigtig med at dissekere en del af huden over brystkirtlen, men bedre end bagbenet, så vinduet ikke begrænser musens mobilitet.
  5. Træk kirurgisk klæbemiddel tilbage med en 31 G sprøjte, påfør en lille mængde af det på overfladen af brystkirtlen omkring kanterne af det område, der skal afbildes.
    FORSIGTIG: Begræns klæbemidlet til små dråber, der danner et cirkulært mønster omkring billedbehandlingsområdet. Væv, der umiddelbart er i kontakt med klæbemidlet, kan ikke afbildes.
  6. Placer vinduet ved hjælp af tang, og hold det fast mod brystkirtlen, indtil klæbemidlet er tørret (~ 2 minutter).
    BEMÆRK: Et cirkulært område af brystkirtelvæv skal nu være synligt gennem vinduet, hvis det udføres korrekt.
  7. Fold vinduets kanter under huden.
  8. Med en sprøjte deponeres en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på kanterne af vinduet, der nu er under huden. Skub ned på huden med tang for at fastgøre huden til vinduet.
  9. Påfør lim rundt om vinduets kanter for at skabe en kant, der hjælper med at forhindre huden i at vokse tilbage over vinduet.

7. Postkirurgisk genopretning

  1. Placer musen i et rent genopretningsbur med rigeligt redemateriale, og sikre, at en del af buret hviler på en varmepude.
  2. Overvåg musen kontinuerligt, indtil den er bevidst og mobil.
  3. Hvis det er nødvendigt, skal du give en ekstra dosis smertestillende 12 timer efter den forebyggende dosis.
    BEMÆRK: Yderligere analgesi er generelt unødvendig, men rådfør dig med en dyrlæge, hvis musen viser tegn på nød (såsom bøjet ryg, usoigneret pels eller mistet interesse for mad). Overvåg musen dagligt i de første 3 dage efter operationen for tegn på infektion eller andre bivirkninger. Mindre end 2% af musene kræver dyrlægehjælp eller eutanasi, typisk på grund af delvis løsrivelse af vinduet. Det er vigtigt at bemærke, at for hanmus med ventrale leverbilleddannelsesvinduer kan kamp mellem mus resultere i løsrivelse af vinduer. Dette undgås ved at huse musene separat.

8. Billeddannelse gennem vinduet

  1. Anæstesi musen i et induktionskammer ved hjælp af 4% (v / v) isofluran.
  2. Påfør oftalmisk smøremiddel på øjnene for at forhindre dem i at tørre og forhindre traumer.
  3. Flyt musen fra induktionskammeret til mikroskopstadiet. Placer musen i anæstesi næsemasken, og sænk isoflurankoncentrationen til ca. 1-1,5% for vedligeholdelsesbedøvelse gennem hele billeddannelsesproceduren.
  4. Placer en trykpudesensor under musen for at overvåge åndedrætshastigheden og fastgør musen til scenen ved hjælp af blødt kirurgisk tape.
  5. Indsæt et rektalt termometer for at overvåge kropstemperaturen under hele billeddannelsessessionen.
  6. Tænd for den opvarmede pude, og overvåg musen nøje for at sikre, at kropstemperaturen ikke overstiger 37 °C.
  7. Brug software til at overvåge musens åndedrætshastighed. Den optimale hastighed er ~ 1 åndedræt / sekund. Juster anæstesi efter behov.
  8. Før hver billedbehandling skal du rengøre vinduet fra ethvert resterende linsenedsænkningsmedium og snavs ved forsigtigt at tørre det af med en vatpind dyppet i 70% ethanol (v / v).
  9. Når du bruger en vandnedsænkningslinse, skal du anvende ultralydsgel på vinduet og undgå bobler.
    BEMÆRK: Destilleret vand kan også bruges, men kan kræve genpåføring under billeddannelse.
  10. For at finde den optimale dybde til billeddannelse skal du først finde gitteret og placere det i fokus.
  11. Bestem den omtrentlige vævsbilleddybde ved at indstille bunden af gitteret til 0. Disse oplysninger er nødvendige for at lokalisere det tilsvarende z-plan i efterfølgende billeddannelsessessioner.
  12. Hvis du vil identificere den samme placering over flere billedbehandlingssessioner, skal du bruge firkanterne på gitteret som referencepunkt. Under billeddannelsen skal du notere gitterets retning og placering i gitteret for hvert billedet synsfelt (f.eks. 2. række fra toppen, 4. kvadrat fra venstre).
  13. Under efterfølgende billedbehandlingssessioner skal du bruge gitteret til at navigere tilbage til bestemte gitterområder - og dermed billedfelter.
  14. Efter hver billedbehandling skal du fjerne eventuelle resterende linsenedsænkningsmedier og snavs ved forsigtigt at tørre vinduet af med en vatpind dyppet i 70% ethanol (v / v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intravital billeddannelse gennem billeddannelsesvinduer kan bruges til at observere, spore og kvantificere en bred vifte af cellulære og molekylære hændelser ved enkeltcelleopløsning over en periode på timer til uger. Ideelle funktioner til et billedvindue omfatter: a) begrænset indvirkning på musens trivsel og vævets fysiologi; b) holdbarhed c) enkelhed ved indsættelse og d) klare landemærker for gentagen billeddannelse af den samme region. Resultatet er et alsidigt, inert silikonevindue, der let kan produceres og indsættes, og som kan udstyres med et gitter for at lokalisere det samme synsfelt i løbet af flere billedbehandlingssessioner.

Vinduet er lavet af PDMS, som er et billigt, fleksibelt og klart materiale. Vinduer kan støbes med forsyninger, der er bredt tilgængelige for køb for de fleste laboratorier. Til disse formål fungerer de cirkulære forme (22 mm diameter), der allerede er ætset på låget på kommercielt tilgængelige 24 brøndplader, godt. Ved at variere mængden af polymer, der anvendes pr. Arealenhed, er det muligt at justere vinduets tykkelse. For at dokumentere effekten af vinduets tykkelse på billedopløsningen blev der udført en PSF-analyse (Point Spread Function) af 40 nm fluorescerende mikrosfærer for at sammenligne billeddannelsen gennem PDMS-vinduer af varierende tykkelse med glasdæksler, der typisk anvendes til intravitale billeddannelsesvinduer (0,17 mm tykke). For at replikere den opsætning, der blev brugt til intravital billeddannelse, blev PSF-billeddannelsen udført ved hjælp af det samme to-fotonmikroskop og vandnedsænkningsobjektiv med ultralydgel påført som et nedsænkningsmedium.

