Imagerie intravitale longitudinale à travers des fenêtres en silicone transparent

Summary

Une approche est présentée ici pour l’imagerie intravitale à long terme utilisant des fenêtres en silicone optiquement claires qui peuvent être collées directement sur le tissu / organe d’intérêt et la peau. Ces fenêtres sont moins chères et plus polyvalentes que d’autres actuellement utilisées sur le terrain, et l’insertion chirurgicale provoque une inflammation et une détresse limitées chez les animaux.

Abstract

La microscopie intravitale (MIV) permet de visualiser le mouvement, la division et la mort des cellules à une résolution unicellulaire. La MIV à travers des fenêtres d’imagerie insérées chirurgicalement est particulièrement puissante car elle permet l’observation longitudinale du même tissu sur des jours ou des semaines. Les fenêtres d’imagerie typiques comprennent un couvercle en verre dans un cadre métallique biocompatible suturé à la peau de la souris. Ces fenêtres peuvent interférer avec la libre circulation des souris, provoquer une forte réponse inflammatoire et échouer en raison de bris de verre ou de sutures déchirées, dont l’une peut nécessiter une euthanasie. Pour résoudre ces problèmes, des fenêtres pour l’imagerie à long terme des organes abdominaux et des glandes mammaires ont été développées à partir d’un film mince de polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère de silicone optiquement clair précédemment utilisé pour les fenêtres d’imagerie crânienne. Ces fenêtres peuvent être collées directement sur les tissus, ce qui réduit le temps nécessaire à l’insertion. Le PDMS est flexible, contribuant à sa durabilité chez la souris au fil du temps – jusqu’à 35 jours ont été testés. L’imagerie longitudinale est l’imagerie de la même région tissulaire au cours de séances distinctes. Une grille en acier inoxydable a été intégrée dans les fenêtres pour localiser la même région, permettant la visualisation de processus dynamiques (comme l’involution des glandes mammaires) aux mêmes endroits, à quelques jours d’intervalle. Cette fenêtre en silicone a également permis de surveiller les cellules cancéreuses disséminées uniques se développant en micro-métastases au fil du temps. Les fenêtres en silicone utilisées dans cette étude sont plus simples à insérer que les fenêtres en verre à cadre métallique et provoquent une inflammation limitée des tissus imagés. De plus, les grilles intégrées permettent un suivi simple de la même région tissulaire lors de séances d’imagerie répétées.

Introduction

La microscopie intravitale (MIV), l’imagerie des tissus chez les animaux anesthésiés, offre un aperçu de la dynamique des événements physiologiques et pathologiques à la résolution cellulaire dans les tissus intacts. Les applications de cette technique varient considérablement, mais la MIV a joué un rôle déterminant dans le domaine de la biologie du cancer pour aider à élucider comment les cellules cancéreuses envahissent les tissus et métastasent, interagissent avec le microenvironnement environnant et répondent aux médicaments ^1,2,3. En outre, la MIV a joué un rôle clé dans la compréhension des mécanismes complexes régissant les réponses immunitaires en fournissant des informations complémentaires aux approches de profilage ex vivo (par exemple, cytométrie en flux). Par exemple, des expériences d’imagerie intravitale ont révélé des détails sur les fonctions immunitaires en ce qui concerne la migration cellulaire et le contact cellule-cellule et ont offert une plate-forme pour quantifier la dynamique spatio-temporelle en réponse à une blessure ou à une infection ^4,5,6,7. Beaucoup de ces processus peuvent également être étudiés par coloration histologique, mais seule la MIV permet le suivi des changements dynamiques. En fait, alors qu’une section histologique offre un instantané du tissu à un moment donné, l’imagerie intravitale peut suivre les événements intercellulaires et subcellulaires au sein du même tissu au fil du temps. En particulier, les progrès dans le marquage de fluorescence et le développement de rapporteurs moléculaires ont permis de corréler les événements moléculaires avec les comportements cellulaires, tels que la prolifération, la mort, la motilité et l’interaction avec d’autres cellules ou la matrice extracellulaire. La plupart des techniques de MIV sont basées sur la microscopie à fluorescence, ce qui, en raison de la diffusion de la lumière, rend l’imagerie des tissus plus profonds difficile. Le tissu d’intérêt doit donc souvent être exposé chirurgicalement avec une procédure souvent invasive et terminale. Ainsi, selon le site de l’organe, le tissu peut être imagé en continu pendant une période variant de quelques-uns à 40 h⁸. Alternativement, l’insertion chirurgicale d’une fenêtre d’imagerie permanente permet l’imagerie séquentielle du même tissu sur une période de jours à^{semaines 7,9}.

Le développement de nouvelles fenêtres d’imagerie a été mis en évidence comme un besoin technologique pour améliorer encore les approches d’imagerie intravitale¹⁰. La fenêtre d’imagerie intravitale prototypique est un anneau métallique contenant un couvercle en verre fixé à la peau avec des sutures¹¹. L’interférence avec la libre circulation, l’accumulation d’exsudat et les dommages à la glissière de couverture en verre sont des problèmes courants observés lors de l’utilisation de telles fenêtres. De plus, la fenêtre prototypique nécessite une production spécialisée et la procédure chirurgicale peut nécessiter une formation approfondie. Pour résoudre ces problèmes, le polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère de silicone, qui a déjà été utilisé dans les fenêtres crâniennes pour l’imagerie à long terme dans le cerveau¹², a été adapté pour une utilisation dans l’imagerie des organes abdominaux et des glandes mammaires. Ici, une méthode détaillée pour générer des fenêtres en silicone à base de PDMS est présentée, y compris comment couler la fenêtre autour d’une grille en acier inoxydable pour fournir des repères pour l’imagerie répétée des mêmes régions tissulaires. En outre, une procédure chirurgicale simple et sans couture pour insérer la fenêtre sur les organes abdominaux ou la glande mammaire est décrite. Cette nouvelle approche permet de surmonter certains des problèmes les plus courants liés aux fenêtres d’imagerie actuellement utilisées et d’accroître l’accessibilité de l’imagerie intravitale longitudinale.

Protocol

Toutes les procédures décrites ont été effectuées conformément aux directives chirurgicales du laboratoire de Cold Spring Harbor et ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du laboratoire de Cold Spring Harbor.

1. Coulée de la fenêtre en silicone

1. Préparez le polymère de silicone (PDMS) en mélangeant l’élastomère de base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 (v / v).
2. Coulez une fenêtre en déposant une petite quantité de PDMS sur une surface stérile et lisse et ajustez le rapport volume/surface à l’épaisseur souhaitée.
   REMARQUE: L’utilisation de 200 mg de solution de polymère pour un cercle de 22 mm de diamètre sur le couvercle d’un couvercle à 24 puits donne un bon compromis entre la robustesse de la fenêtre et la clarté optique.
3. Facultatif : Pour fournir des repères pour l’imagerie répétée des mêmes régions tissulaires, appuyez légèrement sur une grille en acier inoxydable dans le silicone une fois que le PDMS est sur la surface de coulée souhaitée.
4. Pour éliminer les bulles d’air, placez la surface revêtue dans un dessiccateur sous vide pendant 45 minutes pour dégazer le polymère.
5. Durcir les fenêtres en silicone dans un four à 80 °C pendant 45 min.
6. Marquez le polymère sur les bords du moule et pelez doucement les fenêtres durcies de la surface utilisée pour la coulée avec des pinces.
7. Avant la chirurgie, stérilisez les fenêtres en autoclavant.

2. Préparation de la souris pour l’insertion de la fenêtre en silicone

1. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction en utilisant 4% (v/v) d’isoflurane. Déplacez la souris sur un coussin chauffant sur la table chirurgicale, placez la souris dans le masque nasal d’anesthésie et abaissez la concentration d’isoflurane à 2% pour l’entretien tout au long de la chirurgie.
2. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils des membres postérieurs. Ne continuez pas tant que la souris n’est pas inactive et ne montre pas de réponse réflexe de pincement des orteils.
3. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux pour les empêcher de sécher et prévenir les traumatismes.
4. Administrer l’analgésie préventive (buprénorphine 0,05 mg/kg) par voie sous-cutanée.
5. Rasez le site chirurgical et enlevez complètement les poils avec une crème dépilatoire.
6. Appliquer la solution de povidone-iode (10% v / v) et l’éthanol (70% v / v) consécutivement 3x pour prévenir l’infection du site chirurgical.

