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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

स्पष्ट सिलिकॉन विंडोज के माध्यम से अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग

Published: January 5, 2022 doi: 10.3791/62757
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4,5, 1, 1,6, 7,8, 9, 1, 1, 1, 8, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट, सिलिकॉन खिड़कियों का उपयोग करके दीर्घकालिक इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए यहां एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है जिसे सीधे ब्याज के ऊतक / अंग और त्वचा से चिपकाया जा सकता है। ये खिड़कियां वर्तमान में क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले अन्य लोगों की तुलना में सस्ती और अधिक बहुमुखी हैं, और सर्जिकल सम्मिलन जानवरों के लिए सीमित सूजन और संकट का कारण बनता है।

Abstract

Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर सेल आंदोलन, विभाजन और मृत्यु के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। शल्य चिकित्सा से डाली गई इमेजिंग खिड़कियों के माध्यम से आईवीएम विशेष रूप से शक्तिशाली है क्योंकि यह दिनों से लेकर हफ्तों तक एक ही ऊतक के अनुदैर्ध्य अवलोकन की अनुमति देता है। विशिष्ट इमेजिंग खिड़कियों में माउस की त्वचा पर टांके गए बायोकंपैटिबल धातु फ्रेम में एक ग्लास कवरस्लिप शामिल होता है। ये खिड़कियां चूहों के मुक्त आंदोलन में हस्तक्षेप कर सकती हैं, एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकती हैं, और टूटे हुए कांच या फटे हुए टांके के कारण विफल हो सकती हैं, जिनमें से किसी को भी इच्छामृत्यु की आवश्यकता हो सकती है। इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, लंबे समय तक पेट के अंग और स्तन ग्रंथि इमेजिंग के लिए खिड़कियों को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) की एक पतली फिल्म से विकसित किया गया था, जो पहले कपाल इमेजिंग खिड़कियों के लिए उपयोग किया जाने वाला एक ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट सिलिकॉन बहुलक था। इन खिड़कियों को सीधे ऊतकों से चिपकाया जा सकता है, जिससे सम्मिलन के लिए आवश्यक समय कम हो जाता है। पीडीएमएस लचीला है, समय के साथ चूहों में इसके स्थायित्व में योगदान देता है- 35 दिनों तक परीक्षण किया गया है। अनुदैर्ध्य इमेजिंग अलग-अलग सत्रों के दौरान एक ही ऊतक क्षेत्र की इमेजिंग है। एक स्टेनलेस स्टील ग्रिड को एक ही क्षेत्र को स्थानीयकृत करने के लिए खिड़कियों के भीतर एम्बेडेड किया गया था, जिससे गतिशील प्रक्रियाओं (जैसे स्तन ग्रंथि involution) के विज़ुअलाइज़ेशन को एक ही स्थान पर, दिनों के अलावा अनुमति मिलती है। इस सिलिकॉन विंडो ने समय के साथ सूक्ष्म-मेटास्टेसिस में विकसित होने वाली एकल प्रसारित कैंसर कोशिकाओं की निगरानी की भी अनुमति दी। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सिलिकॉन खिड़कियां धातु-फ्रेम वाली कांच की खिड़कियों की तुलना में सम्मिलित करना आसान है और छविवाले ऊतकों की सीमित सूजन का कारण बनती हैं। इसके अलावा, एम्बेडेड ग्रिड बार-बार इमेजिंग सत्रों में एक ही ऊतक क्षेत्र के सीधे ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं।

Introduction

Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM), anesthetized जानवरों में ऊतकों की इमेजिंग, बरकरार ऊतकों में सेलुलर संकल्प पर शारीरिक और रोग संबंधी घटनाओं की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इस तकनीक के अनुप्रयोग व्यापक रूप से भिन्न होते हैं, लेकिन आईवीएम कैंसर जीव विज्ञान के क्षेत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ताकि यह स्पष्ट किया जा सके कि कैंसर कोशिकाएं ऊतकों और मेटास्टेसाइज़ पर कैसे आक्रमण करती हैं, आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ बातचीत करती हैं, औरदवाओं का जवाब देती हैं 1,2,3। इसके अलावा, आईवीएम पूर्व विवो प्रोफाइलिंग दृष्टिकोण (जैसे, फ्लो साइटोमेट्री) के पूरक अंतर्दृष्टि प्रदान करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले जटिल तंत्रों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रहा है। उदाहरण के लिए, इंट्रावाइटल इमेजिंग प्रयोगों ने प्रतिरक्षा कार्यों के बारे में विवरण का खुलासा किया है क्योंकि वे सेल माइग्रेशन और सेल-सेल संपर्क से संबंधित हैं और चोट या संक्रमण 4,5,6,7 के जवाब में स्पैटिओटेम्पोरल गतिशीलता को क्वांटिटेट करने के लिए एक मंच की पेशकश की है। इनमें से कई प्रक्रियाओं का अध्ययन हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग के माध्यम से भी किया जा सकता है, लेकिन केवल आईवीएम गतिशील परिवर्तनों की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। वास्तव में, जबकि एक हिस्टोलॉजिकल अनुभाग किसी दिए गए समय में ऊतक का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है, इंट्रावाइटल इमेजिंग समय के साथ एक ही ऊतक के भीतर अंतरकोशिकीय और उपकोशिकीय घटनाओं को ट्रैक कर सकता है। विशेष रूप से, प्रतिदीप्ति लेबलिंग में प्रगति और आणविक पत्रकारों के विकास ने आणविक घटनाओं को सेलुलर व्यवहारों के साथ सहसंबद्ध होने की अनुमति दी है, जैसे प्रसार, मृत्यु, गतिशीलता, और अन्य कोशिकाओं या बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के साथ बातचीत। अधिकांश आईवीएम तकनीकें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पर आधारित होती हैं, जो प्रकाश प्रकीर्णन के कारण, इमेजिंग गहरे ऊतकों को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। इसलिए, ब्याज के ऊतक को अक्सर आक्रामक और टर्मिनल प्रक्रिया के साथ शल्य चिकित्सा से उजागर करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, अंग साइट के आधार पर, ऊतक को कुछ से 40 घंटे 8 तक की अवधि के लिए लगातार चित्रित किया जा सकताहै। वैकल्पिक रूप से, एक स्थायी इमेजिंग विंडो का सर्जिकल सम्मिलन एक ही ऊतक की इमेजिंग को 7,9 सप्ताह तक दिनों की अवधि में क्रमिक रूप से अनुमति देता है।

नई इमेजिंग खिड़कियों के विकास को इंट्रावाइटल इमेजिंग दृष्टिकोण10 में और सुधार करने के लिए एक तकनीकी आवश्यकता के रूप में हाइलाइट किया गया है। प्रोटोटाइपिकल इंट्रावाइटल इमेजिंग विंडो एक धातु की अंगूठी है जिसमें एक ग्लास कवरस्लिप होता है जोटांके 11 के साथ त्वचा पर सुरक्षित होता है। मुक्त आंदोलन के साथ हस्तक्षेप, एक्सूडेट का संचय, और ग्लास कवरस्लिप को नुकसान इस तरह की खिड़कियों का उपयोग करने के साथ देखी जाने वाली आम समस्याएं हैं। इसके अलावा, प्रोटोटाइपिकल विंडो को विशेष उत्पादन की आवश्यकता होती है, और सर्जिकल प्रक्रिया को व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है। इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, polydimethylsiloxane (PDMS), एक सिलिकॉन बहुलक, जो पहले मस्तिष्क12 में दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए कपाल खिड़कियों में इस्तेमाल किया गया है, पेट के अंग और स्तन ग्रंथि इमेजिंग में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। यहां, पीडीएमएस-आधारित सिलिकॉन खिड़कियों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत की गई है, जिसमें एक ही ऊतक क्षेत्रों के दोहराए गए इमेजिंग के लिए स्थलों को प्रदान करने के लिए स्टेनलेस-स्टील ग्रिड के चारों ओर खिड़की को कैसे कास्ट किया जाए। इसके अलावा, पेट के अंगों या स्तन ग्रंथि पर खिड़की डालने के लिए एक सरल, सिलाई मुक्त सर्जिकल प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। यह नया दृष्टिकोण वर्तमान में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग खिड़कियों के साथ कुछ सबसे आम मुद्दों को दूर करता है और अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग की पहुंच को बढ़ाता है।

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Protocol

वर्णित सभी प्रक्रियाओं को कोल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रयोगशाला सर्जिकल दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और कोल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रयोगशाला में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सिलिकॉन खिड़की कास्टिंग

  1. 10: 1 (v / v) अनुपात में बेस इलास्टोमर और इलाज एजेंट को मिलाकर सिलिकॉन बहुलक (PDMS) तैयार करें।
  2. एक बाँझ, चिकनी सतह पर PDMS की एक छोटी मात्रा जमा करके एक खिड़की डाली और वांछित मोटाई के लिए मात्रा-से-क्षेत्र अनुपात को समायोजित करें।
    नोट: एक 24 अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन के ढक्कन पर एक 22 मिमी व्यास सर्कल के लिए बहुलक समाधान के 200 मिलीग्राम का उपयोग खिड़की की मजबूती और ऑप्टिकल स्पष्टता के बीच एक अच्छा समझौता में परिणाम।
  3. वैकल्पिक: एक ही ऊतक क्षेत्रों के दोहराए गए इमेजिंग के लिए स्थलों को प्रदान करने के लिए, पीडीएमएस वांछित कास्टिंग सतह पर होने के बाद सिलिकॉन में एक स्टेनलेस स्टील ग्रिड को हल्के से दबाएं।
  4. हवा के बुलबुले को हटाने के लिए, बहुलक degas करने के लिए 45 मिनट के लिए एक वैक्यूम desiccator में लेपित सतह जगह.
  5. 45 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में सिलिकॉन खिड़कियों का इलाज करें।
  6. मोल्ड के किनारों पर बहुलक स्कोर और धीरे से संदंश के साथ कास्टिंग के लिए इस्तेमाल की जाने वाली सतह से ठीक खिड़कियों छील।
  7. सर्जरी से पहले, ऑटोक्लेविंग द्वारा खिड़कियों को निष्फल करें।

2. सिलिकॉन विंडो के सम्मिलन के लिए माउस तैयार करना

  1. 4% (v/ v) isoflurane का उपयोग करके एक प्रेरण कक्ष में माउस को एनेस्थेटिक करें। माउस को सर्जिकल टेबल पर एक वार्मिंग पैड पर ले जाएं, माउस को संज्ञाहरण नाक मास्क में रखें, और सर्जरी के दौरान रखरखाव के लिए आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 2% तक कम करें।
  2. पिछले अंगों के पैर की उंगलियों को चुटकी देकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। जब तक माउस निष्क्रिय नहीं होता है तब तक आगे न बढ़ें और पैर की अंगुली चुटकी पलटा प्रतिक्रिया नहीं दिखाता है।
  3. नेत्र स्नेहक को सूखने और आघात को रोकने से रोकने के लिए आंखों पर लागू करें।
  4. pre-emptive analgesia (buprenorphine 0.05 mg / kg) चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
  5. सर्जिकल साइट शेव करें और बालों को हटाने वाली क्रीम के साथ बालों को पूरी तरह से हटा दें।
  6. सर्जिकल साइट संक्रमण को रोकने के लिए पोविडोन-आयोडीन समाधान (10% v / v) और इथेनॉल (70% v / v) लगातार 3x लागू करें।

3. जिगर में इमेजिंग के लिए एक वेंट्रल विंडो सम्मिलित करना; अन्य पेट के अंगों के लिए अनुकूलनीय (चित्रा 1)

