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Cancer Research

透明なシリコーン窓による縦方向の生体内イメージング

Published: January 5, 2022 doi: 10.3791/62757
* These authors contributed equally

Summary

ここでは、関心のある組織/器官および皮膚に直接接着することができる光学的に透明なシリコーン窓を使用して、長期の生体内イメージングのためのアプローチを提示する。これらの窓は、現在現場で使用されている他の窓よりも安価で汎用性が高く、外科的挿入は動物に限られた炎症および苦痛を引き起こす。

Abstract

生体内顕微鏡(IVM)は、単一細胞分解能での細胞移動、分裂、および死の可視化を可能にします。外科的に挿入されたイメージングウィンドウを通るIVMは、数日から数週間にわたって同じ組織の縦断的観察を可能にするため、特に強力である。典型的なイメージングウィンドウは、マウスの皮膚に縫合された生体適合性の金属フレーム内のガラスカバースリップで構成されています。これらの窓は、マウスの自由な動きを妨げ、強い炎症反応を誘発し、ガラスの破損または破れた縫合糸のために失敗し、そのいずれもが安楽死を必要とする可能性がある。これらの問題に対処するために、長期腹部器官および乳腺イメージング用の窓は、以前は頭蓋イメージング窓に使用されていた光学的に透明なシリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン(PDMS)の薄膜から開発された。これらの窓は組織に直接接着することができ、挿入に必要な時間を短縮する。PDMSは柔軟性があり、マウスの耐久性に寄与し、時間の経過とともに最大35日間試験されています。縦方向イメージングは、別々のセッション中に同じ組織領域をイメージングすることです。ステンレス製のグリッドが窓に埋め込まれ、同じ領域をローカライズし、数日離れた同じ場所での動的プロセス(乳腺の退縮など)の視覚化を可能にしました。このシリコーンウィンドウはまた、時間の経過とともに微小転移に発達する単一の播種性癌細胞のモニタリングを可能にした。この研究で使用されたシリコーン窓は、金属フレームのガラス窓よりも挿入が簡単で、画像化された組織の炎症を制限します。さらに、埋め込みグリッドにより、繰り返しイメージングセッションで同じ組織領域を簡単に追跡できます。

Introduction

麻酔をかけられた動物の組織のイメージングである生体内顕微鏡(IVM)は、無傷の組織における細胞分解能での生理学的および病理学的事象のダイナミクスへの洞察を提供する。この技術の応用は多岐にわたりますが、IVMはがん生物学の分野で、がん細胞が組織に侵入して転移し、周囲の微小環境と相互作用し、薬物にどのように反応するかを解明するのに役立つ123。さらに、IVMは、エクスビボプロファイリングアプローチ(例えば、フローサイトメトリー)を補完する洞察を提供することにより、免疫応答を支配する複雑なメカニズムの理解を促進するための鍵となっています。例えば、生体内イメージング実験は、細胞遊走および細胞間接触に関連する免疫機能の詳細を明らかにし、傷害または感染に応答して時空間ダイナミクスを定量するためのプラットフォームを提供している4,5,6,7。これらのプロセスの多くは、組織学的染色によっても研究することができるが、動的変化の追跡を可能にするのはIVMのみである。実際、組織学的切片は所与の時間における組織のスナップショットを提供するが、インバイタルイメージングは、同じ組織内の細胞間および細胞内事象を経時的に追跡することができる。特に、蛍光標識の進歩と分子レポーターの発達により、分子事象は、増殖、死、運動性、および他の細胞または細胞外マトリックスとの相互作用などの細胞挙動と相関することが可能になった。ほとんどのIVM技術は蛍光顕微鏡法に基づいており、光散乱のためにより深い組織のイメージングを困難にします。したがって、関心のある組織は、しばしば侵襲的および終末的処置で外科的に曝露される必要がある。したがって、器官部位に応じて、組織を、数時間から40時間8まで変化する期間にわたって連続的に画像化することができる。あるいは、永久的な画像化窓の外科的挿入は、79週までの数日にわたって同じ組織の画像化を順次可能にする。

新しいイメージングウィンドウの開発は、バイタル内イメージングアプローチをさらに改善するための技術的必要性として強調されています10。プロトタイプのインタビタル画像化ウィンドウは、縫合糸11で皮膚に固定されたガラスカバースリップを含む金属リングである。自由な動きへの干渉、滲出液の蓄積、およびガラスカバースリップの損傷は、そのような窓の使用で見られる一般的な問題である。さらに、プロトタイプウィンドウは特殊な生産を必要とし、外科的処置は広範なトレーニングを必要とする可能性がある。これらの問題に対処するために、シリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン(PDMS)は、以前は脳12における長期画像化のための頭蓋窓において使用されていたが、腹部器官および乳腺画像化における使用のために適合された。ここでは、PDMSベースのシリコーン窓を生成するための詳細な方法が提示され、同じ組織領域の反復画像化のためのランドマークを提供するためにステンレス鋼グリッドの周りに窓を鋳造する方法を含む。さらに、腹部器官または乳腺の上に窓を挿入するための簡単でステッチフリーの外科的処置が記載されている。この新しいアプローチは、現在使用されているイメージングウィンドウの最も一般的な問題のいくつかを克服し、縦方向のインタビタルイメージングのアクセシビリティを向上させます。

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Protocol

記載されているすべての手順は、コールドスプリングハーバー研究所外科ガイドラインに従って行われ、コールドスプリングハーバー研究所の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されていました。

1.シリコンウィンドウを鋳造する

  1. シリコーンポリマー(PDMS)を調製するには、ベースエラストマーと硬化剤を10:1(v/v)の比率で混合します。
  2. 無菌で滑らかな表面に少量のPDMSを堆積させて窓を鋳造し、体積対面積比を所望の厚さに調整する。
    注:24ウェルプレート蓋の蓋に直径22mmの円に対して200mgのポリマー溶液を使用すると、窓の頑丈さと光学的透明度の間に良好な妥協点が生じます。
  3. オプション:同じ組織領域を繰り返しイメージングするためのランドマークを提供するには、PDMSが所望の鋳造面上にあってから、ステンレス鋼グリッドをシリコーンに軽く押し込みます。
  4. 気泡を除去するには、コーティングされた表面を真空デシケーターに45分間置き、ポリマーを脱気する。
  5. シリコーン窓を80°Cのオーブンで45分間硬化させる。
  6. 金型の端にポリマーをスコアリングし、鉗子で鋳造に使用した表面から硬化した窓を静かに剥がします。
  7. 手術前に、オートクレーブで窓を滅菌してください。

2.シリコンウィンドウの挿入のためのマウスの準備

  1. 誘導チャンバー内でマウスを4%(v/v)イソフルランを用いて麻酔する。マウスを手術台の温めパッドに移動し、麻酔ノーズマスクにマウスを置き、イソフルラン濃度を2%に下げて手術中のメンテナンスを行います。
  2. 後肢のつま先をつまんで麻酔の深さを確認してください。マウスが非アクティブになり、つま先のピンチ反射応答が表示されなくなるまで、マウスを続行しないでください。
  3. 眼科用潤滑剤を眼に塗布して、眼が乾燥しないようにし、外傷を予防します。
  4. 先制鎮痛薬(ブプレノルフィン0.05mg/kg)を皮下に投与する。
  5. 手術部位を剃り、脱毛クリームで完全に脱毛します。
  6. ポビドン - ヨウ素溶液(10% v / v)およびエタノール(70% v / v)を連続して3倍に塗布し、手術部位の感染を予防する。

3. 肝臓のイメージングのための腹側窓の挿入;他の腹部器官に適応可能(図1)