Den fulde bredde ved halv maksimum (FWHM) af signalintensiteten beregnet via PSF's pasform i sideplanerne var sammenlignelig med ruden til PDMS-vinduer støbt med 100 mg PDMS (figur 5A,B). Den laterale opløsning sammenlignet med glasdæksler blev reduceret for vinduer støbt med 150-250 mg PDMS (figur 5A,B). I z-aksens billedplan klarede PDMS-vinduer støbt med 100-200 mg polymer sig bedre end glasdæksler (figur 5C). Optisk klarhed gik tabt i vinduer støbt med 300 mg PDMS, hvilket gjorde målingerne upålidelige (figur 5A-C). X / Y-forholdet mellem FWHM-værdierne varierede ikke signifikant mellem glas og PDMS af nogen tykkelse, selvom forholdet for vinduer støbt med 200-250 mg polymer især afveg fra 1 ved hjælp af ultralydgel som nedsænkningsmedium (figur 5D). Men når man bruger vand som et nedsænkningsmedium til vinduesstøbningen med 200 mg, var afvigelsen fra symmetri meget mindre udtalt. Ved denne tykkelse er afvigelser på grund af afvigelser i polymeren derfor sandsynligvis mindre. Maksimale fluorescensintensitetsværdier blev også indsamlet for hver mikrosfære og viste, at glas og PDMS fungerede sammenligneligt, selvom det højeste signal blev registreret gennem glas (figur 5I). Den optimale tykkelse af PDMS-vinduet afhænger af specifikke applikationer og billedbehandlingssystemer. Til de fleste formål er 200 mg polymeropløsning til et cirkulært vindue med en diameter på 22 mm et optimalt kompromis mellem vinduessturdiness og optisk klarhed. Faktisk var vinduer støbt med mindre end 200 mg mere optisk klare med FWHM-værdier svarende til glas, men lejlighedsvis rev under kirurgisk implantation, mens der ikke blev observeret tilfælde af vinduesskader ved anvendelse af 200 mg (i >100 mus).

For at måle denne forskel i materialeegenskaber blev PDMS-vinduer (200 mg og 150 mg) indlæst i en servohydraulisk materialetestmaskine under en belastningskontrolprofil på 1N/s indtil materialesvigt (figur 5J). Kraft- og forskydningsværdier blev målt ved en frekvens på 100 Hz. Kraftforskydningsdataene blev derefter konverteret til stress-belastning ved hjælp af ligningerne:

σ = F / A (1)

Ɛ = ΔL / L0 (2)

Hvor σ er spænding (Pa), F er kraft (N), A er vinduets tværsnitsareal, Ɛ er belastning, ΔL er forskydningen, ogL0 er vinduets tykkelse. Materialets sejhed blev bestemt ved beregning af summationsarealet under spændings-belastningskurven. Et materiales sejhed refererer til dets evne til at deformere plastisk og absorbere energi i processen før brud - en nøgleegenskab for implanterede vinduer13. I overensstemmelse med observationer under billeddannelsesforsøg har vinduer støbt med 200 mg PDMS signifikant større sejhed end vinduer støbt med 150 mg (figur 5K) og er derfor mindre tilbøjelige til at gå i stykker.

Dernæst blev Youngs Modulus (E) af de foretrukne PDMS-vinduer støbt med 200 mg bestemt og sammenlignet med standard glasdæksler ved at udtrække det lineære område af spændingsbelastningskurven og bestemme hældningen ved hjælp af Hookes lov:

σ = EƐ (3)

Youngs modul af glasvinduerne var signifikant større end PDMS, hvilket var forventet, fordi glas er meget mere stift i materialestyrke end PDMS (figur 5L). Selvom glas er et stærkere materiale baseret på dets større Youngs modul, understøtter den større sejhed af 200 mg PDMS-vinduerne således, at de kan anvendes i længere perioder uden risiko for at bryde og nødvendiggøre en anden kirurgisk procedure eller eutanasi.

En stor fordel ved silikonevinduerne er alsidighed. Det er vigtigt, at proceduren for kirurgisk indsættelse af vinduet let kan skræddersys til forskellige anatomiske steder. Tilpasninger til operationen lettes af, at vinduerne let kan ændres med kirurgisk saks, og at vinduer limes på overfladen af vævet / organet af interesse og til huden, hvilket fuldstændigt eliminerer kravet om suturer. Vellykket indsættelse af vinduer på denne måde er opnået for leveren, bugspytkirtlen og brystkirtlen (figur 6A-C). Især blev der udviklet to forskellige protokoller til implantering af enten ventrale eller laterale vinduer til leverbilleddannelse. Figur 1 viser trinnene til indsættelse af et ventralt vindue. Denne procedure kan tilpasses andre abdominale organer og vil give det største billedlige overfladeareal. Medmindre der kræves et stort (>1 cm2) billedligt område, foretrækkes det dog at indsætte et sidevindue i musens højre flanke (figur 2) for at reducere bevægelsesartefakter, f.eks. på grund af åndedræt og peristaltik. Derudover er den kirurgiske procedure til indsættelse af det laterale billeddannelsesvindue kompatibel med en samtidig injektion af kræftceller i portalvenen for eksperimentelt at modellere udviklingen af levermetastase. Således kan mus gennemgå en enkelt procedure i stedet for to separate, når portalveneinjektion og abdominal billeddannelsesvinduesindsættelse er nødvendig i det samme dyr. En analog procedure bruges til at implantere et vindue over bugspytkirtlen på musens venstre flanke (figur 3). Vinduet kan også indsættes over subkutane væv, dvs. normale brystkirtler, samt allerede etablerede spontane eller ortotopisk transplanterede brysttumorer (figur 4). Alternativt kan kræftceller injiceres i brystkirtlen gennem vinduet for i længderetningen at følge udviklingen af en primær tumor, da nåle kan punktere PDMS-filmen uden at gå på kompromis med vinduets integritet.

På grund af deres lave vægt og fleksibilitet forstyrrer silikonevinduer ikke musens mobilitet (Film 1). Således overvinder silikonevinduer store hindringer forbundet med glasvinduer, såsom skrøbelighed, kompleks suturering og indvirkning på dyrenes mobilitet. I stedet er den største begrænsning forbundet med silikonevinduer genvæksten af epitelet under vinduet. Men når en passende mængde hud fjernes, og såret er helt forseglet med lim, er epithelialisering begrænset, og billeddannelse kan fortsætte over længere perioder (op til 35 dage er blevet testet, figur 6D). Efter indsættelse af vinduet kan musen afbildes i længderetningen i ca. en måned, eller indtil det kirurgiske klæbemiddel fejler, eller epithelialisering forekommer. Korte daglige billeddannelsessessioner (~ 60 minutter) eller mindre hyppige, men længere billeddannelsessessioner foretrækkes for at undgå anæstesi-inducerede bivirkninger. Vinduesbærende dyr kan afbildes på enhver intravital billeddannelsesplatform via både enkeltfoton- eller multifotonkonfokalmikroskopi ved hjælp af standardprocedurer (se f.eks. 14). Før og efter hver billedbehandling anbefales det at rengøre vinduet for snavs og snavs ved at tørre det af med en vatpind dyppet i 70% ethanol (v / v).