  1. माउस को सुपाइन स्थिति में रखें।
  2. बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग करके xiphoid प्रक्रिया से 3 मिमी नीचे शुरू होने वाला 10 मिमी चीरा बनाएं।
  3. मिडलाइन के साथ त्वचा के 1-1.5 सेमी2 अनुभाग को हटा दें।
  4. त्वचा के खंड से थोड़ा छोटा पेरिटोनियम के एक खंड को हटाने के लिए बाँझ कैंची और संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें।
  5. वैकल्पिक: जिगर के एक बड़े हिस्से की कल्पना करने के लिए, बाँझ कपास swabs का उपयोग करें बाँझ खारा के साथ moistened जिगर को डायाफ्राम से नीचे धक्का देने के लिए डायाफ्राम से नीचे जिगर को प्रकट करने के लिए falciform स्नायुबंधन का खुलासा करने के लिए डायाफ्राम से जिगर को जोड़ने. अवर वेना कावा को काटने के लिए ध्यान न रखते हुए स्नायुबंधन को अलग करें।
  6. एक 31 जी सिरिंज के साथ सर्जिकल चिपकने वाला वापस ले लो, क्षेत्र के किनारों के आसपास जिगर की सतह पर इसकी एक छोटी मात्रा लागू करने के लिए छवि की जा करने के लिए। यह चिपकने वाला एक परिपत्र सील बनाता है, जिससे इमेजिंग के लिए केंद्र क्षेत्र बरकरार रहता है।
    सावधानी: इमेजिंग क्षेत्र के चारों ओर एक परिपत्र पैटर्न बनाने वाली छोटी बूंदों के लिए चिपकने वाले को सीमित करें। चिपकने वाले के संपर्क में तुरंत ऊतक को चित्रित नहीं किया जा सकता है। चिपकने वाला लागू करने से पहले ऊतक को सुखाने के लिए आवश्यक नहीं है।
    नोट:: किसी भी cyanoacrylate-आधारित चिपकने वाला इस प्रक्रिया के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। सर्जिकल चिपकने वाला बांझपन सुनिश्चित करता है। टर्मिनल प्रक्रियाओं के लिए, सभी उद्देश्य सुपर glues अच्छे परिणाम देते हैं।
  7. संदंश का उपयोग करके खिड़की की स्थिति और इसे जिगर के खिलाफ मजबूती से पकड़ें जब तक कि चिपकने वाला सूख न जाए (~ 2 मिनट)।
  8. पेरिटोनियम के नीचे खिड़की के किनारों को मोड़ें।
  9. एक सिरिंज के साथ, खिड़की के किनारों पर सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा जमा करें जो अब पेरिटोनियम के नीचे हैं। इसे खिड़की पर सुरक्षित करने के लिए संदंश के साथ पेरिटोनियम पर नीचे पुश करें।
  10. इसी तरह, पेरिटोनियम को सुरक्षित करने के लिए संदंश के साथ त्वचा पर नीचे धकेलने से पहले पेरिटोनियम पर सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा जमा करें।
    नोट: यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो जिगर के ऊतकों का एक परिपत्र क्षेत्र अब खिड़की के माध्यम से दिखाई देना चाहिए।
  11. एक रिम बनाने के लिए खिड़की के किनारों के चारों ओर गोंद लागू करें जो त्वचा को खिड़की पर वापस बढ़ने से रोकने में मदद करेगा।
    सावधानी: यदि प्रक्रिया बाँझ सर्जिकल तकनीकों का उपयोग करके की जाती है और सम्मिलन से पहले खिड़की को निष्फल किया जाता है, तो सर्जिकल चिपकने वाले के साथ घाव को सील करना संक्रमण से बचने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, सर्जिकल सम्मिलन या अपूर्ण बंद होने के दौरान उचित एसेप्टिक तकनीकों का पालन करने में विफलता से ओवरट या सबक्लिनिकल संक्रमण हो सकता है और ऊतक से सूख सकता है।

4. जिगर में इमेजिंग के लिए एक पार्श्व खिड़की सम्मिलित; पोर्टल नस में कैंसर कोशिकाओं के समवर्ती इंजेक्शन के साथ संगत (चित्रा 2)

  1. माउस को बाएँ पार्श्व डेक्यूबिटस स्थिति पर रखें
  2. बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग करके कॉस्टल आर्क के नीचे 3 मिमी दाएं फ्लैंक पर 10 मिमी चीरा बनाएं।
  3. त्वचा के एक 1 सेमी2 अनुभाग को हटा दें।
  4. त्वचा के खंड से थोड़ा छोटा पेरिटोनियम के एक खंड को हटाने के लिए बाँझ कैंची और संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें।
  5. एक 31 जी सिरिंज के साथ सर्जिकल चिपकने वाला वापस ले लो, क्षेत्र के किनारों के आसपास जिगर की सतह पर इसकी एक छोटी मात्रा लागू करने के लिए छवि की जा करने के लिए।
    सावधानी: इमेजिंग क्षेत्र के चारों ओर एक परिपत्र पैटर्न बनाने वाली छोटी बूंदों के लिए चिपकने वाले को सीमित करें। चिपकने वाले के संपर्क में तुरंत ऊतक को चित्रित नहीं किया जा सकता है।
    नोट:: किसी भी cyanoacrylate-आधारित चिपकने वाला इस प्रक्रिया के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। सर्जिकल चिपकने वाला बांझपन सुनिश्चित करता है। टर्मिनल प्रक्रियाओं के लिए, सभी उद्देश्य सुपर glues अच्छे परिणाम देते हैं।
  6. संदंश का उपयोग करके खिड़की की स्थिति और इसे जिगर के खिलाफ मजबूती से पकड़ें जब तक कि चिपकने वाला सूख न जाए (~ 2 मिनट)।
  7. पेरिटोनियम के नीचे खिड़की के किनारों को मोड़ें।
  8. एक सिरिंज के साथ, खिड़की के किनारों पर सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा जमा करें जो अब पेरिटोनियम के नीचे हैं। इसे खिड़की पर सुरक्षित करने के लिए संदंश के साथ पेरिटोनियम पर नीचे पुश करें।
  9. इसी तरह, पेरिटोनियम को सुरक्षित करने के लिए संदंश के साथ त्वचा पर नीचे धकेलने से पहले पेरिटोनियम पर सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा जमा करें।
    नोट: यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो जिगर के ऊतकों का एक परिपत्र क्षेत्र अब खिड़की के माध्यम से दिखाई देना चाहिए।
  10. एक रिम बनाने के लिए खिड़की के किनारों के चारों ओर गोंद लागू करें जो त्वचा को खिड़की पर वापस बढ़ने से रोकने में मदद करेगा।
  11. यदि एक पोर्टल शिरा इंजेक्शन की आवश्यकता है:
    1. माउस को सुपाइन स्थिति में रखें।
    2. त्वचा में xiphoid प्रक्रिया से नीचे शुरू एक 10 मिमी चीरा बनाओ।
    3. बाँझ कैंची और संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करते हुए, पेरिटोनियम में 10 मिमी चीरा बनाएं।
    4. बाँझ खारा में दो कपास swabs डुबकी.
    5. कपास swabs का उपयोग करने के लिए धीरे बाँझ धुंध पर आंत खींचने के लिए बाँझ खारा के साथ moistened, मोड़ या अन्यथा अभिविन्यास परेशान नहीं करने के लिए ध्यान रखना.
    6. पेट की गुहा से आंत को विस्थापित करते रहें जब तक कि पोर्टल नस पेट के दाईं ओर दिखाई न दे।
    7. जिगर में पोर्टल शिरा के प्रवेश के बिंदु पर 31-33 जी सुई 5-7 मिमी पुच्छल डालें, जिससे रक्त वाहिका के भीतर आगे बढ़ना सुनिश्चित हो जाता है और इसके माध्यम से नहीं।
    8. धीरे-धीरे कैंसर कोशिकाओं को इंजेक्ट करें (बाँझ पीबीएस के 100 μL में फिर से निलंबित)।
      नोट: इस प्रयोग के लिए amurine अग्नाशय के कैंसर सेल लाइन (उदाहरण के लिए, KPC-BL / 6-1199) को पूर्ण DMEM मीडिया में सुसंस्कृत किया जा सकता है और 1 x 105 कोशिकाओं को बाँझ पीबीएस के 100 μL में इंजेक्ट किया जा सकता है।
    9. रक्तस्राव को रोकने के लिए, सुई को वापस लेने के तुरंत बाद, 1-2 मिनट के लिए सर्जिकल स्पंज के एक छोटे से टुकड़े के साथ इंजेक्शन साइट पर कोमल दबाव लागू करें।
    10. दबाव जारी होने के बाद, हेमोस्टेसिस सुनिश्चित करने के लिए 1-2 मिनट के लिए साइट की निगरानी करें।
    11. नम कपास swabs का उपयोग करते हुए, अंग के शारीरिक अभिविन्यास के बाद पेट गुहा में आंत वापस.
    12. बाँझ संदंश का उपयोग करते हुए, माउस के उदर गुहा के बाईं ओर, पेरिटोनियम के नीचे खिड़की को तुरंत डालें।
    13. 4-0 रेशम टांके के साथ टांका और 7 मिमी स्टेनलेस स्टील घाव क्लिप के साथ मध्य रेखा चीरा स्टेपल.
    14. माउस को बाएँ पार्श्व decubitus स्थिति में ले जाएँ
    15. बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग करके त्वचा के माध्यम से कॉस्टल आर्क के नीचे दाएं फ्लैंक 3 मिमी पर 10 मिमी चीरा बनाएं।
    16. चीरा के चारों ओर त्वचा के एक 1 सेमी2 अनुभाग को हटा दें।
    17. त्वचा के खंड से थोड़ा छोटा पेरिटोनियम के एक खंड को हटाने के लिए बाँझ कैंची और संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें।
    18. खिड़की को जगह में चिपकाने से पहले जिगर के ऊपर जगह में खींचें, जैसा कि चरण 4.8-4.10 के तहत वर्णित है।

5. अग्न्याशय में इमेजिंग के लिए खिड़की सम्मिलित (चित्रा 3)

  1. माउस को दाहिने पार्श्व डेक्यूबिटस स्थिति पर रखें।
  2. बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग करके कॉस्टल आर्क के नीचे 3 मिमी बाएं फ्लैंक पर 10 मिमी चीरा बनाएं।
  3. चीरा के चारों ओर त्वचा के एक 1 सेमी2 अनुभाग को हटा दें।
  4. त्वचा के खंड से थोड़ा छोटा पेरिटोनियम के एक खंड को हटाने के लिए बाँझ कैंची और संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें।
  5. बाँझ खारा के साथ भिगोए गए बाँझ कपास स्वैब का उपयोग करके, अग्न्याशय की कल्पना करने के लिए धीरे से प्लीहा पर खींचें। चीरा के माध्यम से दिखाई देने वाले अधिक सतह क्षेत्र बनाने के लिए नम कपास स्वैब के साथ अग्न्याशय को पुनर्स्थापित करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: इस बिंदु पर, अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं को अग्न्याशय में ऑर्थोटोपिक रूप से इंजेक्ट किया जा सकता है यदि यह प्रयोगात्मक डिजाइन का एक हिस्सा है।
  6. एक 31 जी सिरिंज के साथ सर्जिकल चिपकने वाला वापस ले लो, क्षेत्र के किनारों के आसपास अग्न्याशय की सतह पर इसकी एक छोटी मात्रा लागू करने के लिए imaged किया जा करने के लिए।
    सावधानी: इमेजिंग क्षेत्र के चारों ओर एक परिपत्र पैटर्न बनाने वाली छोटी बूंदों के लिए चिपकने वाले को सीमित करें। चिपकने वाले के संपर्क में तुरंत ऊतक को चित्रित नहीं किया जा सकता है।
  7. संदंश का उपयोग करके खिड़की की स्थिति और इसे अग्न्याशय के खिलाफ मजबूती से रखें जब तक कि चिपकने वाला सूख न जाए (~ 2 मिनट)।
  8. पेरिटोनियम के नीचे खिड़की के किनारों को मोड़ें।
  9. एक सिरिंज के साथ, खिड़की के किनारों पर सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा जमा करें जो अब पेरिटोनियम के नीचे हैं। इसे खिड़की पर सुरक्षित करने के लिए संदंश के साथ पेरिटोनियम पर नीचे पुश करें।
  10. इसी तरह, पेरिटोनियम को सुरक्षित करने के लिए संदंश के साथ त्वचा पर नीचे धकेलने से पहले पेरिटोनियम पर सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा जमा करें।
    नोट: यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो अग्न्याशय ऊतक का एक परिपत्र क्षेत्र अब खिड़की के माध्यम से दिखाई देना चाहिए।
  11. एक रिम बनाने के लिए खिड़की के किनारों के चारों ओर गोंद लागू करें जो त्वचा को खिड़की पर वापस बढ़ने से रोकने में मदद करेगा।

6. स्तन ग्रंथि में इमेजिंग के लिए खिड़की सम्मिलित (चित्रा 4)

  1. माउस को सुपाइन स्थिति पर रखें।
  2. बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग करके वंक्षण निपल्स में से एक के लिए एक 10 मिमी चीरा औसत दर्जे का बनाओ।
  3. स्तन ग्रंथि के ऊपर त्वचा के एक 0.5 सेमी2 अनुभाग को हटा दें।
  4. पालन को बाधित करने के लिए दो सतहों के बीच कैंची फैलाकर त्वचा से स्तन ग्रंथि को सावधानीपूर्वक अलग करने के लिए बाँझ कैंची की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें।
    नोट: वंक्षण स्तन ग्रंथि क्षेत्र की इमेजिंग की सुविधा के लिए, स्तन ग्रंथि के ऊपर त्वचा के एक हिस्से को विच्छेदित करने के लिए सावधान रहें, लेकिन हिंद पैर से बेहतर है, इसलिए खिड़की माउस की गतिशीलता को सीमित नहीं करती है।
  5. एक 31 जी सिरिंज के साथ सर्जिकल चिपकने वाला वापस ले लो, क्षेत्र के किनारों के चारों ओर स्तन ग्रंथि की सतह पर इसकी एक छोटी मात्रा लागू करने के लिए छवि की जा करने के लिए।
    सावधानी: इमेजिंग क्षेत्र के चारों ओर एक परिपत्र पैटर्न बनाने वाली छोटी बूंदों के लिए चिपकने वाले को सीमित करें। चिपकने वाले के संपर्क में तुरंत ऊतक को चित्रित नहीं किया जा सकता है।
  6. संदंश का उपयोग करके खिड़की की स्थिति और इसे स्तन ग्रंथि के खिलाफ मजबूती से पकड़ें जब तक कि चिपकने वाला सूख न जाए (~ 2 मिनट)।
    नोट: स्तन ग्रंथि ऊतक का एक परिपत्र क्षेत्र अब खिड़की के माध्यम से दिखाई देना चाहिए यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है।
  7. त्वचा के नीचे खिड़की के किनारों को मोड़ें।
  8. एक सिरिंज के साथ, खिड़की के किनारों पर सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा जमा करें जो अब त्वचा के नीचे हैं। खिड़की के लिए त्वचा को सुरक्षित करने के लिए संदंश के साथ त्वचा पर नीचे पुश।
  9. एक रिम बनाने के लिए खिड़की के किनारों के चारों ओर गोंद लागू करें जो त्वचा को खिड़की पर वापस बढ़ने से रोकने में मदद करेगा।