3. Insertion d’une fenêtre ventrale pour l’imagerie dans le foie; adaptable pour d’autres organes abdominaux (Figure 1)

1. Placez la souris en position couchée.
2. Faites une incision de 10 mm à partir de 3 mm du processus xiphoïde à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
3. Enlever une section de peau de 1 à 1,5 cm² le long de la ligne médiane.
4. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles et de pinces pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau.
5. Facultatif: Pour visualiser une plus grande partie du foie, utilisez des cotons-tiges stériles humidifiés avec une solution saline stérile pour pousser le foie vers le bas du diaphragme révélant le ligament falciforme reliant le foie au diaphragme. Couper le ligament en prenant soin de ne pas couper la veine cave inférieure.
6. Retirez l’adhésif chirurgical avec une seringue de 31 G, appliquez-en une petite quantité sur la surface du foie autour des bords de la zone à imager. Cet adhésif crée un joint circulaire, laissant la zone centrale intacte pour l’imagerie.
   ATTENTION : Limitez l’adhésif à de petites gouttelettes formant un motif circulaire autour de la zone d’imagerie. Les tissus immédiatement en contact avec l’adhésif ne peuvent pas être imagés. Il n’est pas nécessaire de sécher le tissu avant d’appliquer l’adhésif.
   REMARQUE: Tous les adhésifs à base de cyanoacrylate peuvent être utilisés avec succès pour cette procédure. L’adhésif chirurgical assure la stérilité. Pour les procédures terminales, les super colles tout usage donnent de bons résultats.
7. Positionnez la fenêtre à l’aide d’une pince et maintenez-la fermement contre le foie jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (~2 min).
8. Pliez les bords de la fenêtre sous le péritoine.
9. Avec une seringue, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui se trouvent maintenant sous le péritoine. Appuyez sur le péritoine avec une pince pour le fixer à la fenêtre.
10. De même, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur le péritoine avant de pousser sur la peau avec une pince pour la fixer au péritoine.
    REMARQUE: Si elle est effectuée correctement, une zone circulaire du tissu hépatique devrait maintenant être visible à travers la fenêtre.
11. Appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui aidera à empêcher la peau de repousser sur la fenêtre.
    ATTENTION: Si la procédure est effectuée à l’aide de techniques chirurgicales stériles et que la fenêtre est stérilisée avant l’insertion, le scellement de la plaie avec de l’adhésif chirurgical est suffisant pour éviter les infections. Cependant, le non-respect des techniques aseptiques appropriées lors de l’insertion chirurgicale ou la fermeture imparfaite peut entraîner une infection manifeste ou subclinique et un dessèchement des tissus.

4. Insertion d’une fenêtre latérale pour l’imagerie dans le foie; compatible avec l’injection concomitante de cellules cancéreuses dans la veine porte (Figure 2)

1. Placez la souris sur la position de décubitus latéral gauche
2. Faites une incision de 10 mm sur le flanc droit à 3 mm sous l’arc costal à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
3. Enlever une section de peau de 1 cm² .
4. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles et de pinces pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau.
5. Retirez l’adhésif chirurgical avec une seringue de 31 G, appliquez-en une petite quantité sur la surface du foie autour des bords de la zone à imager.
   ATTENTION : Limitez l’adhésif à de petites gouttelettes formant un motif circulaire autour de la zone d’imagerie. Les tissus immédiatement en contact avec l’adhésif ne peuvent pas être imagés.
   REMARQUE: Tous les adhésifs à base de cyanoacrylate peuvent être utilisés avec succès pour cette procédure. L’adhésif chirurgical assure la stérilité. Pour les procédures terminales, les super colles tout usage donnent de bons résultats.
6. Positionnez la fenêtre à l’aide d’une pince et maintenez-la fermement contre le foie jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (~2 min).
7. Pliez les bords de la fenêtre sous le péritoine.
8. Avec une seringue, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui se trouvent maintenant sous le péritoine. Appuyez sur le péritoine avec une pince pour le fixer à la fenêtre.
9. De même, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur le péritoine avant de pousser sur la peau avec une pince pour la fixer au péritoine.
   REMARQUE: Si elle est effectuée correctement, une zone circulaire du tissu hépatique devrait maintenant être visible à travers la fenêtre.
10. Appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui aidera à empêcher la peau de repousser sur la fenêtre.
11. Si une injection de veine porte est nécessaire :
    1. Placez la souris en position couchée.
    2. Faites une incision de 10 mm en partant du processus xiphoïde dans la peau.
    3. À l’aide d’une deuxième paire de ciseaux et de pinces stériles, faites une incision de 10 mm dans le péritoine.
    4. Trempez deux cotons-tiges dans une solution saline stérile.
    5. Utilisez les cotons-tiges pour tirer doucement l’intestin sur de la gaze stérile humidifiée avec une solution saline stérile, en prenant soin de ne pas tordre ou perturber l’orientation.
    6. Continuez à déplacer l’intestin de la cavité abdominale jusqu’à ce que la veine porte soit visible sur le côté droit de l’abdomen.
    7. Insérez une aiguille de 31–33 G caudale de 5–7 mm jusqu’au point d’entrée de la veine porte dans le foie, en veillant à ce qu’elle se déplace dans le vaisseau sanguin et non à travers celui-ci.
    8. Injecter lentement les cellules cancéreuses (remises en suspension dans 100 μL de PBS stérile).
       REMARQUE: Pour cette expérience, la lignée cellulaire du cancer du pancréas de l’amurine (par exemple, KPC-BL / 6-1199) peut être cultivée dans un milieu DMEM complet et 1 x 10⁵ cellules injectées dans 100 μL de PBS stérile.
    9. Pour prévenir les saignements, immédiatement après avoir retiré l’aiguille, appliquez une légère pression sur le site d’injection avec un petit morceau d’éponge chirurgicale pendant 1 à 2 minutes.
    10. Une fois la pression relâchée, surveillez le site pendant 1 à 2 minutes pour vous assurer de l’hémostase.
    11. À l’aide de cotons-tiges humidifiés, retournez l’intestin dans la cavité abdominale en suivant l’orientation physiologique de l’organe.
    12. À l’aide d’une pince stérile, insérez la fenêtre immédiatement sous le péritoine, sur le côté gauche de la cavité abdominale de la souris.
    13. Suture avec 4-0 sutures en soie et agrafe l’incision médiane avec des clips de plaie en acier inoxydable de 7 mm.
    14. Déplacez la souris vers la position de décubitus latéral gauche
    15. Faites une incision de 10 mm sur le flanc droit à 3 mm sous l’arc costal à travers la peau à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
    16. Retirez une section de peau de 1 cm² autour de l’incision.
    17. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles et de pinces pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau.
    18. Tirez la fenêtre en place sur le foie avant de la coller en place, comme décrit aux étapes 4.8 à 4.10.

5. Insertion de la fenêtre d’imagerie dans le pancréas (Figure 3)

1. Placez la souris sur la position de décubitus latéral droit.
2. Faites une incision de 10 mm sur le flanc gauche à 3 mm sous l’arc costal à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
3. Retirez une section de peau de 1 cm² autour de l’incision.
4. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles et de pinces pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau.
5. À l’aide de cotons-tiges stériles imbibés de solution saline stérile, tirez doucement sur la rate pour visualiser le pancréas. Procédez au repositionnement du pancréas avec les cotons-tiges humidifiés pour rendre plus de surface visible à travers l’incision.
   REMARQUE: À ce stade, les cellules cancéreuses du pancréas peuvent être injectées orthotopiquement dans le pancréas si cela fait partie de la conception expérimentale.
6. Retirez l’adhésif chirurgical avec une seringue de 31 G, appliquez-en une petite quantité sur la surface du pancréas autour des bords de la zone à imager.
   ATTENTION : Limitez l’adhésif à de petites gouttelettes formant un motif circulaire autour de la zone d’imagerie. Les tissus immédiatement en contact avec l’adhésif ne peuvent pas être imagés.
7. Positionnez la fenêtre à l’aide d’une pince et maintenez-la fermement contre le pancréas jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (~2 min).
8. Pliez les bords de la fenêtre sous le péritoine.
9. Avec une seringue, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui se trouvent maintenant sous le péritoine. Appuyez sur le péritoine avec une pince pour le fixer à la fenêtre.
10. De même, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur le péritoine avant de pousser sur la peau avec une pince pour la fixer au péritoine.
    REMARQUE: Si elle est effectuée correctement, une zone circulaire du tissu pancréatique devrait maintenant être visible à travers la fenêtre.
11. Appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui aidera à empêcher la peau de repousser sur la fenêtre.

6. Insertion de la fenêtre d’imagerie dans la glande mammaire (Figure 4)

1. Placez la souris en décubitus dorsal.
2. Faites une incision médiale de 10 mm sur l’un des mamelons inguinaux à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
3. Enlever une section de peau de 0,5 cm² au-dessus de la glande mammaire.
4. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles pour séparer soigneusement la glande mammaire de la peau en étalant les ciseaux entre les deux surfaces pour perturber l’adhérence.
   REMARQUE: Pour faciliter l’imagerie de la région de la glande mammaire inguinale, veillez à disséquer une partie de la peau au-dessus de la glande mammaire mais supérieure à la patte postérieure, de sorte que la fenêtre ne limite pas la mobilité de la souris.
5. Retirez l’adhésif chirurgical avec une seringue de 31 G, appliquez-en une petite quantité sur la surface de la glande mammaire autour des bords de la zone à imager.
   ATTENTION : Limitez l’adhésif à de petites gouttelettes formant un motif circulaire autour de la zone d’imagerie. Les tissus immédiatement en contact avec l’adhésif ne peuvent pas être imagés.
6. Positionnez la fenêtre à l’aide d’une pince et maintenez-la fermement contre la glande mammaire jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (~2 min).
   REMARQUE: Une zone circulaire du tissu de la glande mammaire devrait maintenant être visible à travers la fenêtre si elle est effectuée correctement.
7. Pliez les bords de la fenêtre sous la peau.
8. Avec une seringue, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui sont maintenant sous la peau. Appuyez sur la peau avec des pinces pour fixer la peau à la fenêtre.
9. Appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui aidera à empêcher la peau de repousser sur la fenêtre.