  1. マウスを仰臥位に置きます。
  2. 滅菌はさみと鉗子を使用して剣状突起から3mm下方から10mm切開します。
  3. 正中線に沿って1〜1.5 cm2 の皮膚部分を取り除きます。
  4. 滅菌はさみと鉗子の2番目のペアを使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを削除します。
  5. オプション:肝臓の大部分を視覚化するには、滅菌生理食塩水で湿らせた滅菌綿棒を使用して肝臓を横隔膜から押し下げ、肝臓と横隔膜をつなぐ鷹状靭帯を明らかにします。下大静脈を切らないように注意しながら靭帯を切断する。
  6. 31Gシリンジで外科用接着剤を引き出し、画像化する領域の縁の周りの肝臓の表面に少量塗布する。この接着剤は円形のシールを作成し、中央領域をそのまま残してイメージングします。
    警告: 接着剤は、画像領域の周りに円形のパターンを形成する小さな液滴に制限してください。接着剤と接触した組織はすぐには画像化できない。接着剤を塗布する前に組織を乾燥させる必要はない。
    注:この手順では、シアノアクリレートベースの接着剤を正常に使用できます。外科用接着剤は無菌性を保証します。ターミナル手順では、万能スーパー接着剤が良好な結果をもたらします。
  7. 鉗子を使用して窓を置き、接着剤が乾くまで(〜2分間)肝臓にしっかりと押し付けます。
  8. 腹膜の下の窓の端を折りたたむ。
  9. 注射器で、腹膜の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させる。鉗子で腹膜を押し下げて窓に固定します。
  10. 同様に、腹膜に少量の外科用接着剤を付着させてから、鉗子で皮膚を押し下げて腹膜に固定する。
    注:正しく実行すれば、肝臓組織の円形の領域が窓から見えるはずです。
  11. 窓の端に接着剤を塗って、窓の上に皮膚が伸びるのを防ぐのに役立つ縁を作ります。
    注意:無菌の外科的技術を用いて処置が行われ、挿入前に窓が滅菌されている場合、外科用接着剤で創傷を密封するだけで感染を避けるのに十分である。しかし、外科的挿入または不完全な閉鎖中に適切な無菌技術に従わないと、顕在または無症候性の感染および組織からの乾燥につながる可能性がある。

4. 肝臓のイメージングのための側方窓の挿入;門脈における癌細胞の同時注入と互換性がある(図2)

  1. マウスを左側方褥瘡の位置に置きます
  2. 滅菌はさみと鉗子を使用して、肋骨弓の3 mm下の右脇腹に10 mmの切開を行います。
  3. 皮膚の1cm2 の部分を取り除きます。
  4. 滅菌はさみと鉗子の2番目のペアを使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを削除します。
  5. 31Gシリンジで外科用接着剤を引き出し、画像化する領域の縁の周りの肝臓の表面に少量塗布する。
    警告: 接着剤は、画像領域の周りに円形のパターンを形成する小さな液滴に制限してください。接着剤と接触した組織はすぐには画像化できない。
    注:この手順では、シアノアクリレートベースの接着剤を正常に使用できます。外科用接着剤は無菌性を保証します。ターミナル手順では、万能スーパー接着剤が良好な結果をもたらします。
  6. 鉗子を使用して窓を置き、接着剤が乾くまで(〜2分間)肝臓にしっかりと押し付けます。
  7. 腹膜の下の窓の端を折りたたむ。
  8. 注射器で、腹膜の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させる。鉗子で腹膜を押し下げて窓に固定します。
  9. 同様に、腹膜に少量の外科用接着剤を付着させてから、鉗子で皮膚を押し下げて腹膜に固定する。
    注:正しく実行すれば、肝臓組織の円形の領域が窓から見えるはずです。
  10. 窓の端に接着剤を塗って、窓の上に皮膚が伸びるのを防ぐのに役立つ縁を作ります。
  11. 門脈注入が必要な場合:
    1. マウスを仰臥位に置きます。
    2. 皮膚の剣状突起から10mmの切開を行う。
    3. 滅菌ハサミおよび鉗子の第2のペアを使用して、腹膜に10mmの切開を行う。
    4. 2本の綿棒を滅菌生理食塩水に浸す。
    5. 綿棒を使用して、滅菌生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼの上に腸を優しく引っ張り、向きをねじったり乱したりしないように注意してください。
    6. 門脈が腹部の右側に見えるまで、腹腔から腸を変位させ続ける。
    7. 門脈の肝臓への入り口の入り口まで尾の5〜7mmの31〜33G針を挿入し、血管内を通過せず、血管内に進むようにしてください。
    8. がん細胞をゆっくりと注入する(100 μLの滅菌PBSに再懸濁する)。
      注:この実験のために、アミリン膵臓癌細胞株(例えば、KPC-BL/6-1199)は、完全なDMEM培地および100μLの滅菌PBS中に注射された1 x105 細胞で培養することができる。
    9. 出血を防ぐために、針を抜いた直後に、手術用スポンジの小片で注射部位に1〜2分間穏やかに圧力をかけます。
    10. 圧力が解放された後、止血を確実にするために1〜2分間サイトを監視します。
    11. 湿らせた綿棒を使用して、器官の生理学的配向に従って腸を腹腔に戻す。
    12. 滅菌鉗子を使用して、マウスの腹腔の左側にある腹膜のすぐ下に窓を挿入します。
    13. 4-0シルク縫合糸で縫合し、正中線切開部を7mmのステンレス鋼の創傷クリップでホチキス止めする。
    14. マウスを左横褥瘡の位置に移動する
    15. 滅菌はさみと鉗子を使用して、皮膚を通して肋骨アーチの下の右脇腹3mmに10mmの切開を行う。
    16. 切開部の周りの皮膚の1cm2 部分を除去する。
    17. 滅菌はさみと鉗子の2番目のペアを使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを削除します。
    18. 手順4.8-4.10で説明されているように、窓を肝臓の上の所定の位置に引っ張ってから所定の位置に接着します。

5. 膵臓にイメージング用のウィンドウを挿入する(図3)

  1. マウスを右側の側方褥瘡の位置に置きます。
  2. 滅菌はさみと鉗子を使用して、肋骨アーチの3mm下の左脇腹に10mmの切開を行います。
  3. 切開部の周りの皮膚の1cm2 部分を除去する。
  4. 滅菌はさみと鉗子の2番目のペアを使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを削除します。
  5. 滅菌生理食塩水で浸した滅菌綿棒を使用して、脾臓を優しく引っ張って膵臓を視覚化します。湿らせた綿棒で膵臓の位置を変えて、切開部を通してより多くの表面積が見えるようにします。
    注:この時点で、膵臓癌細胞は、実験計画の一部である場合、膵臓に同所的に注入することができる。
  6. 31Gシリンジで外科用接着剤を引き出し、画像化する領域の縁の周りの膵臓の表面に少量塗布する。
    警告: 接着剤は、画像領域の周りに円形のパターンを形成する小さな液滴に制限してください。接着剤と接触した組織はすぐには画像化できない。
  7. 鉗子を使用して窓を置き、接着剤が乾くまで(〜2分間)膵臓にしっかりと保持します。
  8. 腹膜の下の窓の端を折りたたむ。
  9. 注射器で、腹膜の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させる。鉗子で腹膜を押し下げて窓に固定します。
  10. 同様に、腹膜に少量の外科用接着剤を付着させてから、鉗子で皮膚を押し下げて腹膜に固定する。
    注:正しく実行すれば、膵臓組織の円形領域が窓から見えるはずです。
  11. 窓の端に接着剤を塗って、窓の上に皮膚が伸びるのを防ぐのに役立つ縁を作ります。

6. 乳腺にイメージング用の窓を挿入する(図4)

  1. マウスを仰臥位に置きます。
  2. 滅菌はさみと鉗子を使用して鼠径乳首の1つに10mmの切開内側を作ります。
  3. 乳腺の上の皮膚の0.5cm2 の部分を取り除く。
  4. 2組目の滅菌ハサミを使用して、はさみを2つの表面の間に広げて付着を乱すことで、乳腺を皮膚から慎重に分離します。
    注:鼠径乳腺領域のイメージングを容易にするために、乳腺より上だが後肢よりも優れた皮膚の一部を解剖するように注意し、窓がマウスの可動性を制限しないように注意してください。
  5. 31Gシリンジで外科用接着剤を引き出し、画像化する領域の縁の周りの乳腺の表面に少量塗布する。
    警告: 接着剤は、画像領域の周りに円形のパターンを形成する小さな液滴に制限してください。接着剤と接触した組織はすぐには画像化できない。
  6. 鉗子を使用して窓を置き、接着剤が乾くまで乳腺にしっかりと固定します(〜2分)。
    注:乳腺組織の円形領域は、正しく実行すれば窓から見えるはずです。
  7. 窓の端を皮膚の下に折りたたみます。
  8. シリンジで、皮膚の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させる。鉗子で皮膚を押し下げ、皮膚を窓に固定します。
  9. 窓の端に接着剤を塗って、窓の上に皮膚が伸びるのを防ぐのに役立つ縁を作ります。