7. पोस्ट सर्जिकल वसूली

  1. माउस को पर्याप्त घोंसले के शिकार की सामग्री के साथ एक साफ वसूली पिंजरे में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पिंजरे का हिस्सा हीटिंग पैड पर आराम कर रहा है।
  2. माउस की लगातार निगरानी करें जब तक कि यह सचेत और मोबाइल न हो।
  3. यदि आवश्यक हो, तो प्री-एम्प्टिव खुराक के बाद एनाल्जेसिक 12 घंटे की एक अतिरिक्त खुराक प्रदान करें।
    नोट: अतिरिक्त एनाल्जेसिया आम तौर पर अनावश्यक है, लेकिन एक पशुचिकित्सक से परामर्श करें यदि माउस संकट के संकेत दिखाता है (जैसे कि वापस झुका हुआ, अव्यवस्थित फर, या भोजन में रुचि खो दी)। संक्रमण या अन्य प्रतिकूल प्रभावों के संकेतों के लिए सर्जरी के बाद पहले 3 दिनों के लिए माउस की दैनिक निगरानी करें। 2% से कम चूहों को पशु चिकित्सा ध्यान या इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है, आमतौर पर खिड़की की आंशिक टुकड़ी के कारण। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वेंट्रल लिवर इमेजिंग खिड़कियों वाले पुरुष चूहों के लिए, चूहों के बीच लड़ाई के परिणामस्वरूप खिड़कियों की टुकड़ी हो सकती है। यह चूहों को अलग से आवास देकर टाला जाता है।

8. खिड़की के माध्यम से इमेजिंग

  1. 4% (v/ v) isoflurane का उपयोग करके एक प्रेरण कक्ष में माउस को एनेस्थेटिक करें।
  2. नेत्र स्नेहक को सूखने और आघात को रोकने से रोकने के लिए आंखों पर लागू करें।
  3. माउस को प्रेरण कक्ष से माइक्रोस्कोप चरण में ले जाएँ. माउस को संज्ञाहरण नाक के मुखौटे में रखें, और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान रखरखाव संज्ञाहरण के लिए आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को लगभग 1-1.5% तक कम करें।
  4. सांस की दर की निगरानी करने के लिए माउस के नीचे एक दबाव पैड सेंसर रखें और माउस को नरम सर्जिकल टेप का उपयोग करके मंच पर ठीक करें।
  5. इमेजिंग सत्र के दौरान शरीर के तापमान की निगरानी करने के लिए एक रेक्टल थर्मामीटर डालें।
  6. गर्म पैड को चालू करें, यह सुनिश्चित करने के लिए माउस की बारीकी से निगरानी करें कि शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक न हो।
  7. माउस की सांस दर की निगरानी करने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। इष्टतम दर ~ 1 सांस / सेकंड है। आवश्यकतानुसार संज्ञाहरण समायोजित करें।
  8. प्रत्येक इमेजिंग सत्र से पहले, किसी भी अवशिष्ट लेंस विसर्जन माध्यम और मलबे से खिड़की को धीरे-धीरे 70% इथेनॉल (वी / वी) में डूबे हुए कपास झाड़ू के साथ पोंछकर साफ करें।
  9. पानी विसर्जन लेंस का उपयोग करते समय, बुलबुले से बचने के लिए खिड़की पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें।
    नोट: आसुत पानी का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन इमेजिंग के दौरान पुन: आवेदन की आवश्यकता हो सकती है।
  10. इमेजिंग के लिए इष्टतम गहराई खोजने के लिए, सबसे पहले, ग्रिड का पता लगाएं और इसे फोकस में रखें।
  11. ग्रिड के निचले भाग को 0 पर सेट करके अनुमानित ऊतक इमेजिंग गहराई निर्धारित करें। यह जानकारी बाद के इमेजिंग सत्रों में संबंधित जेड विमान का पता लगाने के लिए आवश्यक है।
  12. एकाधिक इमेजिंग सत्रों पर एक ही स्थान की पहचान करने के लिए, ग्रिड पर वर्गों को संदर्भ बिंदु के रूप में उपयोग करें। इमेजिंग के दौरान, ग्रिड के अभिविन्यास और दृश्य के प्रत्येक क्षेत्र के ग्रिड के भीतर स्थान को नोट करें (उदाहरण के लिए, शीर्षसे 2 पंक्ति , बाईं ओर से 4वां वर्ग)।
  13. क्रमिक इमेजिंग सत्रों के दौरान, विशिष्ट ग्रिड क्षेत्रों में वापस नेविगेट करने के लिए ग्रिड का उपयोग करें - और इस प्रकार इमेजिंग फ़ील्ड।
  14. प्रत्येक इमेजिंग सत्र के बाद, 70% इथेनॉल (v / v) में डूबे कपास झाड़ू के साथ खिड़की को धीरे से पोंछकर किसी भी अवशिष्ट लेंस विसर्जन माध्यम और मलबे को हटा दें।

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Representative Results

इमेजिंग खिड़कियों के माध्यम से इंट्रावाइटल इमेजिंग का उपयोग घंटों से हफ्तों की अवधि में एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर सेलुलर और आणविक घटनाओं की एक विस्तृत सरणी का निरीक्षण, ट्रैक और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इमेजिंग विंडो के लिए आदर्श विशेषताओं में शामिल हैं: ए) माउस की भलाई और ऊतक के शरीर विज्ञान पर सीमित प्रभाव; ख) स्थायित्व; ग) सम्मिलन की सादगी; और घ) एक ही क्षेत्र के दोहराए गए इमेजिंग के लिए स्पष्ट स्थलों। परिणाम एक बहुमुखी, अक्रिय सिलिकॉन विंडो है जिसे आसानी से उत्पादित और डाला जाता है और जिसे कई इमेजिंग सत्रों की अवधि में देखने के एक ही क्षेत्र का पता लगाने के लिए ग्रिड के साथ आउटफिट किया जा सकता है।

खिड़की पीडीएमएस से बनी है, जो एक सस्ती, लचीली और स्पष्ट सामग्री है। विंडोज को उन आपूर्तियों के साथ कास्ट किया जा सकता है जो अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए खरीद के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध हैं। इन उद्देश्यों के लिए, परिपत्र मोल्ड्स (22 मिमी व्यास) जो पहले से ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 24 अच्छी तरह से प्लेटों के ढक्कन पर उकेरे गए हैं, अच्छी तरह से काम करते हैं। प्रति इकाई क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले बहुलक की मात्रा को अलग करके, खिड़की की मोटाई को समायोजित करना संभव है। इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन पर खिड़की की मोटाई के प्रभाव को दस्तावेज करने के लिए, 40 एनएम फ्लोरोसेंट माइक्रोसेफर्स का एक बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) विश्लेषण आमतौर पर इंट्रावाइटल इमेजिंग खिड़कियों (0.17 मिमी मोटी) के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास कवरलिप्स के लिए अलग-अलग मोटाई की पीडीएमएस खिड़कियों के माध्यम से इमेजिंग की तुलना करने के लिए आयोजित किया गया था। इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सेट अप को दोहराने के लिए, पीएसएफ इमेजिंग को एक ही दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप और पानी के विसर्जन लेंस का उपयोग करके किया गया था, जिसमें अल्ट्रासाउंड जेल एक विसर्जन माध्यम के रूप में लागू किया गया था।

पार्श्व विमानों में पीएसएफ के फिट के माध्यम से गणना की गई सिग्नल तीव्रता की आधी अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) पर पूर्ण चौड़ाई 100 मिलीग्राम पीडीएमएस (चित्रा 5ए, बी) के साथ डाली गई पीडीएमएस खिड़कियों के लिए ग्लास के बराबर थी। ग्लास कवरलिप्स की तुलना में पार्श्व रिज़ॉल्यूशन को 150-250 मिलीग्राम पीडीएमएस (चित्रा 5 ए, बी) के साथ खिड़कियों के लिए कम कर दिया गया था। जेड-अक्ष छवि विमान में, 100-200 मिलीग्राम बहुलक के साथ पीडीएमएस खिड़कियों ने ग्लास कवरलिप्स (चित्रा 5 सी) की तुलना में बेहतर प्रदर्शन किया। ऑप्टिकल स्पष्टता पीडीएमएस के 300 मिलीग्राम के साथ खिड़कियों में खो गई थी, जिससे माप अविश्वसनीय हो गए (आंकड़े 5 ए-सी)। एफडब्ल्यूएचएम मूल्यों का एक्स / वाई अनुपात किसी भी मोटाई के ग्लास और पीडीएमएस के बीच काफी भिन्न नहीं था, हालांकि 200-250 मिलीग्राम बहुलक के साथ डाली गई खिड़कियों के लिए अनुपात विशेष रूप से विसर्जन माध्यम (चित्रा 5 डी) के रूप में अल्ट्रासाउंड जेल का उपयोग करके 1 से विचलित हो गया। हालांकि, 200 मिलीग्राम के साथ खिड़की के लिए एक विसर्जन माध्यम के रूप में पानी का उपयोग करते समय, समरूपता से विचलन बहुत कम स्पष्ट था। इस मोटाई पर, बहुलक में aberrations के कारण विचलन इसलिए मामूली होने की संभावना है। प्रत्येक माइक्रोस्फीयर के लिए पीक प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों को भी एकत्र किया गया था और दिखाया गया था कि ग्लास और पीडीएमएस ने तुलनात्मक रूप से प्रदर्शन किया था, हालांकि ग्लास (चित्रा 5I) के माध्यम से उच्चतम संकेत दर्ज किया गया था। PDMS विंडो की इष्टतम मोटाई विशिष्ट अनुप्रयोगों और इमेजिंग सिस्टम पर निर्भर करेगी। अधिकांश उद्देश्यों के लिए, 22 मिमी व्यास परिपत्र खिड़की के लिए 200 मिलीग्राम बहुलक समाधान खिड़की की मजबूती और ऑप्टिकल स्पष्टता के बीच एक इष्टतम समझौता है। दरअसल, 200 मिलीग्राम से कम के साथ डाली गई खिड़कियां अधिक ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट थीं, जिसमें एफडब्ल्यूएचएम मूल्य कांच के समान थे, लेकिन कभी-कभी सर्जिकल आरोपण के दौरान फाड़ दिया जाता था, जबकि 200 मिलीग्राम (>100 चूहों में) का उपयोग करके खिड़की की क्षति का कोई उदाहरण नहीं देखा गया था।

सामग्री गुणों में इन अंतरों को मापने के लिए, पीडीएमएस खिड़कियों (200 मिलीग्राम और 150 मिलीग्राम) को सामग्री की विफलता तक 1 एन / एस के लोड नियंत्रण प्रोफ़ाइल के तहत एक सर्वोहाइड्रोलिक सामग्री परीक्षण मशीन में लोड किया गया था (चित्रा 5 जे)। बल और विस्थापन मूल्यों को 100 हर्ट्ज की आवृत्ति पर मापा गया था। बल-विस्थापन डेटा को तब समीकरणों का उपयोग करके तनाव-तनाव में परिवर्तित किया गया था:

σ = F / A (1)

π = ΠL / L0 (2)

जहां σ तनाव (Pa) है, F बल (N) है, A खिड़की का क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र है, Π स्ट्रेन है, ΠL विस्थापन है, और L0 खिड़की की मोटाई है। सामग्री की क्रूरता तनाव-तनाव वक्र के तहत योग क्षेत्र की गणना करके निर्धारित की गई थी। एक सामग्री की क्रूरता प्लास्टिक को विकृत करने और फ्रैक्चर से पहले प्रक्रिया में ऊर्जा को अवशोषित करने की अपनी क्षमता को संदर्भित करती है - प्रत्यारोपित खिड़कियों के लिए एक महत्वपूर्ण संपत्ति13। इमेजिंग प्रयोगों के दौरान टिप्पणियों के साथ समझौते में, पीडीएमएस के 200 मिलीग्राम के साथ डाली गई खिड़कियों में 150 मिलीग्राम (चित्रा 5K) के साथ डाली गई खिड़कियों की तुलना में काफी अधिक क्रूरता होती है और इसलिए तोड़ने के लिए कम प्रवण होती है।

इसके बाद, 200 मिलीग्राम के साथ डाली गई पसंदीदा पीडीएमएस खिड़कियों के यंग के मापांक (ई) को निर्धारित किया गया था और तनाव-तनाव वक्र के रैखिक क्षेत्र को निकालने और हुक के कानून का उपयोग करके ढलान का निर्धारण करके मानक ग्लास कवरलिप्स की तुलना में:

σ = Eπ (3)

ग्लास खिड़कियों का यंग का मापांक पीडीएमएस की तुलना में काफी अधिक था, जिसकी उम्मीद की गई थी क्योंकि ग्लास पीडीएमएस (चित्रा 5 एल) की तुलना में सामग्री की ताकत में बहुत अधिक कठोर है। इस प्रकार, हालांकि ग्लास अपने अधिक से अधिक यंग के मापांक के आधार पर एक मजबूत सामग्री है, 200 मिलीग्राम पीडीएमएस खिड़कियों की अधिक क्रूरता का समर्थन करता है कि उन्हें तोड़ने के जोखिम के बिना लंबी अवधि के लिए लागू किया जा सकता है और दूसरी सर्जिकल प्रक्रिया या इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है।