For at spore den samme placering over tid kan gitter i rustfrit stål indlejres i vinduet. Figur 7A viser specifikationerne for de specialfremstillede, laserætsede gitre, der anvendes herinde. Kommercielle net til transmissionselektronmikroskopi er også velegnede til denne applikation. Gitteret er indlejret i vinduet under støbeproceduren og er tydeligt synligt over billeddannelsesområdet både for det blotte øje (figur 7B) og gennem mikroskopets kikkert (figur 7C). Fordi vinduet er limet til organets overflade, er placeringen af billedfelter i forhold til gitteret stabil. Under billeddannelsen skal du notere gitterets retning og placering inden for gitteret for hvert synsfelt, der er afbildet (f.eks. 2. række fra toppen, 4. kvadrat fra venstre). Brug derefter gitteret til at navigere tilbage til bestemte gitterområder - og dermed billedfelter - under successive billeddannelsessessioner.

Gitteret er også nyttigt til at justere billedfeltet under en billeddannelsessession, når vævet langsomt driver på grund af f.eks. Åndedræt eller peristaltik. De fleste billedvinduer med en stiv kant kan bindes til en holder under billeddannelse, hvilket tilføjer stabilitet til billedbehandlingsområdet. Da de fleksible vinduer ikke kan stabiliseres direkte, bruges kirurgisk tape til at stabilisere kropssektionen, der indeholder vinduet, og billeddannelsesområdet justeres igen til midten af det tilsvarende gitterkvadrativ eller tidligere identificerede vævsmærker (f.eks. Vaskulære landemærker) med definerede intervaller (typisk hvert 30. minut). Yderligere afdriftkorrektion for mikroskopisk forskydning af synsfeltet udføres digitalt i efteranskaffelsesfasen gennem kode, der justerer rammerne baseret på detekterede vævsmønstre (supplerende kode 1-2).

For at validere, at vinduet ikke forårsager nogen åbenlys systemisk bivirkning, blev vægten af dyr, der havde gennemgået vinduesimplantation og ubehandlede aldersmatchede kontroller, overvåget. Efter et indledende vægttab i forbindelse med operationen fortsætter de fleste mus med indsatte vinduer med at tage på i vægt over tid, hvilket indikerer, at vinduesindsættelse tolereres godt (figur 8A-C). For lever- og brystkirtelvinduer genvindes normal vægt inden for 5 dage efter operationen. Postoperativ genopretning er langsommere efter implantation af vinduet over bugspytkirtlen, hvor mus vender tilbage til præoperativ vægt inden for 14 dage. Denne observation er i overensstemmelse med de forventede virkninger forbundet med manipulation af bugspytkirtlen på tidspunktet for operationen. Bemærk, at selv i tilfælde, hvor vægttab ikke når tærsklen for humant endepunkt, censureres mus, der ikke genvinder præoperativ kropsvægt (<5% af alle mus, eksemplificeret ved musen angivet med * i figur 8B), typisk fra billeddannelsesforsøg. Derudover blev antallet af hvide blodlegemer, bestemt på forskellige tidspunkter efter vinduesindsættelse, ikke ændret i næsten alle vinduesbærende mus sammenlignet med kontroller og ændrede sig ikke betydeligt over tid (figur 8D), hvilket tyder på, at vinduet ikke forårsagede større systemisk betændelse.

For at evaluere graden af lokalt vævsrespons på vinduet og limen blev mus aflivet ved 3, 14 og 28 (brystkirtelvinduer) eller 35 dage (lever- og bugspytkirtelvinduer) efter kirurgisk indsættelse af vinduet til histologisk analyse. Evaluering af hæmatoxylin og eosin (H & E) farvede leversektioner viste overfladisk (20-80 μm), minimal til mild kapselgranuleringsvævsdannelse under vinduerne for de fleste mus (2 ud af 3 mus evalueret på dag 3 og 2 ud af 3 evalueret på dag 14). Disse læsioner var fokale (1-3 mm lange), svarende omtrent til limlagets bredde (figur 8E). Efter 35 dage præsenterede de fleste mus (4 ud af 6 evalueret i to separate forsøg) intet granulært væv, mens nogle få (2 ud af 6) havde moderat fokal kapselsklerose og desmoplasi (i en dybde på 25-250 μm). Interessant nok blev der ikke observeret signifikante læsioner på overfladen af bugspytkirtlen direkte under vinduet på noget tidspunkt i kohorten på ni mus (figur 8G). Imidlertid viste nogle mus områder af atrofi i bugspytkirtlen og betændelse i mavefedtet (steatitis), i overensstemmelse med manipulationsinduceret skade. For brystkirtlen havde 3 ud af 3 mus på dag 3 efter vinduesimplantation enten granuleringsvæv, der minder om et helbredende snit, der er synligt langs kirtlens overflade eller en inflammatorisk reaktion i fedtvævet; på dag 14 havde 3 ud af 3 evaluerede mus granuleringsvæv. Disse læsioner var igen fokale og 1-3 mm lange (figur 8I). Mus med brystkirtelvinduer aflivet 28 dage efter operationen viste ingen åbenlyse histologiske abnormiteter.

Denne analyse tyder på, at vinduet ikke kompromitterer den overordnede fysiologiske arkitektur af de testede organer (lever, bugspytkirtel, brystkirtel). Det reaktive væv, der findes på overfladen af leveren og brystkirtlen, var sandsynligvis en reaktion på limen og begrænset til væv, der straks var i kontakt med klæbemidlet. Normalt væv kan let findes ved siden af (< 100 μm) til det reaktive væv i områder, der ikke udsættes for lim (figur 8E,I), og vævsbetændelsen forstyrrer derfor ikke billeddannelsen af sunde vævsområder. Desuden er vævsreaktionen sandsynligvis reversibel, da de fleste mus (8 ud af 9 mus på tværs af alle vævssteder) ikke viste nogen signifikante læsioner på de sene tidspunkter (28 eller 35 dage), selvom direkte bekræftelse af, at vævsreaktionen løser ville være svært at opnå uden langsgående målinger hos individuelle mus.

Multiplexeret immunohistokemisk farvning til CD45, CD68 og myeloperoxidase (MPO) blev også udført for at karakterisere infiltrationen af henholdsvis leukocytter, monocytter / makrofager og neutrofiler. En stigning i immuncelleinfiltration forbundet med granuleringsvæv og steatitis blev set i brystkirtlen og leveren, men ikke i bugspytkirtlen (figur 8F, H, J).  Bemærk, at disse ændringer sandsynligvis var forbigående, da immuncelleinfiltreringen var sammenlignelig med de ubehandlede kontroller på de sidste tidspunkter (28 dage for brystkirtelvinduer og 35 dage for lever- og bugspytkirtelvinduer).

Leveren blev valgt som stedet for yderligere at karakterisere, om vinduesindsættelse og billeddannelse forårsagede signifikant lokal immuninfiltration ved hjælp af billeddannelse. For at gøre dette blev c-fms-EGFP (MacGreen) mus15, hvor myeloide celler (for det meste makrofager) er mærket med et grønt fluorescerende protein, anvendt. Levervinduer blev implanteret i tre c-fms-EGFP-mus og afbildede dem på dag 1, 3 og 5 efter operationen ved hjælp af gitteret for at finde det samme synsfelt. Antallet af makrofager, der var til stede i billeddannelsesområdet, ændrede sig ikke væsentligt over tid efter vinduesindsættelse (figur 8K).