7. 術後の回復

  1. 十分なネスティング材で清潔な回収ケージにマウスを置き、ケージの一部が加熱パッドの上に置かれていることを確認します。
  2. マウスが意識的で可動性になるまで、マウスを継続的に監視します。
  3. 必要に応じて、先制投与の12時間後に鎮痛剤の追加用量を提供する。
    注:追加の鎮痛は一般的に不要ですが、マウスが苦痛の兆候(背中のふらつき、毛皮の不自由な、食べ物への興味の喪失など)を示す場合は獣医師に相談してください。感染または他の有害作用の徴候について、手術後最初の3日間、マウスを毎日監視する。動物の注意または安楽死を必要とするマウスの2%未満は、典型的には窓の部分的な剥離に起因する。腹側肝臓イメージング窓を有する雄マウスの場合、マウス間の戦闘は窓の剥離をもたらす可能性があることに注意することが重要です。これは、マウスを別々に収容することによって回避される。

8. 窓からの撮影

  1. 誘導チャンバー内でマウスを4%(v/v)イソフルランを用いて麻酔する。
  2. 眼科用潤滑剤を眼に塗布して、眼が乾燥しないようにし、外傷を予防します。
  3. マウスを誘導チャンバーから顕微鏡ステージに移動します。マウスを麻酔ノーズマスクに入れ、イソフルラン濃度を約1〜1.5%に下げて、イメージング手順全体を通して麻酔を維持します。
  4. マウスの下に圧力パッドセンサーを置いて呼吸数を監視し、柔らかいサージカルテープを使用してマウスをステージに固定します。
  5. 直腸体温計を挿入して、イメージングセッション全体を通して体温を監視します。
  6. 加熱したパッドの電源を入れ、マウスを注意深く監視して、体温が37°Cを超えないようにします。
  7. ソフトウェアを利用してマウスの呼吸数を監視します。最適な速度は〜1呼吸/秒です。必要に応じて麻酔を調整します。
  8. 各イメージングセッションの前に、70%エタノール(v / v)に浸した綿棒で優しく拭き取って、残留レンズ浸漬媒体や破片から窓をきれいにしてください。
  9. 水浸漬レンズを利用する場合は、気泡を避けて、超音波ゲルを窓に塗布してください。
    注: 蒸留水を使用することもできますが、イメージング中に再適用が必要になる場合があります。
  10. イメージングに最適な深度を見つけるには、まずグリッドを見つけてピントを合わせます。
  11. グリッドの下部を 0 に設定して、おおよその組織イメージング深度を決定します。この情報は、後続のイメージングセッションで対応するz平面を見つけるために必要です。
  12. 複数のイメージングセッションで同じ位置を特定するには、グリッド上の正方形を参照点として使用します。イメージング中は、グリッドの向きと、画像化された各視野のグリッド内の位置(たとえば、上から2行 、左から4番目の 正方形)に注意してください。
  13. 連続したイメージングセッション中に、グリッドを使用して特定のグリッド領域、つまりイメージングフィールドに戻ります。
  14. 各イメージングセッションに続いて、70%エタノール(v/v)に浸した綿棒で窓を優しく拭き取り、残留レンズ浸漬媒体および破片を除去します。

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Representative Results

イメージングウィンドウによるイントラバイタルイメージングは、数時間から数週間にわたって単一細胞分解能で幅広い細胞および分子イベントを観察、追跡、定量するために使用できます。イメージングウィンドウのための理想的な特徴には、a)マウスの幸福および組織の生理機能に対する限られた影響が含まれる。b)耐久性;c)挿入の単純さ;d)同じ領域の繰り返し画像化のための明確なランドマーク。その結果、汎用性の高い不活性シリコーン窓が簡単に製造および挿入され、グリッドを装備して、複数のイメージングセッションにわたって同じ視野を見つけることができます。

窓はPDMSでできており、安価で柔軟で透明な素材です。窓は、ほとんどの研究室で広く購入可能な消耗品で鋳造することができます。これらの目的のために、市販の24ウェルプレートの蓋にすでにエッチングされている円形金型(直径22mm)がうまく機能する。単位面積当たりに使用するポリマーの量を変えることにより、窓の厚さを調整することができる。イメージング解像度に対するウィンドウの厚さの影響を文書化するために、40nm蛍光微小球の点像分布関数(PSF)分析を行い、さまざまな厚さのPDMSウィンドウを介したイメージングを、インタビタルイメージングウィンドウ(厚さ0.17mm)に通常使用されるガラスカバースリップと比較しました。インタビタルイメージングに使用したセットアップを再現するために、PSFイメージングを、超音波ゲルを浸漬媒体として塗布した同じ2光子顕微鏡および水浸漬レンズを用いて実施した。

PSFを横平面にフィットさせて計算した信号強度の半値全幅(FWHM)は、100mgのPDMSで鋳造したPDMS窓用ガラスのそれと同等であった(図5A、B)。ガラスカバースリップと比較した横方向の分解能は、150~250mgのPDMSで鋳造された窓では低下しました(図5A、B)。z軸画像面では、100~200mgのポリマーで鋳造したPDMS窓は、ガラスカバースリップよりも優れた性能を発揮しました(図5C)。300mgのPDMSで鋳造された窓では光学的明瞭さが失われ、測定の信頼性が低下しました(図5A~C)。FWHM値のX/Y比は、ガラスと任意の厚さのPDMSの間で有意に異ならなかったが、200〜250mgのポリマーで鋳造された窓の比は、超音波ゲルを浸漬媒体として用いた1から著しく逸脱した(図5D)。しかし、200mgの窓鋳造の浸漬媒体として水を使用した場合、対称性からの逸脱ははるかに顕著ではなかった。したがって、この厚さでは、ポリマー中の収差による偏差は軽微である可能性が高い。ピーク蛍光強度値も各ミクロスフェアについて収集され、最も高いシグナルがガラスを通して記録されたが、ガラスおよびPDMSが同程度に機能することを示した(図5I)。PDMSウィンドウの最適な厚さは、特定のアプリケーションとイメージングシステムによって異なります。ほとんどの目的のために、直径22mmの円形窓用の200mgのポリマー溶液は、窓の頑丈さと光学的透明度との間の最適な妥協点である。実際、200mg未満の窓キャストは、光学的にはより明瞭であり、FWHM値はガラスに類似していたが、外科的移植中に時折引き裂かれたが、200mg(>100匹のマウス)を使用して窓損傷の事例は観察されなかった。

これらの材料特性の違いを測定するために、PDMSウィンドウ(200mgおよび150mg)を、材料が故障するまで1N/sの荷重制御プロファイルでサーボ油圧材料試験機に装填しました(図5J)。力および変位の値は、100Hzの周波数で測定した。次に、力-変位データは、次の式を使用して応力-ひずみに変換されました。

σ = F / A (1)

Ɛ = Δ L / L0 (2)

ここで、σは応力(Pa)、Fは力(N)、Aは窓の断面積、Ɛはひずみ、ΔLは変位、L0 は窓の厚さです。材料の靭性は、応力-ひずみ曲線下の総和面積を計算することによって決定した。材料の靭性は、プラスチックに変形し、破壊前のプロセスでエネルギーを吸収する能力を指します - 埋め込み窓13の重要な特性。イメージング実験中の観察と一致して、200mgのPDMSで鋳造された窓は、150mgの窓鋳造よりも有意に高い靭性を有し(図5K)、したがって破損しにくい。

次に、200mgで鋳造された好ましいPDMS窓のヤング率(E)を決定し、応力-ひずみ曲線の線形領域を抽出し、フックの法則を使用して傾きを決定することによって、標準的なガラスカバースリップのヤング率(E)と比較した。

σ = EƐ (3)