सिलिकॉन खिड़कियों का एक प्रमुख लाभ बहुमुखी प्रतिभा है। महत्वपूर्ण रूप से, खिड़की को शल्य चिकित्सा से डालने की प्रक्रिया को आसानी से विभिन्न शारीरिक स्थानों के अनुरूप बनाया जा सकता है। सर्जरी के लिए अनुकूलन इस तथ्य से सुविधाजनक हैं कि खिड़कियों को आसानी से सर्जिकल कैंची के साथ आकार दिया जा सकता है और खिड़कियों को ऊतक / ब्याज के अंग की सतह और त्वचा से चिपकाया जाता है, पूरी तरह से टांके की आवश्यकता को समाप्त कर देता है। इस तरह से खिड़कियों का सफल सम्मिलन जिगर, अग्न्याशय और स्तन ग्रंथि के लिए प्राप्त किया गया है (आंकड़े 6 ए-सी)। विशेष रूप से, जिगर इमेजिंग के लिए या तो वेंट्रल या पार्श्व खिड़कियों को प्रत्यारोपित करने के लिए दो अलग-अलग प्रोटोकॉल विकसित किए गए थे। चित्र 1 एक वेंट्रल विंडो सम्मिलित करने के लिए चरणों को दिखाता है। इस प्रक्रिया को अन्य पेट के अंगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और सबसे बड़ा इमेजेबल सतह क्षेत्र उत्पन्न करेगा। हालांकि, जब तक कि एक बड़े (>1 सेमी2) इमेजेबल क्षेत्र की आवश्यकता नहीं होती है, तब तक माउस के दाहिने फ्लैंक में एक पार्श्व खिड़की डालने (चित्रा 2) को गति कलाकृतियों को कम करने के लिए पसंद किया जाता है, उदाहरण के लिए, श्वसन और पेरिस्टालसिस के कारण। इसके अलावा, पार्श्व इमेजिंग विंडो डालने के लिए सर्जिकल प्रक्रिया यकृत मेटास्टेसिस के विकास को प्रयोगात्मक रूप से मॉडल करने के लिए पोर्टल नस में कैंसर कोशिकाओं के एक समवर्ती इंजेक्शन के साथ संगत है। इस प्रकार, चूहों को दो अलग-अलग लोगों के बजाय एक ही प्रक्रिया से गुजरना पड़ सकता है जब पोर्टल शिरा इंजेक्शन और पेट इमेजिंग विंडो सम्मिलन एक ही जानवर में आवश्यक होते हैं। माउस के बाएं फ्लैंक पर अग्न्याशय पर एक खिड़की को प्रत्यारोपित करने के लिए एक अनुरूप प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है (चित्रा 3)। खिड़की को चमड़े के नीचे के ऊतकों पर भी डाला जा सकता है, यानी, सामान्य स्तन ग्रंथियों, साथ ही साथ पहले से ही स्थापित सहज या ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित स्तन ट्यूमर (चित्रा 4)। वैकल्पिक रूप से, कैंसर कोशिकाओं को प्राथमिक ट्यूमर के विकास का अनुदैर्ध्य रूप से पालन करने के लिए खिड़की के माध्यम से स्तन ग्रंथि में इंजेक्ट किया जा सकता है, क्योंकि सुई खिड़की की अखंडता से समझौता किए बिना पीडीएमएस फिल्म को पंचर कर सकती है।

उनके कम वजन और लचीलेपन के कारण, सिलिकॉन खिड़कियां माउस की गतिशीलता में हस्तक्षेप नहीं करती हैं (मूवी 1)। इस प्रकार, सिलिकॉन खिड़कियां कांच की खिड़कियों से जुड़ी प्रमुख बाधाओं को दूर करती हैं, जैसे कि नाजुकता, जटिल सुटिंग, और पशु गतिशीलता पर प्रभाव। इसके बजाय, सिलिकॉन खिड़कियों से जुड़ी मुख्य सीमा खिड़की के नीचे उपकला का पुनरुत्थान है। हालांकि, जब त्वचा की एक उचित मात्रा को हटा दिया जाता है और घाव को गोंद के साथ पूरी तरह से सील कर दिया जाता है, तो पुन: उपकलाकरण सीमित होता है, और इमेजिंग लंबे समय तक जारी रह सकती है (35 दिनों तक परीक्षण किया गया है, चित्रा 6 डी)। खिड़की डालने के बाद, माउस को लगभग एक महीने के लिए अनुदैर्ध्य रूप से चित्रित किया जा सकता है या जब तक कि सर्जिकल चिपकने वाला विफल नहीं हो जाता है या फिर से उपकलाकरण नहीं होता है। छोटे दैनिक इमेजिंग सत्र (~ 60 मिनट) या कम लगातार लेकिन लंबे समय तक इमेजिंग सत्रों को संज्ञाहरण-प्रेरित प्रतिकूल प्रभावों से बचने के लिए पसंद किया जाता है। विंडो-असर जानवरों को किसी भी इंट्रावाइटल इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म पर चित्रित किया जा सकता है, दोनों एकल-फोटॉन या मल्टीफोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से, मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके (देखें, उदाहरण के लिए, 14)। प्रत्येक इमेजिंग सत्र से पहले और बाद में, 70% इथेनॉल (वी / वी) में डूबे कपास झाड़ू के साथ पोंछकर खिड़की को ग्रिम और मलबे से साफ करने की सलाह दी जाती है।

समय के साथ एक ही स्थान को ट्रैक करने के लिए, स्टेनलेस स्टील ग्रिड को खिड़की के भीतर एम्बेडेड किया जा सकता है। चित्रा 7A कस्टम के लिए विनिर्देशों से पता चलता है बनाया, लेजर उत्कीर्ण ग्रिड यहाँ में इस्तेमाल किया. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए वाणिज्यिक ग्रिड भी इस आवेदन के लिए उपयुक्त हैं। ग्रिड कास्टिंग प्रक्रिया के दौरान खिड़की के भीतर एम्बेडेड है और नग्न आंखों (चित्रा 7 बी) और माइक्रोस्कोप (चित्रा 7 सी) के ओकुलर के माध्यम से इमेजिंग क्षेत्र पर स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। क्योंकि खिड़की अंग की सतह से चिपकी हुई है, ग्रिड के सापेक्ष इमेजिंग फ़ील्ड की स्थिति स्थिर है। इमेजिंग के दौरान, ग्रिड के अभिविन्यास और दृश्य के प्रत्येक क्षेत्र के ग्रिड के भीतर स्थान पर ध्यान दें जो चित्रित किया गया है (उदाहरण के लिए, शीर्षसे 2 पंक्ति , बाईं ओर से 4वां वर्ग)। अगला, विशिष्ट ग्रिड क्षेत्रों पर वापस नेविगेट करने के लिए ग्रिड का उपयोग करें - और इस प्रकार इमेजिंग फ़ील्ड - क्रमिक इमेजिंग सत्रों के दौरान।

ग्रिड एक इमेजिंग सत्र के दौरान इमेजिंग क्षेत्र को संरेखित करने के लिए भी उपयोगी है जब ऊतक धीरे-धीरे बहाव करता है, उदाहरण के लिए, श्वसन या पेरिस्टालसिस। एक कठोर रिम के साथ अधिकांश इमेजिंग खिड़कियों को इमेजिंग के दौरान एक धारक से जोड़ा जा सकता है, जिससे इमेजिंग क्षेत्र में स्थिरता जुड़ सकती है। चूंकि लचीली खिड़कियों को सीधे स्थिर नहीं किया जा सकता है, सर्जिकल टेप का उपयोग खिड़की वाले शरीर के अनुभाग को स्थिर करने के लिए किया जाता है, और इमेजिंग क्षेत्र को संबंधित ग्रिड वर्ग या पहले से पहचाने गए ऊतक स्थलों (जैसे, संवहनी स्थलों) के केंद्र में परिभाषित अंतराल (आमतौर पर हर 30 मिनट) पर फिर से संरेखित किया जाता है। दृश्य के क्षेत्र के माइक्रोस्कोपिक स्थानांतरण के लिए आगे बहाव सुधार कोड के माध्यम से पोस्ट-अधिग्रहण चरण में डिजिटल रूप से किया जाता है जो पता लगाए गए ऊतक पैटर्न (पूरक कोड 1-2) के आधार पर फ्रेम को फिर से संरेखित करता है।

यह सत्यापित करने के लिए कि खिड़की किसी भी अतिरंजित प्रणालीगत प्रतिकूल प्रतिक्रिया का कारण नहीं बनती है, उन जानवरों के वजन की निगरानी की गई थी जो खिड़की के आरोपण और अनुपचारित आयु-मिलान नियंत्रण से गुजरे थे। सर्जरी से जुड़े प्रारंभिक वजन घटाने के बाद, सम्मिलित खिड़कियों वाले अधिकांश चूहों ने समय के साथ वजन बढ़ाना जारी रखा, यह दर्शाता है कि खिड़की सम्मिलन अच्छी तरह से सहन किया जाता है (आंकड़े 8 ए-सी)। जिगर और स्तन ग्रंथि खिड़कियों के लिए, सर्जरी से 5 दिनों के भीतर सामान्य वजन फिर से प्राप्त हो जाता है। अग्न्याशय पर खिड़की के आरोपण के बाद पोस्ट-ऑपरेटिव वसूली धीमी होती है, चूहों के साथ 14 दिनों के भीतर पूर्व-ऑपरेटिव वजन पर लौटने के साथ। यह अवलोकन सर्जरी के समय अग्न्याशय के हेरफेर से जुड़े अपेक्षित प्रभावों के अनुरूप है। ध्यान दें कि उन मामलों में भी जब वजन घटाने मानवीय समापन बिंदु के लिए दहलीज तक नहीं पहुंचते हैं, तो चूहे जो पूर्व-ऑपरेटिव शरीर के वजन को फिर से प्राप्त नहीं करते हैं (सभी चूहों का <5%), चित्रा 8 बी में * द्वारा इंगित माउस द्वारा उदाहरण दिया जाता है) आमतौर पर इमेजिंग प्रयोगों से सेंसर किया जाता है। इसके अलावा, खिड़की सम्मिलन के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर निर्धारित सफेद रक्त कोशिका की गिनती, नियंत्रण की तुलना में लगभग किसी भी खिड़की-असर वाले चूहों में नहीं बदली गई थी और समय के साथ काफी नहीं बदली (चित्रा 8 डी), यह सुझाव देते हुए कि खिड़की ने प्रमुख प्रणालीगत सूजन का कारण नहीं बनाया।

अगला, खिड़की और गोंद के लिए स्थानीय ऊतक प्रतिक्रिया की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए, चूहों को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए खिड़की के सर्जिकल सम्मिलन के बाद 3, 14, और 28 (स्तन ग्रंथि खिड़कियां) या 35 दिनों (यकृत और अग्न्याशय खिड़कियों) पर euthanized किया गया था। हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग वाले जिगर वर्गों के मूल्यांकन ने सतही (20-80 μm) दिखाया, अधिकांश चूहों के लिए खिड़कियों के नीचे न्यूनतम से हल्के कैप्सुलर दानेदार ऊतक गठन (3 में से 2 चूहों का मूल्यांकन दिन 3 में किया गया, और 14 वें दिन में मूल्यांकन किए गए 3 में से 2)। ये घाव फोकल (लंबाई में 1-3 मिमी) थे, जो लगभग गोंद परत की चौड़ाई (चित्रा 8 ई) के अनुरूप थे। 35 दिनों के बाद, अधिकांश चूहों (दो अलग-अलग प्रयोगों में मूल्यांकन किए गए 6 में से 4) ने कोई दानेदार ऊतक प्रस्तुत नहीं किया, जबकि कुछ (6 में से 2) में मध्यम फोकल कैप्सुलर स्केलेरोसिस और डेस्मोप्लासिया (25-250 μm की गहराई पर) था। दिलचस्प बात यह है कि नौ चूहों के समूह में किसी भी समय खिड़की के नीचे सीधे अग्न्याशय की सतह पर कोई महत्वपूर्ण घाव नहीं देखा गया था (चित्रा 8 जी)। हालांकि, कुछ चूहों ने अग्नाशय में शोष के क्षेत्रों और पेट की चर्बी (स्टीटाइटिस) में सूजन का प्रदर्शन किया, जो हेरफेर-प्रेरित क्षति के अनुरूप है। स्तन ग्रंथि के लिए, खिड़की के आरोपण के बाद दिन 3 पर, 3 चूहों में से 3 में या तो दानेदार ऊतक था जो ग्रंथि की सतह के साथ दिखाई देने वाले एक चिकित्सा चीरा या वसा ऊतक में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया की याद दिलाता था; दिन 14 में, मूल्यांकन किए गए 3 चूहों में से 3 में दानेदार ऊतक था। ये घाव फिर से फोकल और लंबाई में 1-3 मिमी थे (चित्रा 8I)। स्तन ग्रंथि खिड़कियों के साथ चूहों को सर्जरी के 28 दिनों के बाद euthanized कोई स्पष्ट हिस्टोलॉजिकल असामान्यताओं को दिखाया।