Dernæst blev vinduet funktionelt testet ved at afbilde et forskelligt sæt biologiske processer på celleniveau (dvs. bevægelse, proliferation, celle-cellekontakt) og vævsniveau (dvs. tumorvækst i bugspytkirtlen, immuninfiltration under brystkirtelinvolution og levermetastase). Bugspytkirtlen er ikke et let tilgængeligt sted for billeddannelse. For at demonstrere, hvordan vinduet kan bruges til at fange kræftcelledynamik i dette organ, blev vinduer indsat over bugspytkirtlen på seks C57BL / 6J-mus på samme tid som ortotopisk injektion af KPC-BL / 6-1199-celler, en bugspytkirtelkræftcellelinje afledt af en almindeligt anvendt KPC (KrasLSL- G12D / + ;p 53LSL-R172H; Pdx1-Cre) genetisk manipuleret musemodel af kræft i bugspytkirtlen. For at blive visualiseret ved konfokal mikroskopi blev KPC-BL / 6-1199 celler konstrueret til at udtrykke doxycyclinducerbar forbedret GFP (iGFP-1199 celler). Seks dage efter injektionen blev musene sat på en doxycyclin diæt for at udløse ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP) i kræftcellerne i bugspytkirtlen. Figur 9 viser repræsentative billeder fra en mus ortotopisk injiceret med iGFP-1199-celler på dag 11 og 14 efter injektion og vinduesindsættelse. Film 2 viser iGFP-1199 tumorkanten i et uddrag af en 2-timers billeddannelsessession på dag 11 efter vinduesindsættelse, hvilket illustrerer evnen til at fange dynamikken i cellemembranprojektion i bugspytkirtlen ved hjælp af silikonevinduerne.

Silikonevinduet kan også bruges til at fange dynamisk immuncelleinfiltration over tid. For at illustrere dette blev brystkirtelvinduer indkapslet i lakterende ACTB-ECFP (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) mus umiddelbart efter fravænning. I disse mus udtrykker alle celler, men de fleste epitelceller, cyanfluorescerende protein (CFP) drevet af beta-actinpromotoren, og myeloide celler - primært neutrofiler, men også makrofager - er mærket af eGFP drevet af lysozym M-promotoren. Musene blev afbildet på dag 2 og 4 efter vinduesindsættelse under processen med brystkirtelinvolution, når brystkirtelvæv begynder at vende tilbage til sin tilstand før graviditeten. To makroer til ImageJ blev udviklet til at reducere bevægelsesartefakter og forbedre visualiseringen, den ene justerer Z-planerne i en 4-dimensionel intravital video (supplerende kode 1), og den anden reducerer wobbliness på grund af vejrtrækning eller andre bevægelsesartefakter (Supplerende kode 2). Figur 10 og film 3A-C viser neutrofil infiltration i det ombyggende brystkirtelvæv på samme sted på dag 2 og 4, hvilket illustrerer, hvordan vinduet kan bruges til at overvåge og spore immuncelleinfiltration og bevægelse over forskellige dage. Et analogt eksperiment blev udført i en c-fms-EGFP-mus, hvor myeloide celler (hovedsageligt makrofager) udtrykte GFP drevet af c-fms-promotoren (Film 4).

Endelig tillader det relativt store overfladeareal af dette tilpasselige vindue observation af sjældne hændelser, såsom dannelse af levermetastase efter intravenøs podning. For at demonstrere dette fænomen blev levervinduer indsat i C57BL/6J-mus på tidspunktet for portalveneinjektion med KPC-BL/6-1199 bugspytkirtelkræftceller, der konstitutivt udtrykte det nukleare fusionsprotein histone2B-CFP (H2B-CFP). Over tid blev udvæksten af enkeltceller og små klynger af 2-3 celler, da de udviklede sig til mikrometastaser (>100 celler) overvåget. Figur 10 viser repræsentative billeder taget på dag 1, 3, 7 og 9 efter injektion og vinduesindsættelse og viser progressionen fra enkeltceller til mikrometastaser.

Alle billeder og film blev indsamlet ved hjælp af et multifotonmikroskop. Maksimale intensitetsprojektioner og filmjusteringer langs Z- og X-akserne over tid blev genereret ved hjælp af ImageJ-software. Justerede billeder og film blev derefter kompileret ved hjælp af Imaris-software.