ガラス窓のヤング率はPDMSよりも有意に高く、ガラスはPDMSよりもはるかに剛性が高いため、これは予想された(図5L)。したがって、ガラスは、その高いヤング率に基づいてより強い材料であるが、200mg PDMSウィンドウのより大きな靭性は、それらが壊れる危険性がなく、2回目の外科的処置または安楽死を必要とすることなく、より長期間適用することができることを支持している。

シリコーン窓の主な利点は汎用性です。重要なことに、窓を外科的に挿入する手順は、異なる解剖学的位置に容易に調整することができる。手術への適応は、窓が外科用はさみで簡単にサイズ変更でき、窓が目的の組織/器官の表面および皮膚に接着され、縫合糸の必要性を完全に排除するという事実によって促進される。このようにして窓をうまく挿入することは、肝臓、膵臓、および乳腺について達成された(図6A〜C)。特に、肝臓イメージングのために腹側または側方窓のいずれかを移植するために、2つの異なるプロトコルが開発された。 図1は 、腹側窓を挿入する手順を示しています。この手順は、他の腹部器官に適合させることができ、最大の画像化可能な表面積をもたらす。ただし、大きな(>1cm2)画像化可能領域が必要でない限り、マウスの右脇腹に横方向の窓を挿入する(図2)ことは、呼吸や蠕動運動などによる運動アーチファクトを減らすために好ましい。さらに、側方イメージングウィンドウを挿入するための外科的手順は、肝転移の発症を実験的にモデル化するために門脈における癌細胞の同時注射と互換性がある。したがって、マウスは、門脈注射および腹部画像窓挿入が同じ動物において必要とされる場合、2つの別々の処置の代わりに単一の処置を受けることができる。同様の手順を使用して、マウスの左脇腹の膵臓の上に窓を埋め込む(図3)。窓はまた、皮下組織、すなわち正常な乳腺、ならびに既に確立された自発的または同所的に移植された乳腺腫瘍の上に挿入することもできる(図4)。あるいは、針が窓の完全性を損なうことなくPDMSフィルムを穿刺することができるので、癌細胞を窓を通して乳腺に注射して原発性腫瘍の発症を縦方向に追跡することができる。

軽量で柔軟性が高いため、シリコン窓はマウスの移動性を妨げません(動画1)。したがって、シリコーン窓は、脆弱性、複雑な縫合、動物の移動性への影響など、ガラス窓に関連する主要な障害を克服します。代わりに、シリコーン窓に関連する主な制限は、窓の下の上皮の再成長である。しかし、適量の皮膚を除去し、創傷を接着剤で完全に密封すると、再上皮化が制限され、画像化を長期間にわたって継続することができる(最大35日間が試験されている、 図6D)。窓を挿入した後、マウスを約1ヶ月間、または外科的接着剤が失敗するか、または再上皮化が起こるまで縦方向に画像化することができる。短い毎日のイメージングセッション(〜60分)またはそれほど頻繁ではないが、麻酔誘発性の有害作用を避けるために、より長いイメージングセッションが好まれる。窓を有する動物は、標準的な手順を用いて、単一光子または多光子共焦点顕微鏡の両方を介して、任意の生体内イメージングプラットフォーム上で画像化することができる(例えば、14を参照されたい)。各イメージングセッションの前後に、70%エタノール(v / v)に浸した綿棒で拭いて、窓を汚れや破片からきれいにすることをお勧めします。

時間の経過とともに同じ位置を追跡するために、ステンレス鋼のグリッドをウィンドウ内に埋め込むことができます。 図7A は、ここで使用されるカスタムメイドのレーザーエッチンググリッドの仕様を示しています。透過型電子顕微鏡用の商用グリッドもこの用途に適しています。グリッドは鋳造手順中に窓内に埋め込まれ、肉眼(図7B)と顕微鏡の眼(図7C)の両方でイメージング領域上にはっきりと見えます。窓は器官の表面に接着されているため、グリッドに対するイメージングフィールドの位置は安定しています。イメージング中は、グリッドの向きと、イメージ化された各視野のグリッド内の位置 (たとえば、上から 2 行 、左から 4番目の 正方形) に注意してください。次に、グリッドを使用して、連続するイメージングセッション中に特定のグリッド領域(したがってイメージングフィールド)に戻ります。

グリッドはまた、例えば呼吸または蠕動運動のために組織がゆっくりとドリフトする場合に、画像化セッション中に画像化野を整列させるためにも有用である。剛性リムを備えたほとんどのイメージングウィンドウは、イメージング中にホルダーに連結することができ、イメージング領域に安定性を追加します。フレキシブルウィンドウを直接安定化させることはできないので、サージカルテープを使用してウィンドウを含む身体部分を安定化させ、画像化領域は、定義された間隔(典型的には30分ごと)で、対応するグリッド正方形または以前に同定された組織ランドマーク(例えば、血管ランドマーク)の中心に再配置される。視野の微視的シフトのためのさらなるドリフト補正は、検出された組織パターン(補足コード1〜2)に基づいてフレームを再整列させるコードを介して、取得後フェーズでデジタルで実行されます。

窓が明白な全身性有害反応を引き起こさないことを検証するために、窓の移植を受けた動物の体重および未治療の年齢一致対照をモニターした。手術に伴う最初の体重減少の後、窓を挿入したほとんどのマウスは時間の経過とともに体重を増やし続け、窓の挿入が忍容性が高いことを示しています(図8A-C)。肝臓および乳腺窓の場合、手術から5日以内に正常な体重が回復する。術後の回復は、膵臓上の窓の移植後に遅く、マウスは14日以内に術前の体重に戻る。この観察は、手術時の膵臓の操作に関連する予想される効果と一致する。なお、体重減少が人道的エンドポイントの閾値に達しない場合でも、術前の体重を回復しないマウス(全マウスの<5%、 図8Bの*で示すマウスで例示)は、典型的には画像化実験から打ち切られる。さらに、窓挿入後の様々な時点で決定された白血球数は、対照と比較してほぼすべての窓付きマウスにおいて変化せず、経時的に有意に変化しなかった(図8D)ことから、窓が大きな全身性炎症を引き起こさなかったことが示唆された。

次に、窓および糊に対する局所組織応答の程度を評価するために、マウスを、組織学的分析のために窓の外科的挿入後3、14、および28日(乳腺窓)または35日(肝臓および膵臓窓)で安楽死させた。ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色肝臓切片の評価は、ほとんどのマウスについて、窓下での表面的(20〜80μm)、最小から軽度の莢膜肉芽組織形成を示した(3日目に評価された3匹のマウスのうち2匹、および14日目に評価された3匹のうち2匹)。これらの病変は焦点(長さ1〜3mm)であり、接着剤層の幅にほぼ対応する(図8E)。35日後、ほとんどのマウス(2つの別々の実験で評価された6匹中4匹)は顆粒組織を示さなかったが、数匹(6匹中2匹)は中等度の局所莢膜硬化症および脱形成(25〜250μmの深さ)を有していた。興味深いことに、9匹のマウスのコホートにおいて、窓の真下の膵臓の表面に有意な病変は観察されなかった(図8G)。しかし、いくつかのマウスは、膵臓の萎縮および腹部脂肪の炎症(脂肪炎)の領域を示し、操作誘発損傷と一致した。乳腺の場合、窓移植後3日目に、3匹のマウスのうち3匹は、腺の表面に沿って見える治癒切開または脂肪組織における炎症反応を連想させる肉芽組織を有していた。14日目において、評価した3匹のマウスのうち3匹が肉芽組織を有していた。これらの病変は再び局所的であり、長さは1〜3mmであった(図8I)。手術後28日目に安楽死させた乳腺窓を有するマウスは、明らかな組織学的異常を示さなかった。

この分析は、窓が試験された器官(肝臓、膵臓、乳腺)の全体的な生理学的構造を損なわないことを示唆している。肝臓と乳腺の表面に見られる反応性組織は、接着剤に対する反応である可能性が高く、接着剤と接触した直後の組織に限定された。正常組織は、接着剤に曝露されていない領域の反応性組織に隣接(<100μm)で容易に見出すことができ(図8E、I)、したがって、組織の炎症は、健康な組織領域の画像化を妨げない。さらに、ほとんどのマウス(9匹中8匹のマウス、すべての組織位置にわたって)が後期時点(28日または35日)に有意な病変を示さなかったため、組織反応が可逆的である可能性が高いが、組織反応が解決するという直接的な確認は、個々のマウスにおける縦断的測定なしでは達成が困難であろう。