इस विश्लेषण से पता चलता है कि खिड़की परीक्षण किए गए अंगों (जिगर, अग्न्याशय, स्तन ग्रंथि) की समग्र शारीरिक वास्तुकला से समझौता नहीं करती है। जिगर और स्तन ग्रंथि की सतह पर पाए जाने वाले प्रतिक्रियाशील ऊतक संभवतः गोंद की प्रतिक्रिया थी और चिपकने वाले के संपर्क में तुरंत ऊतक तक सीमित थी। सामान्य ऊतक आसानी से आसन्न पाया जा सकता है (< 100 μm) उन क्षेत्रों में प्रतिक्रियाशील ऊतक के लिए जो गोंद के संपर्क में नहीं आते हैं (चित्रा 8ई, आई), और ऊतक सूजन, इसलिए, स्वस्थ ऊतक क्षेत्रों की इमेजिंग में हस्तक्षेप नहीं करती है। इसके अलावा, ऊतक प्रतिक्रिया की संभावना प्रतिवर्ती है क्योंकि अधिकांश चूहों (9 चूहों में से 8, सभी ऊतक स्थानों में) ने देर से समय बिंदुओं (28 या 35 दिनों) पर कोई महत्वपूर्ण घाव नहीं दिखाया, हालांकि प्रत्यक्ष पुष्टि है कि ऊतक प्रतिक्रिया का समाधान व्यक्तिगत चूहों में अनुदैर्ध्य माप के बिना प्राप्त करना मुश्किल होगा।

CD45, CD68, और myeloperoxidase (MPO) के लिए मल्टीप्लेक्स्ड इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग को क्रमशः ल्यूकोसाइट्स, मोनोसाइट्स / मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल की घुसपैठ को चिह्नित करने के लिए भी किया गया था। दानेदार ऊतक और स्टीटाइटिस से जुड़े प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ में वृद्धि स्तन ग्रंथि और यकृत में देखी गई थी, लेकिन अग्न्याशय में नहीं (चित्रा 8एफ, एच, जे)।  ध्यान दें, इन परिवर्तनों की संभावना क्षणिक थी क्योंकि प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ अंतिम समय बिंदुओं पर अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में तुलनीय थी (स्तन ग्रंथि खिड़कियों के लिए 28 दिन और जिगर और अग्न्याशय खिड़कियों के लिए 35 दिन)।

जिगर को साइट के रूप में चुना गया था ताकि यह पता लगाया जा सके कि विंडो सम्मिलन और इमेजिंग इमेजिंग का उपयोग करके महत्वपूर्ण स्थानीय प्रतिरक्षा घुसपैठ का कारण बना या नहीं। ऐसा करने के लिए, सी-एफएमएस-ईजीएफपी (मैकग्रीन) चूहों15, जिसमें माइलॉयड कोशिकाओं (ज्यादातर मैक्रोफेज) को हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किया जाता है, का उपयोग किया गया था। जिगर खिड़कियों को तीन सी-एफएमएस-ईजीएफपी चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था और उन्हें देखने के एक ही क्षेत्र का पता लगाने के लिए ग्रिड का उपयोग करके सर्जरी के बाद 1, 3 और 5 दिनों में चित्रित किया गया था। इमेजिंग क्षेत्र में मौजूद मैक्रोफेज की संख्या विंडो सम्मिलन (चित्रा 8K) के बाद समय के साथ काफी नहीं बदली।

इसके बाद, खिड़की को सेलुलर स्तर (यानी, आंदोलन, प्रसार, सेल-सेल संपर्क) और ऊतक स्तर (यानी, अग्न्याशय में ट्यूमर की वृद्धि, स्तन ग्रंथि involution के दौरान प्रतिरक्षा घुसपैठ, और यकृत मेटास्टेसिस) पर जैविक प्रक्रियाओं के एक विविध सेट को इमेजिंग करके कार्यात्मक रूप से परीक्षण किया गया था। अग्न्याशय इमेजिंग के लिए एक आसानी से सुलभ स्थान नहीं है। यह प्रदर्शित करने के लिए कि इस अंग में कैंसर सेल गतिशीलता को कैप्चर करने के लिए खिड़की का उपयोग कैसे किया जा सकता है, खिड़कियों को छह C57BL / 6J चूहों के अग्न्याशय पर एक ही समय में केपीसी-बीएल / 6-1199 कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के रूप में डाला गया था, एक अग्नाशयी कैंसर सेल लाइन जो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले केपीसी (क्रासएलएसएल- जी 12 डी / + ;p 53एलएसएल-आर 172एच) से व्युत्पन्न होती है; Pdx1-Cre) अग्नाशय के कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना किए जाने के लिए, केपीसी-बीएल / 6-1199 कोशिकाओं को डॉक्सीसाइक्लिन-इनड्यूसिबल एन्हांस्ड जीएफपी (आईजीएफपी -1199 कोशिकाओं) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया था। इंजेक्शन के छह दिन बाद, चूहों को अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं में हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की अभिव्यक्ति को ट्रिगर करने के लिए एक डॉक्सीसाइक्लिन आहार पर रखा गया था। चित्रा 9 इंजेक्शन और विंडो सम्मिलन के बाद 11 और 14 दिनों पर iGFP-1199 कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किए गए माउस ऑर्थोटोपिक रूप से प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। मूवी 2 खिड़की सम्मिलन के बाद 11 वें दिन 2-एच इमेजिंग सत्र के एक अंश में आईजीएफपी -1199 ट्यूमर किनारे को दिखाता है, सिलिकॉन खिड़कियों का उपयोग करके अग्न्याशय में सेल झिल्ली प्रक्षेपण की गतिशीलता को पकड़ने की क्षमता को दर्शाता है।

सिलिकॉन विंडो का उपयोग समय के साथ गतिशील प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ को पकड़ने के लिए भी किया जा सकता है। इसे स्पष्ट करने के लिए, स्तन ग्रंथि खिड़कियों को स्तनपान कराने वाले ACTB-ECFP (Tg (CAG-ECFP)CK6Nagy) में insterted किया गया था; LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) चूहों को दूध पिलाने के तुरंत बाद। इन चूहों में, सभी कोशिकाएं, लेकिन सबसे अधिक उपकला कोशिकाएं, बीटा एक्टिन प्रमोटर द्वारा संचालित सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) को व्यक्त करती हैं, और माइलॉयड कोशिकाएं - मुख्य रूप से न्यूट्रोफिल, लेकिन मैक्रोफेज भी - लाइसोजाइम एम प्रमोटर द्वारा संचालित ईजीएफपी द्वारा लेबल की जाती हैं। चूहों को खिड़की सम्मिलन के बाद दिन 2 और 4 पर चित्रित किया गया था, स्तन ग्रंथि involution की प्रक्रिया के दौरान, जब स्तन ग्रंथि ऊतक अपनी पूर्व-गर्भावस्था की स्थिति में लौटना शुरू कर देता है। ImageJ के लिए दो मैक्रोज़ को गति कलाकृतियों को कम करने और विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार करने के लिए विकसित किया गया था, एक 4-आयामी इंट्रावाइटल वीडियो (पूरक कोड 1) में जेड विमानों को संरेखित करता है और दूसरा सांस लेने या अन्य गति कलाकृतियों (पूरक कोड 2) के कारण wobbliness को कम करता है। चित्रा 10 और मूवी 3 ए-सी दिन 2 और 4 में एक ही स्थान पर स्तन ग्रंथि ऊतक को रीमॉडलिंग के भीतर न्यूट्रोफिल घुसपैठ दिखाते हैं, यह दर्शाते हुए कि खिड़की का उपयोग विभिन्न दिनों में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ और आंदोलन की निगरानी और ट्रैक करने के लिए कैसे किया जा सकता है। एक अनुरूप प्रयोग एक सी-एफएमएस-ईजीएफपी माउस में आयोजित किया गया था, जिसमें माइलॉयड कोशिकाएं (मुख्य रूप से मैक्रोफेज) सी-एफएमएस प्रमोटर (मूवी 4) द्वारा संचालित जीएफपी को व्यक्त करती हैं।

अंत में, इस अनुकूलन योग्य खिड़की का अपेक्षाकृत बड़ा सतह क्षेत्र दुर्लभ घटनाओं के अवलोकन की अनुमति देता है, जैसे कि अंतःशिरा टीकाकरण के बाद यकृत मेटास्टेसिस का गठन। इस घटना को प्रदर्शित करने के लिए, जिगर की खिड़कियों को केपीसी-बीएल / 6-1199 अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं के साथ पोर्टल शिरा इंजेक्शन के समय C57BL / 6J चूहों में डाला गया था, जो परमाणु संलयन प्रोटीन हिस्टोन 2 बी-सीएफपी (एच 2 बी-सीएफपी) को व्यक्त करते थे। समय के साथ, एकल कोशिकाओं और 2-3 कोशिकाओं के छोटे समूहों के आउटग्रोथ की निगरानी की गई क्योंकि वे माइक्रोमेटास्टेसिस (>100 कोशिकाओं) में विकसित हुए थे। चित्रा 10 इंजेक्शन और विंडो सम्मिलन के बाद दिन 1, 3, 7 और 9 पर ली गई प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है और एकल कोशिकाओं से माइक्रोमेटास्टेसिस तक की प्रगति को दर्शाता है।

सभी छवियों और फिल्मों को एक मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया गया था। समय के साथ Z और X अक्षों के साथ अधिकतम तीव्रता अनुमानों और फिल्म संरेखण ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। संरेखित छवियों और फिल्मों को तब Imaris सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संकलित किया गया था।