7. Récupération post-chirurgicale

1. Placez la souris dans une cage de récupération propre avec suffisamment de matériel de nidification, en vous assurant qu’une partie de la cage repose sur un coussin chauffant.
2. Surveillez la souris en continu jusqu’à ce qu’elle soit consciente et mobile.
3. Si nécessaire, fournir une dose supplémentaire d’analgésique 12 h après la dose préventive.
   REMARQUE: Une analgésie supplémentaire est généralement inutile, mais consultez un vétérinaire si la souris montre des signes de détresse (comme le dos voûté, la fourrure négligée ou la perte d’intérêt pour la nourriture). Surveillez la souris quotidiennement pendant les 3 premiers jours après la chirurgie pour détecter tout signe d’infection ou d’autres effets indésirables. Moins de 2% des souris nécessitent des soins vétérinaires ou une euthanasie, généralement en raison d’un détachement partiel de la fenêtre. Il est important de noter que pour les souris mâles avec des fenêtres d’imagerie du foie ventral, les combats entre souris peuvent entraîner un détachement des fenêtres. Ceci est évité en logeant les souris séparément.

8. Imagerie à travers la fenêtre

1. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction en utilisant 4% (v/v) d’isoflurane.
2. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux pour les empêcher de sécher et prévenir les traumatismes.
3. Déplacez la souris de la chambre d’induction à l’étage du microscope. Placez la souris dans le masque nasal d’anesthésie et abaissez la concentration d’isoflurane à environ 1 à 1,5% pour l’anesthésie d’entretien tout au long de la procédure d’imagerie.
4. Placez un capteur de coussin de pression sous la souris pour surveiller la fréquence respiratoire et fixez la souris à la scène à l’aide d’un ruban chirurgical souple.
5. Insérez un thermomètre rectal pour surveiller la température corporelle tout au long de la séance d’imagerie.
6. Allumez le coussin chauffant, en surveillant de près la souris pour vous assurer que la température corporelle ne dépasse pas 37 °C.
7. Utilisez un logiciel pour surveiller le taux d’haleine de la souris. Le taux optimal est d’environ 1 respiration / seconde. Ajuster l’anesthésie au besoin.
8. Avant chaque séance d’imagerie, nettoyez la fenêtre de tout milieu d’immersion résiduel de la lentille et des débris en l’essuyant doucement avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70% (v / v).
9. Lorsque vous utilisez une lentille d’immersion dans l’eau, appliquez un gel à ultrasons sur la fenêtre, en évitant les bulles.
   REMARQUE: L’eau distillée peut également être utilisée, mais peut nécessiter une nouvelle application pendant l’imagerie.
10. Pour trouver la profondeur optimale pour l’imagerie, commencez par localiser la grille et placez-la au point.
11. Déterminez la profondeur approximative de l’imagerie tissulaire en définissant le bas de la grille sur 0. Ces informations sont nécessaires pour localiser le plan z correspondant lors de sessions d’imagerie ultérieures.
12. Pour identifier le même emplacement sur plusieurs sessions d’imagerie, utilisez les carrés de la grille comme point de référence. Pendant l’imagerie, notez l’orientation de la grille et l’emplacement dans la grille de chaque champ de vision imagé (par exemple, 2^e ligne du haut, 4^e carré à partir de la gauche).
13. Au cours des sessions d’imagerie successives, utilisez la grille pour revenir à des zones de grille spécifiques - et donc à des champs d’imagerie.
14. Après chaque séance d’imagerie, retirez tout milieu d’immersion résiduel de la lentille et les débris en essuyant doucement la fenêtre avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70 % (v/v).

Representative Results

L’imagerie intravitale via des fenêtres d’imagerie peut être utilisée pour observer, suivre et quantifier un large éventail d’événements cellulaires et moléculaires à une résolution unicellulaire sur une période de plusieurs heures à quelques semaines. Les caractéristiques idéales pour une fenêtre d’imagerie comprennent: a) un impact limité sur le bien-être de la souris et la physiologie du tissu; b) la durabilité; c) simplicité d’insertion; et d) des repères clairs pour l’imagerie répétée de la même région. Le résultat est une fenêtre en silicone inerte polyvalente qui se produit et s’insère facilement et qui peut être équipée d’une grille pour localiser le même champ de vision sur plusieurs sessions d’imagerie.

La fenêtre est faite de PDMS, qui est un matériau peu coûteux, flexible et clair. Les fenêtres peuvent être coulées avec des fournitures largement disponibles à l’achat pour la plupart des laboratoires. À ces fins, les moules circulaires (22 mm de diamètre) déjà gravés sur le couvercle de 24 plaques de puits disponibles dans le commerce fonctionnent bien. En faisant varier la quantité de polymère utilisée par unité de surface, il est possible d’ajuster l’épaisseur de la fenêtre. Pour documenter l’effet de l’épaisseur de la fenêtre sur la résolution d’imagerie, une analyse de la fonction d’étalement ponctuel (PSF) de microsphères fluorescentes de 40 nm a été effectuée afin de comparer l’imagerie à travers des fenêtres PDMS d’épaisseurs variables aux couvercles de verre généralement utilisés pour les fenêtres d’imagerie intravitale (0,17 mm d’épaisseur). Pour reproduire la configuration utilisée pour l’imagerie intravitale, l’imagerie PSF a été réalisée à l’aide du même microscope à deux photons et de la même lentille d’immersion dans l’eau avec un gel à ultrasons appliqué comme milieu d’immersion.

La pleine largeur à la moitié maximale (FWHM) de l’intensité du signal calculée via l’ajustement du PSF dans les plans latéraux était comparable à celle du verre pour les fenêtres PDMS coulées avec 100 mg de PDMS (Figure 5A, B). La résolution latérale par rapport aux couvercles de verre a été réduite pour les fenêtres coulées avec 150 à 250 mg de PDMS (Figure 5A, B). Dans le plan d’image de l’axe Z, les fenêtres PDMS coulées avec 100 à 200 mg de polymère ont obtenu de meilleurs résultats que les couvercles en verre (Figure 5C). La clarté optique a été perdue dans les fenêtres coulées avec 300 mg de PDMS, ce qui a rendu les mesures peu fiables (figures 5A à C). Le rapport X/Y des valeurs FWHM ne différait pas significativement entre le verre et le PDMS de n’importe quelle épaisseur, bien que le rapport pour les fenêtres coulées avec 200 à 250 mg de polymère s’écartait notablement de 1 en utilisant le gel à ultrasons comme milieu d’immersion (Figure 5D). Cependant, lors de l’utilisation de l’eau comme milieu d’immersion pour la fenêtre coulée avec 200 mg, l’écart par rapport à la symétrie était beaucoup moins prononcé. À cette épaisseur, les écarts dus à des aberrations dans le polymère sont donc probablement mineurs. Les valeurs d’intensité de fluorescence maximale ont également été recueillies pour chaque microsphère et ont montré que le verre et le PDMS fonctionnaient de manière comparable, bien que le signal le plus élevé ait été enregistré à travers le verre (figure 5I). L’épaisseur optimale de la fenêtre PDMS dépendra d’applications et de systèmes d’imagerie spécifiques. Pour la plupart des usages, 200 mg de solution de polymère pour une fenêtre circulaire de 22 mm de diamètre est un compromis optimal entre la robustesse de la fenêtre et la clarté optique. En effet, les fenêtres coulées avec moins de 200 mg étaient plus claires optiquement, avec des valeurs FWHM similaires à celles du verre, mais parfois déchirées lors de l’implantation chirurgicale, alors qu’aucun cas de lésion de fenêtre n’a été observé en utilisant 200 mg (chez > 100 souris).

Pour mesurer ces différences dans les propriétés des matériaux, des fenêtres PDMS (200 mg et 150 mg) ont été chargées dans une machine d’essai de matériaux servohydraulique sous un profil de contrôle de charge de 1N/s jusqu’à la défaillance du matériau (Figure 5J). Les valeurs de force et de déplacement ont été mesurées à une fréquence de 100 Hz. Les données force-déplacement ont ensuite été converties en contrainte-déformation à l’aide des équations suivantes :

σ = F / A (1)

Ɛ = ΔL / L₀ (2)

Où σ est la contrainte (Pa), F est la force (N), A est la section transversale de la fenêtre, Ɛ est la déformation, ΔL est le déplacement et L₀ est l’épaisseur de la fenêtre. La ténacité du matériau a été déterminée en calculant la surface de sommation sous la courbe contrainte-déformation. La ténacité d’un matériau fait référence à sa capacité à se déformer plastiquement et à absorber l’énergie dans le processus avant la rupture – une propriété clé pour les fenêtres implantées¹³. En accord avec les observations lors d’expériences d’imagerie, les fenêtres coulées avec 200 mg de PDMS ont une ténacité significativement plus grande que les fenêtres coulées avec 150 mg (Figure 5K) et sont donc moins sujettes à la rupture.

Ensuite, le module de Young (E) des fenêtres PDMS préférées coulées avec 200 mg a été déterminé et comparé à celui des couvercles en verre standard en extrayant la région linéaire de la courbe contrainte-déformation et en déterminant la pente en utilisant la loi de Hooke:

σ = EƐ (3)

Le module de Young des fenêtres en verre était significativement plus grand que le PDMS, ce qui était attendu parce que le verre est beaucoup plus rigide dans la résistance du matériau que le PDMS (Figure 5L). Ainsi, bien que le verre soit un matériau plus résistant en raison de son plus grand module de Young, la plus grande ténacité des fenêtres PDMS de 200 mg permet de les appliquer pendant de plus longues périodes sans risque de rupture et nécessitant une deuxième intervention chirurgicale ou une euthanasie.