CD45、CD68、およびミエロペルオキシダーゼ(MPO)の多重化免疫組織化学染色も行い、それぞれ白血球、単球/マクロファージ、および好中球の浸潤を特徴付けた。肉芽組織および脂肪炎に関連する免疫細胞浸潤の増加は、乳腺および肝臓で見られたが、膵臓では見られなかった(図8F、H、J)。 注目すべきは、免疫細胞浸潤が最後の時点(乳腺窓では28日、肝臓および膵臓窓では35日)の未処理対照の浸潤物と同等であったため、これらの変化は一過性である可能性が高い。

肝臓を部位として選択し、窓の挿入および画像化が画像化を用いて有意な局所免疫浸潤を引き起こしたかどうかをさらに特徴付けた。これを行うために、骨髄系細胞(主にマクロファージ)が緑色蛍光タンパク質で標識された c−fms−EGFP (MacGreen)マウス15を使用した。肝臓窓を3匹の c-fms-EGFP マウスに移植し、同じ視野を見つけるためにグリッドを使用して手術後の1日目、3日目、および5日目にそれらを画像化した。画像化領域に存在するマクロファージの数は、ウィンドウ挿入後の経時的に有意に変化しなかった(図8K)。

次に、細胞レベル(すなわち、運動、増殖、細胞間接触)および組織レベル(すなわち、膵臓における腫瘍増殖、乳腺退縮中の免疫浸潤、および肝転移)における多様な生物学的プロセスのセットを画像化することによって、窓を機能的に試験した。膵臓は、イメージングのための容易なアクセス可能な場所ではありません.この器官における癌細胞の動態を捕捉するために窓をどのように利用できるかを実証するために、一般に使用されるKPC(KrasLSL-G12D/+;p 53 LSL-R172H;Pdx1-Cre)膵臓癌の遺伝子操作マウスモデル。共焦点顕微鏡によって可視化されるために、KPC-BL/6-1199細胞は、ドキシサイクリン誘導性増強GFP(iGFP-1199細胞)を発現するように操作された。注射の6日後、マウスをドキシサイクリン食餌にかけ、膵臓癌細胞における緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を誘発した。図9は、注射および窓挿入後の11日目および14日目にiGFP-1199細胞を同所的に注射したマウスからの代表的な画像を示す。映画2は、窓挿入後11日目の2時間の画像化セッションの抜粋におけるiGFP-1199腫瘍縁部を示し、シリコーン窓を用いて膵臓における細胞膜投影の動態を捕捉する能力を示す。

シリコーン窓は、時間の経過とともに動的な免疫細胞浸潤を捕捉するためにも使用することができる。これを説明するために、乳腺窓を授乳中のACTB-ECFP(Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy)に滅菌した。離乳直後のLysM-eGFP(Lyz2tm1.1Graf)マウス。これらのマウスでは、すべての細胞、しかし最も高度に上皮性細胞は、ベータアクチンプロモーターによって駆動されるシアン蛍光タンパク質(CFP)を発現し、骨髄系細胞(主に好中球であるが、マクロファージも)は、リゾチームMプロモーターによって駆動されるeGFPによって標識される。マウスを、窓挿入後の2日目および4日目、乳腺退縮の過程中、乳腺組織が妊娠前の状態に戻り始めるときに画像化した。ImageJ用の2つのマクロは、モーションアーチファクトを減らし、視覚化を向上させるために開発され、1つは4次元のイントラバイタルビデオでZ平面を整列させ(補足コード1)、もう1つは呼吸やその他のモーションアーチファクトによるぐらつきを軽減します(補足コード2)。図10およびMovie 3A-Cは、2日目と4日目の同じ位置におけるリモデリング乳腺組織内の好中球浸潤を示し、ウィンドウを使用して異なる日にわたる免疫細胞の浸潤および動きを監視および追跡する方法を示しています。同様の実験をc-fms-EGFPマウスにおいて、c-fmsプロモーターによって駆動されるGFPを発現する骨髄系細胞(主にマクロファージ)を用いて行った(動画4)。

最後に、このカスタマイズ可能な窓の比較的大きな表面積は、静脈内接種後の肝転移の形成などのまれな事象の観察を可能にする。この現象を実証するために、核融合タンパク質histone2B-CFP(H2B-CFP)を恒常的に発現するKPC-BL/6-1199膵臓癌細胞を用いた門脈注入時にC57BL/6Jマウスに肝臓窓を挿入した。時間が経つにつれて、単一細胞および微小転移(>100細胞)に発達する2〜3細胞の小さなクラスターの増殖がモニターされた。 図10 は、注射および窓挿入後の1日目、3日目、7日目、および9日目に撮影された代表的な画像を示し、単一細胞から微小転移への進行を示す。

全ての画像及び動画は、多光子顕微鏡を用いて収集された。Z軸とX軸に沿った最大強度投影とムービーアライメントは、ImageJソフトウェアを使用して生成されました。整列した画像とムービーは、Imarisソフトウェアを使用してコンパイルされました。