Figure 1
चित्र 1: जिगर के ऊपर एक वेंट्रल पेट इमेजिंग विंडो का सर्जिकल सम्मिलन। (ए) कार्टून सर्जरी के लिए प्रासंगिक संरचनाओं के शारीरिक स्थान को दर्शाता है। सफेद धराशायी बॉक्स चित्रों में देखे गए सर्जिकल फ़ील्ड को रेखांकित करता है। (बी) एक चीरा xiphoid प्रक्रिया के नीचे 3 मिमी शुरू किया जाता है और नीचे जारी रखा जाता है ताकि त्वचा के 1-1.5 सेमी2 खंड को मध्यरेखा के साथ हटा दिया जाए। (C) पेरिटोनियम का थोड़ा छोटा भाग विच्छेदित होता है। (डी) फाल्सिफॉर्म स्नायुबंधन (सफेद एरोहेड) को काट दिया जाता है, जिससे जिगर नीचे की ओर धकेल दिया जाता है। नोट: बाँझ खारा के साथ नम कपास swabs धीरे आंतरिक अंगों में हेरफेर करने के लिए उपयोग किया जाता है। (ई) एक सिरिंज का उपयोग करते हुए, जिगर की सतह पर ब्याज के क्षेत्र के आसपास की बूंदों में सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी राशि लागू की जाती है। (एफ) खिड़की को तैनात किया जाता है और जिगर के खिलाफ मजबूती से आयोजित किया जाता है जब तक कि चिपकने वाला सूख न जाए (2 मिनट)। (जी) खिड़की के किनारों को पेरिटोनियम और त्वचा के नीचे मोड़ा जाता है। (एच) पेरिटोनियम के लिए खिड़की को सुरक्षित करने के लिए, छायांकित क्षेत्र के अनुरूप खिड़की की सतह पर चिपकने वाला लागू किया जाता है, पेरीटोनियम को नीचे धकेलने और इसे जगह में चिपकाने से पहले। त्वचा इसी तरह पेरिटोनियम पर चिपकी हुई है। गोंद का एक रिम अंततः खिड़की पर उपकला के विकास को रोकने के लिए लाल रेखा के साथ जमा किया जाता है। (I) पोस्ट-सर्जिकल रिकवरी के लिए तैयार माउस को दिखाने वाले चिह्नों के बिना (एच) के समान छवि। डैश्ड लाइनों के साथ उल्लिखित क्षेत्र (जे, के) में आवर्धित किया जाता है। (जे) चिपकने वाली की बूंदों से निशान जिगर की सतह पर दिखाई देते हैं (तीर सिर) (के) जे में एक ही तस्वीर के रूप में एक सफेद धराशायी रेखा द्वारा उल्लिखित खिड़की के माध्यम से दिखाई देने वाले जिगर को दिखाता है। जिगर की सतह पर चिपकने की बूंदों को लाल रंग में रेखांकित किया गया है। छवि के लिए क्षेत्र को सफेद में रेखांकित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जिगर के दाहिने लोब पर एक खिड़की का सर्जिकल सम्मिलन। (ए) कार्टून सर्जरी के लिए प्रासंगिक संरचनाओं के शारीरिक स्थान को दर्शाता है। काला धराशायी बॉक्स चित्रों में देखे गए सर्जिकल फ़ील्ड को रेखांकित करता है। (बी) माउस को बाएं पार्श्व डेक्यूबिटस स्थिति में रखा जाता है, एक चीरा रिब पिंजरे के नीचे 3 मिमी से शुरू होता है, और त्वचा के लगभग 1 सेमी2 खंड को हटा दिया जाता है। (C) पेरिटोनियम का थोड़ा छोटा भाग विच्छेदित होता है। (डी) जिगर को धीरे-धीरे एक नम कपास झाड़ू का उपयोग करके रिब पिंजरे के नीचे खींच लिया जाता है। (ई) एक सिरिंज का उपयोग करते हुए, जिगर की सतह पर बूंदों (सफेद तीर सिर) में सर्जिकल चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा लागू की जाती है। (एफ) खिड़की को तैनात किया जाता है और जिगर के खिलाफ मजबूती से आयोजित किया जाता है जब तक कि चिपकने वाला सूख न जाए (2 मिनट)। (जी) खिड़की के किनारों को पेरिटोनियम और त्वचा के नीचे मोड़ा जाता है। (एच) पेरिटोनियम के लिए खिड़की को सुरक्षित करने के लिए, चिपकने वाला खिड़की की सतह पर लागू किया जाता है, छायांकित क्षेत्र के अनुरूप, पेरिटोनियम को नीचे धकेलने और इसे जगह में चिपकाने से पहले। त्वचा इसी तरह पेरिटोनियम पर चिपकी हुई है। गोंद का एक रिम भी खिड़की पर उपकला के विकास को रोकने के लिए लाल रेखा के साथ जमा किया जाता है। (I) उच्च आवर्धन पर, जिगर (एक सफेद धराशायी रेखा द्वारा उल्लिखित) खिड़की के माध्यम से दिखाई देता है। इमेजिंग क्षेत्र को विंडो (सफेद तीर सिर) में एम्बेडेड ग्रिड द्वारा चिह्नित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अग्न्याशय के ऊपर एक खिड़की का सर्जिकल सम्मिलन। (ए) कार्टून सर्जरी के लिए प्रासंगिक संरचनाओं के शारीरिक स्थान को दर्शाता है। काला धराशायी बॉक्स चित्रों में देखे गए सर्जिकल फ़ील्ड को रेखांकित करता है। (बी) माउस को दाहिने पार्श्व डेक्यूबिटस स्थिति में रखा जाता है। तिल्ली मुंडा त्वचा (धराशायी रेखा) (सी) के माध्यम से दिखाई देती है एक चीरा रिब पिंजरे के नीचे 3 मिमी शुरू होता है, और त्वचा के लगभग 1 सेमी2 खंड को हटा दिया जाता है। (d) पेरिटोनियम का थोड़ा छोटा हिस्सा विच्छेदित होता है। (ई) अग्न्याशय (सफेद तीर सिर) धीरे से खिड़की के स्थान में एक नम कपास झाड़ू के साथ तैनात है। (एफ) एक सिरिंज का उपयोग करते हुए, सर्जिकल चिपकने की एक छोटी मात्रा को प्लीहा पर लागू किया जाता है, साथ ही अग्न्याशय (छवि के लिए क्षेत्र से दूर)। (जी) खिड़की को अग्न्याशय के खिलाफ मजबूती से रखा जाता है और दृढ़ता से आयोजित किया जाता है जब तक कि चिपकने वाला सूख नहीं जाता है (2 मिनट)। खिड़की के किनारों को पेरिटोनियम और त्वचा के नीचे मोड़ा जाता है। (एच) पेरिटोनियम के लिए खिड़की को सुरक्षित करने के लिए, छायांकित क्षेत्र के अनुरूप खिड़की की सतह पर चिपकने वाला लागू किया जाता है, पेरीटोनियम को नीचे धकेलने और इसे जगह में चिपकाने से पहले। त्वचा इसी तरह पेरिटोनियम पर चिपकी हुई है। गोंद का एक रिम भी खिड़की पर उपकला के विकास को रोकने के लिए लाल रेखा के साथ जमा किया जाता है। (I) उच्च आवर्धन पर, अग्न्याशय (एक सफेद धराशायी रेखा द्वारा उल्लिखित) खिड़की के माध्यम से दिखाई देता है। इमेजिंग क्षेत्र को विंडो (सफेद तीर सिर) में एम्बेडेड ग्रिड द्वारा चिह्नित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वंक्षण स्तन ग्रंथि पर एक खिड़की का सर्जिकल सम्मिलन। (ए) कार्टून सर्जरी के लिए प्रासंगिक संरचनाओं के शारीरिक स्थान को दर्शाता है। काला धराशायी बॉक्स चित्रों में देखे गए सर्जिकल फ़ील्ड को रेखांकित करता है। ध्यान दें कि सर्जरी या तो 4वें या 5वें स्तन ग्रंथियों पर की जा सकती है। (बी) माउस को एक बाँझ सर्जिकल क्षेत्र पर एक सुपाइन स्थिति में रखा जाता है। चीरा करनेके लिए 5 वें दाएं निप्पल (तीर सिर) का उपयोग एक मील का पत्थर के रूप में किया जाता है। (सी) एक चीरा बनाया जाता है, स्तन ग्रंथि को अतिरंजित त्वचा से अलग किया जाता है, और त्वचा के लगभग 1 सेमी2 खंड को हटा दिया जाता है। (डी) एक सिरिंज का उपयोग करते हुए, शल्य चिकित्सा चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा स्तन ग्रंथि की सतह पर ब्याज के क्षेत्र के आसपास की बूंदों में लागू किया जाता है। (ई) खिड़की को तब तक तैनात और दृढ़ता से आयोजित किया जाता है जब तक कि चिपकने वाला सूख न जाए (2 मिनट)। (एफ) खिड़की के किनारों को संदंश का उपयोग करके त्वचा के नीचे मोड़ा जाता है। (जी) खिड़की को त्वचा पर सुरक्षित करने के लिए, छायांकित क्षेत्र के अनुरूप खिड़की की सतह पर चिपकने वाला लागू किया जाता है, त्वचा को उस पर नीचे धकेलने और इसे जगह में चिपकाने से पहले। गोंद का एक रिम भी खिड़की पर उपकला के विकास को रोकने के लिए लाल रेखा के साथ जमा किया जाता है।  (एच) 4वें दाहिने स्तन ग्रंथि में एक छोटे से ट्यूमर पर प्रत्यारोपित खिड़की का एक उदाहरण प्रदान किया गया है। डैश्ड लाइनों के साथ उल्लिखित क्षेत्र (I) में उच्च आवर्धन में दिखाया गया है। (I) स्तन ग्रंथि की सतह पर चिपकने वाली बूंदों को लाल रंग में रेखांकित किया गया है। छविकृत किए जाने वाले क्षेत्र को काले रंग में रेखांकित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सिलिकॉन इमेजिंग खिड़कियों में अनुकूल ऑप्टिकल और भौतिक गुण हैं। (A-C) बिंदु प्रसार समारोह को मापने और पीडीएमएस खिड़कियों के इमेजिंग गुणों की तुलना ग्लास कवरलिप्स से करने के लिए, 40 एनएम पीले-हरे रंग के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फियर को अलग-अलग मोटाई या ग्लास कवरलिप्स (# 1.5 मोटाई) की पीडीएमएस खिड़कियों के माध्यम से चित्रित किया गया था।16. इंट्रावाइटल इमेजिंग की स्थितियों से मेल खाने के लिए विसर्जन माध्यम के रूप में अल्ट्रासाउंड जेल का उपयोग करके छवियों को एकत्र किया गया था। प्लॉट्स में आधे अधिकतम (FWHM) पर परिकलित पूर्ण चौड़ाई दिखाएँ (एक) एक्स-अक्ष, (B) वाई-अक्ष, और (C) जेड-अक्ष (एसडी ± मतलब; एन = 3 / समूह, दो या दो से अधिक अलग-अलग खिड़कियों का उपयोग करके अधिग्रहित; एक तरफा एनोवा सभी पीडीएमएस खिड़कियों की तुलना डननेट के कई तुलना परीक्षण के साथ कांच से करता है; केवल महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं)। (D) X और Y अक्ष में परिकलित FWHM मानों के बीच का अनुपात (A-B) को एक्स और वाई अक्षों के साथ बिंदु स्रोत छवियों की समरूपता के उपाय के रूप में दिखाया गया है, और इसलिए ऑप्टिकल विपथन के। (E-G) माइक्रोस्फीयर को 200 मिलीग्राम पीडीएमएस के साथ तीन अलग-अलग खिड़कियों के माध्यम से चित्रित किया गया था (इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली खिड़कियों के समान) चित्र 9, चित्र 10, चित्र 11 और चलचित्र 2, चलचित्र 3, चलचित्र 4) या तीन ग्लास coverslip (# 1.5 मोटाई) बिंदु प्रसार समारोह को मापने के लिए। इंट्रावाइटल इमेजिंग उदाहरणों के विपरीत, इन गणनाओं के लिए छवियों को विसर्जन माध्यम के रूप में पानी का उपयोग करके एकत्र किया गया था। भूखंडों में परिकलित FWHM दिखाएँ (E) एक्स-अक्ष, (F) वाई-अक्ष और (G) जेड-अक्ष (एसडी ± मतलब; एन = 3 / समूह तीन अलग-अलग खिड़कियों का उपयोग करके; मान-व्हिटनी परीक्षण, कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया)। (H) प्लॉट X- और Y-अक्ष में परिकलित FWHM मानों के बीच का अनुपात दिखाता है (E-F). (मैं) भूखंड प्रति माइक्रोस्फीयर (एसडी ± मतलब; एन = 3 / समूह) पीक फ्लोरोसेंट तीव्रता दिखाते हैं; मान-व्हिटनी परीक्षण, कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया)। सभी छवियों को 960 एनएम की तरंग दैर्ध्य और 3% की लेजर शक्ति पर एकत्र किया गया था। प्रत्येक माइक्रोस्फीयर के लिए एक 100 μm z-स्टैक एकत्र किया गया था, जिसमें 0.6 μm का चरण आकार था। छवि फ्रेम 1022 पिक्सेल x 1022 पिक्सेल के एक संकल्प के साथ 69 μm x 69 μm पर सेट किया गया था। विश्लेषण फिजी के साथ किया गया था - MetroloJ प्लगइन. (J) सामग्री गुणों का परीक्षण करने के लिए, पीडीएमएस खिड़कियों को तनाव में रखा गया था और यांत्रिक परीक्षण के दौरान एक लोचदार प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए सुपर गोंद का उपयोग करके दो अंगूठी के आकार के वाशर के बीच सुरक्षित किया गया था। कांच की कठोरता के कारण तनाव के बिना माइक्रो कवर ग्लास स्लिप के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग किया गया था। एक सिलेंडर एक्सट्रूज़न (4 मिमी व्यास, 20 मिमी लंबाई) के साथ एक गोलार्ध (6 मिमी व्यास) से मिलकर एक लोडिंग टिप एक पॉलीलैक्टिक एसिड फिलामेंट का उपयोग करके 3 डी मुद्रित किया गया था। खिड़कियों को सामग्री की विफलता तक 1 एन / एस के लोड नियंत्रण प्रोफ़ाइल के तहत एक सर्वोहाइड्रोलिक सामग्री परीक्षण मशीन में लोड किया गया था। बल और विस्थापन मूल्यों को 100 हर्ट्ज की आवृत्ति पर मापा गया था। छवि विंडो के केंद्र में लागू की जा रही लोडिंग टिप के साथ सेट अप विंडो परीक्षण दिखाती है। (K) प्लॉट MATLAB में Trapz फ़ंक्शन का उपयोग करके तनाव-तनाव वक्र के तहत योग क्षेत्र की गणना करके निर्धारित सामग्री की क्रूरता को दर्शाता है (मतलब ± SEM; n = 3/ समूह प्रत्येक मोटाई और ग्लास कवरलिप के लिए तीन अलग-अलग PDMS खिड़कियों का उपयोग करके; ट्यूकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरफा एनोवा)। (L) प्लॉट तनाव-तनाव वक्र के रैखिक भाग से निर्धारित यंग के मापांक को दर्शाता है (मतलब ± SEM; n = 3/ समूह तीन अलग-अलग PDMS खिड़कियों और ग्लास कवरलिप्स का उपयोग करके; वेल्च के सुधार के साथ टी-परीक्षण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र6: सिलिकॉन विंडो उच्च सहनशीलता और दीर्घायु को दर्शाती है। (A) खिड़की की सर्जरी के 11 दिनों के बाद ग्रिड के बिना एक वेंट्रल पेट इमेजिंग विंडो के साथ एक पुरुष, 7 सप्ताह पुराने C57BL / 6J माउस की एक प्रतिनिधि छवि। (बी) एक पुरुष 7 सप्ताह पुराने C57BL / 6J माउस की एक प्रतिनिधि छवि एक अग्नाशय इमेजिंग विंडो के साथ जिसमें खिड़की की सर्जरी के 14 दिन बाद एक ग्रिड होता है। (सी) एक मादा 12 सप्ताह पुराने C57BL / 6J c-fms-EGFP माउस की एक प्रतिनिधि छवि एक स्तन ग्रंथि इमेजिंग विंडो के साथ एक ग्रिड >7 दिन खिड़की सर्जरी के बाद युक्त। (डी) एक पुरुष 7 सप्ताह पुराने सी-एफएमएस-ईजीएफपी माउस में लिवर इमेजिंग विंडो ने दिन 0 (सर्जरी के तुरंत बाद) और सर्जरी के बाद 35 दिनों पर फोटो (शीर्ष पंक्ति) और छवि (नीचे की पंक्ति) फोटो खिंचवाई। त्वचा की उचित मात्रा को हटाने और गोंद के साथ घाव को सील करने से त्वचा को फिर से उपकला और खिड़की को ऊपर और बाहर धकेलने से रोकता है, जिससे अंग को लंबे समय तक चित्रित किया जा सकता है। स्केल बार = 30 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: खिड़कियों के भीतर ग्रिड दृश्य के एक ही क्षेत्र की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। (ए) लेजर कट स्टेनलेस स्टील खिड़कियों के कस्टम उत्पादन के लिए विस्तृत विनिर्देशों. (बी) इमेजिंग विंडो के भीतर एम्बेडेड एक ग्रिड को जिगर पर देखा जा सकता है, जिसमें खिड़की के चारों ओर गोंद का रिम स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। (C) दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के ओकुलर के माध्यम से खिड़की का दृश्य। रक्त वाहिकाओं (लाल) और जिगर से हरे रंग के संकेत पृष्ठभूमि में देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: विंडो सम्मिलन के लिए प्रणालीगत और स्थानीय प्रतिक्रिया। (A-C) जिगर में खिड़की डालने के बाद 28 दिनों की अवधि के लिए 7 सप्ताह पुराने C57BL / 6J महिला चूहों के लिए वजन की निगरानी की गई थी (एक), अग्न्याशय (B) या स्तन ग्रंथि (C). अनुपचारित आयु-मिलान वाले चूहों की तुलना में प्रतिशत शरीर के वजन में परिवर्तन दिखाया गया है। (*) एक माउस को इंगित करता है जो सामान्य शरीर के वजन को पुनः प्राप्त नहीं करता है और इसलिए एक इमेजिंग प्रयोग से सेंसर किया गया होगा। एक ही नियंत्रण चूहों को प्रत्येक प्रकार की विंडो की आसान तुलना के लिए सभी तीन पैनलों में दिखाया गया है। (Dसफेद रक्त कोशिका (डब्ल्यूबीसी) गिनती सर्जरी के बाद 3, 14, और 28 (स्तन ग्रंथि खिड़की) या 35 (जिगर या अग्न्याशय खिड़की) दिन पर निगरानी की। माउस में WBC गणना के लिए सामान्य श्रेणी डैश्ड लाइनों द्वारा इंगित किया गया है। (E,G,मैं) हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन अनुपचारित नियंत्रण (बाएं) से ऊतक वर्गों के धुंधला और एक 7 सप्ताह पुराने C57BL / 6J माउस पर एक इमेजिंग विंडो (दाएं) के सम्मिलन के 14 दिन बाद (E) जिगर, (G) अग्न्याशय, या (मैं) स्तन ग्रंथि। (E,मैं) सतही और फोकल दानेदार घाव जिगर और स्तन ग्रंथि की सतह (तीर) के साथ असतत स्थानों पर दिखाई देते हैं, जो गोंद की प्रतिक्रिया का सुझाव देते हैं। * द्वारा इंगित सामान्य ऊतक दानेदार घावों से सटे क्षेत्रों में दिखाई देता है। जिगर खिड़कियों के साथ तीन नियंत्रण और तीन चूहों का मूल्यांकन प्रत्येक समय बिंदु (सर्जरी के बाद दिन 3, 14 और 35) पर किया गया था, सिवाय इसके कि जिगर की खिड़कियों के साथ 6 चूहों का मूल्यांकन सर्जरी के बाद 35 वें दिन में किया गया था। 3 में से दो चूहों ने दिन 3 और 14 में दानेदार ऊतक का प्रदर्शन किया। 3 में से 1 चूहों ने दिन 35 पर दानेदार ऊतक का प्रदर्शन किया।  स्तन ग्रंथि खिड़कियों के साथ तीन नियंत्रण और तीन चूहों का मूल्यांकन प्रत्येक समय बिंदु पर किया गया था (सर्जरी के बाद दिन 3, 14, और 28)। 3 में से तीन चूहों में दिन 3 और 14 में स्तन ग्रंथि के वसा ऊतक में दानेदार ऊतक या भड़काऊ प्रतिक्रियाएं थीं। 3 चूहों में से शून्य ने दिन 28 पर दानेदार घावों या भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया। (G) अग्न्याशय में कोई महत्वपूर्ण घाव दिखाई नहीं दे रहे हैं। अग्न्याशय खिड़कियों के साथ तीन नियंत्रण और तीन चूहों का मूल्यांकन प्रत्येक समय बिंदु पर किया गया था (सर्जरी के बाद दिन 3, 14, और 35)। अग्नाशय की खिड़कियों वाले चूहों में किसी भी समय दानेदार ऊतक नहीं थे। स्केल बार = 500 μm (F,H,J) मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग अनुपचारित नियंत्रण से ऊतक वर्गों पर किया गया था और 7 सप्ताह पुराने C57BL / 6J चूहों पर एक इमेजिंग विंडो के सम्मिलन के 14 दिन बाद (F) जिगर, (H) अग्न्याशय या (J) स्तन ग्रंथि। CD45, CD68 और myeloperoxidase (MPO) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग क्रमशः ल्यूकोसाइट्स, मोनोसाइट्स / मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल को लेबल करने के लिए किया गया था। CD45 और CD68 धुंधला एक ही अनुभाग पर प्रदर्शन किया गया था, जबकि एमपीओ धुंधला एक ही ऊतक के एक सीरियल अनुभाग पर प्रदर्शन किया गया था। एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी को एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पाया गया था और पहले चित्रित किया गया था, फिर क्रोमोजेन और माध्यमिक एंटीबॉडी को छीन लिया गया था और स्लाइड्स को एंटी-सीडी 68 को पहचानने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। रंग थ्रेशोल्डिंग द्वारा फिजी सॉफ्टवेयर के साथ परिमाणीकरण किया गया था; मापदंडों को एंटीबॉडी और ऊतकों में समायोजित किया गया था। प्लॉट्स प्रति फ़ील्ड ऑफ व्यू (एफओवी) के प्रति सेल काउंट के रूप में परिमाणीकरण दिखाते हैं (SEM ± मतलब; n = 3/ समूह; Tukey के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरफा ANOVA; केवल महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं)। (K) पुरुष C57BL/ c-fms-EGFP 8-11 सप्ताह की उम्र के चूहों में जिगर के दाहिने लोब पर एक सिलिकॉन इमेजिंग विंडो डाली गई थी। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लेक्टिन (100 μL) को प्रत्येक इमेजिंग सत्र से तुरंत पहले अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया गया था। छवियां एक एकल माउस से हैं, एक ही ग्रिड लोकस पर 1, 3, और 5 दिनों की सर्जरी के बाद, ग्रिड के नीचे लगभग 200 μm पर। स्केल बार = 30 μm. 960 एनएम, लेजर शक्ति 10% की एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर छवि। रक्त वाहिकाएं लाल रंग में दिखाई देती हैं। मैक्रोफेज हरे (सफेद तीर) में दिखाई देते हैं। तीन छविवाले चूहों के प्रतिनिधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: ट्यूमर को विंडो सम्मिलन के बाद हफ्तों में कई समय बिंदुओं पर विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है। अग्नाशयी खिड़की सम्मिलन के समय एक पुरुष 7 सप्ताह पुराने C57BL / 6J माउस orthotopically 1.5 x 104 iGFP-1199 अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया, और खिड़की सम्मिलन के बाद 11 और 14 दिनों पर चित्रित किया गया। स्केल सलाखों = 30 μm. 960 एनएम, लेजर शक्ति 10% की एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर छवि। 6 छविवाले चूहों के प्रतिनिधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: सामान्य स्तन ग्रंथि involution के दौरान प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ में गतिशील परिवर्तन. इमेजिंग विंडो में एम्बेडेड धातु ग्रिड का उपयोग करके, सामान्य ऊतक रीमॉडलिंग के दौरान एक ही स्थान को चित्रित किया जा सकता है, जैसे कि स्तन ग्रंथि involution के दौरान। प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ जैसे गतिशील परिवर्तनों की निगरानी में सिलिकॉन खिड़कियों की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, एक 12 सप्ताह की महिला C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; पेट के स्तन ग्रंथि पर डाली गई इमेजिंग विंडो के साथ लाइएसएम-ईजीएफपी माउस को स्तन ग्रंथि के इनवोल्यूशन के बाद 2 और 4 दिनों में चित्रित किया गया था। न्यूट्रोफिल हरे (सफेद तीर) में दिखाई देते हैं। न्यूट्रोफिल इलास्टेज गतिविधि को इमेजिंग शुरू करने से 4 घंटे पहले एक न्यूट्रोफिल इलास्टेज फ्लोरोसेंट प्रोब को इंजेक्ट करके कल्पना की गई थी, और लाल रंग में दिखाई देता है (या जब न्यूट्रोफिल के साथ सहस्थानीयकृत होता है तो पीला)। उपकला कोशिकाएं नीले रंग में दिखाई देती हैं। स्नैपशॉट जेड अक्ष (गहराई में 100-150 मिमी) के साथ पांच छवियों का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण हैं। छवियां मूवी 3 ए और 3 बी से हैं, और निचली पंक्ति की छवियों पर, केवल सीएफपी सिग्नल दिखाया गया है और छवियों को दो अलग-अलग समय बिंदुओं पर ऊतक के भीतर एक ही स्थान की कल्पना करने के लिए एक लाल डैश्ड लाइन के साथ चिह्नित किया गया है। स्केल सलाखों = 30 μm. 960 एनएम और 1080 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके चित्रित किया गया, क्रमशः 10% और 15% पर लेजर शक्ति। चार छविवाले चूहों के प्रतिनिधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: कैंसर मेटास्टेसिस के गठन को समय के साथ ट्रैक किया जा सकता है। एक पुरुष C57BL / 6J 10 सप्ताह पुराना माउस 1 x 105 KPC-BL / 6-1199 अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया, जो खिड़की सम्मिलन के समय पोर्टल नस के माध्यम से परमाणु स्थानीयकृत हिस्टोन H2B संयुग्मित सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (H2B-CFP) को व्यक्त करता है। लिवर इमेजिंग को इंजेक्शन के बाद एक पार्श्व खिड़की 24 घंटे (दिन 1) के माध्यम से और तीन बाद के समय बिंदुओं (9 दिनों तक) के माध्यम से किया गया था, जैसा कि संकेत दिया गया है। इंजेक्शन के बाद दिन 1 और 3 पर दिखाई देने वाली एक एकल कैंसर कोशिका को सफेद तीर के साथ इंगित किया जाता है। कोलेजन फाइबर से दूसरे हार्मोनिक संकेत भी सियान चैनल (पीले तीर) में कल्पना की गई थी। छवियां प्रत्येक अलग-अलग समय बिंदु पर एक ही माउस से होती हैं। एकल z-विमान छवियों को गहराई में 300 μm और 350 μm के बीच लिया गया। स्केल सलाखों = 30 μm. 880 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके चित्रित किया गया। लेजर शक्ति 8% पर। तीन छविवाले चूहों के प्रतिनिधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूवी 1: सिलिकॉन कल्पनाजी खिड़कियां चूहों में अच्छी तरह से सहन कर रहे हैं। फिल्म एक पुरुष 9 सप्ताह पुराने C57BL / 6J माउस विंडो सम्मिलन के बाद 14 दिनों से पता चलता है. माउस दर्द से जुड़े किसी भी मानक व्यवहार को प्रदर्शित नहीं करता है (उदाहरण के लिए, खराब सौंदर्य, बंद आंखें, या सुस्ती)। छह रिकॉर्ड किए गए चूहों के प्रतिनिधि, और सफल विंडो आरोपण के बाद देखे गए 100 से अधिक चूहों के अनुरूप। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूवी 2: ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं की उपकोशिकीय इमेजिंग। iGFP-1199 कोशिकाओं को एक पुरुष 7 सप्ताह पुराने C57BL / 6J माउस के अग्न्याशय में ऑर्थोटोपिक रूप से इंजेक्ट किया गया था और कैंसर कोशिकाओं और खिड़की सम्मिलन के इंजेक्शन के बाद 11 वें दिन की छवि बनाई गई थी। फिल्म जेड अक्ष के साथ छह छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण है और 2-एच इमेजिंग अवधि से निकाली गई है। समय टिकट (h:min:s:ms). छह छविवाले चूहों के प्रतिनिधि। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूवी 3: ACTB-ECFP में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ में परिवर्तन; Involution के दौरान LysM-eGFP चूहों. महिला C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; माइलॉयड कोशिकाओं में जीएफपी को व्यक्त करने वाले लाइएसएम-ईजीएफपी चूहों (मुख्य रूप से ग्रैनुलोसाइट्स में लेकिन मैक्रोफेज में भी), और सभी कोशिकाओं में ईसीएफपी (लेकिन उपकला कोशिकाओं में उच्चतम) 8 सप्ताह की उम्र में पैदा हुए थे। प्रसव के बाद, पिल्लों को माउस प्रति छह पिल्ले के लिए सामान्यीकृत किया गया था। प्रसूति के बाद 10 वें दिन, पिल्लों को वीन किया गया था और पेट के स्तन ग्रंथि इमेजिंग खिड़कियों को डाला गया था। माइलॉयड कोशिकाएं हरे रंग में दिखाई देती हैं; न्यूट्रोफिल इलास्टेज गतिविधि, इमेजिंग की शुरुआत से 4 घंटे पहले इंजेक्ट की गई न्यूट्रोफिल इलास्टेज 680 फास्ट प्रोब का उपयोग करके लेबल की गई, लाल रंग में दिखाई देती है (जब न्यूट्रोफिल के साथ सह-स्थानीयकरण किया जाता है तो पीला दिखाई देगा); और उपकला कोशिकाएं नीले रंग में दिखाई देती हैं। फिल्में जेड अक्ष (गहराई में 100-150 μm) के साथ पांच छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण हैं। (ए) स्तन ग्रंथि involution के दिन 2 पर इमेजिंग. स्केल बार = 20 μm. 960 एनएम और 1080 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके चित्रित किया गया, क्रमशः 10% और 15% पर लेजर शक्ति। (बी) स्तन ग्रंथि involution के दिन 4 पर इमेजिंग. स्केल बार = 20 μm. फिल्म मूवी 3ए के रूप में एक ही माउस और ऊतक क्षेत्र से है। (सी) मूवी 3 बी से ब्याज के एक क्षेत्र का उच्च आवर्धन, जिसमें दो न्यूट्रोफिल एक दूसरे के साथ बातचीत करते हुए और स्तन ग्रंथि की उपकला कोशिकाओं को दिखाया गया है। न्यूट्रोफिल माइग्रेशन के दौरान अग्रणी किनारे पर क्षणिक झिल्ली प्रोट्रूशन का गठन देखा जा सकता है। समय टिकट (h:min:s:ms). चार छविवाले चूहों के प्रतिनिधि। Movie 3A डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें. मूवी 3बी डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। मूवी 3सी डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।     

