Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Summary

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Abstract

Die intravitale Mikroskopie (IVM) ermöglicht die Visualisierung von Zellbewegung, -teilung und -tod bei Einzelzellauflösung. IVM durch chirurgisch eingesetzte Bildgebungsfenster ist besonders leistungsfähig, da es die Längsmessung desselben Gewebes über Tage bis Wochen ermöglicht. Typische Bildfenster bestehen aus einem Glasdeckglas in einem biokompatiblen Metallrahmen, der an der Haut der Maus vernäht ist. Diese Fenster können die freie Bewegung der Mäuse beeinträchtigen, eine starke Entzündungsreaktion hervorrufen und aufgrund von Glasscherben oder zerrissenen Nähten versagen, von denen jede Euthanasie erfordern kann. Um diese Probleme anzugehen, wurden Fenster für die langfristige Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen aus einem dünnen Film aus Polydimethylsiloxan (PDMS) entwickelt, einem optisch klaren Silikonpolymer, das zuvor für kraniale Bildgebungsfenster verwendet wurde. Diese Fenster können direkt auf das Gewebe geklebt werden, wodurch die Zeit für das Einführen reduziert wird. PDMS ist flexibel und trägt im Laufe der Zeit zu seiner Haltbarkeit bei Mäusen bei – es wurden bis zu 35 Tage getestet. Längsschnittbildgebung ist die Bildgebung derselben Geweberegion während separater Sitzungen. Ein Edelstahlgitter wurde in die Fenster eingebettet, um die gleiche Region zu lokalisieren, was die Visualisierung dynamischer Prozesse (wie die Involution der Brustdrüse) an den gleichen Stellen im Abstand von Tagen ermöglicht. Dieses Silikonfenster ermöglichte auch die Überwachung einzelner disseminierter Krebszellen, die sich im Laufe der Zeit zu Mikrometastasen entwickelten. Die in dieser Studie verwendeten Silikonfenster sind einfacher einzusetzen als metallgerahmte Glasfenster und verursachen eine begrenzte Entzündung des abgebildeten Gewebes. Darüber hinaus ermöglichen eingebettete Gitter eine einfache Verfolgung derselben Geweberegion in wiederholten Bildgebungssitzungen.

Introduction

Die intravitale Mikroskopie (IVM), die Bildgebung von Geweben bei betäubten Tieren, bietet Einblicke in die Dynamik physiologischer und pathologischer Ereignisse bei zellulärer Auflösung in intaktem Gewebe. Die Anwendungen dieser Technik sind sehr unterschiedlich, aber IVM war im Bereich der Krebsbiologie von entscheidender Bedeutung, um aufzuklären, wie Krebszellen in Gewebe eindringen und metastasieren, mit der umgebenden Mikroumgebung interagieren und auf Medikamente reagieren ^1,2,3. Darüber hinaus war IVM der Schlüssel zum besseren Verständnis der komplexen Mechanismen, die Immunantworten steuern, indem es Erkenntnisse lieferte, die Ex-vivo-Profiling-Ansätze (z. B. Durchflusszytometrie) ergänzten. Zum Beispiel haben intravitale Bildgebungsexperimente Details über Immunfunktionen in Bezug auf Zellmigration und Zell-Zell-Kontakt enthüllt und eine Plattform zur Quantifizierung der raumzeitlichen Dynamik als Reaktion auf Verletzungen oder Infektionen^geboten 4,5,6,7. Viele dieser Prozesse können auch durch histologische Färbung untersucht werden, aber nur IVM ermöglicht die Verfolgung dynamischer Veränderungen. Während ein histologischer Abschnitt eine Momentaufnahme des Gewebes zu einem bestimmten Zeitpunkt bietet, kann die intravitale Bildgebung interzelluläre und subzelluläre Ereignisse innerhalb desselben Gewebes im Laufe der Zeit verfolgen. Insbesondere Fortschritte bei der Fluoreszenzmarkierung und die Entwicklung molekularer Reporter haben es ermöglicht, molekulare Ereignisse mit zellulärem Verhalten wie Proliferation, Tod, Motilität und Interaktion mit anderen Zellen oder der extrazellulären Matrix zu korrelieren. Die meisten IVM-Techniken basieren auf der Fluoreszenzmikroskopie, die aufgrund der Lichtstreuung die Abbildung tieferer Gewebe schwierig macht. Das interessierende Gewebe muss daher oft mit einem oft invasiven und terminalen Verfahren operativ exponiert werden. So kann das Gewebe je nach Organstelle kontinuierlich für einen Zeitraum von wenigen bis 40 h⁸ abgebildet werden. Alternativ ermöglicht das chirurgische Einsetzen eines permanenten Bildgebungsfensters die sequentielle Abbildung desselben Gewebes über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen ^7,9.

Die Entwicklung neuer Bildgebungsfenster wurde als technologischer Bedarf zur weiteren Verbesserung intravitaler Bildgebungsansätze^{hervorgehoben 10}. Das prototypische intravitale Bildgebungsfenster ist ein Metallring, der einen Glasdeckel enthält, der mit Nähten¹¹ auf der Haut befestigt ist. Störungen der Bewegungsfreiheit, die Ansammlung von Exsudat und Schäden am Glasdeckglas sind häufige Probleme bei der Verwendung solcher Fenster. Darüber hinaus erfordert das prototypische Fenster eine spezielle Produktion, und der chirurgische Eingriff kann eine umfangreiche Schulung erfordern. Um diese Probleme anzugehen, wurde Polydimethylsiloxan (PDMS), ein Silikonpolymer, das zuvor in Schädelfenstern für die Langzeitbildgebung im Gehirn verwendet wurde¹², für den Einsatz in der Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen angepasst. Hier wird eine detaillierte Methode zur Erzeugung von PDMS-basierten Silikonfenstern vorgestellt, einschließlich der Frage, wie das Fenster um ein Edelstahlgitter gegossen wird, um Landmarken für die wiederholte Abbildung derselben Geweberegionen bereitzustellen. Weiterhin wird ein einfacher, stichfreier Operationsablauf zum Einführen des Fensters über Bauchorgane oder die Brustdrüse beschrieben. Dieser neue Ansatz überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern und erhöht die Zugänglichkeit der intravitalen Längsbildgebung.

Protocol

Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den chirurgischen Richtlinien des Cold Spring Harbor Laboratory durchgeführt und waren vom Institutional Animal Care and Use Committee des Cold Spring Harbor Laboratory genehmigt worden.

1. Gießen des Silikonfensters

1. Bereiten Sie das Silikonpolymer (PDMS) vor, indem Sie das Basiselastomer und den Härter im Verhältnis 10:1 (v/v) mischen.
2. Gießen Sie ein Fenster, indem Sie eine kleine Menge PDMS auf eine sterile, glatte Oberfläche abscheiden und das Verhältnis von Volumen zu Fläche auf die gewünschte Dicke einstellen.
   HINWEIS: Die Verwendung von 200 mg Polymerlösung für einen Kreis mit einem Durchmesser von 22 mm auf dem Deckel eines 24-Well-Plate-Deckels führt zu einem guten Kompromiss zwischen Fensterrobustheit und optischer Klarheit.
3. Optional: Um Landmarken für die wiederholte Bildgebung derselben Geweberegionen bereitzustellen, drücken Sie leicht ein Edelstahlgitter in das Silikon, nachdem sich das PDMS auf der gewünschten Gießoberfläche befindet.
4. Um Luftblasen zu entfernen, legen Sie die beschichtete Oberfläche für 45 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator, um das Polymer zu entgasen.
5. Die Silikonfenster in einem Ofen bei 80 °C für 45 min aushärten.
6. Ritzen Sie das Polymer an den Rändern der Form und ziehen Sie die ausgehärteten Fenster vorsichtig von der Oberfläche ab, die für das Gießen mit Pinzetten verwendet wird.
7. Sterilisieren Sie vor der Operation die Fenster durch Autoklavieren.

2. Vorbereitung der Maus für das Einsetzen des Silikonfensters

1. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 4% (v/v) Isofluran. Bewegen Sie die Maus zu einem Wärmekissen auf dem Operationstisch, legen Sie die Maus in die Anästhesie-Nasenmaske und senken Sie die Isofluran-Konzentration auf 2% für die Aufrechterhaltung während der gesamten Operation.
2. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen der Hinterbeine kneifen. Fahren Sie nicht fort, bis die Maus inaktiv ist und keine Zehenklemmreflexreaktion zeigt.
3. Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen auf, um zu verhindern, dass sie austrocknen und ein Trauma verhindern.
4. Präventive Analgesie (Buprenorphin 0,05 mg/kg) subkutan verabreichen.
5. Rasieren Sie die Operationsstelle und entfernen Sie die Haare vollständig mit einer Haarentfernungscreme.
6. Tragen Sie Povidon-Jod-Lösung (10% v/v) und Ethanol (70% v/v) 3x nacheinander auf, um eine Infektion an der Operationsstelle zu verhindern.

3. Einführen eines ventralen Fensters für die Bildgebung in der Leber; anpassbar für andere Bauchorgane (Abbildung 1)

1. Stellen Sie die Maus in Rückenlage.
2. Machen Sie einen 10-mm-Einschnitt, der 3 mm nach unten mit sterilen Scheren und Pinzetten beginnt.
3. Entfernen Sie einen 1–1,5 cm² großen Hautabschnitt entlang der Mittellinie.
4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
5. Optional: Um einen größeren Teil der Leber sichtbar zu machen, verwenden Sie sterile Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung angefeuchtet sind, um die Leber vom Zwerchfell nach unten zu drücken und das falciforme Band freizulegen, das die Leber mit dem Zwerchfell verbindet. Durchtrennen Sie das Band und achten Sie darauf, die untere Hohlvene nicht zu schneiden.
6. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze ab, tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Leber an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf. Dieser Klebstoff erzeugt eine kreisförmige Dichtung, die den mittleren Bereich für die Bildgebung intakt lässt.
   VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden. Es ist nicht notwendig, das Gewebe vor dem Auftragen des Klebstoffs zu trocknen.
   HINWEIS: Alle Klebstoffe auf Cyanacrylatbasis können für dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt werden. Chirurgischer Klebstoff sorgt für Sterilität. Für Klemmenverfahren liefern Allzweck-Sekundenkleber gute Ergebnisse.
7. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Leber, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
8. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
9. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
10. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
    HINWEIS: Bei korrekter Durchführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Lebergewebes durch das Fenster sichtbar sein.
11. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.
    ACHTUNG: Wenn der Eingriff mit sterilen chirurgischen Techniken durchgeführt wird und das Fenster vor dem Einsetzen sterilisiert wird, reicht das Versiegeln der Wunde mit chirurgischem Klebstoff aus, um Infektionen zu vermeiden. Das Versäumnis, die richtigen aseptischen Techniken während des chirurgischen Einführens oder eines unvollkommenen Verschlusses zu befolgen, kann jedoch zu einer offensichtlichen oder subklinischen Infektion und zum Austrocknen des Gewebes führen.

4. Einfügen eines seitlichen Fensters für die Bildgebung in der Leber; kompatibel mit der gleichzeitigen Injektion von Krebszellen in die Pfortader (Abbildung 2)

1. Platzieren Sie die Maus auf der linken seitlichen Dekubitusposition
2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt an der rechten Flanke 3 mm unterhalb des Rippenbogens mit steriler Schere und Pinzette.
3. Entfernen Sie einen 1 cm² großen Hautabschnitt.
4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
5. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze ab, tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Leber an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
   VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
   HINWEIS: Alle Klebstoffe auf Cyanacrylatbasis können für dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt werden. Chirurgischer Klebstoff sorgt für Sterilität. Für Klemmenverfahren liefern Allzweck-Sekundenkleber gute Ergebnisse.
6. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Leber, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
7. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
8. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
9. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
   HINWEIS: Bei korrekter Durchführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Lebergewebes durch das Fenster sichtbar sein.
10. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.
11. Wenn eine Pfortaderinjektion erforderlich ist:
    1. Stellen Sie die Maus in Rückenlage.
    2. Machen Sie einen 10-mm-Einschnitt, beginnend mit dem Xiphoid-Prozess in der Haut.
    3. Machen Sie mit einer zweiten sterilen Schere und Pinzette einen 10-mm-Schnitt im Peritoneum.
    4. Tauchen Sie zwei Wattestäbchen in sterile Kochsalzlösung.
    5. Verwenden Sie die Wattestäbchen, um den Darm vorsichtig auf sterile Gaze zu ziehen, die mit steriler Kochsalzlösung angefeuchtet ist, und achten Sie darauf, die Ausrichtung nicht zu verdrehen oder anderweitig zu stören.
    6. Verschieben Sie den Darm aus der Bauchhöhle, bis die Pfortader auf der rechten Seite des Abdomens sichtbar ist.
    7. Führen Sie eine 31–33 G Nadel 5–7 mm Caudal zum Eintrittspunkt der Pfortader in die Leber ein und achten Sie darauf, innerhalb des Blutgefäßes und nicht durch es hindurch zu gehen.
    8. Injizieren Sie langsam die Krebszellen (resuspendiert in 100 μL sterilem PBS).
       HINWEIS: Für dieses Experiment kann die Amurinzelllinie für Bauchspeicheldrüsenkrebs (z. B. KPC-BL / 6-1199) in vollständigen DMEM-Medien kultiviert und 1 x 10⁵ Zellen in 100 μL steriles PBS injiziert werden.
    9. Um Blutungen zu vermeiden, üben Sie unmittelbar nach dem Zurückziehen der Nadel mit einem kleinen Stück chirurgischem Schwamm für 1–2 min sanften Druck auf die Injektionsstelle aus.
    10. Nachdem der Druck nachgelassen hat, überwachen Sie die Stelle für 1-2 Minuten, um die Hämostase sicherzustellen.
    11. Mit angefeuchteten Wattestäbchen den Darm nach der physiologischen Orientierung des Organs in die Bauchhöhle zurückbringen.
    12. Verwenden Sie eine sterile Pinzette und setzen Sie das Fenster unmittelbar unter dem Peritoneum auf der linken Seite der Bauchhöhle der Maus ein.
    13. Nähen Sie mit 4-0 Seidennähten und heften Sie den Mittellinienschnitt mit 7 mm gewickelten Edelstahlclips.
    14. Bewegen Sie die Maus in die linke seitliche Dekubitusposition
    15. Machen Sie einen 10 mm Einschnitt an der rechten Flanke 3 mm unter dem Rippenbogen durch die Haut mit steriler Schere und Pinzette.
    16. Entfernen Sie einen 1 cm² großen Hautabschnitt um den Schnitt herum.
    17. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
    18. Ziehen Sie das Fenster über die Leber, bevor Sie es an Ort und Stelle kleben, wie unter den Schritten 4.8 bis 4.10 beschrieben.

5. Einfügen des Fensters für die Bildgebung in der Bauchspeicheldrüse (Abbildung 3)

1. Platzieren Sie die Maus auf der rechten seitlichen Dekubitusposition.
2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt an der linken Flanke 3 mm unterhalb des Rippenbogens mit steriler Schere und Pinzette.
3. Entfernen Sie einen 1 cm² großen Hautabschnitt um den Schnitt herum.
4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
5. Ziehen Sie mit sterilen Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung getränkt sind, vorsichtig an der Milz, um die Bauchspeicheldrüse zu visualisieren. Positionieren Sie die Bauchspeicheldrüse mit den angefeuchteten Wattestäbchen neu, um durch den Schnitt mehr Oberfläche sichtbar zu machen.
   HINWEIS: An diesem Punkt können Bauchspeicheldrüsenkrebszellen orthotop in die Bauchspeicheldrüse injiziert werden, wenn dies Teil des experimentellen Designs ist.
6. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze zurück und tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Bauchspeicheldrüse an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
   VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
7. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Bauchspeicheldrüse, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
8. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
9. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
10. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
    HINWEIS: Bei korrekter Ausführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Bauchspeicheldrüsengewebes durch das Fenster sichtbar sein.
11. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.

6. Einfügen des Fensters für die Bildgebung in die Brustdrüse (Abbildung 4)

1. Legen Sie die Maus auf die Rückenlage.
2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt medial zu einem der Leistenbrustwarzen mit steriler Schere und Pinzette.
3. Entfernen Sie einen 0,5 cm² großen Hautabschnitt oberhalb der Brustdrüse.
4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere, um die Brustdrüse vorsichtig von der Haut zu trennen, indem Sie die Schere zwischen den beiden Oberflächen verteilen, um die Haftung zu stören.
   HINWEIS: Um die Bildgebung des Leisten-Brustdrüsenbereichs zu erleichtern, achten Sie darauf, einen Teil der Haut oberhalb der Brustdrüse, aber oberhalb des Hinterbeins zu sezieren, damit das Fenster die Beweglichkeit der Maus nicht einschränkt.
5. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze zurück und tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Brustdrüse an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
   VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
6. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Brustdrüse, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
   HINWEIS: Ein kreisförmiger Bereich des Brustdrüsengewebes sollte jetzt durch das Fenster sichtbar sein, wenn er korrekt ausgeführt wird.
7. Falten Sie die Ränder des Fensters unter die Haut.
8. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter der Haut befinden. Drücken Sie mit einer Pinzette auf die Haut, um die Haut am Fenster zu befestigen.
9. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.

7. Nachchirurgische Genesung

1. Legen Sie die Maus in einen sauberen Erholungskäfig mit reichlich Nistmaterial und stellen Sie sicher, dass ein Teil des Käfigs auf einem Heizkissen ruht.
2. Überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis sie bewusst und mobil ist.
3. Falls erforderlich, geben Sie eine zusätzliche Dosis Analgetikum 12 h nach der präventiven Dosis.
   HINWEIS: Zusätzliche Analgesie ist im Allgemeinen unnötig, aber konsultieren Sie einen Tierarzt, wenn die Maus Anzeichen von Stress zeigt (wie gebeugter Rücken, ungepflegtes Fell oder verlorenes Interesse an Nahrung). Überwachen Sie die Maus täglich für die ersten 3 Tage nach der Operation auf Anzeichen einer Infektion oder andere Nebenwirkungen. Weniger als 2% der Mäuse benötigen tierärztliche Hilfe oder Euthanasie, typischerweise aufgrund einer teilweisen Ablösung des Fensters. Es ist wichtig zu beachten, dass bei männlichen Mäusen mit ventralen Leberbildgebungsfenstern der Kampf zwischen Mäusen zu einer Ablösung der Fenster führen kann. Dies wird vermieden, indem die Mäuse separat untergebracht werden.

8. Bildgebung durch das Fenster

1. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 4% (v/v) Isofluran.
2. Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen auf, um zu verhindern, dass sie austrocknen und ein Trauma verhindern.
3. Bewegen Sie die Maus von der Induktionskammer in die Mikroskopstufe. Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Nasenmaske und senken Sie die Isofluran-Konzentration auf etwa 1-1,5% für die Erhaltungsanästhesie während des gesamten bildgebenden Verfahrens.
4. Platzieren Sie einen Druckkissensensor unter der Maus, um die Atemfrequenz zu überwachen, und fixieren Sie die Maus mit weichem chirurgischem Klebeband auf der Bühne.
5. Setzen Sie ein Rektalthermometer ein, um die Körpertemperatur während der gesamten Bildgebungssitzung zu überwachen.
6. Schalten Sie das beheizte Pad ein und überwachen Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Körpertemperatur 37 ° C nicht überschreitet.
7. Verwenden Sie Software, um die Atemfrequenz der Maus zu überwachen. Die optimale Rate beträgt ~ 1 Atem / Sekunde. Stellen Sie die Anästhesie nach Bedarf ein.
8. Reinigen Sie vor jeder Bildgebungssitzung das Fenster von Restlinsentauchmedium und Ablagerungen, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol (v / v) getaucht ist.
9. Wenn Sie eine Wassertauchlinse verwenden, tragen Sie Ultraschallgel auf das Fenster auf und vermeiden Sie Blasen.
   HINWEIS: Destilliertes Wasser kann ebenfalls verwendet werden, erfordert jedoch möglicherweise eine erneute Anwendung während der Bildgebung.
10. Um die optimale Tiefe für die Bildgebung zu finden, lokalisieren Sie zuerst das Raster und platzieren Sie es im Fokus.
11. Bestimmen Sie die ungefähre Gewebebildgebungstiefe, indem Sie den unteren Rand des Gitters auf 0 setzen. Diese Informationen sind notwendig, um die entsprechende z-Ebene in nachfolgenden Bildgebungssitzungen zu lokalisieren.
12. Um dieselbe Position über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg zu identifizieren, verwenden Sie die Quadrate auf dem Raster als Referenzpunkt. Notieren Sie sich während der Bildgebung die Ausrichtung des Rasters und die Position innerhalb des Rasters jedes abgebildeten Sichtfelds (z. B. 2. Reihe von oben, ^{4. Quadrat} von links).
13. Verwenden Sie während aufeinanderfolgender Bildgebungssitzungen das Raster, um zu bestimmten Rasterbereichen - und damit zu Bildfeldern - zu navigieren.
14. Entfernen Sie nach jeder Bildgebungssitzung alle verbleibenden Linsentauchmedien und Ablagerungen, indem Sie das Fenster vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol (v / v) getaucht ist.

Representative Results

Die intravitale Bildgebung durch Bildgebungsfenster kann verwendet werden, um eine breite Palette von zellulären und molekularen Ereignissen mit Einzelzellauflösung über einen Zeitraum von Stunden bis Wochen zu beobachten, zu verfolgen und zu quantifizieren. Zu den idealen Merkmalen für ein Bildgebungsfenster gehören: a) begrenzte Auswirkungen auf das Wohlbefinden der Maus und die Physiologie des Gewebes; b) Haltbarkeit; c) Einfachheit des Einfügens; und d) Freie Landmarken für wiederholte Bildgebung derselben Region. Das Ergebnis ist ein vielseitiges, inertes Silikonfenster, das leicht hergestellt und eingesetzt werden kann und mit einem Raster ausgestattet werden kann, um das gleiche Sichtfeld über die Spannweite mehrerer Bildgebungssitzungen zu lokalisieren.

Das Fenster besteht aus PDMS, einem kostengünstigen, flexiblen und klaren Material. Fenster können mit Zubehör gegossen werden, die für die meisten Labore weit verbreitet sind. Für diese Zwecke funktionieren die Rundformen (22 mm Durchmesser), die bereits auf dem Deckel von handelsüblichen 24 Wellplatten geätzt sind, gut. Durch Variieren der Menge an Polymer, die pro Flächeneinheit verwendet wird, ist es möglich, die Dicke des Fensters einzustellen. Um den Einfluss der Dicke des Fensters auf die Bildauflösung zu dokumentieren, wurde eine PSF-Analyse (Point Spread Function) von 40 nm fluoreszierenden Mikrosphären durchgeführt, um die Bildgebung durch PDMS-Fenster unterschiedlicher Dicke mit Glasdeckgläsern zu vergleichen, die typischerweise für intravitale Bildgebungsfenster verwendet werden (0,17 mm dick). Um den für die intravitale Bildgebung verwendeten Aufbau zu replizieren, wurde die PSF-Bildgebung mit demselben Zwei-Photonen-Mikroskop und derselben Wassertauchlinse mit Ultraschallgel als Tauchmedium durchgeführt.

Die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) der Signalintensität, die über die Anpassung der PSF in die seitlichen Ebenen berechnet wurde, war vergleichbar mit der von Glas für PDMS-Fenster, die mit 100 mg PDMS gegossen wurden (Abbildung 5A,B). Die laterale Auflösung im Vergleich zu Glasabdeckungen wurde für Fensterguss mit 150–250 mg PDMS reduziert (Abbildung 5A,B). In der Bildebene der z-Achse schnitten PDMS-Fenster mit 100 bis 200 mg Polymer besser ab als Glasabdeckungen (Abbildung 5C). Die optische Klarheit ging bei Fenstern mit 300 mg PDMS verloren, was die Messungen unzuverlässig machte (Abbildungen 5A–C). Das X/Y-Verhältnis der FWHM-Werte unterschied sich nicht signifikant zwischen Glas und PDMS beliebiger Dicke, obwohl das Verhältnis für Fensterguss mit 200–250 mg Polymer deutlich von 1 mit Ultraschallgel als Tauchmedium abwich (Abbildung 5D). Bei der Verwendung von Wasser als Tauchmedium für den Fensterguss mit 200 mg war die Abweichung von der Symmetrie jedoch deutlich geringer. Bei dieser Dicke sind Abweichungen aufgrund von Aberrationen im Polymer daher wahrscheinlich gering. Die Spitzenwerte der Fluoreszenzintensität wurden ebenfalls für jede Mikrosphäre gesammelt und zeigten, dass Glas und PDMS vergleichbar funktionierten, obwohl das höchste Signal durch Glas aufgezeichnet wurde (Abbildung 5I). Die optimale Dicke des PDMS-Fensters hängt von spezifischen Anwendungen und Bildgebungssystemen ab. Für die meisten Zwecke sind 200 mg Polymerlösung für ein kreisförmiges Fenster mit einem Durchmesser von 22 mm ein optimaler Kompromiss zwischen Fensterrobustheit und optischer Klarheit. Tatsächlich waren Fenster, die mit weniger als 200 mg gegossen wurden, optisch klarer, mit FWHM-Werten, die denen von Glas ähnlich waren, aber gelegentlich während der chirurgischen Implantation rissen, während mit 200 mg (bei >100 Mäusen) keine Fälle von Fensterschäden beobachtet wurden.

Um diese Unterschiede in den Materialeigenschaften zu messen, wurden PDMS-Fenster (200 mg und 150 mg) unter einem Laststeuerungsprofil von 1N/s bis zum Materialversagen in eine servohydraulische Materialprüfmaschine geladen (Abbildung 5J). Kraft- und Wegwerte wurden mit einer Frequenz von 100 Hz gemessen. Die Kraft-Weg-Daten wurden dann unter Verwendung der Gleichungen in Spannungs-Dehnung umgewandelt:

σ = F / A (1)

ɛ = δ l / l₀ (2)

Dabei ist σ Spannung (Pa), F ist Kraft (N), A ist die Querschnittsfläche des Fensters, Ɛ ist Dehnung, ΔL ist die Verschiebung und L₀ ist die Dicke des Fensters. Die Zähigkeit des Materials wurde durch Berechnung der Summenfläche unter der Spannungs-Dehnungs-Kurve bestimmt. Die Zähigkeit eines Materials bezieht sich auf seine Fähigkeit, sich vor dem Bruch plastisch zu verformen und Energie im Prozess zu absorbieren – eine Schlüsseleigenschaft für implantierte Fenster¹³. In Übereinstimmung mit Beobachtungen während bildgebender Experimente haben Fenster, die mit 200 mg PDMS gegossen wurden, eine deutlich höhere Zähigkeit als Fensterguss mit 150 mg (Abbildung 5K) und sind daher weniger anfällig für Brüche.

Als nächstes wurde der Young-Modul (E) des bevorzugten PDMS-Fenstergusses mit 200 mg bestimmt und mit dem von Standardglas-Deckgläsern verglichen, indem der lineare Bereich der Spannungs-Dehnungs-Kurve extrahiert und die Steigung unter Verwendung des Hookeschen Gesetzes bestimmt wurde:

σ = Eɛ (3)

Der Elastizitätsmodul der Glasfenster war deutlich größer als der von PDMS, was erwartet wurde, da Glas in der Materialfestigkeit viel steifer ist als PDMS (Abbildung 5L). Obwohl Glas aufgrund seines größeren Young-Moduls ein stärkeres Material ist, unterstützt die größere Zähigkeit der 200-mg-PDMS-Fenster, dass sie über einen längeren Zeitraum angewendet werden können, ohne dass das Risiko besteht, dass sie brechen und einen zweiten chirurgischen Eingriff oder eine Euthanasie erfordern.

Ein großer Vorteil der Silikonfenster ist die Vielseitigkeit. Wichtig ist, dass das Verfahren zum chirurgischen Einsetzen des Fensters leicht auf verschiedene anatomische Stellen zugeschnitten werden kann. Anpassungen an die Operation werden durch die Tatsache erleichtert, dass die Fenster leicht mit einer chirurgischen Schere verkleinert werden können und dass Fenster auf die Oberfläche des interessierenden Gewebes / Organs und auf die Haut geklebt werden, wodurch die Notwendigkeit von Nähten vollständig entfällt. Für Leber, Bauchspeicheldrüse und Brustdrüse wurde auf diese Weise eine erfolgreiche Einführung von Fenstern erreicht (Abbildungen 6A–C). Insbesondere wurden zwei verschiedene Protokolle entwickelt, um entweder ventrale oder laterale Fenster für die Leberbildgebung zu implantieren. Abbildung 1 zeigt die Schritte zum Einfügen eines ventralen Fensters. Dieses Verfahren kann für andere Bauchorgane angepasst werden und ergibt die größte abbildbare Oberfläche. Sofern jedoch kein großer (>1 cm 2) bildbarer Bereich erforderlich ist, wird das Einfügen eines seitlichen Fensters in die rechte Flanke der Maus (Abbildung 2) bevorzugt, um Bewegungsartefakte zu verringern, z. B. aufgrund von Atmung und Peristaltik. Darüber hinaus ist das chirurgische Verfahren zum Einsetzen des lateralen Bildgebungsfensters mit einer gleichzeitigen Injektion von Krebszellen in die Pfortader kompatibel, um die Entwicklung von Lebermetastasen experimentell zu modellieren. So können Mäuse ein einzelnes Verfahren anstelle von zwei separaten Verfahren durchlaufen, wenn bei demselben Tier eine Pfortveneninjektion und eine Fenstereinführung in die Bauchbildgebung erforderlich sind. Ein analoges Verfahren wird verwendet, um ein Fenster über der Bauchspeicheldrüse an der linken Flanke der Maus zu implantieren (Abbildung 3). Das Fenster kann auch über Unterhautgewebe, d.h. normale Brustdrüsen, sowie bereits etablierte spontane oder orthotopisch transplantierte Brusttumoren eingeführt werden (Abbildung 4). Alternativ können Krebszellen durch das Fenster in die Brustdrüse injiziert werden, um die Entwicklung eines Primärtumors in Längsrichtung zu verfolgen, da Nadeln den PDMS-Film durchstechen können, ohne die Integrität des Fensters zu beeinträchtigen.

Aufgrund ihres geringen Gewichts und ihrer Flexibilität beeinträchtigen Silikonfenster nicht die Beweglichkeit der Maus (Film 1). So überwinden Silikonfenster große Hindernisse, die mit Glasfenstern verbunden sind, wie Zerbrechlichkeit, komplexes Nähen und Auswirkungen auf die Mobilität von Tieren. Stattdessen ist die Haupteinschränkung, die mit Silikonfenstern verbunden ist, das Nachwachsen des Epithels unter dem Fenster. Wenn jedoch eine angemessene Menge Haut entfernt wird und die Wunde vollständig mit Klebstoff verschlossen ist, ist die Reepithelialisierung begrenzt, und die Bildgebung kann über längere Zeiträume fortgesetzt werden (bis zu 35 Tage wurden getestet, Abbildung 6D). Nach dem Einsetzen des Fensters kann die Maus etwa einen Monat lang in Längsrichtung abgebildet werden oder bis der chirurgische Klebstoff versagt oder eine Reepithelialisierung auftritt. Kurze tägliche Bildgebungssitzungen (~ 60 min) oder weniger häufige, aber längere Bildgebungssitzungen werden bevorzugt, um anästhesieinduzierte Nebenwirkungen zu vermeiden. Fenstertragende Tiere können auf jeder intravitalen Bildgebungsplattform sowohl über Einzelphotonen- als auch über Multiphotonen-konfokalmikroskopie mit Standardverfahren abgebildet werden (siehe z. B. ¹⁴). Vor und nach jeder Bildgebungssitzung ist es ratsam, das Fenster von Schmutz und Ablagerungen zu reinigen, indem Sie es mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol (v / v) getaucht ist.

Um den gleichen Ort im Laufe der Zeit zu verfolgen, können Edelstahlgitter in das Fenster eingebettet werden. Abbildung 7A zeigt die Spezifikationen für die hier verwendeten maßgefertigten, lasergeätzten Gitter. Auch handelsübliche Gitter für die Transmissionselektronenmikroskopie eignen sich für diese Anwendung. Das Raster wird während des Gießvorgangs in das Fenster eingebettet und ist sowohl mit bloßem Auge (Abbildung 7B) als auch durch das Okular des Mikroskops (Abbildung 7C) deutlich über den Bildbereich sichtbar. Da das Fenster auf die Oberfläche des Organs geklebt ist, ist die Position der Bildfelder relativ zum Gitter stabil. Notieren Sie sich während der Bildgebung die Ausrichtung des Rasters und die Position innerhalb des Rasters jedes abgebildeten Sichtfelds (z. B. 2. Reihe von oben,^{4. Quadrat} von links). Verwenden Sie als Nächstes das Raster, um während aufeinanderfolgender Bildgebungssitzungen zu bestimmten Rasterbereichen - und damit zu Bildfeldern - zu navigieren.

Das Gitter ist auch nützlich, um das Bildgebungsfeld während einer Bildgebungssitzung auszurichten, wenn das Gewebe aufgrund von z. B. Atmung oder Peristaltik langsam driftet. Die meisten Bildfenster mit einem starren Rand können während der Bildgebung an eine Halterung gebunden werden, wodurch der Bildbereich stabilisiert wird. Da die flexiblen Fenster nicht direkt stabilisiert werden können, wird chirurgisches Klebeband verwendet, um den Körperabschnitt zu stabilisieren, der das Fenster enthält, und der Bildbereich wird in definierten Abständen (typischerweise alle 30 Minuten) auf die Mitte des entsprechenden Gitterquadrats oder zuvor identifizierte Gewebemarkierungen (z. B. vaskuläre Landmarken) ausgerichtet. Eine weitere Driftkorrektur zur mikroskopischen Verschiebung des Sichtfeldes erfolgt digital in der Post-Acquisition-Phase durch Code, der die Frames basierend auf detektierten Gewebemustern neu ausrichtet (Supplemental Code 1–2).

Um zu bestätigen, dass das Fenster keine offensichtliche systemische Nebenwirkung hervorruft, wurde das Gewicht der Tiere, die einer Fensterimplantation und unbehandelten altersangepassten Kontrollen unterzogen worden waren, überwacht. Nach einem anfänglichen Gewichtsverlust im Zusammenhang mit der Operation nehmen die meisten Mäuse mit eingeführten Fenstern im Laufe der Zeit weiter an Gewicht zu, was darauf hindeutet, dass das Einsetzen des Fensters gut vertragen wird (Abbildungen 8A-C). Bei Leber- und Brustdrüsenfenstern wird das Normalgewicht innerhalb von 5 Tagen nach der Operation wiedererlangt. Die postoperative Genesung ist nach der Implantation des Fensters über der Bauchspeicheldrüse langsamer, wobei die Mäuse innerhalb von 14 Tagen zum präoperativen Gewicht zurückkehren. Diese Beobachtung stimmt mit den erwarteten Auswirkungen überein, die mit der Manipulation der Bauchspeicheldrüse zum Zeitpunkt der Operation verbunden sind. Beachten Sie, dass selbst in Fällen, in denen der Gewichtsverlust den Schwellenwert für einen humanen Endpunkt nicht erreicht, Mäuse, die kein präoperatives Körpergewicht (<5% aller Mäuse, veranschaulicht durch die Maus, die durch * in Abbildung 8B angezeigt wird) nicht wiedererlangen, typischerweise von bildgebenden Experimenten zensiert werden. Darüber hinaus wurden die Anzahl der weißen Blutkörperchen, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Einsetzen des Fensters bestimmt wurden, bei fast allen fenstertragenden Mäusen im Vergleich zu Kontrollen nicht verändert und veränderten sich im Laufe der Zeit nicht wesentlich (Abbildung 8D), was darauf hindeutet, dass das Fenster keine größere systemische Entzündung verursachte.

Als nächstes, um den Grad der lokalen Gewebereaktion auf das Fenster und den Kleber zu bewerten, wurden Mäuse nach 3, 14 und 28 (Brustdrüsenfenster) oder 35 Tagen (Leber- und Bauchspeicheldrüsenfenster) nach chirurgischem Einsetzen des Fensters für die histologische Analyse eingeschläfert. Die Auswertung von mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Leberschnitten zeigte bei den meisten Mäusen eine oberflächliche (20–80 μm), minimale bis leichte Kapselgranulationsgewebebildung unter den Fenstern (2 von 3 Mäusen an Tag 3 und 2 von 3 an Tag 14). Diese Läsionen waren fokal (1–3 mm lang) und entsprachen in etwa der Breite der Leimschicht (Abbildung 8E). Nach 35 Tagen wiesen die meisten Mäuse (4 von 6 in zwei separaten Experimenten untersuchten) kein körniges Gewebe auf, während einige (2 von 6) eine moderate fokale Kapselsklerose und Desmoplasie (in einer Tiefe von 25-250 μm) aufwiesen. Interessanterweise wurden zu keinem Zeitpunkt in der Kohorte von neun Mäusen signifikante Läsionen auf der Oberfläche der Bauchspeicheldrüse direkt unter dem Fenster beobachtet (Abbildung 8G). Einige Mäuse zeigten jedoch Bereiche der Atrophie in der Bauchspeicheldrüse und Entzündungen im Bauchfett (Steatitis), die mit manipulationsinduzierten Schäden übereinstimmen. Für die Brustdrüse hatten 3 von 3 Mäusen am Tag 3 nach der Fensterimplantation entweder Granulationsgewebe, das an einen heilenden Schnitt erinnerte, der entlang der Oberfläche der Drüse sichtbar war, oder eine Entzündungsreaktion im Fettgewebe; Am 14. Tag hatten 3 von 3 untersuchten Mäusen Granulationsgewebe. Diese Läsionen waren wieder fokal und 1–3 mm lang (Abbildung 8I). Mäuse mit Brustdrüsenfenstern, die 28 Tage nach der Operation eingeschläfert wurden, zeigten keine offensichtlichen histologischen Anomalien.

Diese Analyse legt nahe, dass das Fenster die physiologische Gesamtarchitektur der getesteten Organe (Leber, Bauchspeicheldrüse, Brustdrüse) nicht beeinträchtigt. Das reaktive Gewebe, das auf der Oberfläche der Leber und der Brustdrüse gefunden wurde, war wahrscheinlich eine Reaktion auf den Klebstoff und beschränkte sich auf Gewebe, das sofort mit dem Klebstoff in Kontakt kam. Normales Gewebe kann leicht neben (< 100 μm) des reaktiven Gewebes in Regionen gefunden werden, die keinem Klebstoff ausgesetzt sind (Abbildung 8E, I), und die Gewebeentzündung stört daher nicht die Bildgebung gesunder Geweberegionen. Darüber hinaus ist die Gewebereaktion wahrscheinlich reversibel, da die meisten Mäuse (8 von 9 Mäusen, über alle Gewebestellen hinweg) zu den späten Zeitpunkten (28 oder 35 Tage) keine signifikanten Läsionen zeigten, obwohl eine direkte Bestätigung, dass sich die Gewebereaktion auflöst, ohne Längsschnittmessungen an einzelnen Mäusen schwer zu erreichen wäre.

Eine multiplexe immunhistochemische Färbung für CD45, CD68 und Myeloperoxidase (MPO) wurde ebenfalls durchgeführt, um die Infiltration von Leukozyten, Monozyten / Makrophagen bzw. Neutrophilen zu charakterisieren. Eine Zunahme der Immunzellinfiltration im Zusammenhang mit Granulationsgewebe und Steatitis wurde in der Brustdrüse und der Leber beobachtet, jedoch nicht in der Bauchspeicheldrüse (Abbildung 8F, H, J).  Bemerkenswert ist, dass diese Veränderungen wahrscheinlich vorübergehend waren, da das Immunzellinfiltrat mit dem der unbehandelten Kontrollen zu den letzten Zeitpunkten vergleichbar war (28 Tage für Brustdrüsenfenster und 35 Tage für Leber- und Bauchspeicheldrüsenfenster).

Die Leber wurde als Ort gewählt, um weiter zu charakterisieren, ob Fenstereinführung und Bildgebung eine signifikante lokale Immuninfiltration mittels Bildgebung verursachten. Dazu wurden c-fms-EGFP (MacGreen) Mäuse¹⁵ verwendet, bei denen myeloische Zellen (meist Makrophagen) mit einem grün fluoreszierenden Protein markiert sind. Leberfenster wurden in drei c-fms-EGFP-Mäuse implantiert und sie an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Operation mit dem Raster aufgenommen, um das gleiche Sichtfeld zu lokalisieren. Die Anzahl der im Bildgebungsbereich vorhandenen Makrophagen hat sich im Laufe der Zeit nach dem Fenstereinfügen nicht wesentlich verändert (Abbildung 8K).

Als nächstes wurde das Fenster funktionell getestet, indem eine Vielzahl von biologischen Prozessen auf zellulärer Ebene (dh Bewegung, Proliferation, Zell-Zell-Kontakt) und Gewebeebene (dh Tumorwachstum in der Bauchspeicheldrüse, Immuninfiltration während der Involution der Brustdrüse und Lebermetastasierung) abgebildet wurde. Die Bauchspeicheldrüse ist kein leicht zugänglicher Ort für die Bildgebung. Um zu demonstrieren, wie das Fenster genutzt werden kann, um die Krebszelldynamik in diesem Organ zu erfassen, wurden Fenster über die Bauchspeicheldrüse von sechs C57BL/6J-Mäusen gleichzeitig mit der orthotopen Injektion von KPC-BL/6-1199-Zellen eingeführt, einer Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinie, die von einem häufig verwendeten KPC (Kras^LSL-G12D/+;p 53^LSL-R172H; Pdx1-Cre) gentechnisch verändertes Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs. Um durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht zu werden, wurden KPC-BL/6-1199-Zellen entwickelt, um Doxycyclin-induzierbare verstärkte GFP (iGFP-1199-Zellen) zu exprimieren. Sechs Tage nach der Injektion wurden die Mäuse auf eine Doxycyclin-Diät gesetzt, um die Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) in den Bauchspeicheldrüsenkrebszellen auszulösen. Abbildung 9 zeigt repräsentative Bilder einer Maus, die an den Tagen 11 und 14 nach der Injektion und dem Einfügen in das Fenster orthotop mit iGFP-1199-Zellen injiziert wurde. Film 2 zeigt die iGFP-1199-Tumorkante in einem Ausschnitt einer 2-stündigen Bildgebungssitzung am Tag 11 nach dem Fenstereinfügen und veranschaulicht die Fähigkeit, die Dynamik der Zellmembranprojektion in der Bauchspeicheldrüse mit den Silikonfenstern zu erfassen.

Das Silikonfenster kann auch verwendet werden, um die dynamische Infiltration von Immunzellen im Laufe der Zeit zu erfassen. Um dies zu veranschaulichen, wurden Brustdrüsenfenster in laktierendes ACTB-ECFP (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy) instiert; LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) Mäuse unmittelbar nach dem Absetzen. In diesen Mäusen exprimieren alle Zellen, aber die meisten Epithelzellen, Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP), das vom Beta-Actin-Promotor angetrieben wird, und myeloische Zellen - hauptsächlich Neutrophile, aber auch Makrophagen - werden durch eGFP markiert, das vom Lysozym-M-Promotor angetrieben wird. Die Mäuse wurden an den Tagen 2 und 4 nach dem Einsetzen des Fensters während des Prozesses der Brustdrüseninvolution abgebildet, wenn das Brustdrüsengewebe in seinen Zustand vor der Schwangerschaft zurückkehrt. Zwei Makros für ImageJ wurden entwickelt, um Bewegungsartefakte zu reduzieren und die Visualisierung zu verbessern, eines richtet die Z-Ebenen in einem 4-dimensionalen intravitalen Video aus (Supplemental Code 1) und das andere reduziert die Wackeligkeit durch Atmung oder andere Bewegungsartefakte (Supplemental Code 2). Abbildung 10 und Film 3A–C zeigen die neutrophile Infiltration innerhalb des umbauenden Brustdrüsengewebes an derselben Stelle an den Tagen 2 und 4 und veranschaulichen, wie das Fenster verwendet werden könnte, um die Infiltration und Bewegung von Immunzellen über verschiedene Tage zu überwachen und zu verfolgen. Ein analoges Experiment wurde in einer c-fms-EGFP-Maus durchgeführt, wobei myeloische Zellen (hauptsächlich Makrophagen) GFP exprimierten, das vom c-fms-Promotor angetrieben wurde (Film 4).

Schließlich ermöglicht die relativ große Oberfläche dieses anpassbaren Fensters die Beobachtung seltener Ereignisse wie der Bildung von Lebermetastasen nach intravenöser Impfung. Um dieses Phänomen zu demonstrieren, wurden Leberfenster in C57BL/6J-Mäuse zum Zeitpunkt der Pfortaderinjektion mit KPC-BL/6-1199-Bauchspeicheldrüsenkrebszellen eingeführt, die konstitutiv das Kernfusionsprotein Histon2B-CFP (H2B-CFP) exprimierten. Im Laufe der Zeit wurde das Auswachsen einzelner Zellen und kleiner Cluster von 2-3 Zellen, als sie sich zu Mikrometastasen (>100 Zellen) entwickelten, überwacht. Abbildung 10 zeigt repräsentative Bilder, die an den Tagen 1, 3, 7 und 9 nach der Injektion und Fenstereinführung aufgenommen wurden, und zeigt den Verlauf von einzelnen Zellen zu Mikrometastasen.

Alle Bilder und Filme wurden mit einem Multiphotonenmikroskop aufgenommen. Projektionen mit maximaler Intensität und Filmausrichtungen entlang der Z- und X-Achse im Laufe der Zeit wurden mit der ImageJ-Software generiert. Abgestimmte Bilder und Filme wurden dann mit der Imaris-Software kompiliert.

Abbildung 1: Chirurgisches Einführen eines ventralen abdominalen Bildgebungsfensters über die Leber . (A) Der Cartoon zeigt die anatomische Lage von Strukturen, die für die Operation relevant sind. Die weiß gestrichelte Box umreißt das auf den Bildern betrachtete Operationsfeld. (B) Es wird ein Schnitt gemacht, der 3 mm unterhalb des Xiphoidfortsatzes beginnt und nach unten fortgesetzt wird, so dass ein 1–1,5 cm² großer Hautabschnitt entlang der Mittellinie entfernt wird. (C) Ein etwas kleinerer Abschnitt des Peritoneums wird seziert. (D) Das Band falciform (weiße Pfeilspitze) wird durchtrennt und drückt die Leber nach unten. Hinweis: Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung angefeuchtet sind, werden verwendet, um die inneren Organe sanft zu manipulieren. (E) Unter Verwendung einer Spritze wird eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs in Tröpfchen um den interessierenden Bereich auf der Oberfläche der Leber aufgetragen. (F) Das Fenster wird positioniert und fest an der Leber gehalten, bis der Klebstoff getrocknet ist (2 min). (G) Die Ränder des Fensters sind unter dem Peritoneum und der Haut gefaltet. (H) Um das Fenster am Peritoneum zu befestigen, wird Klebstoff auf die Oberfläche des Fensters aufgetragen, die dem schattigen Bereich entspricht, bevor das Peritoneum darauf gedrückt und an Ort und Stelle geklebt wird. Die Haut wird in ähnlicher Weise auf das Peritoneum geklebt. Ein Klebstoffrand wird schließlich entlang der roten Linie abgeschieden, um das Wachstum des Epithels über dem Fenster zu verhindern. (I) Gleiches Bild wie in (H) ohne die Markierungen, die die Maus für die postoperative Genesung bereit zeigen. Der mit gestrichelten Linien umrandete Bereich wird vergrößert in (J, K). (J) Markierungen von den Klebstofftröpfchen sind auf der Oberfläche der Leber sichtbar (Pfeilspitzen) (K) Gleiches Foto wie in J, das die Leber durch das Fenster zeigt, das von einer weiß gestrichelten Linie umrissen wird. Die Klebstofftröpfchen auf der Leberoberfläche sind rot umrandet. Der abzubildende Bereich ist weiß umrandet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Chirurgisches Einführen eines Fensters über den rechten Leberlappen. (A) Die Karikatur zeigt die anatomische Lage von Strukturen, die für die Operation relevant sind. Der schwarz gestrichelte Kasten umreißt das auf den Bildern betrachtete Operationsfeld. (B) Die Maus wird in die linke laterale Dekubitusposition gebracht, ein Schnitt wird 3 mm unterhalb des^Brustkorbs gemacht und ein etwa 1 cm 2 großer Hautabschnitt entfernt. (C) Ein etwas kleinerer Abschnitt des Peritoneums wird seziert. (D) Die Leber wird mit einem angefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig unter den Brustkorb gezogen. (E) Mit einer Spritze wird eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs in Tröpfchen (weiße Pfeilspitze) auf die Oberfläche der Leber aufgetragen. (F) Das Fenster wird positioniert und fest an der Leber gehalten, bis der Klebstoff getrocknet ist (2 min). (G) Die Ränder des Fensters sind unter dem Peritoneum und der Haut gefaltet. (H) Um das Fenster am Peritoneum zu befestigen, wird Klebstoff auf die Oberfläche des Fensters aufgetragen, der dem schattigen Bereich entspricht, bevor das Peritoneum darauf gedrückt und an Ort und Stelle geklebt wird. Die Haut wird in ähnlicher Weise auf das Peritoneum geklebt. Ein Klebstoffrand wird auch entlang der roten Linie abgeschieden, um das Wachstum des Epithels über dem Fenster zu verhindern. (I) Bei starker Vergrößerung ist die Leber (umrandet durch eine weiß gestrichelte Linie) durch das Fenster sichtbar. Der Bildbereich wird durch das im Fenster eingebettete Raster markiert (weiße Pfeilspitze). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Chirurgisches Einführen eines Fensters über die Bauchspeicheldrüse. (A) Die Karikatur zeigt die anatomische Lage von Strukturen, die für die Operation relevant sind. Der schwarz gestrichelte Kasten umreißt das auf den Bildern betrachtete Operationsfeld. (B) Die Maus wird in die rechte seitliche Dekubitusposition gebracht. Die Milz ist durch die rasierte Haut sichtbar (gestrichelte Linie) (C) Ein Schnitt wird ab 3 mm unterhalb des^Brustkorbs gemacht und ein ca. 1 cm 2 großer Hautabschnitt entfernt. (D) Ein etwas kleinerer Abschnitt des Peritoneums wird seziert. (E) Die Bauchspeicheldrüse (weiße Pfeilspitze) wird vorsichtig mit einem angefeuchteten Wattestäbchen an der Stelle des Fensters positioniert. (F) Mit einer Spritze wird eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Milz sowie die Bauchspeicheldrüse (weg von der abzubildenden Region) aufgetragen. (G) Das Fenster wird fest an der Bauchspeicheldrüse positioniert und gehalten, bis der Klebstoff getrocknet ist (2 min). Die Ränder des Fensters sind unter dem Peritoneum und der Haut gefaltet. (H) Um das Fenster am Peritoneum zu befestigen, wird Klebstoff auf die Oberfläche des Fensters aufgetragen, die dem schattigen Bereich entspricht, bevor das Peritoneum darauf gedrückt und an Ort und Stelle geklebt wird. Die Haut wird in ähnlicher Weise auf das Peritoneum geklebt. Ein Klebstoffrand wird auch entlang der roten Linie abgeschieden, um das Wachstum des Epithels über dem Fenster zu verhindern. (I) Bei starker Vergrößerung ist die Bauchspeicheldrüse (umrandet durch eine weiß gestrichelte Linie) durch das Fenster sichtbar. Der Bildbereich wird durch das im Fenster eingebettete Raster markiert (weiße Pfeilspitze). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Chirurgisches Einführen eines Fensters über die Leistenbrustdrüse. (A) Die Karikatur zeigt die anatomische Lage von Strukturen, die für die Operation relevant sind. Der schwarz gestrichelte Kasten umreißt das auf den Bildern betrachtete Operationsfeld. Beachten Sie, dass die Operation entweder an den 4. oder 5^. Brustdrüsen durchgeführt werden kann. (B) Die Maus wird in Rückenlage auf einem sterilen Operationsfeld platziert. Die 5^. rechte Brustwarze (Pfeilspitze) wird als Orientierungspunkt verwendet, um den Schnitt durchzuführen. (C) Es wird ein Schnitt gemacht, die Brustdrüse wird von der darüber liegenden Haut getrennt und ein etwa 1 cm² großer Hautabschnitt entfernt. (D) Unter Verwendung einer Spritze wird eine kleine Menge chirurgischer Klebstoffe in Tröpfchen um den interessierenden Bereich auf der Oberfläche der Brustdrüse aufgetragen. (E) Das Fenster wird so lange positioniert und gehalten, bis der Klebstoff getrocknet ist (2 min). (F) Die Ränder des Fensters werden mit einer Pinzette unter der Haut gefaltet. (G) Um das Fenster auf der Haut zu befestigen, wird Klebstoff auf die Oberfläche des Fensters aufgetragen, die dem schattigen Bereich entspricht, bevor die Haut darauf gedrückt und an Ort und Stelle geklebt wird. Ein Klebstoffrand wird auch entlang der roten Linie abgeschieden, um das Wachstum des Epithels über dem Fenster zu verhindern.  (H) Ein Beispiel für ein Fenster, das über einen kleinen Tumor in der^{4. rechten} Brustdrüse implantiert wird, wird bereitgestellt. Der mit gestrichelten Linien umrandete Bereich wird in (I) in höherer Vergrößerung dargestellt. (I) Die Klebstofftröpfchen auf der Brustdrüsenoberfläche sind rot umrandet. Der abzubildende Bereich ist schwarz umrandet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Silikon-Bildgebungsfenster haben günstige optische und materielle Eigenschaften. (A–C) Um die Punktspreizfunktion zu messen und die Abbildungseigenschaften der PDMS-Fenster mit denen von Glasabdeckungen zu vergleichen, wurden 40 nm gelb-grün fluoreszierende Mikrokugeln durch PDMS-Fenster unterschiedlicher Dicke oder Glasabdeckungen (# 1,5 Dicke) abgebildet¹⁶. Die Bilder wurden mit Ultraschallgel als Tauchmedium gesammelt, um den Bedingungen der intravitalen Bildgebung zu entsprechen. Diagramme zeigen die berechnete volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) in der (Ein) X-Achse, (B) Y-Achse und (C) Z-Achse (Mittelwert ± SD; n = 3/Gruppe, ermittelt mit zwei oder mehr separaten Fenstern; unidirektionale ANOVA vergleicht alle PDMS-Fenster mit Glas mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest; es werden nur signifikante Unterschiede angezeigt). (D) Das Verhältnis zwischen berechneten FWHM-Werten in der X- und Y-Achse (A–B) wird als Maß für die Symmetrie der Punktquellenbilder entlang der X- und Y-Achse und damit für optische Aberrationen dargestellt. (E–GMikrosphären wurden durch drei separate Fenster mit 200 mg PDMS (ähnlich den Fenstern, die für die intravitale Bildgebung für Abbildung 9, Abbildung 10, Abbildung 11 und Film 2, Film 3, Film 4) oder drei Glasabdeckungen (#1,5 Dicke) zur Messung der Punktstreufunktion. Im Gegensatz zu den intravitalen Bildgebungsbeispielen wurden Bilder für diese Berechnungen mit Wasser als Tauchmedium gesammelt. Plots zeigen die berechnete FWHM in der (E) X-Achse, (F) Y-Achse und (G) Z-Achse (Mittelwert ± SD; n = 3/Gruppe mit drei separaten Fenstern; Mann-Whitney-Test wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt). (H) Das Diagramm zeigt das Verhältnis zwischen berechneten FWHM-Werten in der X- und Y-Achse (E–F). (Ich) Plots zeigen die maximale Fluoreszenzintensität pro Mikrokugel (Mittelwert ± SD; n = 3/Gruppe; Mann-Whitney-Test wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt). Alle Bilder wurden bei einer Wellenlänge von 960 nm und einer Laserleistung von 3% gesammelt. Für jede Mikrokugel wurde ein 100 μm Z-Stack mit einer Schrittweite von 0,6 μm gesammelt. Der Bildrahmen wurde auf 69 μm x 69 μm mit einer Auflösung von 1022 Pixeln x 1022 Pixeln eingestellt. Die Analyse wurde mit dem Fiji - MetroloJ Plugin durchgeführt. (J) Um die Materialeigenschaften zu testen, wurden PDMS-Fenster in Spannung gehalten und zwischen zwei ringförmigen Unterlegscheiben mit Sekundenkleber gesichert, um eine elastische Reaktion während der mechanischen Prüfung zu gewährleisten. Das gleiche Verfahren wurde für Mikro-Deckglasschlüsse ohne die Spannung aufgrund der Steifigkeit des Glases verwendet. Eine Ladespitze, bestehend aus einer Halbkugel (6 mm Durchmesser) mit einer Zylinderextrusion (4 mm Durchmesser, 20 mm Länge) wurde mit einem Polymilchsäurefilament in 3D gedruckt. Die Fenster wurden unter einem Lastregelprofil von 1 N/s bis zum Materialversagen in eine servohydraulische Materialprüfmaschine verladen. Kraft- und Wegwerte wurden mit einer Frequenz von 100 Hz gemessen. Die Abbildung zeigt die Fenstertests, die eingerichtet wurden, wobei die Ladespitze in der Mitte des Fensters angewendet wird. (K) Das Diagramm zeigt die Zähigkeit des Materials, die durch Berechnung der Summierungsfläche unter der Spannungs-Dehnungs-Kurve mit der Trapz-Funktion in MATLAB bestimmt wurde (Mittelwert ± SEM; n = 3/Gruppe mit drei separaten PDMS-Fenstern für jede Dicke und Glasabdeckungen; Einweg-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest). (L) Das Diagramm zeigt den Elastizitätsmodul, der aus dem linearen Teil der Spannungs-Dehnungs-Kurve bestimmt wird (Mittelwert ± SEM; n = 3/Gruppe unter Verwendung von drei separaten PDMS-Fenstern und Glasabdeckungen; t-Test mit Welch-Korrektur). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Das Silikonfenster weist eine hohe Verträglichkeit und Langlebigkeit auf. (A) Ein repräsentatives Bild einer männlichen, 7 Wochen alten C57BL/6J-Maus mit einem ventralen abdominalen Bildgebungsfenster ohne Raster 11 Tage nach der Fensteroperation. (B) Ein repräsentatives Bild einer 7 Wochen alten C57BL/6J-Maus mit einem Pankreas-Bildgebungsfenster, das 14 Tage nach der Fensteroperation ein Gitter enthält. (C) Ein repräsentatives Bild einer weiblichen 12 Wochen alten C57BL/6J c-fms-EGFP-Maus mit einem Brustdrüsenbildgebungsfenster, das ein Raster >7 Tage nach der Fensteroperation enthält. (D) Leberbildgebungsfenster in einer 7 Wochen alten c-fms-EGFP-Maus, fotografiert (obere Reihe) und abgebildet (untere Reihe) am Tag 0 (unmittelbar nach der Operation) und 35 Tage nach der Operation. Das Entfernen der entsprechenden Menge Haut und das Versiegeln der Wunde mit Klebstoff verhindert, dass die Haut wieder Epithelisierung und Druck des Fensters nach oben und außen führt, so dass das Organ langfristig abgebildet werden kann. Maßstabsbalken = 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Raster innerhalb der Fenster ermöglichen die Verfolgung desselben Sichtfelds. (A) Detaillierte Spezifikationen für die kundenspezifische Herstellung von lasergeschnittenen Edelstahlfenstern. (B) Ein in das Bildfenster eingebettetes Gitter ist über der Leber zu sehen, wobei der Klebstoffrand um das Fenster deutlich sichtbar ist. (C) Blick auf das Fenster durch das Okular des Zwei-Photonen-Mikroskops. Blutgefäße (rot) und grüne Signale aus der Leber sind im Hintergrund zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Systemische und lokale Reaktion auf Fenstereinfügung. (A–C) Das Gewicht wurde bei 7 Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Mäusen über einen Zeitraum von 28 Tagen nach dem Einsetzen des Fensters in die Leber überwacht (Ein), der Bauchspeicheldrüse (B) oder die Brustdrüse (C). Es wird eine prozentuale Veränderung des Körpergewichts im Vergleich zu unbehandelten altersangepassten Mäusen gezeigt. (*) weist auf eine Maus hin, die kein normales Körpergewicht wiedererlangt hat und daher von einem bildgebenden Experiment zensiert worden wäre. Die gleichen Steuermäuse werden in allen drei Panels angezeigt, um den Vergleich mit jedem Fenstertyp zu erleichtern. (D) Die Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC) wurde an den Tagen 3, 14 und 28 (Brustdrüsenfenster) oder 35 (Leber- oder Bauchspeicheldrüsenfenster) nach der Operation überwacht. Der normale Bereich für die WBC-Anzahl in der Maus wird durch gestrichelte Linien angezeigt. (E,G,Ich) Hämatoxylin- und Eosinfärbung von Gewebeschnitten aus unbehandelten Kontrollen (links) und eine 7 Wochen alte C57BL/6J-Maus 14 Tage nach dem Einfügen eines Bildgebungsfensters (rechts) über die (E) Leber, (G) Bauchspeicheldrüse oder (Ich) Brustdrüse. (E,Ich) Oberflächliche und fokale Granulationsläsionen sind an diskreten Stellen entlang der Oberfläche (Pfeil) von Leber und Brustdrüse sichtbar, was auf eine Reaktion auf den Klebstoff hindeutet. Normales Gewebe, das durch * gekennzeichnet ist, ist in den Regionen sichtbar, die an die Granulationsläsionen angrenzen. Drei Kontrollen und drei Mäuse mit Leberfenstern wurden zu jedem Zeitpunkt (Tage 3, 14 und 35 nach der Operation) untersucht, mit der Ausnahme, dass 6 Mäuse mit Leberfenstern am Tag 35 nach der Operation untersucht wurden. Zwei von 3 Mäusen zeigten an den Tagen 3 und 14 Granulationsgewebe. 1 von 3 Mäusen zeigte an Tag 35 Granulationsgewebe.  Drei Kontrollen und drei Mäuse mit Brustdrüsenfenstern wurden zu jedem Zeitpunkt (Tag 3, 14 und 28 nach der Operation) untersucht. Drei von 3 Mäusen hatten an den Tagen 3 und 14 Granulationsgewebe oder Entzündungsreaktionen im Fettgewebe der Brustdrüse. Keine von 3 Mäusen zeigte am 28. Tag Granulationsläsionen oder Entzündungsreaktionen. (G) In der Bauchspeicheldrüse sind keine signifikanten Läsionen sichtbar. Drei Kontrollen und drei Mäuse mit Pankreasfenstern wurden zu jedem Zeitpunkt (Tage 3, 14 und 35 nach der Operation) ausgewertet. Mäuse mit Pankreasfenstern hatten zu keinem Zeitpunkt Granulationsgewebe. Maßstabsleiste = 500 μm (F,H,J) Die immunhistochemische Multiplex-Färbung wurde 14 Tage nach dem Einsetzen eines Bildgebungsfensters über die (F) Leber, (H) Bauchspeicheldrüse oder (J) Brustdrüse. Antikörper gegen CD45, CD68 und Myeloperoxidase (MPO) wurden verwendet, um Leukozyten, Monozyten/Makrophagen bzw. Neutrophile zu markieren. Die CD45- und CD68-Färbung wurde auf demselben Abschnitt durchgeführt, während die MPO-Färbung auf einem seriellen Abschnitt desselben Gewebes durchgeführt wurde. Der Anti-CD45-Antikörper wurde mit einem HRP-konjugierten sekundären Antikörper nachgewiesen und zuerst abgebildet, dann wurden das Chromogen und der sekundäre Antikörper abgestreift und Objektträger wurden mit einem sekundären Antikörper inkubiert, der Anti-CD68 erkennt. Die Quantifizierung wurde mit Fidschi-Software durch Farbschwellen durchgeführt; Die Parameter wurden über Antikörper und Gewebe hinweg angepasst. Plots zeigen die Quantifizierung als Zellzahlen pro Sichtfeld (FOV) (Mittelwert ± SEM; n = 3/Gruppe; Einweg-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest; nur signifikante Unterschiede sind angezeigt). (K) Stecker C57BL/6J c-fms-EGFP Mäuse im Alter von 8-11 Wochen hatten ein Silikon-Bildgebungsfenster, das über den rechten Leberlappen eingeführt wurde. Fluoreszierend markiertes Lektin (100 μL) wurde unmittelbar vor jeder Bildgebungssitzung intravenös injiziert. Die Bilder stammen von einer einzigen Maus am selben Rasterort an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Operation, etwa 200 μm unterhalb des Gitters. Maßstabsleiste = 30 μm. Abgebildet mit einer Anregungswellenlänge von 960 nm, Laserleistung 10%. Blutgefäße erscheinen rot. Makrophagen erscheinen grün (weiße Pfeile). Vertreter von drei abgebildeten Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: Tumore können zu mehreren Zeitpunkten über Wochen nach dem Fenstereinfügen visualisiert werden. Repräsentative Bilder einer männlichen, 7 Wochen alten C57BL/6J-Maus, die zum Zeitpunkt des Einsetzens des Pankreasfensters orthotop mit 1,5 x 10⁴ iGFP-1199-Bauchspeicheldrüsenkrebszellen injiziert und an den Tagen 11 und 14 nach dem Einfügen des Fensters aufgenommen wurde. Maßstabsstäbe = 30 μm. Abgebildet mit einer Anregungswellenlänge von 960 nm, Laserleistung 10%. Vertreter von 6 abgebildeten Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 10: Dynamische Veränderungen der Immunzellinfiltration während der normalen Brustdrüseninvolution. Mit dem im Bildgebungsfenster eingebetteten Metallgitter kann die gleiche Stelle während des normalen Gewebeumbaus, z. B. während der Involution der Brustdrüse, abgebildet werden. Um die Funktionalität der Silikonfenster bei der Überwachung dynamischer Veränderungen wie der Infiltration von Immunzellen weiter zu bewerten, wurde eine 12 Wochen alte Frau C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; Die LysM-eGFP-Maus mit einem Bildgebungsfenster, das über die Bauchbrustdrüse eingeführt wurde, wurde an den Tagen 2 und 4 nach der Involution der Brustdrüse aufgenommen. Neutrophile erscheinen grün (weiße Pfeile). Die Aktivität der Neutrophilen Elastase wurde durch Injektion einer Neutrophilen Elastase-Fluoreszenzsonde 4 Stunden vor Beginn der Bildgebung visualisiert und erscheint in Rot (oder Gelb, wenn sie mit Neutrophilen kolokalisiert wird). Die Epithelzellen erscheinen blau. Schnappschüsse sind eine Projektion mit maximaler Intensität von fünf Bildern entlang der Z-Achse (100–150 mm Tiefe). Die Bilder stammen aus den Filmen 3A und 3B, und auf den Bildern in der unteren Reihe wird nur das CFP-Signal angezeigt und die Bilder sind mit einer rot gestrichelten Linie markiert, um die gleichen Positionen innerhalb des Gewebes zu den beiden verschiedenen Zeitpunkten zu visualisieren. Maßstabsstäbe = 30 μm. Abgebildet mit 960 nm und 1080 nm Anregungswellenlängen, Laserleistung bei 10% bzw. 15%. Repräsentativ für vier abgebildete Mäuse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 11: Die Bildung von Krebsmetastasen kann im Laufe der Zeit verfolgt werden. Einer männlichen C57BL/6J 10 Wochen alten Maus wurde 1 x 10⁵ KPC-BL/6-1199 Bauchspeicheldrüsenkrebszellen injiziert, die zum Zeitpunkt des Fenstereinlegens nukleär lokalisiertes Histon H2B konjugiertes Cyanfluoreszenzprotein (H2B-CFP) durch die Pfortader exprimierten. Die Leberbildgebung wurde durch ein laterales Fenster 24 h (Tag 1) nach der Injektion und zu drei späteren Zeitpunkten (bis zu 9 Tagen) durchgeführt, wie angegeben. Eine einzelne Krebszelle, die an den Tagen 1 und 3 nach der Injektion sichtbar ist, ist mit weißen Pfeilen gekennzeichnet. Das zweite harmonische Signal von Kollagenfasern wurde ebenfalls im Cyankanal (gelbe Pfeile) visualisiert. Die Bilder stammen zu jedem beliebigen Zeitpunkt von derselben Maus. Einzelne Z-Ebenen-Bilder, die zwischen 300 μm und 350 μm in der Tiefe aufgenommen wurden. Maßstabsstäbe = 30 μm. Abgebildet mit einer Anregungswellenlänge von 880 nm. Laserleistung bei 8%. Vertreter von drei abgebildeten Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Film 1: Silikon-imaging-g-Fensterwerden bei Mäusen gut vertragen. Der Film zeigt eine männliche 9 Wochen alte C57BL / 6J-Maus 14 Tage nach dem Einfügen des Fensters. Die Maus zeigt keines der Standardverhaltensweisen, die mit Schmerzen verbunden sind (z. B. schlechte Pflege, geschlossene Augen oder Lethargie). Repräsentativ für sechs aufgezeichnete Mäuse und konsistent mit über 100 Mäusen, die nach erfolgreicher Fensterimplantation beobachtet wurden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Film 2: Subzelluläre Bildgebung von orthotopisch implantierten Bauchspeicheldrüsenkrebszellen. iGFP-1199-Zellen wurden orthotop in die Bauchspeicheldrüse einer männlichen 7 Wochen alten C57BL/6J-Maus injiziert und am 11. Tag nach Injektion von Krebszellen und Fensterinsertion aufgenommen. Der Film ist eine Projektion mit maximaler Intensität von sechs Bildern entlang der Z-Achse, die aus einer 2-stündigen Bildgebungsperiode extrahiert wurden. Zeitstempel (h:min:s:ms). Vertreter von sechs abgebildeten Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Film 3: Veränderungen in der Infiltration von Immunzellen in ACTB-ECFP; LysM-eGFP-Mäuse während der Involution. Buchse C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; LysM-eGFP-Mäuse, die GFP in myeloischen Zellen (hauptsächlich in Granulozyten, aber auch in Makrophagen) exprimierten, und ECFP in allen Zellen (aber am höchsten in Epithelzellen) wurden im Alter von 8 Wochen gezüchtet. Nach der Geburt wurden die Welpen auf sechs Welpen pro Maus normalisiert. Am Tag 10 nach der Geburt wurden die Welpen entwöhnt und abdominale Brustdrüsen-Bildgebungsfenster eingesetzt. Myeloische Zellen erscheinen grün; Die Aktivität der Neutrophilen Elastase, die mit der 4 h vor Beginn der Bildgebung injizierten Neutrophilen Elastase 680 FAST-Sonde markiert wurde, erscheint rot (erscheint gelb, wenn sie mit Neutrophilen kolokalisiert wird); und Epithelzellen erscheinen in blau. Filme sind eine maximale Intensität von fünf Bildern entlang der Z-Achse (100–150 μm Tiefe). (A) Bildgebung am Tag 2 der Brustdrüseninvolution. Maßstabsleiste = 20 μm. Abgebildet mit 960 nm und 1080 nm Anregungswellenlängen, Laserleistung bei 10% bzw. 15%. (B) Bildgebung am Tag 4 der Brustdrüseninvolution. Maßstabsleiste = 20 μm. Der Film stammt aus der gleichen Maus- und Geweberegion wie Film 3A. (C) Höhere Vergrößerung einer Region von Interesse aus Film 3B, die zwei Neutrophile zeigt, die miteinander und mit den Epithelzellen der Brustdrüse interagieren. Die Bildung von transienten Membranvorsprüngen kann an der Vorderkante während der neutrophilen Migration beobachtet werden. Zeitstempel (h:min:s:ms). Repräsentativ für vier abgebildete Mäuse. Bitte klicken Sie hier, um Film 3A herunterzuladen. Bitte klicken Sie hier, um Film 3B herunterzuladen. Bitte klicken Sie hier, um Movie 3C herunterzuladen.     

Film 4: Veränderungen in der Infiltration von Immunzellen in c-fms-EGFP-Mäusen während der Involution. Weibliche C57BL/6J c-fms-EGFP-Mäuse mit GFP-markierten Makrophagen wurden im Alter von 8 Wochen gezüchtet. Nach der Geburt wurden die Würfe auf sechs Welpen pro Maus eingestellt. Am Tag 10 nach der Geburt wurden die Welpen entwöhnt und abdominale Brustdrüsen-Bildgebungsfenster eingesetzt. Der Film, der am Involutionstag 1 (einen Tag nach dem Einsetzen des Fensters) aufgenommen wurde, hebt das prominente Makrophagen-Infiltrat während der Involution hervor. Makrophagen erscheinen in Grün, Kollagenfasern (zweite harmonische Generation) erscheinen in Blau und Blutgefäße erscheinen in Rot (Lectin-DyLight 594). Maßstabsleiste = 20 μm. Bilder sind Projektionen mit maximaler Intensität von fünf Bildern entlang der Z-Achse (100–150 um Tiefe). Abgebildet mit 960 nm und 800 nm Anregungswellenlängen, Laserleistung bei 10% bzw. 15%. Zeitstempel (h:min:s:ms). Vertreter von drei abgebildeten Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

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Discussion

Intravitale Bildgebungsfenster sind wichtige Werkzeuge, um physiologische und pathologische Prozesse in zellulärer Auflösung direkt sichtbar zu machen, während sie sich im Laufe der Zeit entfalten. Das neuartige Verfahren zum Gießen und Einsetzen flexibler Silikonbildgebungsfenster in Mäuse überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern (Exsudat, Bruch und Störung der normalen Mobilität), bietet zusätzliche Sicherheit für die Maus und erhöht die Zugänglichkeit dieser Technik.

Die am weitesten verbreiteten Bildgebungsfenster bestehen aus einem Metallrahmen, der einen Glasdeckel hält. Ein großes Hindernis für die Verwendung dieser prototypischen Fenster besteht darin, dass die Sicherung des Metallrings mit mühsamen Nähverfahren verbunden ist, die Personal mit fortgeschrittener chirurgischer Ausbildung erfordern. Darüber hinaus ist die Herstellung der Rahmen kostspielig und erfordert spezielle Ausrüstung. Die PDMS-Fenster überwinden beide Probleme. Das Verfahren zum Einfügen der PDMS-Fenster eliminiert das Nähen und senkt die Barriere für das Erlernen der Technik erheblich. Die Materialien zur Herstellung der Fenster sind ebenfalls kostengünstig und können leicht erworben werden. Darüber hinaus können sowohl die Form des Fensters als auch der chirurgische Eingriff für die Abbildung verschiedener Organe angepasst werden, einschließlich Brustdrüse, Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz und Darm.

Während aktuelle intravitale Bildgebungsfenster die Längsschnittbildgebung in der Regel für einige Tage ermöglichen, schränken mehrere häufige Probleme die Verwendung dieser Fenster für längere Zeiträume ein. Das Gewicht und die Größe von Glasfenstern können die freie Bewegung der Mäuse beeinträchtigen, und Exsudat kann sich gegen das Fenster ansammeln. Mäuse können auch den Glasdeckel beschädigen, was zu Wunden und Infektionen führt. Im Gegensatz dazu hält das hier beschriebene Verfahren das gleiche Maß an Zugänglichkeit zum Gewebe aufrecht und minimiert gleichzeitig die Belastung der Tiere. PDMS ist ein sicheres, biostabiles, synthetisches Polymer, das häufig für biomedizinische Anwendungen beim Menschen verwendet wird, wie z. B. Arzneimittelabgabegeräte, Gesichtsrekonstruktionschirurgie und Brustimplantate. Neben der Erhöhung der Toleranz der Tiere gegenüber dem Fenster ist die Verwendung eines biologisch inerten Materials im Gegensatz zu Glas besonders wichtig für Studien, an denen das Immunsystem beteiligt ist, bei denen lokale Entzündungen einen verwirrenden Effekt hätten. Darüber hinaus ist eine wesentliche Verbesserung die Beseitigung von Stichen, da Mäuse an ihnen beißen und ziehen, was dazu führen kann, dass die metallgerahmten Glasbildfenster herausfallen. Dieses Problem wurde teilweise durch eine neuere Generation von Fenstern behoben, die so konzipiert wurden, dass die Stiche in einer Rille⁹ verborgen sind. Diese letztere Strategie erfordert jedoch das Nähen von Geldbeutelnähten, ein kompliziertes, fehleranfälliges Verfahren, das oft dazu führt, dass die Stiche zu fest gezogen werden, was zu Nekrose des Gewebes und Schmerzen führt. Daher stellt die Möglichkeit, das Fenster an Ort und Stelle zu kleben, einen großen Vorteil des Silikonfensteransatzes dar. Darüber hinaus besteht das Fenster aus einem flexiblen, langlebigen Material mit vernachlässigbarem Gewicht, das seine Auswirkungen auf die Bewegung des Tieres verringert, wie zuvor in einem Vergleich von Fenstern bewertet wurde, die Silikon anstelle von Metall verwendeten, um ein Glasdeckglas^{zu halten 17}. Durch die vollständige Beseitigung des Glasabdeckglases beseitigt das Silikonfenster die Probleme mit den Metallrahmen und dem Glas. Darüber hinaus ermöglicht die Flexibilität des Fensters ein leichtes Einführen und verringert die Spannungskraft, die durch das Verkleben einer starren Oberfläche auf die Organe verursacht wird, wodurch das Risiko einer dauerhaften Schädigung des beobachteten Gewebes verringert wird. Da das Fenster viel einfacher einzuführen und an Ort und Stelle zu halten ist, nimmt das Gesamtverfahren weniger Zeit in Anspruch, wodurch die möglichen Nebenwirkungen aufgrund einer längeren Anästhesie begrenzt werden. Bei der Einführung über die Leber ist der Unterschied in der Eingriffszeit besonders groß, von 45 min für metallgerahmte Fenster bis 15 min für die Silikonfenster. In der Tat, während das Einführen des Metallrahmens über die Leber eine Dissektion des Xiphoidprozesses (des Knorpels am Ende des Brustbeins) erfordert, der auch potenziell schmerzhaft ist und eine anhaltende Entzündung verursacht, ist diese Dissektion für das Einführen des Silikonfensters unnötig. Schließlich bietet das in dieser Arbeit vorgestellte Bildgebungsfenster zusätzliche Vorteile im Hinblick auf mögliche Anwendungen. Zum Beispiel bieten Silikonfenster im Gegensatz zu Glasfenstern einen einfachen Zugang zum Gewebe, so dass Krebszellen, fluoreszierende Farbstoffe oder Medikamente direkt durch das Fenster injiziert werden können.

Ein weiteres PDMS-basiertes Silikonbildgebungsfenster, das für die Einführung an einer Vielzahl von anatomischen Stellen, einschließlich der Brustdrüse, geeignet ist, wurde kürzlich beschrieben¹⁸. Dieses Fenster ist geformt, um eine Form und eine spezielle Kante zu erzeugen, die eine schnelle Implantation des Fensters ohne Stiche oder Klebstoff ermöglicht. Im Gegensatz dazu benötigt das hier vorgestellte Silikonfenster keine spezielle Form und kann vor allem während des chirurgischen Eingriffs in Form geschnitten werden, um sich an die anatomische Lage und die einzelne Maus anzupassen. Obwohl das hierin beschriebene Protokoll die Verwendung von Klebstoff erfordert, ermöglicht diese zusätzliche Anforderung die Bildgebung von Bauchorganen, einschließlich Leber und Milz. Darüber hinaus ermöglicht das hier beschriebene Silikonfenster die Einbettung eines Edelstahlgitters in das Fenster, das Referenzpunkte liefert. Diese Landmarken ermöglichen die Rückverfolgung des gleichen genauen Ortes im Laufe der Zeit und erleichtern die wiederholte Bildgebung derselben Stelle über mehrere Sitzungen (Längsschnittbildgebung), um Prozesse zu untersuchen, die Tage bis Wochen dauern, wie z. B. die Entwicklung metastasierender Läsionen.

Zusammenfassend wurde ein Silikon-Bildgebungsfenster für den Einsatz in der longitudinalen IVM der Brustdrüse oder der Bauchorgane entwickelt. Das Fenster ist optisch klar, sehr langlebig und preiswert. Die Einfachheit des Fenstereinfügeverfahrens reduziert die technischen Fähigkeiten, die für die Implementierung fensterbasierter intravitaler Bildgebungsansätze erforderlich sind. Die Anpassungsfähigkeit des Fensters an verschiedene Gewebestellen ermöglicht die Implementierung von IVM in einer Vielzahl von biologischen Studien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453