Figure 1
図1:腹部イメージング窓を肝臓に外科的に挿入する(A)この漫画は、手術に関連する構造の解剖学的位置を示している。白い破線のボックスは、写真で見た手術場の輪郭を示しています。(B)切開は、剣状突起の3mm下から始まり、正中線に沿って皮膚の1〜1.5cm2の部分が除去されるように下方に続く。(C)腹膜のわずかに小さい部分を解剖する。(D)熱帯熱マラリア状靭帯(白い矢じり)が切断され、肝臓が押し下げられる。注:滅菌生理食塩水で湿らせた綿棒は、内臓を優しく操作するために使用されます。(e)シリンジを用いて、少量の外科用接着剤を肝臓表面の関心領域の周囲の液滴に塗布する。(F)窓を肝臓にしっかりと押し付け、接着剤が乾燥するまで(2分間)保持する。(G)窓の端は腹膜と皮膚の下に折り畳まれている。(h)窓を腹膜に固定するために、陰影のある領域に対応する窓の表面に接着剤を塗布してから、腹膜を押し下げて所定の位置に接着する。皮膚も同様に腹膜に接着されています。接着剤の縁は、窓の上皮の成長を防ぐために、最終的に赤い線に沿って堆積される。(I)(H)と同じ画像は、マウスが手術後の回復の準備ができていることを示すマーキングなし。破線で輪郭が描かれた領域は、(J, K)で拡大される。(J)接着剤の液滴からのマークが肝臓の表面に見える(矢印の頭)(K)白い破線で囲まれた窓から見える肝臓を示すJと同じ写真。肝臓表面上の接着剤の液滴は赤で輪郭を描いています。イメージ化する領域は白で囲まれています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:肝臓の右葉上の窓の外科的挿入。 (A)漫画は、手術に関連する構造の解剖学的位置を示しています。黒い破線のボックスは、写真で見た手術場の輪郭を示しています。(B)マウスを左側褥瘡位置に置き、胸郭の3mm下から切開を行い、約1cm2 の皮膚切片を除去する。(C)腹膜のわずかに小さい部分を解剖する。(D)肝臓を湿らせた綿棒を使用して胸郭の下に静かに引き下ろす。(e)シリンジを用いて、少量の外科用接着剤を肝臓表面の液滴(白矢印頭)に塗布する。(F)窓を肝臓にしっかりと押し付け、接着剤が乾燥するまで(2分間)保持する。(G)窓の端は腹膜と皮膚の下に折り畳まれている。(H)窓を腹膜に固定するために、腹膜をその上に押し下げて所定の位置に接着する前に、陰影のある領域に対応する窓の表面に接着剤を塗布する。皮膚も同様に腹膜に接着されています。接着剤の縁も、窓の上の上皮の成長を防ぐために赤い線に沿って沈着する。(I)高倍率では、肝臓(白い破線で囲まれた)が窓から見える。撮像領域は、ウィンドウに埋め込まれたグリッド(白い矢印の頭)によってマークされる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3: 膵臓上の窓の外科的挿入。(A)漫画は、手術に関連する構造の解剖学的位置を示しています。黒い破線のボックスは、写真で見た手術場の輪郭を示しています。(B)マウスを右側褥瘡位置に配置する。脾臓は剃毛した皮膚(破線)を通して見える(C)胸郭の3mm下から切開を行い、約1cm2 の皮膚切片を除去する。(d)腹膜のわずかに小さい部分を切開する。(E)膵臓(白い矢印の頭)は、窓の位置に湿らせた綿棒で優しく配置されます。(F)シリンジを用いて、少量の外科用接着剤を脾臓および膵臓(画像化される領域から離れる)に塗布する。(G)窓を膵臓に対してしっかりと配置して保持し、接着剤が乾燥するまで(2分間)。窓の端は腹膜と皮膚の下に折り畳まれています。(h)窓を腹膜に固定するために、陰影のある領域に対応する窓の表面に接着剤を塗布してから、腹膜を押し下げて所定の位置に接着する。皮膚も同様に腹膜に接着されています。接着剤の縁も、窓の上の上皮の成長を防ぐために赤い線に沿って沈着する。(I)高倍率では、膵臓(白い破線で囲まれた)が窓から見える。撮像領域は、ウィンドウに埋め込まれたグリッド(白い矢印の頭)によってマークされる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:鼠径乳腺上の窓の外科的挿入。 (A)漫画は、手術に関連する構造の解剖学的位置を示しています。黒い破線のボックスは、写真で見た手術場の輪郭を示しています。手術は、4番目または5番目の乳腺のいずれかで行うことができることに注意してください。(b)マウスを無菌手術野上で仰臥位に置く。右5番目の乳首(矢印の頭)は切開を行うための目印として用いられる。(C)切開を行い、乳腺を上層の皮膚から分離し、皮膚の約1cm2の部分を除去する。(d)シリンジを用いて、乳腺表面の関心領域周辺の液滴に少量の外科用接着剤を塗布する。(E)接着剤が乾燥するまで(2分間)窓を配置し、しっかりと保持する。(F)窓の端は、鉗子を使用して皮膚の下に折り畳まれる。(G)窓を皮膚に固定するために、皮膚を押し下げて所定の位置に接着する前に、陰影のある領域に対応する窓の表面に接着剤を塗布する。接着剤の縁も、窓の上の上皮の成長を防ぐために赤い線に沿って沈着する。 (h)右4番目の乳腺に小さな腫瘍の上に移植された窓の例が設けられている。破線で輪郭を引いた領域は、(I)においてより高い倍率で示されている。(i)乳腺表面上の接着剤の液滴が赤色で輪郭を描いている。イメージする領域は黒で囲まれています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:シリコーンイメージングウィンドウは、良好な光学的および材料特性を有する。 (A~C)点像分布関数を測定し、PDMS窓の撮像特性をガラスカバースリップの撮像特性と比較するために、40nm黄緑色蛍光微小球を、様々な厚さのPDMS窓またはガラスカバースリップ(#1.5厚さ)を通して画像化した。16.画像は、生体内画像化の条件に合致するように浸漬媒体として超音波ゲルを用いて収集された。プロットは、計算された半値全幅(FWHM)を(ある) X 軸、(B) Y 軸、および (C) Z軸(平均±SD;n = 3/group、2つ以上の別々の窓を使用して取得;一元配置分散分析はすべてのPDMS窓をダネットの多重比較検定でガラスと比較する;有意差のみが示されている)。(D) X 軸と Y 軸で計算された FWHM 値の比率 (A–B)は、X軸およびY軸に沿った点ソース画像の対称性の尺度として示され、したがって光学収差の尺度として示される。(E–G)微小球を、200mgのPDMSで鋳造した3つの別々の窓を通して画像化した( 図9, 図 10, 図 11 そして 映画 2, 映画 3, 映画 4)または3つのガラスカバースリップ(#1.5厚さ)を使用して、点像分布関数を測定します。イントラバイタルイメージングの例とは対照的に、これらの計算のための画像は、浸漬媒体として水を使用して収集された。プロットは、計算されたFWHMを(E) X 軸、(F) Y 軸と (G) Z 軸 (平均 ± SD; n = 3/group (3 つの別々のウィンドウを使用)マン・ホイットニー検定では、有意差は検出されなかった)。(H)プロットは、X軸とY軸(E から F).()プロットは、微小球当たりのピーク蛍光強度を示す(平均±SD;n=3/group;マン・ホイットニー検定では、有意差は検出されなかった)。すべての画像は、960nmの波長および3%のレーザーパワーで収集された。各微小球について100μmのzスタックを、0.6μmのステップサイズで収集した。画像フレームは69μm×69μmに設定し、解像度は1022画素×1022画素とした。分析はフィジー - MetroloJプラグインで実行されました。(J)材料特性をテストするために、PDMS窓を張力で保持し、機械的試験中に弾性応答を保証するためにスーパー接着剤を使用して2つのリング状のワッシャーの間に固定した。同様の手順を、ガラスの剛性による張力のないマイクロカバーガラススリップに使用した。シリンダー押出し(直径4mm、長さ20mm)を有する半球(直径6mm)からなるローディングチップを、ポリ乳酸フィラメントを用いて3Dプリントした。窓は、材料が故障するまで1 N / sの負荷制御プロファイルの下でサーボ油圧材料試験機に装填されました。力および変位の値は、100Hzの周波数で測定した。この画像は、ウィンドウの中央にローディングチップが適用されるように設定されたウィンドウテストを示しています。(K)プロットは、MATLABのTrapz関数を使用して応力-ひずみ曲線下の合計面積を計算することによって決定された材料の靭性を示しています(SEM±平均;厚さとガラスカバースリップごとに3つの別々のPDMSウィンドウを使用するn = 3/group;テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析)。(L)プロットは、応力-ひずみ曲線の線形部分から決定されたヤング率を示しています(SEM±平均;3つの別々のPDMS窓とガラスカバースリップを使用したn = 3/group;ウェルチ補正によるt検定)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:シリコン窓は高い忍容性と寿命を示す。 (A)窓手術後11日目にグリッドのない腹側腹部画像窓を有する生後7週齢の雄C57BL/6Jマウスの代表画像。(B)窓手術後14日目にグリッドを含む膵臓イメージングウィンドウを有するオス7週齢C57BL/6Jマウスの代表画像。(c)窓手術後>7日目にグリッドを含む乳腺画像窓を有する生後12週齢の雌性C57BL/6J c-fms-EGFPマウスの代表画像。(d)0日目(手術直後)および術後35日目に、雄7週齢のc−fms−EGFPマウスにおける肝臓画像化ウィンドウ(上段)および画像化(下段)を撮影した。適量の皮膚を除去し、接着剤で創傷を密封すると、皮膚が再上皮化して窓を押し広げるのを防ぎ、臓器を長期間画像化することができる。スケール バー = 30 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: ウィンドウ内のグリッドを使用すると、同じ視野を追跡できます。 (A)レーザーカットステンレス鋼窓のカスタム生産のための詳細な仕様。(B)イメージングウィンドウ内に埋め込まれたグリッドが肝臓の上に見え、ウィンドウの周りの接着剤の縁がはっきりと見えます。(c)2つの光子顕微鏡の眼を通しての窓の眺め。肝臓からの血管(赤)と緑の信号がバックグラウンドで見ることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図 8: ウィンドウ挿入に対する全身的および局所的な応答。 (A~C)7週齢のC57BL/6J雌マウスについて、肝臓への窓挿入後28日間の期間にわたって体重をモニターした(ある)、膵臓(B)または乳腺(C).未処置の年齢一致マウスと比較した体重変化パーセントが示されている。(*)は、正常な体重を取り戻さなかったため、画像化実験から打ち切られたであろうマウスを示す。同じコントロールマウスが3つのパネルすべてに表示され、各タイプのウィンドウとの比較が容易になります。(D)白血球(WBC)数は、手術後3日目、14日目、および28日目(乳腺窓)または35日目(肝臓または膵臓窓)にモニターされる。マウスのWBCカウントの正常範囲は破線で示されます。(E,G,)未処理の対照(左)および7週齢のC57BL/6Jマウス(右)上に画像化窓を挿入してから14日後の組織切片のヘマトキシリンおよびエオジン染色(E) 肝臓, (G) 膵臓、または ()乳腺。(E,)表在性および局所肉芽形成病変は、肝臓および乳腺の表面(矢印)に沿った離散的な場所で見られ、接着剤に対する反応を示唆している。*で示す正常組織は、肉芽病変に隣接する領域に見える。3匹のコントロールおよび3匹の肝臓窓を有するマウスを、各時点(手術後3日目、14日目、および35日目)で評価したが、肝臓窓を有する6匹のマウスは、手術後35日目に評価された。3匹のマウスのうち2匹は、3日目および14日目に肉芽組織を示した。3匹のマウスのうち1匹が35日目に肉芽組織を示した。 乳腺窓を有する3匹の対照および3匹のマウスを、各時点(手術後3日目、14日目、および28日目)で評価した。マウス3匹中3匹は、3日目および14日目に乳腺の脂肪組織において肉芽組織または炎症反応を有していた。3匹のマウスのうち0匹が28日目に肉芽形成病変または炎症反応を示した。(G)膵臓に有意な病変は見られない。3匹のコントロールおよび膵臓窓を有する3匹のマウスを、各時点(手術後3日目、14日目、および35日目)で評価した。膵臓窓を有するマウスは、いずれの時点でも肉芽組織を有さなかった。スケールバー = 500 μm (F,H,J)マルチプレックス免疫組織化学染色を、未処置の対照および7週齢のC57BL/6Jマウスからの組織切片に対して、画像化窓(F) 肝臓, (H) 膵臓または (J)乳腺。CD45、CD68およびミエロペルオキシダーゼ(MPO)に対する抗体を用いて、白血球、単球/マクロファージおよび好中球をそれぞれ標識した。CD45およびCD68染色を同じ切片に対して行い、MPO染色を同じ組織の連続切片に対して行った。抗CD45抗体をHRP結合二次抗体で検出し、最初に画像化し、次いで色原体および二次抗体を剥離し、スライドを抗CD68を認識する二次抗体と共にインキュベートした。定量化は、色の閾値化によってフィジーのソフトウェアで実行されました。パラメータは、抗体および組織にわたって調整した。プロットは、視野あたりの細胞数(FOV)として定量化を示します(SEM±平均、n = 3/グループ、Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析、有意差のみが示されています)。(K) オス C57BL/6J c-fms-EGFP 8〜11週齢のマウスは、肝臓の右葉にシリコーン画像窓を挿入した。蛍光標識レクチン(100 μL)を、各イメージングセッションの直前に静脈内注射した。画像は、手術後1日目、3日目、5日目の同じグリッド軌跡にある1匹のマウスからのもので、グリッドから約200μm下にあります。スケールバー = 30 μm。励起波長960nm、レーザーパワー10%を用いて画像化した。血管は赤く表示されます。マクロファージは緑色(白い矢印)で表示されます。3匹の画像化されたマウスの代表。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:腫瘍は、ウィンドウ挿入後数週間にわたって複数の時点で視覚化することができる。 膵窓挿入時に1.5 x 104 iGFP-1199膵臓癌細胞を同所注射した1匹の雄7週齢C57BL/6Jマウスからの代表的な画像を、窓挿入後の11日目および14 日目に画像化した。スケールバー = 30 μm。励起波長960nm、レーザーパワー10%を用いて画像化した。6匹の画像化されたマウスの代表である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 10
図10: 正常な乳腺退縮中の免疫細胞浸潤の動的変化。 イメージングウィンドウに埋め込まれた金属グリッドを使用して、乳腺退縮時などの正常組織リモデリング中に同じ位置を画像化することができる。免疫細胞浸潤のような動的変化を監視する際のシリコーン窓の機能性をさらに評価するために、12週齢の雌C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFPを; 腹部乳腺の上に挿入された画像化窓を有するLysM−eGFPマウスを、乳腺退縮後の2日目および4日目に画像化した。好中球は緑色(白い矢印)で表示されます。好中球エラスターゼ活性は、イメージング開始の4時間前に好中球エラスターゼ蛍光プローブを注入することによって可視化され、赤色(または好中球と共局在化する場合は黄色)で現れる。上皮細胞は青色で表示されます。スナップショットは、Z 軸に沿った 5 つの画像 (深さ 100 ~ 150 mm) の最大強度投影です。画像は 動画3A 3Bからのもので、下段の画像ではCFP信号のみが表示され、画像は赤い破線でマークされ、2つの異なる時点で組織内の同じ位置を視覚化します。スケールバー = 30 μm。960nmおよび1080nmの励起波長を用いて画像化し、それぞれ10%および15%でのレーザーパワー。4匹の画像マウスの代表である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 11
図11:がん転移の形成を経時的に追跡できる。 10週齢の雄性C57BL/6Jマウスに、窓挿入時に門脈を介して核限局性ヒストンH2B結合シアン蛍光タンパク質(H2B-CFP)を発現する膵臓癌細胞を1 x105 KPC-BL/6-1199注射した。肝臓画像化は、注射後24時間(1日目)および3つの後の時点(最大9日間)に、示されたように横窓を通して実施した。注射後1日目と3日目に見える単一の癌細胞が白い矢印で示されています。コラーゲン線維からの第2高調波信号もシアンチャネルで可視化された(黄色矢印)。画像は、異なる各時点で同じマウスからのものです。深さ300 μm~350 μmで撮影された単一の z 平面画像。スケールバー = 30 μm。励起波長880nmを用いて画像化した。レーザー出力は8%です。 3匹の画像化されたマウスの代表。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