मूवी 4: involution के दौरान सी-एफएमएस-ईजीएफपी चूहों में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ में परिवर्तन। मादा C57BL / 6J c-fms-EGFP चूहों, GFP-लेबल मैक्रोफेज के साथ, 8 सप्ताह की उम्र में पैदा हुए थे। प्रसव के बाद, कूड़े को माउस प्रति छह पिल्ले में समायोजित किया गया था। प्रसूति के बाद 10 वें दिन, पिल्लों को वीन किया गया था और पेट के स्तन ग्रंथि इमेजिंग खिड़कियों को डाला गया था। फिल्म, involution दिन 1 (खिड़की के सम्मिलन के एक दिन बाद) पर अधिग्रहित, involution के दौरान प्रमुख मैक्रोफेज घुसपैठ पर प्रकाश डाला गया। मैक्रोफेज हरे रंग में दिखाई देते हैं, कोलेजन फाइबर (दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी) नीले रंग में दिखाई देते हैं, और रक्त वाहिकाएं लाल रंग में दिखाई देती हैं (लेक्टिन-डीवाईलाइट 594)। स्केल बार = 20 μm. छवियां जेड अक्ष (गहराई में 100-150 उम) के साथ पांच छवियों की अधिकतम तीव्रता अनुमान हैं। 960 एनएम और 800 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके चित्रित किया गया, क्रमशः 10% और 15% पर लेजर शक्ति। समय टिकट (h:min:s:ms). तीन छविवाले चूहों के प्रतिनिधि। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इंट्रावाइटल इमेजिंग खिड़कियां सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर शारीरिक और पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं को सीधे विज़ुअलाइज़ करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं क्योंकि वे समय के साथ प्रकट होते हैं। कास्टिंग और चूहों में लचीला, सिलिकॉन इमेजिंग खिड़कियों को डालने के लिए वर्णित उपन्यास प्रक्रिया वर्तमान में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग खिड़कियों (एक्सूडेट, ब्रेकिंग और सामान्य गतिशीलता के साथ हस्तक्षेप) के साथ कुछ सबसे आम मुद्दों को दूर करती है, माउस के लिए अतिरिक्त सुरक्षा प्रदान करती है, और इस तकनीक की पहुंच को बढ़ाती है।

सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली इमेजिंग खिड़कियों में एक धातु फ्रेम होता है जो ग्लास कवरस्लिप रखता है। इन प्रोटोटाइपिकल खिड़कियों के उपयोग के लिए एक बड़ी बाधा यह है कि धातु की अंगूठी को सुरक्षित करने में श्रमसाध्य सिलाई प्रक्रियाएं शामिल हैं, जो उन्नत सर्जिकल प्रशिक्षण के साथ कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, फ्रेम का निर्माण महंगा है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। PDMS खिड़कियां इन दोनों मुद्दों को दूर करती हैं। पीडीएमएस खिड़कियों को डालने की प्रक्रिया सिलाई को समाप्त कर देती है, तकनीक सीखने के लिए बाधा को काफी कम करती है। खिड़कियों का उत्पादन करने के लिए सामग्री भी सस्ती हैं और आसानी से खरीदी जा सकती हैं। इसके अलावा, खिड़की के आकार और सर्जिकल प्रक्रिया दोनों को स्तन ग्रंथि, यकृत, अग्न्याशय, प्लीहा और आंत सहित विभिन्न अंगों की इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

जबकि वर्तमान इंट्रावाइटल इमेजिंग खिड़कियां आमतौर पर कुछ दिनों के लिए अनुदैर्ध्य इमेजिंग की अनुमति देती हैं, कई सामान्य समस्याएं विस्तारित अवधि के लिए इन खिड़कियों के उपयोग को सीमित करती हैं। कांच की खिड़कियों का वजन और आकार चूहों के मुक्त आंदोलन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, और एक्सूडेट खिड़की के खिलाफ जमा हो सकता है। चूहे ग्लास कवरस्लिप को भी नुकसान पहुंचा सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप घाव और संक्रमण हो सकते हैं। इसके विपरीत, यहां वर्णित प्रक्रिया जानवरों के लिए संकट को कम करते हुए ऊतक तक पहुंच के समान स्तर को बनाए रखती है। पीडीएमएस एक सुरक्षित, बायोस्टेबल, सिंथेटिक बहुलक है जो व्यापक रूप से मनुष्यों में बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे कि दवा वितरण उपकरण, चेहरे-पुनर्निर्माण सर्जरी और स्तन प्रत्यारोपण। खिड़की के जानवरों की सहिष्णुता को बढ़ाने से परे, कांच के विपरीत जैविक रूप से निष्क्रिय सामग्री का उपयोग, उन अध्ययनों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो प्रतिरक्षा प्रणाली को शामिल करते हैं, जहां स्थानीय सूजन एक भ्रमित प्रभाव होगा। इसके अतिरिक्त, एक प्रमुख सुधार टांके का उन्मूलन है, क्योंकि चूहे उन पर काटेंगे और खींचेंगे, जिससे धातु-फ्रेम वाली ग्लास इमेजिंग खिड़कियां गिर सकती हैं। इस मुद्दे को आंशिक रूप से खिड़कियों की एक नई पीढ़ी द्वारा संबोधित किया गया था जिसे डिज़ाइन किया गया था ताकि टांके एक नाली9 में छिपे हुए हों। हालांकि, इस बाद की रणनीति के लिए पर्स-स्ट्रिंग की आवश्यकता होती है, जो एक जटिल, त्रुटि-प्रवण प्रक्रिया है जो अक्सर टांके को बहुत तंग खींचने का कारण बनती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक और दर्द का परिगलन होता है। इसलिए, जगह में खिड़की गोंद करने की क्षमता सिलिकॉन विंडो दृष्टिकोण का एक बड़ा लाभ का गठन करती है। इसके अलावा, खिड़की नगण्य वजन के साथ एक लचीली, टिकाऊ सामग्री से बनी होती है, जो जानवर के आंदोलन पर इसके प्रभाव को कम करती है, जैसा कि पहले खिड़कियों की तुलना में मूल्यांकन किया गया था जो ग्लास कवरस्लिप17 को पकड़ने के लिए धातु के बजाय सिलिकॉन का उपयोग करते थे। ग्लास कवरस्लिप को पूरी तरह से खत्म करके, सिलिकॉन विंडो धातु फ्रेम और ग्लास दोनों के साथ मुद्दों को समाप्त करती है। इसके अलावा, खिड़की का लचीलापन इसे आसानी से डालने की अनुमति देता है और अंगों को एक कठोर सतह को चिपकाने के कारण तनाव बल को कम करता है, इस प्रकार ऊतक को स्थायी क्षति के जोखिम को कम करता है। इसके अलावा, क्योंकि खिड़की डालने और जगह में रखने के लिए बहुत आसान है, समग्र प्रक्रिया में कम समय लगता है, लंबे समय तक संज्ञाहरण के कारण संभावित दुष्प्रभावों को सीमित करता है। जिगर पर सम्मिलन के लिए, प्रक्रिया के समय में अंतर विशेष रूप से पर्याप्त है, धातु-फ्रेम वाली खिड़कियों के लिए 45 मिनट से सिलिकॉन खिड़कियों के लिए 15 मिनट तक। वास्तव में, जबकि जिगर पर धातु फ्रेम डालने के लिए xiphoid प्रक्रिया (उरोस्थि के अंत में उपास्थि) के विच्छेदन की आवश्यकता होती है, जो संभावित रूप से दर्दनाक भी है और निरंतर सूजन का कारण बनता है, यह विच्छेदन सिलिकॉन विंडो डालने के लिए अनावश्यक है। अंत में, इस काम में प्रस्तुत इमेजिंग विंडो संभावित अनुप्रयोगों के संबंध में अतिरिक्त लाभ प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, कांच की खिड़कियों के विपरीत, सिलिकॉन खिड़कियां ऊतक तक आसान पहुंच प्रदान करती हैं, इसलिए कैंसर कोशिकाओं, फ्लोरोसेंट रंजक या दवाओं को सीधे खिड़की के माध्यम से इंजेक्ट किया जा सकता है।

एक और पीडीएमएस-आधारित सिलिकॉन इमेजिंग विंडो जो विभिन्न प्रकार के शारीरिक स्थानों पर सम्मिलन के लिए उपयुक्त है, जिसमें स्तन ग्रंथि भी शामिल है, हाल ही में18 का वर्णन किया गया था। उस खिड़की को एक आकार और विशेष किनारे उत्पन्न करने के लिए ढाला जाता है जो टांके या गोंद की आवश्यकता के बिना खिड़की के तेजी से आरोपण की अनुमति देता है। इसके विपरीत, यहां प्रस्तुत सिलिकॉन विंडो को किसी भी विशेष मोल्ड की आवश्यकता नहीं होती है और महत्वपूर्ण बात यह है कि शारीरिक स्थान और व्यक्तिगत माउस के अनुकूल होने के लिए सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान आकार में कटौती की जा सकती है। यद्यपि यहां वर्णित प्रोटोकॉल को गोंद के उपयोग की आवश्यकता होती है, यह अतिरिक्त आवश्यकता यकृत और प्लीहा सहित पेट के अंगों की इमेजिंग की अनुमति देती है। इसके अलावा, यहां वर्णित सिलिकॉन विंडो विंडो के भीतर एक स्टेनलेस-स्टील ग्रिड के एम्बेडिंग की अनुमति देती है, जो संदर्भ स्थलों को प्रदान करती है। ये लैंडमार्क समय के साथ एक ही सटीक स्थान का पता लगाने में सक्षम होते हैं और मेटास्टैटिक घावों के विकास जैसे प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कई सत्रों (अनुदैर्ध्य इमेजिंग) पर एक ही साइट की बार-बार इमेजिंग की सुविधा प्रदान करते हैं जो दिनों से सप्ताह तक लगते हैं।

संक्षेप में, एक सिलिकॉन इमेजिंग विंडो स्तन ग्रंथि या पेट के अंगों के अनुदैर्ध्य आईवीएम में उपयोग के लिए विकसित की गई थी। खिड़की ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट, अत्यधिक टिकाऊ और सस्ती है। विंडो सम्मिलन प्रक्रिया की सादगी विंडो-आधारित इंट्रावाइटल इमेजिंग दृष्टिकोण को लागू करने के लिए आवश्यक तकनीकी कौशल को कम करती है। विविध ऊतक साइटों के लिए खिड़की की अनुकूलनशीलता जैविक अध्ययन की एक विशाल सरणी में आईवीएम के कार्यान्वयन की अनुमति देती है।

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Disclosures

एम.ई. Insmed, Inc के लिए brensocatib के लिए अनुसंधान सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य है; विविडियन थेराप्यूटिक्स, इंक के लिए वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य; Protalix, Inc के लिए एक सलाहकार;; और Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. में शेयर रखता है Mestag Therapeutics के सह-संस्थापक हैं, और वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड पर हैं और Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology, और Cygnal Therapeutics में शेयर रखते हैं। अन्य लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम लेजर-कट स्टेनलेस स्टील ग्रिड को डिजाइन करने और अनुकूलित करने में उनकी सहायता के लिए रोब एफर्ट को धन्यवाद देते हैं। इस काम को CSHL कैंसर केंद्र (P30-CA045508) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) (1R01CA2374135 और 5P01CA013106-49) से एम.ई. के लिए धन द्वारा समर्थित किया गया था; CSHL और Northwell Health; थॉम्पसन परिवार फाउंडेशन; अमेरिका भर में तैरना; और सीएसएचएल को सिमंस फाउंडेशन से अनुदान। एमएस को राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम प्रशिक्षण पुरस्कार (T32-GM008444) और पुरस्कार संख्या 1F30CA253993-01 के तहत एनआईएच के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था। L.M. एक जेम्स एस McDonnell फाउंडेशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित है. जेएमए एक कैंसर अनुसंधान संस्थान / इरविंगटन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (सीआरआई पुरस्कार # 3435) के प्राप्तकर्ता हैं। डीएटी अग्नाशय के कैंसर अनुसंधान और थॉम्पसन परिवार फाउंडेशन के लिए Lustgarten फाउंडेशन समर्पित प्रयोगशाला द्वारा समर्थित है। कार्टून Biorender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows - Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 179
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Maiorino, L., Shevik, M., Adrover,… More

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y. X., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

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