Figure 1
Figur 1: Kirurgisk indsættelse af et ventralt abdominalt billeddannelsesvindue over leveren. (A) Tegneserien viser den anatomiske placering af strukturer, der er relevante for operationen. Den hvide stiplede boks skitserer det kirurgiske felt, der ses på billederne. (B) Der foretages et snit, der starter 3 mm under xiphoidprocessen og fortsætter nedad, således at en 1-1,5 cm2 sektion af huden fjernes langs midterlinjen. (C) En lidt mindre del af bughinden dissekeres. (D) Det falciforme ledbånd (hvid pilespids) er afskåret og skubber leveren ned. Bemærk: bomuldspindler fugtet med sterilt saltvand bruges til forsigtigt at manipulere indre organer. (E) Ved hjælp af en sprøjte påføres en lille mængde kirurgisk klæbemiddel i dråber omkring interesseområdet på leverens overflade. (F) Vinduet placeres og holdes fast mod leveren, indtil klæbemidlet er tørret (2 min.). (G) Vinduets kanter foldes under bughinden og huden. (H) For at fastgøre vinduet til bughinden påføres klæbemiddel på overfladen af vinduet svarende til det skyggefulde område, inden du skubber bughinden ned på det og limer det på plads. Huden limes ligeledes på bughinden. En kant af lim deponeres endelig langs den røde linje for at forhindre vækst af epitelet over vinduet. (I) Samme billede som i (H) uden markeringer, der viser musen klar til postkirurgisk genopretning. Område skitseret med stiplede linjer forstørres i (J, K). (J) Mærker fra klæbedråberne er synlige på leverens overflade (pilespidser) (K) Samme foto som i J, der viser leveren synlig gennem vinduet skitseret af en hvid stiplet linje. Klæbedråberne på leveroverfladen er skitseret i rødt. Det område, der skal afbildes, er skitseret med hvidt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kirurgisk indsættelse af et vindue over leverens højre lap. (A) Tegneserien viser den anatomiske placering af strukturer, der er relevante for operationen. Den sorte stiplede boks skitserer det kirurgiske felt, der ses på billederne. (B) Musen placeres i venstre laterale decubitusposition, der foretages et snit, der starter 3 mm under brystkassen, og en ca. 1 cm2 sektion af huden fjernes. (C) En lidt mindre del af bughinden dissekeres. (D) Leveren trækkes forsigtigt ned under brystkassen ved hjælp af en fugtet vatpind. (E) Ved hjælp af en sprøjte påføres en lille mængde kirurgisk klæbemiddel i dråber (hvidt pilehoved) på leverens overflade. (F) Vinduet placeres og holdes fast mod leveren, indtil klæbemidlet er tørret (2 min.). (G) Vinduets kanter foldes under bughinden og huden. (H) For at fastgøre vinduet til bughinden påføres klæbemiddel på vinduets overflade, svarende til det skyggefulde område, inden du skubber bughinden ned på det og limer det på plads. Huden limes ligeledes på bughinden. En kant af lim deponeres også langs den røde linje for at forhindre vækst af epitelet over vinduet. (I) Ved høj forstørrelse er leveren (skitseret af en hvid stiplet linje) synlig gennem vinduet. Billedbehandlingsområdet er markeret med gitteret indlejret i vinduet (hvidt pilehoved). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kirurgisk indsættelse af et vindue over bugspytkirtlen. (A) Tegneserien viser den anatomiske placering af strukturer, der er relevante for operationen. Den sorte stiplede boks skitserer det kirurgiske felt, der ses på billederne. (B) Musen placeres i højre laterale decubitusposition. Milten er synlig gennem den barberede hud (stiplet linje) (C) Der foretages et snit, der starter 3 mm under brystkassen, og en ca. 1 cm2 sektion af huden fjernes. (D) En lidt mindre del af bughinden dissekeres. (E) Bugspytkirtlen (hvid pilespids) placeres forsigtigt med en fugtet vatpind på vinduets placering. (F) Ved hjælp af en sprøjte påføres en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på milten såvel som bugspytkirtlen (væk fra det område, der skal afbildes). (G) Vinduet placeres og holdes fast mod bugspytkirtlen, indtil klæbemidlet er tørret (2 min.). Vinduets kanter foldes under bughinden og huden. (H) For at fastgøre vinduet til bughinden påføres klæbemiddel på overfladen af vinduet svarende til det skyggefulde område, inden du skubber bughinden ned på det og limer det på plads. Huden limes ligeledes på bughinden. En kant af lim deponeres også langs den røde linje for at forhindre vækst af epitelet over vinduet. (I) Ved høj forstørrelse er bugspytkirtlen (skitseret af en hvid stiplet linje) synlig gennem vinduet. Billedbehandlingsområdet er markeret med gitteret indlejret i vinduet (hvidt pilehoved). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kirurgisk indsættelse af et vindue over lyskebrystkirtlen. (A) Tegneserien viser den anatomiske placering af strukturer, der er relevante for operationen. Den sorte stiplede boks skitserer det kirurgiske felt, der ses på billederne. Bemærk, at operationen kan udføres på enten den 4. eller den 5. brystkirtler. (B) Musen placeres i liggende stilling på et sterilt kirurgisk felt. Den 5. højre brystvorte (pilespids) bruges som et vartegn til at udføre snittet. (C) Der foretages et snit, brystkirtlen adskilles fra den overhændende hud, og en ca. 1 cm2 sektion af huden fjernes. (D) Ved hjælp af en sprøjte påføres en lille mængde kirurgisk klæbemiddel i dråber omkring interesseområdet på overfladen af brystkirtlen. (E) Vinduet placeres og holdes fast, indtil klæbemidlet er tørret (2 min.). (F) Vinduets kanter foldes under huden ved hjælp af tang. (G) For at fastgøre vinduet til huden påføres klæbemiddel på overfladen af vinduet svarende til det skyggefulde område, inden huden skubbes ned på den og limes på plads. En kant af lim deponeres også langs den røde linje for at forhindre vækst af epitelet over vinduet.  (H) Der gives et eksempel på et vindue implanteret over en lille tumor i den 4. højre brystkirtel. Område skitseret med stiplede linjer vises i højere forstørrelse i (I). (I) Klæbedråberne på brystkirtlens overflade er skitseret med rødt. Det område, der skal afbildes, er skitseret i sort. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Silikone billedbehandling vinduer har gunstige optiske og materielle egenskaber. (A-C) For at måle punktspredningsfunktionen og sammenligne PDMS-vinduernes billedbehandlingsegenskaber med glasdæksler blev 40 nm gulgrønne fluorescerende mikrosfærer afbildet gennem PDMS-vinduer af varierende tykkelse eller glasdæksler (# 1.5 tykkelse)16. Billeder blev indsamlet ved hjælp af ultralydgel som nedsænkningsmedium for at matche betingelserne for intravital billeddannelse. Plots viser den beregnede fulde bredde ved halv maksimum (FWHM) i (En) X-aksen, (B) Y-aksen, og (C) Z-akse (gennemsnit ± SD; n = 3/gruppe, erhvervet ved hjælp af to eller flere separate vinduer; envejs ANOVA, der sammenligner alle PDMS-vinduer med glas med Dunnetts multiple sammenligningstest; kun signifikante forskelle er angivet). (D) Forholdet mellem de beregnede FWHM-værdier i aksen X og Y (A-B) vises som et mål for symmetrien af punktkildebillederne langs X- og Y-akserne og dermed af optiske aberrationer. (E-G) Mikrosfærer blev afbildet gennem tre separate vinduer støbt med 200 mg PDMS (svarende til de vinduer, der blev brugt til intravital billeddannelse til Figur 9, Figur 10, Figur 11 og Film 2, Film 3, Film 4) eller tre glasdæksler (nr. 1,5 tykkelse) for at måle punktspredningsfunktionen. I modsætning til de intravitale billeddannelseseksempler blev billeder til disse beregninger indsamlet ved hjælp af vand som nedsænkningsmedium. Plots viser den beregnede FWHM i (E) X-aksen, (F) Y-aksen og (G) Z-akse (gennemsnit ± SD; n = 3/gruppe ved hjælp af tre separate vinduer; Mann-Whitney test, ingen signifikante forskelle blev påvist). (H) Plot viser forholdet mellem beregnede FWHM-værdier i X- og Y-aksen (E-F). (Jeg) Afbildninger viser den maksimale fluorescerende intensitet pr. mikrosfære (gennemsnit ± SD; n = 3/gruppe; Mann-Whitney test, ingen signifikante forskelle blev påvist). Alle billeder blev indsamlet ved en bølgelængde på 960 nm og en lasereffekt på 3%. En 100 μm z-stak blev indsamlet for hver mikrosfære med en trinstørrelse på 0,6 μm. Billedrammen blev sat til 69 μm x 69 μm med en opløsning på 1022 pixels x 1022 pixels. Analysen blev udført med Fiji - MetroloJ plugin. (J) For at teste materialets egenskaber blev PDMS-vinduer holdt i spænding og fastgjort mellem to ringformede skiver ved hjælp af superlim for at sikre en elastisk respons under mekanisk testning. Den samme procedure blev anvendt til mikrodækselglasgl glider uden spænding på grund af glassets stivhed. En belastningsspids bestående af en halvkugle (6 mm diameter) med en cylinderekstrudering (4 mm diameter, 20 mm længde) blev 3D-printet ved hjælp af et polymælkesyrefilament. Vinduerne blev læsset i en servohydraulisk materialetestmaskine under en belastningskontrolprofil på 1 N/s indtil materialesvigt. Kraft- og forskydningsværdier blev målt ved en frekvens på 100 Hz. Billedet viser vinduestesten, der er konfigureret med indlæsningsspidsen, der anvendes i midten af vinduet. (K) ) Plottet viser sejheden af det materiale, der bestemmes ved beregning af summationsarealet under spændingsbelastningskurven ved hjælp af Trapz-funktionen i MATLAB (gennemsnit ± SEM; n = 3/gruppe ved hjælp af tre separate PDMS-vinduer for hver tykkelse og glasdæksler; envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest). (L) ) Plot viser Youngs modul bestemt ud fra den lineære del af spændingsbelastningskurven (gennemsnitlig ± SEM; n = 3/gruppe ved hjælp af tre separate PDMS-vinduer og glasdæksler; t-test med Welchs korrektion). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Silikonevinduet viser høj tolerabilitet og lang levetid. (A) Et repræsentativt billede af en mandlig, 7 uger gammel C57BL/ 6J mus med et ventralt abdominalt billeddannelsesvindue uden gitter 11 dage efter vinduesoperation. (B) Et repræsentativt billede af en 7 uger gammel C57BL/6J-mus af hankøn med et vindue til billeddannelse af bugspytkirtlen, der indeholder et gitter 14 dage efter vinduesoperationen. (C) Et repræsentativt billede af en kvindelig 12 uger gammel C57BL/6J c-fms-EGFP-mus med et brystkirtelbilleddannelsesvindue, der indeholder et gitter >7 dage efter vinduesoperationen. (D) Leverbilleddannelsesvindue i en mandlig 7 uger gammel c-fms-EGFP-mus fotograferet (øverste række) og afbildet (nederste række) på dag 0 (umiddelbart efter operationen) og 35 dage efter operationen. Fjernelse af den passende mængde hud og forsegling af såret med lim forhindrer huden i at epitelisere og skubbe vinduet op og ud, så organet kan afbildes på lang sigt. Skalabjælker = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Gitre i vinduerne tillader sporing af det samme synsfelt. (A) Detaljerede specifikationer for specialproduktion af laserskårne vinduer i rustfrit stål. (B) Et gitter indlejret i billedvinduet kan ses over leveren, med limkanten omkring vinduet tydeligt synlig. (C) Udsigt over vinduet gennem kikkerten på de to fotonmikroskoper. Blodkar (rødt) og grønt signal fra leveren kan ses i baggrunden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Systemisk og lokal reaktion på vinduesindsættelse. (A-C) Vægten blev overvåget for 7 uger gamle C57BL/6J hunmus i en periode på 28 dage efter vinduesindsættelse i leveren (En), bugspytkirtlen (B) eller brystkirtlen (C). Procentvis ændring i kropsvægt i forhold til ubehandlede aldersmatchede mus er vist. (*) angiver en mus, der ikke genvandt normal kropsvægt og derfor ville være blevet censureret fra et billeddannelseseksperiment. De samme kontrolmus vises i alle tre paneler for lettere sammenligning med hver type vindue. (D) Antal hvide blodlegemer (WBC) overvåget på dag 3, 14 og 28 (brystkirtelvindue) eller 35 (lever- eller bugspytkirtelvindue) efter operationen. Det normale interval for WBC-antal i musen er angivet med stiplede linjer. (E,G,Jeg) Hæmatoxylin- og eosinfarvning af vævssektioner fra ubehandlede kontroller (til venstre) og en 7 uger gammel C57BL/6J-mus 14 dage efter indsættelse af et billedvindue (højre) over (E) lever, (G) bugspytkirtlen, eller (Jeg) brystkirtlen. (E,Jeg) Overfladiske og fokale granuleringslæsioner er synlige på diskrete steder langs overfladen (pilen) af lever og brystkirtel, hvilket tyder på en reaktion på limen. Normalt væv angivet med * er synligt i de områder, der støder op til granuleringslæsionerne. Tre kontroller og tre mus med levervinduer blev evalueret på hvert tidspunkt (dag 3, 14 og 35 efter operationen), bortset fra at 6 mus med levervinduer blev evalueret på dag 35 efter operationen. To ud af 3 mus udviste granuleringsvæv på dag 3 og 14. 1 ud af 3 mus udviste granuleringsvæv på dag 35.  Tre kontroller og tre mus med brystkirtelvinduer blev evalueret på hvert tidspunkt (dag 3, 14 og 28 efter operationen). Tre ud af 3 mus havde granuleringsvæv eller inflammatoriske reaktioner i brystkirtlenes fedtvæv på dag 3 og 14. Nul ud af 3 mus udviste granuleringslæsioner eller inflammatoriske reaktioner på dag 28. (G) Ingen signifikante læsioner er synlige i bugspytkirtlen. Tre kontroller og tre mus med bugspytkirtelvinduer blev evalueret på hvert tidspunkt (dag 3, 14 og 35 efter operationen). Mus med vinduer i bugspytkirtlen havde ikke granuleringsvæv på noget tidspunkt. Skalabjælke = 500 μm (F,H,J) Multiplex immunohistokemisk farvning blev udført på vævssektioner fra ubehandlede kontroller og 7 uger gamle C57BL/6J-mus 14 dage efter indsættelse af et billeddannelsesvindue over (F) lever, (H) bugspytkirtlen eller (J) brystkirtlen. Antistoffer mod CD45, CD68 og myeloperoxidase (MPO) blev anvendt til at mærke henholdsvis leukocytter, monocytter/makrofager og neutrofiler. CD45 og CD68 farvning blev udført på samme sektion, mens MPO farvning blev udført på en seriel sektion af det samme væv. Anti-CD45-antistoffet blev påvist med et HRP-konjugeret sekundært antistof og afbildet først, derefter blev kromogenet og det sekundære antistof fjernet, og dias blev inkuberet med et sekundært antistof, der genkendte anti-CD68. Kvantificering blev udført med Fiji-software ved farvetærskel; parametre blev justeret på tværs af antistoffer og væv. Plots viser kvantificeringen som celletal pr. synsfelt (FOV) (gennemsnit ± SEM; n = 3 / gruppe; envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest; kun signifikante forskelle er angivet). (K) Mand C57BL/6J c-fms-EGFP mus 8-11 uger havde et silikonebilleddannelsesvindue indsat over leverens højre lap. Fluorescerende mærket lektin (100 μL) blev injiceret intravenøst umiddelbart før hver billeddannelsessession. Billederne er fra en enkelt mus på samme gittersted på dag 1, 3 og 5 efter operationen ca. 200 μm under gitteret. Skalabjælke = 30 μm. Afbildet ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 960 nm, lasereffekt 10%. Blodkar vises i rødt. Makrofager vises i grønt (hvide pile). Repræsentant for tre afbildede mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Tumorer kan visualiseres på flere tidspunkter over uger efter vinduesindsættelse. Repræsentative billeder fra en mandlig 7 uger gammel C57BL/6J mus ortotopisk injiceret med 1,5 x 104 iGFP-1199 bugspytkirtelkræftceller på tidspunktet for indsættelse af bugspytkirtelvinduet og afbildet på dag 11 og 14 efter vinduesindsættelse. Skalastænger = 30 μm. Afbildet ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 960 nm, lasereffekt 10%. Repræsentant for 6 afbildede mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Dynamiske ændringer i immuncelleinfiltration under normal brystkirtelinvolution. Ved hjælp af metalgitteret indlejret i billeddannelsesvinduet kan det samme sted afbildes under normal vævsombygning, såsom under brystkirtelindvikulation. For yderligere at evaluere silikonevinduernes funktionalitet til overvågning af dynamiske ændringer som immuncelleinfiltration, en 12 uger gammel kvindelig C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; LysM-eGFP-mus med et billeddannelsesvindue indsat over abdominal brystkirtlen blev afbildet på dag 2 og 4 efter brystkirtelinvolution. Neutrofiler vises i grønt (hvide pile). Neutrofil elastaseaktivitet blev visualiseret ved at injicere en neutrofil elastase fluorescerende sonde 4 timer før billeddannelsen påbegyndes og vises i rødt (eller gult, når det er colokaliseret med neutrofiler). Epitelcellerne vises i blåt. Snapshots er en maksimal intensitetsprojektion af fem billeder langs Z-aksen (100-150 mm i dybden). Billeder er fra film 3A og 3B, og på billederne i nederste række vises kun CFP-signalet, og billederne markeres med en rød stiplet linje for at visualisere de samme placeringer i vævet på de to forskellige tidspunkter. Skalastænger = 30 μm. Afbildet ved hjælp af 960 nm og 1080 nm excitationsbølgelængder, lasereffekt ved henholdsvis 10% og 15%. Repræsentant for fire afbildede mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: Dannelsen af kræftmetastase kan spores over tid. En mandlig C57BL/6J 10 uger gammel mus injiceret med 1 x 105 KPC-BL/6-1199 kræftceller i bugspytkirtlen, der udtrykker nukleart lokaliseret histon H2B-konjugeret cyanfluorescerende protein (H2B-CFP) gennem portalvenen på tidspunktet for vinduesindsættelsen. Leverbilleddannelse blev udført gennem et lateralt vindue 24 timer (dag 1) efter injektion og på tre senere tidspunkter (op til 9 dage) som angivet. En enkelt kræftcelle, der er synlig på dag 1 og 3 efter injektion, er angivet med hvide pile. Andet harmonisk signal fra kollagenfibre blev også visualiseret i cyankanalen (gule pile). Billeder er fra den samme mus på hvert andet tidspunkt. Enkelt z-plan billeder taget mellem 300 μm og 350 μm i dybden. Skalastænger = 30 μm. Afbildet ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 880 nm. Lasereffekt ved 8%. Repræsentant for tre afbildede mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Film 1: Silikone imaging vinduer tolereres godt i mus. Film viser en mandlig 9 uger gammel C57BL / 6J mus 14 dage efter vinduesindsættelse. Mus udviser ikke nogen af de standardadfærd, der er forbundet med smerte (f.eks. Dårlig pleje, lukkede øjne eller sløvhed). Repræsentativ for seks registrerede mus og i overensstemmelse med over 100 mus observeret efter vellykket vinduesimplantation. Klik her for at downloade denne video.