映画1:シリコンイマジンgウィンドウはマウスで忍容性が良好です。 映画は、9週齢のオスのC57BL/6Jマウスがウィンドウ挿入から14日後を示しています。マウスは、疼痛に関連する標準的な行動(例えば、グルーミング不良、閉塞目、または嗜眠)のいずれも示さない。6匹の記録されたマウスの代表は、窓移植の成功後に観察された100匹以上のマウスと一致した。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

映画2:同所移植された膵臓癌細胞の細胞内イメージング。 iGFP-1199細胞を雄生7週齢C57BL/6Jマウスの膵臓に同所的に注射し、癌細胞の注射および窓挿入後の11日目に画像化した。このムービーは、Z軸に沿った6つの画像の最大強度投影であり、2時間の撮影期間から抽出されます。タイムスタンプ (h:min:s:ms)。6匹の画像マウスの代表である。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

動画3: ACTB-ECFPにおける免疫細胞浸潤の変化;LysM-eGFP マウスは退縮中である。メス C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; 骨髄系細胞(主に顆粒球だけでなくマクロファージでも)でGFPを発現するLysM-eGFPマウス、およびすべての細胞でECFP(ただし上皮細胞で最も高い)を8週齢で飼育した。分娩後、子犬はマウス1匹あたり6匹の仔に正規化された。分娩後10日目に、子犬を離乳させ、腹部乳腺画像窓を挿入した。骨髄系細胞は緑色で現れる。イメージング開始の4時間前に注射された好中球エラスターゼ680 FASTプローブを用いて標識された好中球エラスターゼ活性は、赤色で現れる(好中球と共局在化すると黄色に見える)。上皮細胞は青色で現れる。ムービーは、Z 軸に沿った 5 つの画像(深さ 100 ~ 150 μm)の最大強度投影です。 (A) 乳腺退縮の2日目の画像化。スケールバー = 20 μm。960nmおよび1080nmの励起波長を用いて画像化し、それぞれ10%および15%でのレーザーパワー。(b) 乳腺退縮の4日目の画像化。スケールバー = 20 μm。 (C) Movie 3Bからの関心領域のより高い倍率化は、乳腺の上皮細胞と互いに相互作用する2つの好中球を示す。一過性膜突起の形成は、好中球移動中に前縁部で観察することができる。タイムスタンプ (h:min:s:ms)。4匹の画像マウスの代表である。 ここをクリックしてムービー3Aをダウンロードしてください。   ここをクリックしてムービー3Bをダウンロードしてください。   ここをクリックしてMovie 3Cをダウンロードしてください。