Un avantage majeur des fenêtres en silicone est la polyvalence. Il est important de noter que la procédure d’insertion chirurgicale de la fenêtre peut être facilement adaptée à différents endroits anatomiques. Les adaptations à la chirurgie sont facilitées par le fait que les fenêtres peuvent être facilement redimensionnées avec des ciseaux chirurgicaux et que les fenêtres sont collées à la surface du tissu / organe d’intérêt et à la peau, éliminant complètement le besoin de sutures. L’insertion réussie de fenêtres de cette façon a été réalisée pour le foie, le pancréas et la glande mammaire (figures 6A-C). En particulier, deux protocoles différents ont été développés pour implanter des fenêtres ventrales ou latérales pour l’imagerie hépatique. La figure 1 montre les étapes à suivre pour insérer une fenêtre ventrale. Cette procédure peut être adaptée à d’autres organes abdominaux et donnera la plus grande surface imageable. Cependant, à moins qu’une grande zone d’imagerie (>1 cm²) ne soit nécessaire, il est préférable d’insérer une fenêtre latérale dans le flanc droit de la souris (figure 2) pour réduire les artefacts de mouvement, par exemple en raison de la respiration et du péristaltisme. De plus, la procédure chirurgicale d’insertion de la fenêtre d’imagerie latérale est compatible avec une injection simultanée de cellules cancéreuses dans la veine porte pour modéliser expérimentalement le développement de métastases hépatiques. Ainsi, les souris peuvent subir une seule procédure au lieu de deux procédures distinctes lorsque l’injection de veine porte et l’insertion de fenêtre d’imagerie abdominale sont nécessaires chez le même animal. Une procédure analogue est utilisée pour implanter une fenêtre sur le pancréas sur le flanc gauche de la souris (Figure 3). La fenêtre peut également être insérée sur des tissus sous-cutanés, c’est-à-dire des glandes mammaires normales, ainsi que sur des tumeurs mammaires spontanées ou orthotopiquement transplantées déjà établies (Figure 4). Alternativement, les cellules cancéreuses peuvent être injectées dans la glande mammaire à travers la fenêtre pour suivre longitudinalement le développement d’une tumeur primaire, car les aiguilles peuvent percer le film PDMS sans compromettre l’intégrité de la fenêtre.

En raison de leur faible poids et de leur flexibilité, les fenêtres en silicone n’interfèrent pas avec la mobilité de la souris (film 1). Ainsi, les fenêtres en silicone surmontent les principaux obstacles associés aux fenêtres en verre, tels que la fragilité, la suture complexe et l’impact sur la mobilité animale. Au lieu de cela, la principale limitation associée aux fenêtres en silicone est la repousse de l’épithélium sous la fenêtre. Cependant, lorsqu’une quantité appropriée de peau est enlevée et que la plaie est complètement scellée avec de la colle, la réépithélialisation est limitée et l’imagerie peut se poursuivre sur de longues périodes (jusqu’à 35 jours ont été testés, Figure 6D). Après avoir inséré la fenêtre, la souris peut être imagée longitudinalement pendant environ un mois ou jusqu’à ce que l’adhésif chirurgical échoue ou qu’une réépithélialisation se produise. Des séances d’imagerie quotidiennes courtes (~ 60 min) ou des séances d’imagerie moins fréquentes mais plus longues sont privilégiées pour éviter les effets indésirables induits par l’anesthésie. Les animaux porteurs de fenêtres peuvent être photographiés sur n’importe quelle plate-forme d’imagerie intravitale, par microscopie confocale à photon unique ou à plusieurs photons, en utilisant des procédures standard (voir, par exemple, ¹⁴). Avant et après chaque séance d’imagerie, il est conseillé de nettoyer la fenêtre de la crasse et des débris en l’essuyant avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70% (v / v).

Afin de suivre le même emplacement au fil du temps, des grilles en acier inoxydable peuvent être intégrées dans la fenêtre. La figure 7A montre les spécifications des grilles gravées au laser sur mesure utilisées ici. Les grilles commerciales pour la microscopie électronique à transmission conviennent également à cette application. La grille est intégrée dans la fenêtre pendant la procédure de coulée et est clairement visible sur la zone d’imagerie à la fois à l’œil nu (Figure 7B) et à travers les oculaires du microscope (Figure 7C). Étant donné que la fenêtre est collée à la surface de l’organe, la position des champs d’imagerie par rapport à la grille est stable. Pendant l’imagerie, notez l’orientation de la grille et l’emplacement dans la grille de chaque champ de vision imagé (par exemple, 2^e ligne du haut, 4^e carré à partir de la gauche). Ensuite, utilisez la grille pour revenir à des zones de grille spécifiques - et donc à des champs d’imagerie - lors de sessions d’imagerie successives.

La grille est également utile pour aligner le champ d’imagerie lors d’une séance d’imagerie lorsque le tissu dérive lentement en raison, par exemple, de la respiration ou du péristaltisme. La plupart des fenêtres d’imagerie avec un bord rigide peuvent être attachées à un support pendant l’imagerie, ce qui ajoute de la stabilité à la zone d’imagerie. Étant donné que les fenêtres flexibles ne peuvent pas être directement stabilisées, du ruban chirurgical est utilisé pour stabiliser la section du corps contenant la fenêtre, et la zone d’imagerie est réalignée au centre du carré de grille correspondant ou des repères tissulaires précédemment identifiés (par exemple, des repères vasculaires) à des intervalles définis (généralement toutes les 30 minutes). Une correction supplémentaire de la dérive pour le déplacement microscopique du champ de vision est effectuée numériquement dans la phase post-acquisition grâce à un code qui réaligne les images en fonction des motifs tissulaires détectés (code supplémentaire 1-2).

Pour valider que la fenêtre ne provoque pas d’effet indésirable systémique manifeste, le poids des animaux ayant subi une implantation de fenêtre et des témoins non traités appariés selon l’âge a été surveillé. Après une perte de poids initiale associée à la chirurgie, la plupart des souris avec des fenêtres insérées continuent de prendre du poids au fil du temps, ce qui indique que l’insertion de fenêtres est bien tolérée (figures 8A à C). Pour les fenêtres du foie et des glandes mammaires, le poids normal est repris dans les 5 jours suivant la chirurgie. La récupération postopératoire est plus lente après l’implantation de la fenêtre sur le pancréas, les souris revenant au poids préopératoire dans les 14 jours. Cette observation est cohérente avec les effets attendus associés à la manipulation du pancréas au moment de la chirurgie. Notez que même dans les cas où la perte de poids n’atteint pas le seuil du critère d’évaluation sans cruauté, les souris qui ne reprennent pas de poids corporel préopératoire (<5% de toutes les souris, illustré par la souris indiquée par * dans la figure 8B) sont généralement censurées à partir d’expériences d’imagerie. De plus, le nombre de globules blancs, déterminé à divers moments après l’insertion de la fenêtre, n’a pas été modifié chez presque toutes les souris porteuses de fenêtres par rapport aux témoins et n’a pas changé considérablement au fil du temps (figure 8D), ce qui suggère que la fenêtre n’a pas causé d’inflammation systémique majeure.

Ensuite, pour évaluer le degré de réponse tissulaire locale à la fenêtre et à la colle, les souris ont été euthanasiées à 3, 14 et 28 (fenêtres de la glande mammaire) ou 35 jours (fenêtres du foie et du pancréas) après l’insertion chirurgicale de la fenêtre pour analyse histologique. L’évaluation des coupes hépatiques colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) a montré une formation superficielle (20 à 80 μm), minimale à légère de granulation capsulaire sous les fenêtres pour la plupart des souris (2 souris sur 3 évaluées au jour 3 et 2 sur 3 évaluées au jour 14). Ces lésions étaient focales (1–3 mm de longueur), correspondant approximativement à la largeur de la couche de colle (Figure 8E). Après 35 jours, la plupart des souris (4 sur 6 évaluées dans deux expériences distinctes) ne présentaient aucun tissu granulaire, tandis que quelques-unes (2 sur 6) présentaient une sclérose capsulaire focale modérée et une desmoplasie (à une profondeur de 25 à 250 μm). Fait intéressant, aucune lésion significative n’a été observée à la surface du pancréas directement sous la fenêtre à aucun moment de la cohorte de neuf souris (figure 8G). Cependant, certaines souris présentaient des zones d’atrophie dans le pancréas et d’inflammation de la graisse abdominale (stéatite), ce qui correspond à des dommages induits par la manipulation. Pour la glande mammaire, le jour 3 après l’implantation de la fenêtre, 3 souris sur 3 avaient soit un tissu de granulation rappelant une incision cicatrisante visible le long de la surface de la glande, soit une réaction inflammatoire dans le tissu adipeux; au jour 14, 3 souris sur 3 évaluées avaient du tissu de granulation. Ces lésions étaient à nouveau focales et mesuraient de 1 à 3 mm de long (figure 8I). Les souris avec des fenêtres de glande mammaire euthanasiées 28 jours après la chirurgie n’ont montré aucune anomalie histologique évidente.

Cette analyse suggère que la fenêtre ne compromet pas l’architecture physiologique globale des organes testés (foie, pancréas, glande mammaire). Le tissu réactif trouvé à la surface du foie et de la glande mammaire était probablement une réaction à la colle et se limitait au tissu immédiatement en contact avec l’adhésif. Le tissu normal peut être facilement trouvé adjacent (< 100 μm) au tissu réactif dans les régions non exposées à la colle (Figure 8E, I), et l’inflammation tissulaire, par conséquent, n’interfère pas avec l’imagerie des régions tissulaires saines. De plus, la réaction tissulaire est probablement réversible car la plupart des souris (8 souris sur 9, tous les emplacements tissulaires) n’ont montré aucune lésion significative aux derniers moments (28 ou 35 jours), bien que la confirmation directe que la réponse tissulaire se résout serait difficile à obtenir sans mesures longitudinales chez des souris individuelles.

Une coloration immunohistochimique multiplexée pour CD45, CD68 et la myéloperoxydase (MPO) a également été effectuée pour caractériser l’infiltration des leucocytes, des monocytes/macrophages et des neutrophiles, respectivement. Une augmentation de l’infiltration des cellules immunitaires associée au tissu de granulation et à la stéatite a été observée dans la glande mammaire et le foie, mais pas dans le pancréas (figure 8F, H, J).  Il convient de noter que ces changements étaient probablement transitoires, car l’infiltrat des cellules immunitaires était comparable à celui des témoins non traités aux derniers points temporels (28 jours pour les fenêtres des glandes mammaires et 35 jours pour les fenêtres du foie et du pancréas).

Le foie a été choisi comme site pour caractériser davantage si l’insertion de fenêtres et l’imagerie provoquaient une infiltration immunitaire locale importante à l’aide de l’imagerie. Pour ce faire, des souris c-fms-EGFP (MacGreen)¹⁵, dans lesquelles des cellules myéloïdes (principalement des macrophages) sont marquées avec une protéine fluorescente verte, ont été utilisées. Les fenêtres hépatiques ont été implantées chez trois souris c-fms-EGFP et les ont imagées les jours 1, 3 et 5 après la chirurgie en utilisant la grille pour localiser le même champ de vision. Le nombre de macrophages présents dans la zone d’imagerie n’a pas changé considérablement au fil du temps après l’insertion de la fenêtre (Figure 8K).

Ensuite, la fenêtre a été testée fonctionnellement en imageant un ensemble diversifié de processus biologiques au niveau cellulaire (c.-à-d. mouvement, prolifération, contact cellule-cellule) et tissulaire (c.-à-d. croissance tumorale dans le pancréas, infiltration immunitaire pendant l’involution de la glande mammaire et métastases hépatiques). Le pancréas n’est pas un endroit facilement accessible pour l’imagerie. Pour démontrer comment la fenêtre peut être utilisée pour capturer la dynamique des cellules cancéreuses dans cet organe, des fenêtres ont été insérées sur le pancréas de six souris C57BL / 6J en même temps que l’injection orthotopique de cellules KPC-BL / 6-1199, une lignée cellulaire de cancer du pancréas dérivée d’un KPC couramment utilisé (Kras^{LSL- G12D / +} ;p 53^LSL-R172H; Pdx1-Cre) modèle murin génétiquement modifié du cancer du pancréas. Afin d’être visualisées par microscopie confocale, les cellules KPC-BL/6-1199 ont été conçues pour exprimer la GFP améliorée inductible à la doxycycline (cellules iGFP-1199). Six jours après l’injection, les souris ont été soumises à un régime de doxycycline pour déclencher l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules cancéreuses du pancréas. La figure 9 montre des images représentatives d’une souris injectée orthotopiquement avec des cellules iGFP-1199 les jours 11 et 14 suivant l’injection et l’insertion de la fenêtre. Le film 2 montre le bord de la tumeur iGFP-1199 dans un extrait d’une séance d’imagerie de 2 heures le jour 11 après l’insertion de la fenêtre, illustrant la capacité de capturer la dynamique de la projection de la membrane cellulaire dans le pancréas à l’aide des fenêtres en silicone.

La fenêtre en silicone peut également être utilisée pour capturer l’infiltration dynamique des cellules immunitaires au fil du temps. Pour illustrer cela, les fenêtres des glandes mammaires ont été insérées dans l’ACTB-ECFP en lactation (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); Souris LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) immédiatement après le sevrage. Chez ces souris, toutes les cellules, mais la plupart des cellules hautement épithéliales, expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) entraînée par le promoteur bêta-actine, et les cellules myéloïdes – principalement les neutrophiles, mais aussi les macrophages – sont marquées par eGFP entraînée par le promoteur lysozyme M. Les souris ont été photographiées les jours 2 et 4 après l’insertion de la fenêtre, pendant le processus d’involution de la glande mammaire, lorsque le tissu de la glande mammaire commence à revenir à son état d’avant la grossesse. Deux macros pour ImageJ ont été développées pour réduire les artefacts de mouvement et améliorer la visualisation, l’une aligne les plans Z dans une vidéo intravitale en 4 dimensions (code supplémentaire 1) et l’autre réduit l’oscillation due à la respiration ou à d’autres artefacts de mouvement (code supplémentaire 2). La figure 10 et le film 3A–C montrent l’infiltration de neutrophiles dans le tissu remodelant de la glande mammaire au même endroit aux jours 2 et 4, illustrant comment la fenêtre pourrait être utilisée pour surveiller et suivre l’infiltration et le mouvement des cellules immunitaires à différents jours. Une expérience analogue a été menée sur une souris c-fms-EGFP, avec des cellules myéloïdes (principalement des macrophages) exprimant la GFP entraînée par le promoteur c-fms (film 4).

Enfin, la surface relativement grande de cette fenêtre personnalisable permet d’observer des événements rares, tels que la formation de métastases hépatiques après inoculation intraveineuse. Pour démontrer ce phénomène, des fenêtres hépatiques ont été insérées chez des souris C57BL/6J au moment de l’injection de veine porte avec des cellules cancéreuses du pancréas KPC-BL/6-1199 exprimant de manière constitutive la protéine de fusion nucléaire histone2B-CFP (H2B-CFP). Au fil du temps, l’excroissance de cellules individuelles et de petits groupes de 2 à 3 cellules au fur et à mesure qu’elles se développaient en micrométastases (cellules >100) a été surveillée. La figure 10 montre des images représentatives prises les jours 1, 3, 7 et 9 après l’injection et l’insertion de fenêtres et montre la progression des cellules individuelles aux micrométastases.

Toutes les images et tous les films ont été collectés à l’aide d’un microscope multiphotonique. Des projections d’intensité maximale et des alignements de films le long des axes Z et X au fil du temps ont été générés à l’aide du logiciel ImageJ. Des images et des films alignés ont ensuite été compilés à l’aide du logiciel Imaris.

Figure 1 : Insertion chirurgicale d’une fenêtre d’imagerie abdominale ventrale au-dessus du foie. (A) Le dessin animé montre l’emplacement anatomique des structures pertinentes pour la chirurgie. La boîte en pointillés blanc décrit le champ chirurgical vu sur les photos. (B) Une incision est pratiquée à partir de 3 mm en dessous du processus xiphoïde et en continuant vers le bas de sorte qu’une section de peau de 1 à 1,5 cm² soit enlevée le long de la ligne médiane. (C) Une section légèrement plus petite du péritoine est disséquée. (D) Le ligament falciforme (pointe de flèche blanche) est sectionné, poussant le foie vers le bas. Remarque: des cotons-tiges humidifiés avec une solution saline stérile sont utilisés pour manipuler doucement les organes internes. (E) À l’aide d’une seringue, une petite quantité d’adhésif chirurgical est appliquée en gouttelettes autour de la zone d’intérêt à la surface du foie. (F) La fenêtre est positionnée et maintenue fermement contre le foie jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (2 min). (G) Les bords de la fenêtre sont pliés sous le péritoine et la peau. (H) Pour fixer la fenêtre au péritoine, un adhésif est appliqué sur la surface de la fenêtre correspondant à la zone ombragée, avant de pousser le péritoine vers le bas et de le coller en place. La peau est également collée sur le péritoine. Un rebord de colle est finalement déposé le long de la ligne rouge pour empêcher la croissance de l’épithélium au-dessus de la fenêtre. (I) Même image qu’en (H) sans les marques montrant la souris prête pour la récupération post-chirurgicale. La zone délimitée par des lignes pointillées est agrandie en (J, K). (J) Les marques des gouttelettes d’adhésif sont visibles à la surface du foie (pointes de flèches) (K) Même photo que dans J montrant le foie visible à travers la fenêtre délimitée par une ligne pointillée blanche. Les gouttelettes d’adhésif sur la surface du foie sont soulignées en rouge. La zone à imager est délimitée en blanc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Insertion chirurgicale d’une fenêtre sur le lobe droit du foie. (A) La caricature montre l’emplacement anatomique des structures pertinentes pour la chirurgie. La boîte en pointillés noire dessine le champ chirurgical vu sur les photos. (B) La souris est placée en position de décubitus latéral gauche, une incision est pratiquée à partir de 3 mm sous la cage thoracique et une section de peau d’environ 1 cm² est enlevée. (C) Une section légèrement plus petite du péritoine est disséquée. (D) Le foie est doucement tiré vers le bas sous la cage thoracique à l’aide d’un coton-tige humidifié. (E) À l’aide d’une seringue, une petite quantité d’adhésif chirurgical est appliquée en gouttelettes (tête de flèche blanche) à la surface du foie. (F) La fenêtre est positionnée et maintenue fermement contre le foie jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (2 min). (G) Les bords de la fenêtre sont pliés sous le péritoine et la peau. (H) Pour fixer la fenêtre au péritoine, un adhésif est appliqué sur la surface de la fenêtre, correspondant à la zone ombragée, avant de pousser le péritoine vers le bas et de le coller en place. La peau est également collée sur le péritoine. Un bord de colle est également déposé le long de la ligne rouge pour empêcher la croissance de l’épithélium au-dessus de la fenêtre. (I) À fort grossissement, le foie (souligné par une ligne pointillée blanche) est visible à travers la fenêtre. La zone d’imagerie est marquée par la grille intégrée dans la fenêtre (flèche blanche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Insertion chirurgicale d’une fenêtre au-dessus du pancréas. (A) La caricature montre l’emplacement anatomique des structures pertinentes pour la chirurgie. La boîte en pointillés noire dessine le champ chirurgical vu sur les photos. (B) La souris est placée en position de décubitus latéral droit. La rate est visible à travers la peau rasée (ligne pointillée) (C) Une incision est pratiquée à partir de 3 mm sous la cage thoracique et une section de peau d’environ 1 cm² est enlevée. (D) Une section légèrement plus petite du péritoine est disséquée. (E) Le pancréas (tête de flèche blanche) est délicatement positionné avec un coton-tige humidifié à l’emplacement de la fenêtre. (F) À l’aide d’une seringue, une petite quantité d’adhésif chirurgical est appliquée sur la rate, ainsi que sur le pancréas (loin de la région à imager). (G) La fenêtre est positionnée et maintenue fermement contre le pancréas jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (2 min). Les bords de la fenêtre sont pliés sous le péritoine et la peau. (H) Pour fixer la fenêtre au péritoine, un adhésif est appliqué sur la surface de la fenêtre correspondant à la zone ombragée, avant de pousser le péritoine vers le bas et de le coller en place. La peau est également collée sur le péritoine. Un bord de colle est également déposé le long de la ligne rouge pour empêcher la croissance de l’épithélium au-dessus de la fenêtre. (I) À fort grossissement, le pancréas (souligné par une ligne pointillée blanche) est visible à travers la fenêtre. La zone d’imagerie est marquée par la grille intégrée dans la fenêtre (flèche blanche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Insertion chirurgicale d’une fenêtre au-dessus de la glande mammaire inguinale. (A) La caricature montre l’emplacement anatomique des structures pertinentes pour la chirurgie. La boîte en pointillés noire dessine le champ chirurgical vu sur les photos. Notez que la chirurgie peut être réalisée sur la^4ème ou la^5ème glande mammaire. (B) La souris est placée en position couchée sur un champ chirurgical stérile. Le 5^ème mamelon droit (tête de flèche) est utilisé comme point de repère pour effectuer l’incision. (C) Une incision est pratiquée, la glande mammaire est séparée de la peau sus-jacente et une section de peau d’environ 1 cm² est enlevée. (D) À l’aide d’une seringue, une petite quantité d’adhésif chirurgical est appliquée en gouttelettes autour de la zone d’intérêt à la surface de la glande mammaire. (E) La fenêtre est positionnée et maintenue fermement jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (2 min). (F) Les bords de la fenêtre sont pliés sous la peau à l’aide d’une pince. (G) Pour fixer la fenêtre à la peau, un adhésif est appliqué sur la surface de la fenêtre correspondant à la zone ombragée, avant de pousser la peau vers le bas et de la coller en place. Un bord de colle est également déposé le long de la ligne rouge pour empêcher la croissance de l’épithélium au-dessus de la fenêtre.  (H) Un exemple de fenêtre implantée sur une petite tumeur dans la^4ème glande mammaire droite est fourni. Les zones délimitées par des lignes pointillées sont représentées par un grossissement plus élevé en (I). (I) Les gouttelettes d’adhésif à la surface de la glande mammaire sont soulignées en rouge. La zone à imager est délimitée en noir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Les fenêtres d’imagerie en silicone ont des propriétés optiques et matérielles favorables. (A–C) Pour mesurer la fonction d’étalement des points et comparer les propriétés d’imagerie des fenêtres PDMS à celles des couvercles en verre, des microsphères fluorescentes jaune-vert de 40 nm ont été imagées à travers des fenêtres PDMS d’épaisseur variable ou des couvercles en verre (épaisseur # 1,5)¹⁶. Les images ont été recueillies à l’aide d’un gel à ultrasons comme milieu d’immersion pour correspondre aux conditions de l’imagerie intravitale. Les graphiques montrent la pleine largeur calculée à la moitié maximale (FWHM) dans le (Un) Axe X (B) Axe des Y, et (C) Axe Z (moyenne ± SD; n = 3/groupe, acquis à l’aide de deux fenêtres séparées ou plus; ANOVA unidirectionnelle comparant toutes les fenêtres PDMS au verre avec le test de comparaisons multiples de Dunnett; seules des différences significatives sont indiquées). (D) Rapport entre les valeurs FWHM calculées dans les axes X et Y (A–B) est représenté comme une mesure de la symétrie des images de source ponctuelle le long des axes X et Y, et donc des aberrations optiques. (E–G) Les microsphères ont été imagées à travers trois fenêtres distinctes coulées avec 200 mg de PDMS (similaires aux fenêtres utilisées pour l’imagerie intravitale pour Graphique 9, Graphique 10, Graphique 11 et Film 2, Film 3, Film 4) ou trois couvercles en verre (épaisseur # 1,5) pour mesurer la fonction d’étalement ponctuel. Contrairement aux exemples d’imagerie intravitale, les images pour ces calculs ont été recueillies en utilisant de l’eau comme milieu d’immersion. Les graphiques montrent le FWHM calculé dans le (E) Axe X (F) Axe Y et (G) Axe Z (moyenne ± SD; n = 3/groupe à l’aide de trois fenêtres distinctes; Test de Mann-Whitney, aucune différence significative n’a été détectée). (H) Le graphique montre le rapport entre les valeurs FWHM calculées sur les axes X et Y (E–F). (Je) Les graphiques montrent l’intensité fluorescente maximale par microsphère (moyenne ± ET; n = 3/groupe; Test de Mann-Whitney, aucune différence significative n’a été détectée). Toutes les images ont été collectées à une longueur d’onde de 960 nm et une puissance laser de 3%. Une pile z de 100 μm a été collectée pour chaque microsphère, avec une taille de pas de 0,6 μm. Le cadre de l’image a été défini à 69 μm x 69 μm avec une résolution de 1022 pixels x 1022 pixels. L’analyse a été effectuée avec le plugin Fidji - MetroloJ. (J) Pour tester les propriétés des matériaux, les fenêtres PDMS ont été maintenues en tension et fixées entre deux rondelles en forme d’anneau à l’aide de super colle pour assurer une réponse élastique pendant les essais mécaniques. La même procédure a été utilisée pour les glissements de verre de micro-couverture sans la tension due à la rigidité du verre. Une pointe de chargement constituée d’un hémisphère (6 mm de diamètre) avec une extrusion de cylindre (4 mm de diamètre, 20 mm de longueur) a été imprimée en 3D à l’aide d’un filament d’acide polylactique. Les fenêtres ont été chargées dans une machine d’essai de matériaux servohydrauliques sous un profil de contrôle de charge de 1 N/s jusqu’à la défaillance du matériau. Les valeurs de force et de déplacement ont été mesurées à une fréquence de 100 Hz. L’image montre la configuration du test de fenêtre avec l’embout de chargement appliqué au centre de la fenêtre. (K) Le graphique montre la ténacité du matériau déterminée en calculant la surface de sommation sous la courbe contrainte-déformation à l’aide de la fonction Trapz dans MATLAB (moyenne ± SEM; n = 3/groupe à l’aide de trois fenêtres PDMS distinctes pour chaque épaisseur et couvercles de verre; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey). (L) Le diagramme montre le module de Young déterminé à partir de la partie linéaire de la courbe contrainte-déformation (moyenne ± SEM; n = 3/groupe à l’aide de trois fenêtres PDMS et de couvercles en verre distincts; test t avec correction de Welch). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : La fenêtre en silicone démontre une tolérabilité et une longévité élevées. (A) Image représentative d’un homme de 7 semaines d’une souris C57BL/6J âgée de 7 semaines avec une fenêtre d’imagerie abdominale ventrale sans grille 11 jours après la chirurgie de la fenêtre. (B) Une image représentative d’un homme de 7 semaines de souris C57BL/6J avec une fenêtre d’imagerie pancréatique contenant une grille 14 jours après la chirurgie de la fenêtre. (C) Une image représentative d’une souris C57BL/6J c-fms-EGFP âgée de 12 semaines avec une fenêtre d’imagerie de la glande mammaire contenant une grille >7 jours après la chirurgie de la fenêtre. (D) Fenêtre d’imagerie hépatique chez une souris c-fms-EGFP mâle de 7 semaines photographiée (rangée du haut) et imagée (rangée du bas) le jour 0 (immédiatement après la chirurgie) et 35 jours après la chirurgie. Enlever la quantité appropriée de peau et sceller la plaie avec de la colle empêche la peau de se réépithéliser et de pousser la fenêtre vers le haut et vers l’extérieur, ce qui permet à l’organe d’être imagé à long terme. Barres d’échelle = 30 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7 : Les grilles dans les fenêtres permettent de suivre le même champ de vision. (A) Spécifications détaillées pour la production sur mesure de fenêtres en acier inoxydable découpées au laser. (B) Une grille encastrée dans la fenêtre d’imagerie peut être vue au-dessus du foie, avec le bord de colle autour de la fenêtre clairement visible. (C) Vue de la fenêtre à travers les oculaires du microscope à deux photons. Les vaisseaux sanguins (rouges) et le signal vert du foie peuvent être vus en arrière-plan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 8 : Réponse systémique et locale à l’insertion de fenêtres. (A–C) Le poids a été surveillé pour les souris femelles C57BL/6J âgées de 7 semaines pendant une période de 28 jours suivant l’insertion d’une fenêtre dans le foie (Un), le pancréas (B) ou la glande mammaire (C). Le pourcentage de changement de poids corporel par rapport aux souris non traitées appariées selon l’âge est montré. (*) indique une souris qui n’a pas retrouvé un poids corporel normal et qui aurait donc été censurée à partir d’une expérience d’imagerie. Les mêmes souris témoins sont affichées dans les trois panneaux pour faciliter la comparaison avec chaque type de fenêtre. (D) Nombre de globules blancs (WBC) surveillé aux jours 3, 14 et 28 (fenêtre de la glande mammaire) ou 35 (fenêtre du foie ou du pancréas) après la chirurgie. La plage normale pour le nombre de WBC dans la souris est indiquée par des lignes pointillées. (E,G,Je) Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de coupes tissulaires provenant de témoins non traités (à gauche) et d’une souris C57BL/6J âgée de 7 semaines 14 jours après l’insertion d’une fenêtre d’imagerie (à droite) au-dessus du (E), foie (G), le pancréas, ou (Je) glande mammaire. (E,Je) Des lésions de granulation superficielles et focales sont visibles à des endroits discrets le long de la surface (flèche) du foie et de la glande mammaire, suggérant une réaction à la colle. Le tissu normal indiqué par * est visible dans les régions adjacentes aux lésions de granulation. Trois témoins et trois souris avec des fenêtres hépatiques ont été évalués à chaque point temporel (jours 3, 14 et 35 après la chirurgie), sauf que 6 souris avec des fenêtres hépatiques ont été évaluées au jour 35 après la chirurgie. Deux souris sur 3 présentaient du tissu de granulation aux jours 3 et 14. 1 souris sur 3 présentait un tissu de granulation au jour 35.  Trois témoins et trois souris présentant des fenêtres de glande mammaire ont été évalués à chaque point temporel (jours 3, 14 et 28 suivant la chirurgie). Trois souris sur 3 avaient du tissu de granulation ou des réactions inflammatoires dans le tissu adipeux de la glande mammaire aux jours 3 et 14. Aucune souris sur 3 n’a présenté de lésions de granulation ou de réactions inflammatoires au jour 28. (G) Aucune lésion significative n’est visible dans le pancréas. Trois témoins et trois souris avec des fenêtres pancréatiques ont été évalués à chaque point temporel (jours 3, 14 et 35 après la chirurgie). Les souris avec des fenêtres pancréatiques n’avaient pas de tissu de granulation à aucun moment. Barre d’échelle = 500 μm (F,H,J) Une coloration immunohistochimique multiplexe a été effectuée sur des coupes de tissus provenant de témoins non traités et de souris C57BL/6J âgées de 7 semaines 14 jours après l’insertion d’une fenêtre d’imagerie au-dessus du (F), foie (H) pancréas ou (J) glande mammaire. Des anticorps dirigés contre CD45, CD68 et la myéloperoxydase (MPO) ont été utilisés pour marquer respectivement les leucocytes, les monocytes/macrophages et les neutrophiles. La coloration CD45 et CD68 a été effectuée sur la même section tandis que la coloration MPO a été effectuée sur une section série du même tissu. L’anticorps anti-CD45 a été détecté avec un anticorps secondaire conjugué HRP et imagé en premier, puis le chromogène et l’anticorps secondaire ont été dépouillés et les lames ont été incubées avec un anticorps secondaire reconnaissant l’anti-CD68. La quantification a été effectuée avec le logiciel Fidji par seuil de couleur; les paramètres ont été ajustés sur les anticorps et les tissus. Les graphiques montrent la quantification sous forme de nombre de cellules par champ de vision (FOV) (moyenne ± SEM; n = 3 / groupe; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey; seules des différences significatives sont indiquées). (K) Mâle C57BL/6J c-fms-EGFP les souris âgées de 8 à 11 semaines avaient une fenêtre d’imagerie en silicone insérée sur le lobe droit du foie. La lectine marquée par fluorescence (100 μL) a été injectée par voie intraveineuse immédiatement avant chaque séance d’imagerie. Les images proviennent d’une seule souris, au même locus de grille les jours 1, 3 et 5 suivant la chirurgie, à environ 200 μm sous la grille. Barre d’échelle = 30 μm. Imaged en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 960 nm, puissance laser 10%. Les vaisseaux sanguins apparaissent en rouge. Les macrophages apparaissent en vert (flèches blanches). Représentant de trois souris imagées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9: Les tumeurs peuvent être visualisées à plusieurs moments sur des semaines après l’insertion de la fenêtre. Images représentatives d’une souris C57BL/6J mâle de 7 semaines injectée orthotopiquement avec 1,5 x 10⁴ cellules cancéreuses du pancréas iGFP-1199 au moment de l’insertion de la fenêtre pancréatique, et imagées les jours 11 et 14 après l’insertion de la fenêtre. Barres d’échelle = 30 μm. Imaged en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 960 nm, puissance laser 10%. Représentant de 6 souris imagées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Changements dynamiques dans l’infiltration des cellules immunitaires pendant l’involution normale des glandes mammaires. En utilisant la grille métallique intégrée dans la fenêtre d’imagerie, le même emplacement peut être imagé lors du remodelage normal des tissus, par exemple lors de l’involution des glandes mammaires. Pour évaluer davantage la fonctionnalité des fenêtres en silicone dans la surveillance des changements dynamiques tels que l’infiltration de cellules immunitaires, une femelle de 12 semaines C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; La souris LysM-eGFP avec une fenêtre d’imagerie insérée sur la glande mammaire abdominale a été imagée les jours 2 et 4 après l’involution de la glande mammaire. Les neutrophiles apparaissent en vert (flèches blanches). L’activité de l’élastase neutrophile a été visualisée en injectant une sonde fluorescente Neutrophile Elastase 4 heures avant le début de l’imagerie, et apparaît en rouge (ou jaune lorsqu’elle est colocalisée avec des neutrophiles). Les cellules épithéliales apparaissent en bleu. Les instantanés sont une projection d’intensité maximale de cinq images le long de l’axe Z (100 à 150 mm de profondeur). Les images proviennent des films 3A et 3B, et sur les images de la rangée inférieure, seul le signal CFP est affiché et les images sont marquées d’une ligne pointillée rouge pour visualiser les mêmes emplacements dans les tissus aux deux points temporels différents. Barres d’échelle = 30 μm. Image à l’aide de longueurs d’onde d’excitation de 960 nm et 1080 nm, puissance laser à 10% et 15% respectivement. Représentant de quatre souris imagées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : La formation de métastases cancéreuses peut être suivie au fil du temps. Une souris mâle C57BL/6J âgée de 10 semaines s’est vu injecter 1 x 10⁵ cellules cancéreuses du pancréas KPC-BL/6-1199 exprimant la protéine fluorescente cyan conjuguée H2B (H2B-CFP) localisée par l’intermédiaire de la veine porte au moment de l’insertion de la fenêtre. L’imagerie hépatique a été réalisée par une fenêtre latérale 24 h (jour 1) après l’injection et à trois moments ultérieurs (jusqu’à 9 jours), comme indiqué. Une seule cellule cancéreuse visible aux jours 1 et 3 après l’injection est indiquée par des flèches blanches. Le deuxième signal harmonique des fibres de collagène a également été visualisé dans le canal cyan (flèches jaunes). Les images proviennent de la même souris à chaque point temporel différent. Images à plan Z unique prises entre 300 μm et 350 μm de profondeur. Barres d’échelle = 30 μm. Imaged en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 880 nm. Puissance laser à 8%. Représentant de trois souris imagées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Film 1: Les fenêtres en silicone imagineg sont bien tolérées chez la souris. Le film montre une souris C57BL/6J de 9 semaines mâle 14 jours après l’insertion de la fenêtre. La souris ne présente aucun des comportements standard associés à la douleur (par exemple, mauvais toilettage, yeux fermés ou léthargie). Représentatif de six souris enregistrées, et cohérent avec plus de 100 souris observées après une implantation réussie de la fenêtre. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Film 2: Imagerie subcellulaire de cellules cancéreuses du pancréas implantées orthotopiquement. Les cellules iGFP-1199 ont été injectées orthotopiquement dans le pancréas d’une souris C57BL/6J mâle âgée de 7 semaines et photographiées le jour 11 après l’injection de cellules cancéreuses et l’insertion de fenêtres. Le film est une projection d’intensité maximale de six images le long de l’axe Z et extraite d’une période d’imagerie de 2 heures. Horodatage (h:min:s:ms). Représentant de six souris imagées. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Film 3: Changements dans l’infiltration des cellules immunitaires dans ACTB-ECFP; Souris LysM-eGFP pendant l’involution. Femelle C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; Les souris LysM-eGFP exprimant la GFP dans les cellules myéloïdes (principalement dans les granulocytes mais aussi dans les macrophages), et l’ECFP dans toutes les cellules (mais la plus élevée dans les cellules épithéliales) ont été élevées à l’âge de 8 semaines. Après la parturition, les petits ont été normalisés à six petits par souris. Le jour 10 après la parturition, les petits ont été sevrés et des fenêtres d’imagerie de la glande mammaire abdominale ont été insérées. Les cellules myéloïdes apparaissent en vert; l’activité de l’élastase neutrophile, marquée à l’aide de la sonde Neutrophile Elastase 680 FAST injectée 4 h avant le début de l’imagerie, apparaît en rouge (apparaîtra jaune lorsqu’elle est colocalisée avec des neutrophiles); et les cellules épithéliales apparaissent en bleu. Les films sont une projection d’intensité maximale de cinq images le long de l’axe Z (100-150 μm de profondeur). (A) Imagerie au jour 2 de l’involution de la glande mammaire. Barre d’échelle = 20 μm. Image à l’aide de longueurs d’onde d’excitation de 960 nm et 1080 nm, puissance laser à 10% et 15% respectivement. (B) Imagerie au jour 4 de l’involution de la glande mammaire. Barre d’échelle = 20 μm. Le film provient de la même région de souris et de tissus que le film 3A. (C) Grossissement plus élevé d’une région d’intérêt du film 3B, montrant deux neutrophiles interagissant l’un avec l’autre et les cellules épithéliales de la glande mammaire. La formation de protubérances membranaires transitoires peut être observée au bord d’attaque lors de la migration des neutrophiles. Horodatage (h:min:s:ms). Représentant de quatre souris imagées. Veuillez cliquer ici pour télécharger le film 3A. Veuillez cliquer ici pour télécharger le film 3B. Veuillez cliquer ici pour télécharger Movie 3C.     

Film 4: Changements dans l’infiltration des cellules immunitaires chez les souris c-fms-EGFP pendant l’involution. Des souris femelles C57BL/6J c-fms-EGFP, avec des macrophages marqués GFP, ont été élevées à l’âge de 8 semaines. Après la parturition, les portées ont été ajustées à six petits par souris. Le jour 10 après la parturition, les petits ont été sevrés et des fenêtres d’imagerie de la glande mammaire abdominale ont été insérées. Le film, acquis le jour 1 de l’involution (un jour après l’insertion de la fenêtre), met en évidence l’infiltrat proéminent des macrophages pendant l’involution. Les macrophages apparaissent en vert, les fibres de collagène (deuxième génération harmonique) apparaissent en bleu et les vaisseaux sanguins apparaissent en rouge (Lectin-DyLight 594). Barre d’échelle = 20 μm. Les images sont des projections d’intensité maximale de cinq images le long de l’axe Z (100-150 um de profondeur). Imaged en utilisant des longueurs d’onde d’excitation de 960 nm et 800 nm, puissance laser à 10% et 15% respectivement. Horodatage (h:min:s:ms). Représentant de trois souris imagées. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Les fenêtres d’imagerie intravitale sont des outils importants pour visualiser directement les processus physiologiques et pathologiques à la résolution cellulaire au fur et à mesure qu’ils se déroulent au fil du temps. La nouvelle procédure décrite pour la coulée et l’insertion de fenêtres d’imagerie flexibles en silicone chez la souris surmonte certains des problèmes les plus courants avec les fenêtres d’imagerie actuellement utilisées (exsudat, rupture et interférence avec la mobilité normale), offre une sécurité supplémentaire à la souris et augmente l’accessibilité de cette technique.

Les fenêtres d’imagerie les plus utilisées comprennent un cadre métallique tenant un couvercle en verre. Un obstacle majeur à l’utilisation de ces fenêtres prototypiques est que la sécurisation de l’anneau métallique implique des procédures de couture laborieuses, nécessitant un personnel ayant une formation chirurgicale avancée. De plus, la fabrication des cadres est coûteuse et nécessite un équipement spécialisé. Les fenêtres PDMS surmontent ces deux problèmes. La procédure d’insertion des fenêtres PDMS élimine les coutures, réduisant considérablement la barrière à l’apprentissage de la technique. Les matériaux pour produire les fenêtres sont également peu coûteux et peuvent être facilement achetés. En outre, la forme de la fenêtre et l’intervention chirurgicale peuvent être adaptées pour l’imagerie de différents organes, y compris la glande mammaire, le foie, le pancréas, la rate et l’intestin.

Alors que les fenêtres d’imagerie intravitale actuelles permettent généralement l’imagerie longitudinale pendant quelques jours, plusieurs problèmes courants limitent l’utilisation de ces fenêtres pendant de longues périodes. Le poids et la taille des fenêtres en verre peuvent interférer avec le libre mouvement des souris et l’exsudat peut s’accumuler contre la fenêtre. Les souris peuvent également endommager le couvercle en verre, entraînant des plaies et des infections. En revanche, la procédure décrite ici maintient le même niveau d’accessibilité au tissu tout en minimisant la détresse pour les animaux. Le PDMS est un polymère synthétique biostable et sûr largement utilisé pour des applications biomédicales chez l’homme, telles que les dispositifs d’administration de médicaments, la chirurgie de reconstruction faciale et les implants mammaires. Au-delà de l’augmentation de la tolérance des animaux à la fenêtre, l’utilisation d’un matériau biologiquement inerte, par opposition au verre, est particulièrement importante pour les études impliquant le système immunitaire, où l’inflammation locale serait un effet de confusion. De plus, une amélioration majeure est l’élimination des points de suture, car les souris mordent et tirent sur eux, ce qui peut provoquer la chute des fenêtres d’imagerie en verre à cadre métallique. Ce problème a été partiellement résolu par une nouvelle génération de fenêtres conçues pour que les points de suture soient dissimulés dans une rainure⁹. Cependant, cette dernière stratégie nécessite une suture des cordons de la bourse, qui est une procédure compliquée et sujette aux erreurs qui provoque souvent des points de suture trop serrés, entraînant une nécrose des tissus et des douleurs. Par conséquent, la possibilité de coller la fenêtre en place constitue un avantage majeur de l’approche de la fenêtre en silicone. De plus, la fenêtre est faite d’un matériau flexible et durable avec un poids négligeable, ce qui diminue son impact sur le mouvement de l’animal, comme précédemment évalué dans une comparaison de fenêtres qui utilisaient du silicone au lieu du métal pour maintenir un couvercle en verre¹⁷. En éliminant complètement le couvercle en verre, la fenêtre en silicone élimine les problèmes avec les cadres métalliques et le verre. De plus, la flexibilité de la fenêtre permet de l’insérer facilement et diminue la force de contrainte causée par le collage d’une surface rigide sur les organes, diminuant ainsi le risque de dommages permanents aux tissus observés. De plus, comme la fenêtre est beaucoup plus facile à insérer et à maintenir en place, la procédure globale prend moins de temps, ce qui limite les effets secondaires possibles dus à une anesthésie prolongée. Pour l’insertion sur le foie, la différence de temps de procédure est particulièrement importante, de 45 min pour les fenêtres à cadre métallique à 15 min pour les fenêtres en silicone. En fait, alors que l’insertion du cadre métallique sur le foie nécessite une dissection du processus xiphoïde (le cartilage à l’extrémité du sternum), qui est également potentiellement douloureux et provoque une inflammation soutenue, cette dissection est inutile pour insérer la fenêtre en silicone. Enfin, la fenêtre d’imagerie présentée dans ce travail offre des avantages supplémentaires en ce qui concerne les applications possibles. Par exemple, contrairement aux fenêtres en verre, les fenêtres en silicone offrent un accès facile aux tissus, de sorte que les cellules cancéreuses, les colorants fluorescents ou les médicaments peuvent être injectés directement par la fenêtre.

Une autre fenêtre d’imagerie en silicone à base de PDMS adaptée à l’insertion à divers endroits anatomiques, y compris la glande mammaire, a récemment été décrite¹⁸. Cette fenêtre est moulée pour générer une forme et un bord spécialisé qui permet une implantation rapide de la fenêtre sans avoir besoin de coutures ou de colle. En revanche, la fenêtre en silicone présentée ici ne nécessite aucun moule spécial et, surtout, peut être découpée en forme pendant l’intervention chirurgicale pour s’adapter à l’emplacement anatomique et à la souris individuelle. Bien que le protocole décrit ici nécessite l’utilisation de colle, cette exigence supplémentaire permet l’imagerie des organes abdominaux, y compris le foie et la rate. De plus, la fenêtre en silicone décrite ici permet d’intégrer une grille en acier inoxydable dans la fenêtre, ce qui fournit des repères de référence. Ces repères permettent de tracer le même emplacement exact au fil du temps et facilitent l’imagerie répétée du même site sur plusieurs séances (imagerie longitudinale) pour étudier des processus qui prennent des jours à des semaines tels que le développement de lésions métastatiques.

En résumé, une fenêtre d’imagerie en silicone a été développée pour une utilisation dans la MIV longitudinale de la glande mammaire ou des organes abdominaux. La fenêtre est optiquement claire, très durable et peu coûteuse. La simplicité de la procédure d’insertion de fenêtre réduit les compétences techniques requises pour mettre en œuvre des approches d’imagerie intravitale basées sur des fenêtres. L’adaptabilité de la fenêtre à divers sites tissulaires permet la mise en œuvre de la MIV dans une vaste gamme d’études biologiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453