Film 2: Subcellulær billeddannelse af ortotopisk implanterede kræftceller i bugspytkirtlen. iGFP-1199-celler blev injiceret ortotopisk i bugspytkirtlen hos en mandlig 7-ugers gammel C57BL / 6J-mus og afbildet på dag 11 efter injektion af kræftceller og vinduesindsættelse. Filmen er en maksimal intensitetsprojektion på seks billeder langs Z-aksen og ekstraheret fra en 2-timers billeddannelsesperiode. Tidsstempel (h:min:s:ms). Repræsentant for seks afbildede mus. Klik her for at downloade denne video.

Film 3: Ændringer i immuncelleinfiltration i ACTB-ECFP; LysM-eGFP mus under involution. Kvinde C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; LysM-eGFP-mus, der udtrykte GFP i myeloide celler (hovedsageligt i granulocytter, men også i makrofager) og ECFP i alle celler (men højest i epitelceller) blev opdrættet ved 8 ugers alderen. Efter fødslen blev hvalpe normaliseret til seks hvalpe pr. Mus. På dag 10 efter fødslen blev hvalpene fravænnet, og abdominal brystkirtelbilleddannelsesvinduer blev indsat. Myeloide celler vises i grønt; neutrofil elastaseaktivitet, mærket ved hjælp af Neutrophil Elastase 680 FAST-sonden injiceret 4 timer før billeddannelsens start, vises i rødt (vises gult, når det er colokaliseret med neutrofiler); og epitelceller vises i blåt. Film er en maksimal intensitetsprojektion på fem billeder langs Z-aksen (100-150 μm i dybden). (A) Billeddannelse på dag 2 af brystkirtel involution. Skalabjælke = 20 μm. Afbildet ved hjælp af 960 nm og 1080 nm excitationsbølgelængder, lasereffekt ved henholdsvis 10% og 15%. (B) Billeddannelse på dag 4 af brystkirtel involution. Skalabjælke = 20 μm. Filmen er fra samme muse- og vævsregion som Film 3A. (C) Højere forstørrelse af en region af interesse fra Film 3B, der viser to neutrofiler, der interagerer med hinanden og epitelcellerne i brystkirtlen. Dannelsen af forbigående membranfremspring kan observeres ved forkanten under neutrofil migration. Tidsstempel (h:min:s:ms). Repræsentant for fire afbildede mus. Klik her for at downloade Movie 3A. Klik her for at downloade Movie 3B. Klik her for at downloade Movie 3C.     

Film 4: Ændringer i immuncelleinfiltration i c-fms-EGFP-mus under involution. Kvindelige C57BL / 6J c-fms-EGFP-mus med GFP-mærkede makrofager blev opdrættet ved 8 ugers alderen. Efter fødslen blev kuld justeret til seks hvalpe pr. mus. På dag 10 efter fødslen blev hvalpene fravænnet, og abdominal brystkirtelbilleddannelsesvinduer blev indsat. Filmen, der blev erhvervet på involutionsdag 1 (en dag efter indsættelse af vinduet), fremhæver det fremtrædende makrofaginfiltrat under involution. Makrofager vises i grønt, kollagenfibre (anden harmonisk generation) vises i blåt, og blodkar vises i rødt (Lectin-DyLight 594). Skalabjælke = 20 μm. Billeder er maksimale intensitetsprojektioner af fem billeder langs Z-aksen (100-150 um i dybden). Afbildet ved hjælp af 960 nm og 800 nm excitationsbølgelængder, lasereffekt ved henholdsvis 10% og 15%. Tidsstempel (h:min:s:ms). Repræsentant for tre afbildede mus. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende kode 1. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kode 2. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intravitale billeddannelsesvinduer er vigtige værktøjer til direkte visualisering af fysiologiske og patologiske processer ved cellulær opløsning, når de udfolder sig over tid. Den nye procedure, der er beskrevet for støbning og indsættelse af fleksible silikonebilleddannelsesvinduer i mus, overvinder nogle af de mest almindelige problemer med aktuelt anvendte billedvinduer (ekssudat, brud og interferens med normal mobilitet), giver yderligere sikkerhed for musen og øger tilgængeligheden af denne teknik.