動画4:退縮中の c-fms-EGFP マウスにおける免疫細胞浸潤の変化。 雌性C57BL/6J c-fms-EGFPマウスを、GFP標識マクロファージと共に、8週齢で飼育した。分娩後、同腹仔をマウス1匹あたり6匹の子犬に調整した。分娩後10日目に、子犬を離乳させ、腹部乳腺画像窓を挿入した。インボリューション1日目(ウィンドウ挿入後1日目)に取得されたこの映画は、インボリューション中の顕著なマクロファージ浸潤を強調する。マクロファージは緑色で、コラーゲン線維(第二高調波生成)は青色で、血管は赤色で表示されます(Lectin-DyLight 594)。スケールバー = 20 μm。画像は、Z 軸に沿った 5 つの画像の最大強度投影です (深さ 100 ~ 150 um)。960nmおよび800nmの励起波長を用いて画像化し、それぞれ10%および15%でのレーザーパワー。タイムスタンプ (h:min:s:ms)。3匹の画像化されたマウスの代表。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

生体内イメージングウィンドウは、生理学的および病理学的プロセスを細胞分解能で直接視覚化するための重要なツールです。マウスに柔軟なシリコーンイメージングウィンドウをキャスティングおよび挿入するために説明されている新しい手順は、現在使用されているイメージングウィンドウの最も一般的な問題(滲出液、破損、および通常の可動性との干渉)のいくつかを克服し、マウスにさらなる安全性を提供し、この技術のアクセシビリティを向上させます。

最も広く使用されているイメージングウィンドウは、ガラスカバースリップを保持する金属フレームで構成されています。これらのプロトタイプウィンドウの使用に対する主な障害は、金属リングの固定には面倒なステッチング手順が必要であり、高度な外科的訓練を受けた人員が必要であることです。さらに、フレームの製造にはコストがかかり、特殊な機器が必要です。PDMS ウィンドウは、これらの問題の両方を克服します。PDMSウィンドウを挿入する手順は、ステッチングを排除し、技術を学ぶための障壁を大幅に下げます。窓を作る材料も安価で、簡単に購入できます。さらに、窓の形状と外科的処置の両方は、乳腺、肝臓、膵臓、脾臓、および腸を含む異なる器官を画像化するために適合させることができる。

現在の生体内イメージングウィンドウでは、通常数日間縦方向イメージングが可能ですが、いくつかの一般的な問題により、これらのウィンドウの使用が長期間制限されています。ガラス窓の重量およびサイズは、マウスの自由な動きを妨げる可能性があり、滲出液は窓に対して蓄積することができる。マウスはまた、ガラスカバースリップを損傷し、創傷および感染をもたらす可能性がある。対照的に、ここで説明する手順は、動物にとって苦痛を最小限に抑えながら、組織への同じレベルのアクセシビリティを維持する。PDMSは、薬物送達装置、顔再建手術、乳房インプラントなど、ヒトにおける生物医学的用途に広く使用されている、安全で生体安定性のある合成ポリマーである。窓に対する動物の耐性を高めるだけでなく、ガラスとは対照的に生物学的に不活性な材料を使用することは、局所的な炎症が交絡効果となる免疫系を含む研究にとって特に重要である。さらに、大きな改善点は、マウスが噛んで引っ張るので、ステッチの排除であり、金属フレームのガラスイメージングウィンドウが脱落する可能性があります。この問題は、ステッチが溝9に隠されるように設計された新しい世代のウィンドウによって部分的に解決されました。しかし、この後者の戦略は、しばしばステッチがきつく引っ張られすぎて、組織の壊死および痛みをもたらす複雑でエラーを起こしやすい手順である財布ストリング縫合を必要とする。したがって、窓を所定の位置に接着する能力は、シリコーン窓アプローチの主要な利点を構成する。さらに、窓は、ガラスカバースリップ17を保持するために金属の代わりにシリコーンを使用した窓の比較において以前に評価されたように、無視できる程度の重量を有する柔軟で耐久性のある材料でできており、これは動物の動きに対するその影響を減少させる。ガラスカバースリップを完全に排除することにより、シリコーン窓は金属フレームとガラスの両方の問題を排除します。さらに、窓の柔軟性により、窓を簡単に挿入することができ、剛性表面を臓器に接着することによって引き起こされる応力力を低減し、観察される組織への永久的な損傷のリスクを低減する。さらに、窓は挿入して所定の位置に保持するのがはるかに簡単であるため、全体的な手順にかかる時間が短縮され、麻酔の延長による副作用の可能性が制限されます。肝臓への挿入の場合、処置時間の差は特に大きく、金属フレーム窓の45分からシリコーン窓の15分までである。実際、金属フレームを肝臓に挿入するには、剣状突起(胸骨の端にある軟骨)の解剖が必要であり、これも潜在的に痛みを伴い、持続的な炎症を引き起こすが、この解剖はシリコーン窓を挿入するのに不要である。最後に、この研究で提示されたイメージングウィンドウは、可能なアプリケーションに関してさらなる利点を提供する。例えば、ガラス窓とは異なり、シリコーン窓は組織に容易にアクセスできるため、癌細胞、蛍光色素、または薬物を窓から直接注入することができる。

乳腺を含む様々な解剖学的位置への挿入に適した別のPDMSベースのシリコーン画像化窓が、最近記載された18。その窓は、ステッチや接着剤を必要とせずに窓の迅速な移植を可能にする形状および特殊なエッジを生成するように成形される。対照的に、ここに提示されるシリコーン窓は、いかなる特別な型も必要とせず、そして重要なことに、解剖学的位置および個々のマウスに適応するように外科的処置の間に形状に切断することができる。本明細書に記載されるプロトコルは接着剤の使用を必要とするが、この追加の要件は、肝臓および脾臓を含む腹部器官の画像化を可能にする。さらに、ここで説明するシリコーン窓は、窓内にステンレス鋼グリッドを埋め込むことを可能にし、参照ランドマークを提供する。これらのランドマークは、時間の経過とともに同じ正確な位置のトレースを可能にし、転移性病変の発症など、数日から数週間かかるプロセスを研究するために、複数のセッションにわたって同じ部位の反復イメージング(縦方向イメージング)を容易にする。

要約すると、シリコーンイメージングウィンドウは、乳腺または腹部器官の縦方向IVMに使用するために開発された。窓は光学的に透明で、耐久性が高く、安価です。ウィンドウ挿入手順が単純であるため、ウィンドウベースの生体内イメージングアプローチを実装するために必要な技術的スキルが低下します。多様な組織部位への窓の適応性は、膨大な数の生物学的研究におけるIVMの実施を可能にする。

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Disclosures

M.E.は、Insmed, Inc.の ブレンソカティブ の研究諮問委員会のメンバーです。Vividion Therapeutics, Inc.の科学諮問委員会のメンバー。Protalix, Inc.のコンサルタント。Agios Pharmaceuticals, Inc.の株式を保有していますD.A.T.はMestag Therapeuticsの共同設立者であり、科学諮問委員会のメンバーであり、Mestag Therapeutics、Leap Therapeutics、Surface Oncology、Cygnal Therapeuticsの株式を保有しています。他の著者は、競合する利益を宣言していません。

Acknowledgments

レーザーカットされたステンレス鋼グリッドの設計と最適化におけるロブ・アイファートの支援に感謝します。この研究は、CSHLがんセンター(P30-CA045508)および国立衛生研究所(NIH)からのM.E.のための資金(1R01CA2374135および5P01CA013106-49)によって支援された。CSHLとノースウェルヘルス;トンプソン家族財団;アメリカ全土を泳ぐ。サイモンズ財団からCSHLへの助成金。M.S.は、一般医科学研究所医学者養成プログラム研修賞(T32-GM008444)およびNIH国立がん研究所(受賞番号1F30CA253993-01)の支援を受けました。L.M.はジェームズ・S・マクドネル財団のポスドク・フェローシップの支援を受けています。J.M.A.は、がん研究所/アービントン・ポスドク・フェローシップ(CRI賞#3435)の受賞者です。D.A.T.は、Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer ResearchとThompson Family Foundationの支援を受けています。漫画は Biorender.com で作成されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows - Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

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References

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がん研究 第179号
透明なシリコーン窓による縦方向の生体内イメージング
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Maiorino, L., Shevik, M., Adrover,More

Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y. X., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

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