De mest anvendte billedvinduer består af en metalramme, der holder et glasdæksler. En stor hindring for brugen af disse prototypiske vinduer er, at sikring af metalringen involverer besværlige syningsprocedurer, hvilket nødvendiggør personale med avanceret kirurgisk træning. Derudover er fremstillingen af rammerne dyr og kræver specialudstyr. PDMS-vinduerne overvinder begge disse problemer. Proceduren for at indsætte PDMS-vinduerne eliminerer syning, hvilket reducerer barrieren for at lære teknikken betydeligt. Materialerne til fremstilling af vinduerne er også billige og kan let købes. Derudover kan både vinduets form og den kirurgiske procedure tilpasses til billeddannelse af forskellige organer, herunder brystkirtlen, leveren, bugspytkirtlen, milten og tarmen.

Mens de nuværende intravitale billeddannelsesvinduer tillader langsgående billeddannelse i typisk et par dage, begrænser flere almindelige problemer brugen af disse vinduer i længere perioder. Vægten og størrelsen af glasvinduer kan forstyrre musens frie bevægelighed, og ekssudat kan akkumulere mod vinduet. Mus kan også beskadige glasdæksedlen, hvilket resulterer i sår og infektioner. I modsætning hertil opretholder den procedure, der er beskrevet her, det samme niveau af tilgængelighed til vævet, samtidig med at dyrenes nød minimeres. PDMS er en sikker, biostabel, syntetisk polymer, der i vid udstrækning anvendes til biomedicinske anvendelser hos mennesker, såsom lægemiddelleveringsanordninger, ansigtsrekonstruktionskirurgi og brystimplantater. Ud over at øge dyrenes tolerance over for vinduet er brugen af et biologisk inert materiale i modsætning til glas særlig vigtigt for undersøgelser, der involverer immunsystemet, hvor lokal betændelse ville være en forvirrende effekt. Derudover er en stor forbedring eliminering af sting, da mus vil bide og trække i dem, hvilket kan få de metalindrammede glasbilleddannelsesvinduer til at falde ud. Dette problem blev delvist løst af en nyere generation af vinduer, der blev designet, så stingene er skjult i en rille9. Denne sidstnævnte strategi kræver imidlertid suturering af pungstrenge, hvilket er en kompliceret, fejlbehæftet procedure, der ofte får sting til at blive trukket for stramt, hvilket resulterer i nekrose af vævet og smerten. Derfor udgør evnen til at lime vinduet på plads en stor fordel ved silikonevinduesmetoden. Desuden er vinduet lavet af et fleksibelt, holdbart materiale med ubetydelig vægt, hvilket mindsker dets indvirkning på dyrets bevægelse, som tidligere vurderet i en sammenligning af vinduer, der brugte silikone i stedet for metal til at holde et glasdæksler17. Ved helt at fjerne glasdæksesedlen eliminerer silikonevinduet problemerne med både metalrammerne og glasset. Desuden gør vinduets fleksibilitet det let at indsætte det og reducerer spændingskraften forårsaget af limning af en stiv overflade på organerne, hvilket reducerer risikoen for permanent skade på vævet, der observeres. Derudover, fordi vinduet er meget lettere at indsætte og holde på plads, tager den samlede procedure mindre tid, hvilket begrænser de mulige bivirkninger på grund af langvarig anæstesi. Ved indsættelse over leveren er forskellen i proceduretid særlig betydelig, fra 45 min for metalindrammede vinduer til 15 min for silikonevinduerne. Faktisk, mens indsættelse af metalrammen over leveren kræver dissektion af xiphoid-processen (brusk i slutningen af brystbenet), hvilket også er potentielt smertefuldt og forårsager vedvarende betændelse, er denne dissektion unødvendig for at indsætte silikonevinduet. Endelig giver billeddannelsesvinduet, der præsenteres i dette arbejde, yderligere fordele med hensyn til mulige anvendelser. For eksempel, i modsætning til glasvinduer, giver silikonevinduer nem adgang til vævet, så kræftceller, fluorescerende farvestoffer eller lægemidler kan injiceres direkte gennem vinduet.

Et andet PDMS-baseret silikonebilleddannelsesvindue, der er egnet til indsættelse på en række anatomiske steder, herunder brystkirtlen, blev for nylig beskrevet18. Dette vindue er støbt til at generere en form og specialiseret kant, der muliggør hurtig implantation af vinduet uden behov for sting eller lim. I modsætning hertil kræver silikonevinduet, der præsenteres her, ingen speciel form og vigtigst af alt kan skæres i form under den kirurgiske procedure for at tilpasse sig den anatomiske placering og den enkelte mus. Selvom den protokol, der er beskrevet heri, nødvendiggør brug af lim, tillader dette yderligere krav billeddannelse af abdominale organer, herunder lever og milt. Desuden giver silikonevinduet, der er beskrevet her, mulighed for indlejring af et rustfrit stålgitter i vinduet, hvilket giver referencemærker. Disse landemærker muliggør sporing af den samme nøjagtige placering over tid og letter gentagen billeddannelse af det samme sted over flere sessioner (langsgående billeddannelse) for at studere processer, der tager dage til uger, såsom udvikling af metastatiske læsioner.

Sammenfattende blev der udviklet et silikonebilleddannelsesvindue til brug i langsgående IVM i brystkirtlen eller abdominale organer. Vinduet er optisk klart, meget holdbart og billigt. Enkelheden ved vinduesindsættelsesproceduren reducerer de tekniske færdigheder, der kræves for at implementere vinduesbaserede intravitale billeddannelsesmetoder. Vinduets tilpasningsevne til forskellige vævssteder gør det muligt at implementere IVM i en lang række biologiske undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.E. er medlem af forskningsrådet for brensocatib for Insmed, Inc.; medlem af det videnskabelige rådgivende organ for Vividion Therapeutics, Inc.; konsulent for Protalix, Inc.; og ejer aktier i Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. er medstifter af Mestag Therapeutics og er medlem af det videnskabelige rådgivende udvalg og har aktier i Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology og Cygnal Therapeutics. De øvrige forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Rob Eifert for hans hjælp med at designe og optimere de laserskårne gitter i rustfrit stål. Dette arbejde blev støttet af CSHL Cancer Center (P30-CA045508) og midler til ME fra National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 og 5P01CA013106-49); CSHL og Northwell Health; Thompson Family Foundation; Svøm over Amerika; og et tilskud fra Simons Foundation til CSHL. MS blev støttet af National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) og National Cancer Institute of the NIH under tildelingsnummer 1F30CA253993-01. L.M. er støttet af et James S. McDonnell Foundation Postdoc Fellowship. J.M.A. er modtager af et Cancer Research Institute / Irvington Postdoc Fellowship (CRI Award # 3435). D.A.T. er støttet af Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research og Thompson Family Foundation. Tegnefilm blev oprettet med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows - Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Tags

Kræftforskning udgave 179
Langsgående intravital billeddannelse gennem klare silikonevinduer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover,… More

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y. X., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter