Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

Summary

Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.

Abstract

La microscopía intravital (IVM) permite la visualización del movimiento, la división y la muerte celular a resolución de una sola célula. La IVM a través de ventanas de imágenes insertadas quirúrgicamente es particularmente poderosa porque permite la observación longitudinal del mismo tejido durante días o semanas. Las ventanas de imágenes típicas comprenden una cubierta de vidrio en un marco de metal biocompatible suturado a la piel del ratón. Estas ventanas pueden interferir con el libre movimiento de los ratones, provocar una fuerte respuesta inflamatoria y fallar debido a vidrios rotos o suturas rotas, cualquiera de las cuales puede requerir eutanasia. Para abordar estos problemas, se desarrollaron ventanas para imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias a largo plazo a partir de una película delgada de polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona ópticamente transparente utilizado anteriormente para ventanas de imágenes craneales. Estas ventanas se pueden pegar directamente a los tejidos, reduciendo el tiempo necesario para la inserción. PDMS es flexible, lo que contribuye a su durabilidad en ratones a lo largo del tiempo: se han probado hasta 35 días. Las imágenes longitudinales son imágenes de la misma región del tejido durante sesiones separadas. Se incrustó una rejilla de acero inoxidable dentro de las ventanas para localizar la misma región, lo que permitió la visualización de procesos dinámicos (como la involución de la glándula mamaria) en los mismos lugares, con días de diferencia. Esta ventana de silicona también permitió el monitoreo de células cancerosas diseminadas individuales que se convierten en micrometástasis con el tiempo. Las ventanas de silicona utilizadas en este estudio son más fáciles de insertar que las ventanas de vidrio con marco de metal y causan una inflamación limitada de los tejidos fotografiados. Además, las rejillas integradas permiten un seguimiento sencillo de la misma región del tejido en sesiones repetidas de imágenes.

Introduction

La microscopía intravital (IVM), la imagen de tejidos en animales anestesiados, ofrece información sobre la dinámica de eventos fisiológicos y patológicos a resolución celular en tejidos intactos. Las aplicaciones de esta técnica varían ampliamente, pero la IVM ha sido fundamental en el campo de la biología del cáncer para ayudar a dilucidar cómo las células cancerosas invaden los tejidos y hacen metástasis, interactúan con el microambiente circundante y responden a los medicamentos ^1,2,3. Además, la IVM ha sido clave para avanzar en la comprensión de los complejos mecanismos que gobiernan las respuestas inmunes al proporcionar información complementaria a los enfoques de perfiles ex vivo (por ejemplo, citometría de flujo). Por ejemplo, los experimentos de imágenes intravitales han revelado detalles sobre las funciones inmunes en relación con la migración celular y el contacto célula-célula y han ofrecido una plataforma para cuantificar la dinámica espaciotemporal en respuesta a una lesión o infección 4,5,6,7. Muchos de estos procesos también se pueden estudiar a través de la tinción histológica, pero solo la IVM permite el seguimiento de los cambios dinámicos. De hecho, mientras que una sección histológica ofrece una instantánea del tejido en un momento dado, las imágenes intravitales pueden rastrear eventos intercelulares y subcelulares dentro del mismo tejido a lo largo del tiempo. En particular, el progreso en el etiquetado de fluorescencia y el desarrollo de reporteros moleculares han permitido que los eventos moleculares se correlacionen con comportamientos celulares, como la proliferación, la muerte, la motilidad y la interacción con otras células o la matriz extracelular. La mayoría de las técnicas de IVM se basan en la microscopía de fluorescencia, que debido a la dispersión de la luz, hace que las imágenes de tejidos más profundos sean un desafío. El tejido de interés, por lo tanto, a menudo necesita ser expuesto quirúrgicamente con un procedimiento a menudo invasivo y terminal. Por lo tanto, dependiendo del sitio del órgano, el tejido se puede visualizar continuamente durante un período que varía de unos pocos a 40 h⁸. Alternativamente, la inserción quirúrgica de una ventana de imagen permanente permite la obtención de imágenes del mismo tejido secuencialmente durante un período de días a semanas ^7,9.

El desarrollo de nuevas ventanas de imagen se ha destacado como una necesidad tecnológica para mejorar aún más los enfoques de imagen intravital¹⁰. La ventana de imagen intravital prototípica es un anillo metálico que contiene una funda de vidrio asegurada a la piel con suturas¹¹. La interferencia con el libre movimiento, la acumulación de exudado y el daño a la cubierta de vidrio son problemas comunes que se observan con el uso de tales ventanas. Además, la ventana prototípica requiere una producción especializada, y el procedimiento quirúrgico puede requerir una capacitación extensa. Para abordar estos problemas, el polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona, que anteriormente se ha utilizado en ventanas craneales para imágenes a largo plazo en el cerebro¹², se adaptó para su uso en imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias. Aquí, se presenta un método detallado para generar ventanas de silicona basadas en PDMS, que incluye cómo fundir la ventana alrededor de una rejilla de acero inoxidable para proporcionar puntos de referencia para imágenes repetidas de las mismas regiones de tejido. Además, se describe un procedimiento quirúrgico simple y sin puntos de sutura para insertar la ventana sobre los órganos abdominales o la glándula mamaria. Este nuevo enfoque supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente y aumenta la accesibilidad de las imágenes intravitales longitudinales.

Protocol

Todos los procedimientos descritos se realizaron de acuerdo con las Pautas Quirúrgicas del Laboratorio de Cold Spring Harbor y habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Laboratorio de Cold Spring Harbor.

1. Fundición de la ventana de silicona

1. Prepare el polímero de silicona (PDMS) mezclando el elastómero base y el agente de curado en una proporción de 10: 1 (v / v).
2. Funda una ventana depositando una pequeña cantidad de PDMS en una superficie estéril y lisa y ajusta la relación volumen-área al espesor deseado.
   NOTA: El uso de 200 mg de solución de polímero para un círculo de 22 mm de diámetro en la tapa de una tapa de 24 placas de pozo da como resultado un buen compromiso entre la robustez de la ventana y la claridad óptica.
3. Opcional: Para proporcionar puntos de referencia para imágenes repetidas de las mismas regiones de tejido, presione ligeramente una rejilla de acero inoxidable en la silicona después de que el PDMS esté en la superficie de fundición deseada.
4. Para eliminar las burbujas de aire, coloque la superficie recubierta en un desecador al vacío durante 45 minutos para desgasificar el polímero.
5. Curar las ventanas de silicona en un horno a 80 °C durante 45 min.
6. Puntúe el polímero en los bordes del molde y pele suavemente las ventanas curadas de la superficie utilizada para la fundición con fórceps.
7. Antes de la cirugía, esterilice las ventanas en autoclave.

2. Preparación del ratón para la inserción de la ventana de silicona

1. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 4% (v/v). Mueva el ratón a una almohadilla de calentamiento en la mesa quirúrgica, coloque el ratón en la máscara nasal de anestesia y reduzca la concentración de isoflurano al 2% para el mantenimiento durante toda la cirugía.
2. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies de las extremidades posteriores. No proceda hasta que el ratón esté inactivo y no muestre una respuesta refleja de pellizco del dedo del pie.
3. Aplique lubricante oftálmico en los ojos para evitar que se sequen y prevenir traumatismos.
4. Administrar analgesia preventiva (buprenorfina 0,05 mg/kg) por vía subcutánea.
5. Afeitar el sitio quirúrgico y eliminar completamente el vello con una crema depilatoria.
6. Aplique la solución de povidona yodada (10% v / v) y etanol (70% v / v) consecutivamente 3 veces para prevenir la infección del sitio quirúrgico.

3. Inserción de una ventana ventral para la obtención de imágenes en el hígado; adaptable para otros órganos abdominales (Figura 1)

1. Coloque el ratón en posición supina.
2. Haga una incisión de 10 mm a partir de 3 mm hacia abajo del proceso xifoide con tijeras y fórceps estériles.
3. Retire una sección de piel de 1–1,5 cm² a lo largo de la línea media.
4. Use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel.
5. Opcional: Para visualizar una porción más grande del hígado, use hisopos de algodón estériles humedecidos con solución salina estéril para empujar el hígado hacia abajo desde el diafragma revelando el ligamento falciforme que conecta el hígado con el diafragma. Cortar el ligamento teniendo cuidado de no cortar la vena cava inferior.
6. Retire el adhesivo quirúrgico con una jeringa de 31 G, aplique una pequeña cantidad de él en la superficie del hígado alrededor de los bordes del área a fotografiar. Este adhesivo crea un sello circular, dejando el área central intacta para la obtención de imágenes.
   PRECAUCIÓN: Limite el adhesivo a pequeñas gotas que formen un patrón circular alrededor del área de imágenes. No se puede obtener una imagen del tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo. No es necesario secar el tejido antes de aplicar el adhesivo.
   NOTA: Cualquier adhesivo a base de cianoacrilato se puede utilizar con éxito para este procedimiento. El adhesivo quirúrgico asegura la esterilidad. Para los procedimientos terminales, los súper pegamentos de uso múltiple producen buenos resultados.
7. Coloque la ventana con fórceps y manténgala firmemente contra el hígado hasta que el adhesivo se haya secado (~ 2 min).
8. Dobla los bordes de la ventana debajo del peritoneo.
9. Con una jeringa, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo del peritoneo. Empuje hacia abajo el peritoneo con fórceps para asegurarlo a la ventana.
10. Del mismo modo, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico sobre el peritoneo antes de empujar hacia abajo la piel con fórceps para asegurarlo al peritoneo.
    NOTA: Si se realiza correctamente, un área circular de tejido hepático ahora debe ser visible a través de la ventana.
11. Aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que ayudará a evitar que la piel vuelva a crecer sobre la ventana.
    PRECAUCIÓN: Si el procedimiento se lleva a cabo utilizando técnicas quirúrgicas estériles y la ventana se esteriliza antes de la inserción, el sellado de la herida con adhesivo quirúrgico es suficiente para evitar infecciones. Sin embargo, la falta de seguimiento de las técnicas asépticas adecuadas durante la inserción quirúrgica o el cierre imperfecto puede provocar una infección manifiesta o subclínica y la desecación del tejido.

4. Inserción de una ventana lateral para la obtención de imágenes en el hígado; compatible con la inyección simultánea de células cancerosas en la vena porta (Figura 2)

1. Coloque el ratón en la posición del decúbito lateral izquierdo
2. Haga una incisión de 10 mm en el flanco derecho 3 mm por debajo del arco costal usando tijeras y fórceps estériles.
3. Retire una sección de piel de 1 cm² .
4. Use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel.
5. Retire el adhesivo quirúrgico con una jeringa de 31 G, aplique una pequeña cantidad de él en la superficie del hígado alrededor de los bordes del área a fotografiar.
   PRECAUCIÓN: Limite el adhesivo a pequeñas gotas que formen un patrón circular alrededor del área de imágenes. No se puede obtener una imagen del tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo.
   NOTA: Cualquier adhesivo a base de cianoacrilato se puede utilizar con éxito para este procedimiento. El adhesivo quirúrgico asegura la esterilidad. Para los procedimientos terminales, los súper pegamentos de uso múltiple producen buenos resultados.
6. Coloque la ventana con fórceps y manténgala firmemente contra el hígado hasta que el adhesivo se haya secado (~ 2 min).
7. Dobla los bordes de la ventana debajo del peritoneo.
8. Con una jeringa, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo del peritoneo. Empuje hacia abajo el peritoneo con fórceps para asegurarlo a la ventana.
9. Del mismo modo, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico sobre el peritoneo antes de empujar hacia abajo la piel con fórceps para asegurarlo al peritoneo.
   NOTA: Si se realiza correctamente, un área circular de tejido hepático ahora debe ser visible a través de la ventana.
10. Aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que ayudará a evitar que la piel vuelva a crecer sobre la ventana.
11. Si se requiere una inyección en la vena porta:
    1. Coloque el ratón en posición supina.
    2. Haga una incisión de 10 mm a partir del proceso xifoide en la piel.
    3. Usando un segundo par de tijeras y fórceps estériles, haga una incisión de 10 mm en el peritoneo.
    4. Sumerja dos hisopos de algodón en solución salina estéril.
    5. Use los hisopos de algodón para tirar suavemente del intestino sobre una gasa estéril humedecida con solución salina estéril, teniendo cuidado de no torcer o alterar la orientación.
    6. Siga desplazando el intestino de la cavidad abdominal hasta que la vena porta sea visible en el lado derecho del abdomen.
    7. Inserte una aguja de 31–33 G caudal de 5–7 mm hasta el punto de entrada de la vena porta en el hígado, asegurándose de proceder dentro del vaso sanguíneo y no a través de él.
    8. Inyecte lentamente las células cancerosas (resuspendidas en 100 μL de PBS estéril).
       NOTA: Para este experimento, la línea celular de cáncer de páncreas amurino (por ejemplo, KPC-BL/6-1199) se puede cultivar en medios DMEM completos y 1 x 10⁵ células inyectadas en 100 μL de PBS estéril.
    9. Para prevenir el sangrado, inmediatamente después de retirar la aguja, aplique una presión suave en el sitio de la inyección con un pequeño trozo de esponja quirúrgica durante 1-2 min.
    10. Después de liberar la presión, controle el sitio durante 1-2 minutos para garantizar la hemostasia.
    11. Usando hisopos de algodón humedecidos, devuelva el intestino a la cavidad abdominal siguiendo la orientación fisiológica del órgano.
    12. Usando fórceps estériles, inserte la ventana inmediatamente debajo del peritoneo, en el lado izquierdo de la cavidad abdominal del ratón.
    13. Sutura con suturas de seda 4-0 y grapa la incisión de la línea media con clips enrollados de acero inoxidable de 7 mm.
    14. Mueva el ratón a la posición del decúbito lateral izquierdo
    15. Haga una incisión de 10 mm en el flanco derecho 3 mm debajo del arco costal a través de la piel usando tijeras y fórceps estériles.
    16. Retire una sección de piel de 1 cm² alrededor de la incisión.
    17. Use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel.
    18. Tire de la ventana en su lugar sobre el hígado antes de pegarla en su lugar, como se describe en los pasos 4.8 a 4.10.

5. Inserción de la ventana para la obtención de imágenes en el páncreas (Figura 3)

1. Coloque el ratón en la posición del decúbito lateral derecho.
2. Haga una incisión de 10 mm en el flanco izquierdo 3 mm por debajo del arco costal usando tijeras y fórceps estériles.
3. Retire una sección de piel de 1 cm² alrededor de la incisión.
4. Use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel.
5. Usando hisopos de algodón estéril empapados con solución salina estéril, tire suavemente del bazo para visualizar el páncreas. Proceda a reposicionar el páncreas con los hisopos de algodón humedecidos para hacer visible más área de superficie a través de la incisión.
   NOTA: En este punto, las células de cáncer de páncreas se pueden inyectar ortotópicamente en el páncreas si es parte del diseño experimental.
6. Retire el adhesivo quirúrgico con una jeringa de 31 G, aplique una pequeña cantidad de él en la superficie del páncreas alrededor de los bordes del área a fotografiar.
   PRECAUCIÓN: Limite el adhesivo a pequeñas gotas que formen un patrón circular alrededor del área de imágenes. No se puede obtener una imagen del tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo.
7. Coloque la ventana con fórceps y manténgala firmemente contra el páncreas hasta que el adhesivo se haya secado (~ 2 min).
8. Dobla los bordes de la ventana debajo del peritoneo.
9. Con una jeringa, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo del peritoneo. Empuje hacia abajo el peritoneo con fórceps para asegurarlo a la ventana.
10. Del mismo modo, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico sobre el peritoneo antes de empujar hacia abajo la piel con fórceps para asegurarlo al peritoneo.
    NOTA: Si se realiza correctamente, un área circular de tejido pancreático ahora debe ser visible a través de la ventana.
11. Aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que ayudará a evitar que la piel vuelva a crecer sobre la ventana.

6. Inserción de la ventana para la obtención de imágenes en la glándula mamaria (Figura 4)

1. Coloque el ratón en posición supina.
2. Haga una incisión medial de 10 mm en uno de los pezones inguinales con tijeras y fórceps estériles.
3. Retire una sección de piel de 0,5 cm² por encima de la glándula mamaria.
4. Use un segundo par de tijeras estériles para separar cuidadosamente la glándula mamaria de la piel extendiendo las tijeras entre las dos superficies para interrumpir la adherencia.
   NOTA: Para facilitar la obtención de imágenes del área de la glándula mamaria inguinal, tenga cuidado de diseccionar una porción de piel por encima de la glándula mamaria pero superior a la pata trasera, de modo que la ventana no limite la movilidad del ratón.
5. Retire el adhesivo quirúrgico con una jeringa de 31 G, aplique una pequeña cantidad de él en la superficie de la glándula mamaria alrededor de los bordes del área a fotografiar.
   PRECAUCIÓN: Limite el adhesivo a pequeñas gotas que formen un patrón circular alrededor del área de imágenes. No se puede obtener una imagen del tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo.
6. Coloque la ventana con fórceps y manténgala firmemente contra la glándula mamaria hasta que el adhesivo se haya secado (~ 2 min).
   NOTA: Un área circular de tejido de la glándula mamaria ahora debe ser visible a través de la ventana si se realiza correctamente.
7. Dobla los bordes de la ventana debajo de la piel.
8. Con una jeringa, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo de la piel. Empuje hacia abajo la piel con fórceps para asegurar la piel a la ventana.
9. Aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que ayudará a evitar que la piel vuelva a crecer sobre la ventana.

7. Recuperación postquirúrgica

1. Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia con abundante material de anidación, asegurándose de que parte de la jaula descanse sobre una almohadilla térmica.
2. Monitoree el mouse continuamente hasta que esté consciente y móvil.
3. Si es necesario, proporcione una dosis adicional de analgésico 12 h después de la dosis preventiva.
   NOTA: La analgesia adicional generalmente es innecesaria, pero consulte con un veterinario si el ratón muestra signos de angustia (como espalda encorvada, pelaje descuidado o pérdida de interés en la comida). Monitoree al ratón diariamente durante los primeros 3 días después de la cirugía para detectar signos de infección u otros efectos adversos. Menos del 2% de los ratones requieren atención veterinaria o eutanasia, generalmente debido al desprendimiento parcial de la ventana. Es importante tener en cuenta que para los ratones machos con ventanas de imágenes hepáticas ventrales, la lucha entre ratones puede provocar el desprendimiento de las ventanas. Esto se evita alojando a los ratones por separado.

8. Imágenes a través de la ventana

1. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 4% (v/v).
2. Aplique lubricante oftálmico en los ojos para evitar que se sequen y prevenir traumatismos.
3. Mueva el ratón de la cámara de inducción a la etapa del microscopio. Coloque al ratón en la máscara nasal de anestesia y reduzca la concentración de isoflurano a aproximadamente 1-1.5% para la anestesia de mantenimiento durante todo el procedimiento de imágenes.
4. Coloque un sensor de almohadilla de presión debajo del mouse para monitorear la frecuencia respiratoria y fije el mouse al escenario con cinta quirúrgica suave.
5. Inserte un termómetro rectal para controlar la temperatura corporal durante toda la sesión de imágenes.
6. Encienda la almohadilla térmica, monitoreando el mouse de cerca para asegurarse de que la temperatura corporal no exceda los 37 ° C.
7. Utilice software para monitorear la frecuencia respiratoria del mouse. La velocidad óptima es de ~ 1 respiración / segundo. Ajuste la anestesia según sea necesario.
8. Antes de cada sesión de imágenes, limpie la ventana de cualquier medio de inmersión residual de la lente y los desechos limpiándola suavemente con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70% (v / v).
9. Cuando utilice una lente de inmersión en agua, aplique gel de ultrasonido en la ventana, evitando burbujas.
   NOTA: El agua destilada también se puede utilizar, pero puede requerir una nueva aplicación durante la toma de imágenes.
10. Para encontrar la profundidad óptima para la obtención de imágenes, primero, ubique la cuadrícula y colóquela en foco.
11. Determine la profundidad aproximada de las imágenes de tejido estableciendo la parte inferior de la cuadrícula en 0. Esta información es necesaria para localizar el plano z correspondiente en las sesiones de imagen posteriores.
12. Para identificar la misma ubicación en varias sesiones de imágenes, utilice los cuadrados de la cuadrícula como punto de referencia. Durante la obtención de imágenes, observe la orientación de la cuadrícula y la ubicación dentro de la cuadrícula de cada campo de visión fotografiado (por ejemplo,^2ª fila desde la parte superior,^4ª cuadrada desde la izquierda).
13. Durante las sucesivas sesiones de imágenes, use la cuadrícula para navegar de regreso a áreas de cuadrícula específicas y, por lo tanto, a campos de imágenes.
14. Después de cada sesión de imágenes, retire cualquier medio de inmersión residual de la lente y los desechos limpiando suavemente la ventana con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70% (v / v).

Representative Results

Las imágenes intravitales a través de ventanas de imágenes se pueden usar para observar, rastrear y cuantificar una amplia gama de eventos celulares y moleculares a resolución de una sola célula durante un período de horas a semanas. Las características ideales para una ventana de imágenes incluyen: a) impacto limitado en el bienestar del ratón y la fisiología del tejido; b) durabilidad; c) simplicidad de inserción; y d) puntos de referencia claros para imágenes repetidas de la misma región. El resultado es una ventana de silicona versátil e inerte que se produce e inserta fácilmente y que se puede equipar con una rejilla para ubicar el mismo campo de visión en el lapso de varias sesiones de imágenes.

La ventana está hecha de PDMS, que es un material económico, flexible y transparente. Las ventanas se pueden fundir con suministros que están ampliamente disponibles para su compra en la mayoría de los laboratorios. Para estos fines, los moldes circulares (22 mm de diámetro) que ya están grabados en la tapa de 24 placas de pozo disponibles comercialmente funcionan bien. Al variar la cantidad de polímero utilizado por unidad de área, es posible ajustar el grosor de la ventana. Para documentar el efecto del grosor de la ventana en la resolución de la imagen, se realizó un análisis de función de dispersión de puntos (PSF) de microesferas fluorescentes de 40 nm para comparar las imágenes a través de ventanas PDMS de diferentes espesores con cubiertas de vidrio típicamente utilizadas para ventanas de imágenes intravitales (0,17 mm de espesor). Para replicar la configuración utilizada para las imágenes intravitales, las imágenes de PSF se realizaron utilizando el mismo microscopio de dos fotones y la lente de inmersión en agua con gel de ultrasonido aplicado como medio de inmersión.

El ancho total a la mitad máximo (FWHM) de la intensidad de la señal calculada a través del ajuste del PSF en los planos laterales fue comparable al del vidrio para ventanas PDMS fundidas con 100 mg de PDMS (Figura 5A, B). La resolución lateral en comparación con las cubiertas de vidrio se redujo para ventanas fundidas con 150-250 mg de PDMS (Figura 5A, B). En el plano de imagen del eje Z, las ventanas PDMS fundidas con 100-200 mg de polímero funcionaron mejor que las cubiertas de vidrio (Figura 5C). La claridad óptica se perdió en ventanas fundidas con 300 mg de PDMS, lo que hace que las mediciones no sean confiables (Figuras 5A-C). La relación X/Y de los valores de FWHM no difirió significativamente entre el vidrio y el PDMS de ningún espesor, aunque la relación para ventanas fundidas con 200-250 mg de polímero se desvió notablemente de 1 utilizando gel de ultrasonido como medio de inmersión (Figura 5D). Sin embargo, cuando se usó agua como medio de inmersión para el molde de ventana con 200 mg, la desviación de la simetría fue mucho menos pronunciada. En este espesor, las desviaciones debidas a aberraciones en el polímero son, por lo tanto, probablemente menores. También se recogieron los valores máximos de intensidad de fluorescencia para cada microesfera y mostraron que el vidrio y el PDMS se desempeñaron de manera comparable, aunque la señal más alta se registró a través del vidrio (Figura 5I). El grosor óptimo de la ventana PDMS dependerá de aplicaciones específicas y sistemas de imágenes. Para la mayoría de los propósitos, 200 mg de solución de polímero para una ventana circular de 22 mm de diámetro es un compromiso óptimo entre la robustez de la ventana y la claridad óptica. De hecho, las ventanas fundidas con menos de 200 mg fueron ópticamente más claras, con valores de FWHM similares al vidrio, pero ocasionalmente se rompieron durante la implantación quirúrgica, mientras que no se observaron casos de daño en la ventana con 200 mg (en ratones > 100).

Para medir estas diferencias en las propiedades del material, las ventanas PDMS (200 mg y 150 mg) se cargaron en una máquina de prueba de material servohidráulico bajo un perfil de control de carga de 1N / s hasta la falla del material (Figura 5J). Los valores de fuerza y desplazamiento se midieron a una frecuencia de 100 Hz. Los datos de fuerza-desplazamiento se convirtieron en tensión-tensión utilizando las ecuaciones:

σ = F / A (1)

Ɛ = ΔL / L₀ (2)

Donde σ es tensión (Pa), F es fuerza (N), A es el área de sección transversal de la ventana, Ɛ es tensión, ΔL es el desplazamiento y L₀ es el grosor de la ventana. La tenacidad del material se determinó calculando el área de suma bajo la curva tensión-deformación. La tenacidad de un material se refiere a su capacidad para deformarse plásticamente y absorber energía en el proceso antes de la fractura, una propiedad clave para las ventanas implantadas¹³. De acuerdo con las observaciones durante los experimentos de imagen, las ventanas fundidas con 200 mg de PDMS tienen una tenacidad significativamente mayor que las ventanas fundidas con 150 mg (Figura 5K) y, por lo tanto, son menos propensas a romperse.

A continuación, se determinó el módulo de Young (E) de las ventanas PDMS preferidas fundidas con 200 mg y se comparó con el de los techos de vidrio estándar extrayendo la región lineal de la curva de tensión-deformación y determinando la pendiente utilizando la ley de Hooke:

σ = EƐ (3)

El módulo de Young de las ventanas de vidrio fue significativamente mayor que el PDMS, lo que se esperaba porque el vidrio es mucho más rígido en resistencia del material que el PDMS (Figura 5L). Así, aunque el vidrio es un material más fuerte en base a su mayor módulo de Young, la mayor tenacidad de las ventanas PDMS de 200 mg soporta que se puedan aplicar durante periodos más largos sin riesgo de rotura y requiriendo un segundo procedimiento quirúrgico o eutanasia.

Una gran ventaja de las ventanas de silicona es la versatilidad. Es importante destacar que el procedimiento para insertar quirúrgicamente la ventana se puede adaptar fácilmente a diferentes ubicaciones anatómicas. Las adaptaciones a la cirugía se ven facilitadas por el hecho de que las ventanas se pueden redimensionar fácilmente con tijeras quirúrgicas y que las ventanas están pegadas a la superficie del tejido / órgano de interés y a la piel, eliminando por completo el requisito de suturas. Se ha logrado la inserción exitosa de ventanas de esta manera para el hígado, el páncreas y la glándula mamaria (Figuras 6A-C). En particular, se desarrollaron dos protocolos diferentes para implantar ventanas ventrales o laterales para imágenes hepáticas. La Figura 1 muestra los pasos para insertar una ventana ventral. Este procedimiento se puede adaptar para otros órganos abdominales y producirá la mayor superficie de imagen. Sin embargo, a menos que se requiera un área grande (>1 cm²) con imágenes, se prefiere insertar una ventana lateral en el flanco derecho del ratón (Figura 2) para disminuir los artefactos de movimiento, por ejemplo, debido a la respiración y la peristalsis. Además, el procedimiento quirúrgico para insertar la ventana de imágenes lateral es compatible con una inyección concurrente de células cancerosas en la vena porta para modelar experimentalmente el desarrollo de metástasis hepáticas. Por lo tanto, los ratones pueden someterse a un solo procedimiento en lugar de dos separados cuando se necesita la inyección de vena porta y la inserción de la ventana de imágenes abdominales en el mismo animal. Se utiliza un procedimiento análogo para implantar una ventana sobre el páncreas en el flanco izquierdo del ratón (Figura 3). La ventana también se puede insertar sobre tejidos subcutáneos, es decir, glándulas mamarias normales, así como tumores mamarios espontáneos u ortotópicos ya establecidos (Figura 4). Alternativamente, las células cancerosas se pueden inyectar en la glándula mamaria a través de la ventana para seguir longitudinalmente el desarrollo de un tumor primario, ya que las agujas pueden perforar la película PDMS sin comprometer la integridad de la ventana.

Debido a su bajo peso y flexibilidad, las ventanas de silicona no interfieren con la movilidad del ratón (Película 1). Por lo tanto, las ventanas de silicona superan los principales obstáculos asociados con las ventanas de vidrio, como la fragilidad, la sutura compleja y el impacto en la movilidad de los animales. En cambio, la principal limitación asociada con las ventanas de silicona es el rebrote del epitelio debajo de la ventana. Sin embargo, cuando se extrae una cantidad adecuada de piel y la herida está completamente sellada con pegamento, la reepitelización es limitada y las imágenes pueden continuar durante períodos prolongados de tiempo (se han probado hasta 35 días, Figura 6D). Después de insertar la ventana, el ratón se puede visualizar longitudinalmente durante aproximadamente un mes o hasta que el adhesivo quirúrgico falle o se produzca una reepitelización. Las sesiones de imágenes diarias cortas (~ 60 min) o las sesiones de imágenes menos frecuentes pero más largas se favorecen para evitar efectos adversos inducidos por la anestesia. Los animales portadores de ventanas pueden ser fotografiados en cualquier plataforma de imágenes intravitales, a través de microscopía confocal de fotón único o multifotón, utilizando procedimientos estándar (véase, por ejemplo, ¹⁴). Antes y después de cada sesión de imágenes, es recomendable limpiar la ventana de suciedad y escombros limpiándola con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70% (v / v).

Para rastrear la misma ubicación a lo largo del tiempo, las rejillas de acero inoxidable se pueden incrustar dentro de la ventana. La Figura 7A muestra las especificaciones para las rejillas grabadas con láser hechas a medida que se usan aquí. Las redes comerciales para microscopía electrónica de transmisión también son adecuadas para esta aplicación. La rejilla está incrustada dentro de la ventana durante el procedimiento de fundición y es claramente visible sobre el área de imágenes tanto a simple vista (Figura 7B) como a través de los oculares del microscopio (Figura 7C). Debido a que la ventana está pegada a la superficie del órgano, la posición de los campos de imágenes en relación con la cuadrícula es estable. Durante la obtención de imágenes, observe la orientación de la cuadrícula y la ubicación dentro de la cuadrícula de cada campo de visión que se visualiza (por ejemplo,^2ª fila desde la parte superior,^4ª cuadrada desde la izquierda). A continuación, utilice la cuadrícula para navegar de vuelta a áreas de cuadrícula específicas, y por lo tanto a campos de imágenes, durante las sucesivas sesiones de imágenes.

La rejilla también es útil para alinear el campo de imágenes durante una sesión de imágenes cuando el tejido se desplaza lentamente debido, por ejemplo, a la respiración o la peristalsis. La mayoría de las ventanas de imágenes con un borde rígido se pueden atar a un soporte durante la toma de imágenes, lo que agrega estabilidad al área de imágenes. Dado que las ventanas flexibles no se pueden estabilizar directamente, se utiliza cinta quirúrgica para estabilizar la sección del cuerpo que contiene la ventana, y el área de imágenes se vuelve a alinear con el centro del cuadrado de cuadrícula correspondiente o puntos de referencia de tejido previamente identificados (por ejemplo, puntos de referencia vasculares) a intervalos definidos (generalmente cada 30 minutos). La corrección adicional de la deriva para el desplazamiento microscópico del campo de visión se realiza digitalmente en la fase posterior a la adquisición a través de un código que realinea los marcos en función de los patrones de tejido detectados (código suplementario 1-2).

Para validar que la ventana no causa ninguna reacción adversa sistémica manifiesta, se monitoreó el peso de los animales que se habían sometido a la implantación de ventanas y a controles de edad no tratados. Después de una pérdida de peso inicial asociada con la cirugía, la mayoría de los ratones con ventanas insertadas continúan aumentando de peso con el tiempo, lo que indica que la inserción de ventanas es bien tolerada (Figuras 8A-C). Para las ventanas del hígado y la glándula mamaria, el peso normal se recupera dentro de los 5 días posteriores a la cirugía. La recuperación postoperatoria es más lenta después de la implantación de la ventana sobre el páncreas, y los ratones vuelven al peso preoperatorio dentro de los 14 días. Esta observación es consistente con los efectos esperados asociados con la manipulación del páncreas en el momento de la cirugía. Tenga en cuenta que incluso en los casos en que la pérdida de peso no alcanza el umbral para el punto final humano, los ratones que no recuperan el peso corporal preoperatorio (<5% de todos los ratones, ejemplificado por el ratón indicado por * en la Figura 8B) generalmente son censurados de los experimentos de imágenes. Además, los recuentos de glóbulos blancos, determinados en varios puntos de tiempo después de la inserción de la ventana, no se alteraron en casi ningún ratón portador de ventana en comparación con los controles y no cambiaron considerablemente con el tiempo (Figura 8D), lo que sugiere que la ventana no causó inflamación sistémica importante.

A continuación, para evaluar el grado de respuesta del tejido local a la ventana y el pegamento, los ratones fueron sacrificados a los 3, 14 y 28 (ventanas de la glándula mamaria) o 35 días (ventanas del hígado y el páncreas) después de la inserción quirúrgica de la ventana para el análisis histológico. La evaluación de las secciones de hígado teñidas de hematoxilina y eosina (H&E) mostró una formación superficial (20-80 μm), de tejido de granulación capsular mínima a leve debajo de las ventanas para la mayoría de los ratones (2 de cada 3 ratones evaluados en el día 3 y 2 de cada 3 evaluados en el día 14). Estas lesiones eran focales (1–3 mm de longitud), correspondiendo aproximadamente al ancho de la capa de pegamento (Figura 8E). Después de 35 días, la mayoría de los ratones (4 de 6 evaluados en dos experimentos separados) no presentaron tejido granular, mientras que unos pocos (2 de 6) tenían esclerosis capsular focal moderada y desmoplasia (a una profundidad de 25-250 μm). Curiosamente, no se observaron lesiones significativas en la superficie del páncreas directamente debajo de la ventana en ningún punto temporal en la cohorte de nueve ratones (Figura 8G). Sin embargo, algunos ratones mostraron áreas de atrofia en la pancreata e inflamación en la grasa abdominal (esteatitis), consistente con el daño inducido por la manipulación. Para la glándula mamaria, el día 3 después de la implantación de la ventana, 3 de cada 3 ratones tenían tejido de granulación que recordaba a una incisión de curación visible a lo largo de la superficie de la glándula o una reacción inflamatoria en el tejido graso; en el día 14, 3 de cada 3 ratones evaluados tenían tejido de granulación. Estas lesiones fueron nuevamente focales y de 1-3 mm de longitud (Figura 8I). Los ratones con ventanas de la glándula mamaria sacrificados 28 días después de la cirugía no mostraron anomalías histológicas obvias.

Este análisis sugiere que la ventana no compromete la arquitectura fisiológica general de los órganos probados (hígado, páncreas, glándula mamaria). El tejido reactivo que se encuentra en la superficie del hígado y la glándula mamaria fue probablemente una reacción al pegamento y se limitó al tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo. El tejido normal se puede encontrar fácilmente adyacente (< 100 μm) al tejido reactivo en regiones no expuestas al pegamento (Figura 8E, I), y la inflamación del tejido, por lo tanto, no interfiere con la imagen de las regiones de tejido sano. Además, la reacción tisular es probablemente reversible ya que la mayoría de los ratones (8 de cada 9 ratones, en todas las ubicaciones del tejido) no mostraron lesiones significativas en los últimos puntos de tiempo (28 o 35 días), aunque la confirmación directa de que la reacción tisular se resuelve sería difícil de lograr sin mediciones longitudinales en ratones individuales.

También se realizó tinción inmunohistoquímica multiplexada para CD45, CD68 y mieloperoxidasa (MPO) para caracterizar la infiltración de leucocitos, monocitos/macrófagos y neutrófilos, respectivamente. Se observó un aumento en la infiltración de células inmunes asociada con el tejido de granulación y la esteatitis en la glándula mamaria y el hígado, pero no en el páncreas (Figura 8F, H, J).  Cabe destacar que estos cambios probablemente fueron transitorios, ya que el infiltrado de células inmunes fue comparable al de los controles no tratados en los últimos puntos de tiempo (28 días para las ventanas de la glándula mamaria y 35 días para las ventanas del hígado y el páncreas).

El hígado fue elegido como el sitio para caracterizar aún más si la inserción de la ventana y las imágenes causaron una infiltración inmune local significativa utilizando imágenes. Para ello, se utilizaron ratones c-fms-EGFP (MacGreen)¹⁵, en los que las células mieloides (en su mayoría macrófagos) están marcadas con una proteína fluorescente verde. Las ventanas hepáticas se implantaron en tres ratones c-fms-EGFP y se tomaron imágenes de ellas en los días 1, 3 y 5 después de la cirugía utilizando la rejilla para localizar el mismo campo de visión. El número de macrófagos presentes en el área de la imagen no cambió considerablemente con el tiempo después de la inserción de la ventana (Figura 8K).

A continuación, la ventana se probó funcionalmente mediante la obtención de imágenes de un conjunto diverso de procesos biológicos a nivel celular (es decir, movimiento, proliferación, contacto célula-célula) y a nivel tisular (es decir, crecimiento tumoral en el páncreas, infiltración inmune durante la involución de la glándula mamaria y metástasis hepática). El páncreas no es un lugar de fácil acceso para las imágenes. Para demostrar cómo se puede utilizar la ventana para capturar la dinámica de las células cancerosas en este órgano, se insertaron ventanas sobre el páncreas de seis ratones C57BL / 6J al mismo tiempo que la inyección ortotópica de células KPC-BL / 6-1199, una línea celular de cáncer de páncreas derivada de un KPC de uso común (Kras^{LSL- G12D / +} ;p 53^LSL-R172H; Pdx1-Cre) modelo de ratón genéticamente modificado de cáncer de páncreas. Para ser visualizadas por microscopía confocal, las células KPC-BL/6-1199 fueron diseñadas para expresar GFP mejorada inducible por doxiciclina (células iGFP-1199). Seis días después de la inyección, los ratones fueron puestos en una dieta de doxiciclina para desencadenar la expresión de proteína verde fluorescente (GFP) en las células de cáncer de páncreas. La Figura 9 muestra imágenes representativas de un ratón inyectado ortotópicamente con células iGFP-1199 en los días 11 y 14 después de la inyección y la inserción de la ventana. La película 2 muestra el borde del tumor iGFP-1199 en un extracto de una sesión de imágenes de 2 horas el día 11 después de la inserción de la ventana, lo que ilustra la capacidad de capturar la dinámica de la proyección de la membrana celular en el páncreas utilizando las ventanas de silicona.

La ventana de silicona también se puede utilizar para capturar la infiltración dinámica de células inmunes a lo largo del tiempo. Para ilustrar esto, las ventanas de las glándulas mamarias se insertizaron en ACTB-ECFP lactante (Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy); Ratones LysM-eGFP (Lyz2tm1.1Graf) inmediatamente después del destete. En estos ratones, todas las células, pero la mayoría de las células epiteliales, expresan proteína fluorescente cian (CFP) impulsada por el promotor de actina beta, y las células mieloides, principalmente neutrófilos, pero también macrófagos, están marcadas por eGFP impulsada por el promotor de lisozima M. Los ratones fueron fotografiados en los días 2 y 4 después de la inserción de la ventana, durante el proceso de involución de la glándula mamaria, cuando el tejido de la glándula mamaria comienza a regresar a su estado anterior al embarazo. Se desarrollaron dos macros para ImageJ para reducir los artefactos de movimiento y mejorar la visualización, una alinea los planos Z en un video intravital de 4 dimensiones (código suplementario 1) y la otra reduce el tambaleo debido a la respiración u otros artefactos de movimiento (código suplementario 2). La Figura 10 y la Película 3A-C muestran la infiltración de neutrófilos dentro del tejido de la glándula mamaria remodelante en el mismo lugar en los días 2 y 4, ilustrando cómo la ventana podría usarse para monitorear y rastrear la infiltración y el movimiento de las células inmunes en diferentes días. Se realizó un experimento análogo en un ratón c-fms-EGFP, con células mieloides (principalmente macrófagos) expresando GFP impulsadas por el promotor c-fms (Película 4).

Por último, el área de superficie relativamente grande de esta ventana personalizable permite la observación de eventos raros, como la formación de metástasis hepáticas después de la inoculación intravenosa. Para demostrar este fenómeno, se insertaron ventanas hepáticas en ratones C57BL/6J en el momento de la inyección de la vena porta con células de cáncer de páncreas KPC-BL/6-1199 que expresan constitutivamente la proteína de fusión nuclear histona2B-CFP (H2B-CFP). Con el tiempo, se monitoreó el crecimiento de células individuales y pequeños grupos de 2-3 células a medida que se convertían en micrometástasis (>100 células). La Figura 10 muestra imágenes representativas tomadas en los días 1, 3, 7 y 9 después de la inyección y la inserción de ventana y demuestra la progresión de células individuales a micrometástasis.

Todas las imágenes y películas se recopilaron utilizando un microscopio multifotónico. Las proyecciones de máxima intensidad y las alineaciones de películas a lo largo de los ejes Z y X a lo largo del tiempo se generaron utilizando el software ImageJ. Las imágenes y películas alineadas se compilaron utilizando el software Imaris.

Figura 1: Inserción quirúrgica de una ventana de imágenes abdominales ventrales sobre el hígado. (A) La caricatura muestra la ubicación anatómica de las estructuras relevantes para la cirugía. La caja discontinua blanca delinea el campo quirúrgico que se ve en las imágenes. (B) Se realiza una incisión comenzando 3 mm por debajo del proceso xifoide y continuando hacia abajo para que se elimine una sección de piel de 1 a 1,5 cm² a lo largo de la línea media. (C) Se disecciona una sección ligeramente más pequeña del peritoneo. (D) El ligamento falciforme (punta de flecha blanca) se corta, empujando el hígado hacia abajo. Nota: los hisopos de algodón humedecidos con solución salina estéril se utilizan para manipular suavemente los órganos internos. (E) Usando una jeringa, se aplica una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en gotitas alrededor del área de interés en la superficie del hígado. (F) La ventana se coloca y se mantiene firmemente contra el hígado hasta que el adhesivo se haya secado (2 min). (G) Los bordes de la ventana se pliegan debajo del peritoneo y la piel. (H) Para asegurar la ventana al peritoneo, se aplica adhesivo en la superficie de la ventana correspondiente al área sombreada, antes de empujar el peritoneo hacia abajo sobre ella y pegarla en su lugar. La piel está pegada de manera similar en el peritoneo. Finalmente se deposita un borde de pegamento a lo largo de la línea roja para evitar el crecimiento del epitelio sobre la ventana. (I) La misma imagen que en (H) sin las marcas que muestran el ratón listo para la recuperación postquirúrgica. El área delineada con líneas discontinuas se magnifica en (J, K). (J) Las marcas de las gotas de adhesivo son visibles en la superficie del hígado (puntas de flecha) (K) Misma foto que en J que muestra el hígado visible a través de la ventana delineada por una línea discontinua blanca. Las gotas de adhesivo en la superficie del hígado están delineadas en rojo. El área a fotografiar está delineada en blanco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Inserción quirúrgica de una ventana sobre el lóbulo derecho del hígado. (A) La caricatura muestra la ubicación anatómica de las estructuras relevantes para la cirugía. La caja discontinua negra delinea el campo quirúrgico que se ve en las imágenes. (B) El ratón se coloca en la posición de decúbito lateral izquierdo, se realiza una incisión a partir de 3 mm por debajo de la caja torácica y se extrae una sección de piel de aproximadamente 1 cm² . (C) Se disecciona una sección ligeramente más pequeña del peritoneo. (D) El hígado se tira suavemente hacia abajo por debajo de la caja torácica con un hisopo de algodón humedecido. (E) Usando una jeringa, se aplica una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en gotas (punta de flecha blanca) en la superficie del hígado. (F) La ventana se coloca y se mantiene firmemente contra el hígado hasta que el adhesivo se haya secado (2 min). (G) Los bordes de la ventana se pliegan debajo del peritoneo y la piel. (H) Para asegurar la ventana al peritoneo, se aplica adhesivo en la superficie de la ventana, correspondiente al área sombreada, antes de empujar el peritoneo hacia abajo sobre ella y pegarla en su lugar. La piel está pegada de manera similar en el peritoneo. También se deposita un borde de pegamento a lo largo de la línea roja para evitar el crecimiento del epitelio sobre la ventana. (I) Con un aumento alto, el hígado (delineado por una línea discontinua blanca) es visible a través de la ventana. El área de imagen está marcada por la cuadrícula incrustada en la ventana (punta de flecha blanca). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Inserción quirúrgica de una ventana sobre el páncreas. (A) La caricatura muestra la ubicación anatómica de las estructuras relevantes para la cirugía. La caja discontinua negra delinea el campo quirúrgico que se ve en las imágenes. (B) El ratón se coloca en la posición de decúbito lateral derecho. El bazo es visible a través de la piel afeitada (línea discontinua) (C) Se realiza una incisión a partir de 3 mm por debajo de la caja torácica, y se extrae una sección de piel de aproximadamente 1 cm² . (D) Se disecciona una sección ligeramente más pequeña del peritoneo. (E) El páncreas (punta de flecha blanca) se coloca suavemente con un hisopo de algodón humedecido en la ubicación de la ventana. (F) Usando una jeringa, se aplica una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico al bazo, así como al páncreas (lejos de la región a fotografiar). (G) La ventana se coloca y se mantiene firmemente contra el páncreas hasta que el adhesivo se haya secado (2 min). Los bordes de la ventana se pliegan debajo del peritoneo y la piel. (H) Para asegurar la ventana al peritoneo, se aplica adhesivo en la superficie de la ventana correspondiente al área sombreada, antes de empujar el peritoneo hacia abajo sobre ella y pegarla en su lugar. La piel está pegada de manera similar en el peritoneo. También se deposita un borde de pegamento a lo largo de la línea roja para evitar el crecimiento del epitelio sobre la ventana. (I) Con un aumento alto, el páncreas (delineado por una línea discontinua blanca) es visible a través de la ventana. El área de imagen está marcada por la cuadrícula incrustada en la ventana (punta de flecha blanca). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Inserción quirúrgica de una ventana sobre la glándula mamaria inguinal. (A) La caricatura muestra la ubicación anatómica de las estructuras relevantes para la cirugía. La caja discontinua negra delinea el campo quirúrgico que se ve en las imágenes. Tenga en cuenta que la cirugía se puede realizar en la^4ª o la^5ª glándula mamaria. (B) El ratón se coloca en posición supina en un campo quirúrgico estéril. El^5º pezón derecho (punta de flecha) se utiliza como punto de referencia para realizar la incisión. (C) Se hace una incisión, la glándula mamaria se separa de la piel suprayacente y se extrae una sección de piel de aproximadamente 1 cm² . (D) Usando una jeringa, se aplica una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en gotitas alrededor del área de interés en la superficie de la glándula mamaria. (E) La ventana se coloca y se mantiene firmemente hasta que el adhesivo se haya secado (2 min). (F) Los bordes de la ventana se pliegan debajo de la piel usando fórceps. (G) Para asegurar la ventana a la piel, se aplica adhesivo en la superficie de la ventana correspondiente al área sombreada, antes de empujar la piel hacia abajo sobre ella y pegarla en su lugar. También se deposita un borde de pegamento a lo largo de la línea roja para evitar el crecimiento del epitelio sobre la ventana.  (H) Se proporciona un ejemplo de una ventana implantada sobre un pequeño tumor en la^4ª glándula mamaria derecha. El área delineada con líneas discontinuas se muestra en un aumento más alto en (I). (I) Las gotas de adhesivo en la superficie de la glándula mamaria están delineadas en rojo. El área a fotografiar está delineada en negro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Las ventanas de imágenes de silicona tienen propiedades ópticas y materiales favorables. (A–C) Para medir la función de dispersión de puntos y comparar las propiedades de imagen de las ventanas PDMS con las de las cubiertas de vidrio, se tomaron imágenes de microesferas fluorescentes de color amarillo-verde de 40 nm a través de ventanas PDMS de espesor variable o cubiertas de vidrio (espesor # 1.5)¹⁶. Las imágenes se recolectaron utilizando gel de ultrasonido como medio de inmersión para que coincida con las condiciones de las imágenes intravitales. Los gráficos muestran el ancho completo calculado a la mitad del máximo (FWHM) en el (Un) Eje X, (B) Eje Y, y (C) Eje Z (media ± SD; n = 3/grupo, adquirido utilizando dos o más ventanas separadas; ANOVA unidireccional que compara todas las ventanas PDMS con vidrio con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett; solo se indican diferencias significativas). (D) La relación entre los valores calculados de FWHM en los ejes X e Y (A–B) se muestra como una medida de la simetría de las imágenes de origen puntual a lo largo de los ejes X e Y, y por lo tanto de las aberraciones ópticas. (E–G) Las microesferas se tomaron imágenes a través de tres ventanas separadas fundidas con 200 mg de PDMS (similar a las ventanas utilizadas para imágenes intravitales para Figura 9, Figura 10, Figura 11 y Película 2, Película 3, Película 4) o tres fundas de vidrio (espesor #1.5) para medir la función de dispersión de puntos. A diferencia de los ejemplos de imágenes intravitales, las imágenes para estos cálculos se recolectaron utilizando agua como medio de inmersión. Los gráficos muestran el FWHM calculado en el (E) Eje X, (F) Eje Y y (G) Eje Z (media ± SD; n = 3/grupo usando tres ventanas separadas; Prueba de Mann-Whitney, no se detectaron diferencias significativas). (H) La gráfica muestra la relación entre los valores calculados de FWHM en los ejes X e Y (E–F). (Yo) Los gráficos muestran la intensidad fluorescente máxima por microesfera (media ± de desd; n = 3/grupo; Prueba de Mann-Whitney, no se detectaron diferencias significativas). Todas las imágenes se recogieron a una longitud de onda de 960 nm y una potencia láser del 3%. Se recolectó una pila z de 100 μm para cada microesfera, con un tamaño de paso de 0,6 μm. El marco de imagen se estableció en 69 μm x 69 μm con una resolución de 1022 píxeles x 1022 píxeles. El análisis se realizó con el plugin Fiji - MetroloJ. (J) Para probar las propiedades del material, las ventanas PDMS se mantuvieron en tensión y se aseguraron entre dos arandelas en forma de anillo utilizando súper pegamento para garantizar una respuesta elástica durante las pruebas mecánicas. El mismo procedimiento se utilizó para los deslizamientos de vidrio de micro cubierta sin la tensión debido a la rigidez del vidrio. Una punta de carga que consiste en un hemisferio (6 mm de diámetro) con una extrusión de cilindro (4 mm de diámetro, 20 mm de longitud) se imprimió en 3D utilizando un filamento de ácido poliláctico. Las ventanas se cargaron en una máquina de prueba de material servohidráulico bajo un perfil de control de carga de 1 N / s hasta la falla del material. Los valores de fuerza y desplazamiento se midieron a una frecuencia de 100 Hz. La imagen muestra la prueba de ventana configurada con la punta de carga que se aplica en el centro de la ventana. (K) La gráfica muestra la tenacidad del material determinada mediante el cálculo del área de suma bajo la curva de tensión-deformación utilizando la función Trapz en MATLAB (media ± SEM; n = 3/grupo utilizando tres ventanas PDMS separadas para cada espesor y cubiertas de vidrio; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey). (L) La gráfica muestra el módulo de Young determinado a partir de la porción lineal de la curva tensión-deformación (media ± SEM; n = 3/grupo utilizando tres ventanas PDMS separadas y cubiertas de vidrio; prueba t con corrección de Welch). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: La ventana de silicona demuestra una alta tolerabilidad y longevidad. (A) Una imagen representativa de un ratón macho C57BL/6J de 7 semanas de edad con una ventana de imágenes abdominales ventrales sin una rejilla 11 días después de la cirugía de ventana. (B) Una imagen representativa de un ratón macho C57BL/6J de 7 semanas de edad con una ventana de imágenes pancreáticas que contiene una rejilla 14 días después de la cirugía de ventana. (C) Una imagen representativa de una hembra de 12 semanas de edad C57BL / 6J c-fms-EGFP de ratón con una ventana de imágenes de la glándula mamaria que contiene una rejilla >7 días después de la cirugía de ventana. (D) Ventana de imágenes hepáticas en un ratón c-fms-EGFP masculino de 7 semanas de edad fotografiado (fila superior) y fotografiado (fila inferior) el día 0 (inmediatamente después de la cirugía) y 35 días después de la cirugía. Eliminar la cantidad adecuada de piel y sellar la herida con pegamento evita que la piel se vuelva a epitelizar y empuje la ventana hacia arriba y hacia afuera, lo que permite que el órgano se muestre a largo plazo. Barras de escala = 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Las cuadrículas dentro de las ventanas permiten el seguimiento del mismo campo de visión. (A) Especificaciones detalladas para la producción personalizada de ventanas de acero inoxidable cortadas con láser. (B) Se puede ver una rejilla incrustada dentro de la ventana de imágenes sobre el hígado, con el borde de pegamento alrededor de la ventana claramente visible. (C) Vista de la ventana a través de los oculares del microscopio de dos fotones. Los vasos sanguíneos (rojo) y la señal verde del hígado se pueden ver en el fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Respuesta sistémica y local a la inserción de ventanas. (A–C) Se monitorizó el peso de ratones hembra C57BL/6J de 7 semanas de edad durante un período de 28 días después de la inserción de la ventana en el hígado (Un), el páncreas (B) o la glándula mamaria (C). Se muestra el cambio porcentual del peso corporal en comparación con los ratones de la misma edad no tratados. (*) indica un ratón que no recuperó el peso corporal normal y, por lo tanto, habría sido censurado de un experimento de imágenes. Los mismos ratones de control se muestran en los tres paneles para facilitar la comparación con cada tipo de ventana. (D) Recuento de glóbulos blancos (WBC) monitoreado en los días 3, 14 y 28 (ventana de la glándula mamaria) o 35 (ventana del hígado o páncreas) después de la cirugía. El rango normal para el recuento de glóbulos blancos en el ratón se indica mediante líneas discontinuas. (E,G,Yo) Tinción de hematoxilina y eosina de secciones de tejido de controles no tratados (izquierda) y un ratón C57BL/6J de 7 semanas de edad 14 días después de la inserción de una ventana de imágenes (derecha) sobre el (E) hígado, (G) páncreas, o (Yo) glándula mamaria. (E,YoLas lesiones de granulación superficial y focal son visibles en lugares discretos a lo largo de la superficie (flecha) del hígado y la glándula mamaria, lo que sugiere una reacción al pegamento. El tejido normal indicado por * es visible en las regiones adyacentes a las lesiones de granulación. Se evaluaron tres controles y tres ratones con ventanas hepáticas en cada punto temporal (días 3, 14 y 35 después de la cirugía), excepto que 6 ratones con ventanas hepáticas se evaluaron en el día 35 después de la cirugía. Dos de cada 3 ratones exhibieron tejido de granulación en los días 3 y 14. 1 de cada 3 ratones exhibió tejido de granulación en el día 35.  Se evaluaron tres controles y tres ratones con ventanas de la glándula mamaria en cada punto temporal (días 3, 14 y 28 después de la cirugía). Tres de cada 3 ratones tuvieron tejido de granulación o reacciones inflamatorias en el tejido graso de la glándula mamaria en los días 3 y 14. Cero de cada 3 ratones exhibieron lesiones de granulación o reacciones inflamatorias en el día 28. (G) No se ven lesiones significativas en el páncreas. Se evaluaron tres controles y tres ratones con ventanas de páncreas en cada punto temporal (días 3, 14 y 35 después de la cirugía). Los ratones con ventanas pancreáticas no tenían tejido de granulación en ningún momento. Barra de escala = 500 μm (F,H,J) La tinción inmunohistoquímica multiplex se realizó en secciones de tejido de controles no tratados y ratones C57BL/6J de 7 semanas de edad 14 días después de la inserción de una ventana de imágenes sobre el (F) hígado, (H) páncreas o (J) glándula mamaria. Se utilizaron anticuerpos contra CD45, CD68 y mieloperoxidasa (MPO) para etiquetar leucocitos, monocitos/macrófagos y neutrófilos respectivamente. La tinción de CD45 y CD68 se realizó en la misma sección, mientras que la tinción de MPO se realizó en una sección seriada del mismo tejido. El anticuerpo anti-CD45 se detectó con un anticuerpo secundario conjugado con HRP y se tomaron imágenes primero, luego se eliminaron el cromógeno y el anticuerpo secundario y se incubaron diapositivas con un anticuerpo secundario que reconocía anti-CD68. La cuantificación se realizó con el software de Fiji por umbral de color; los parámetros se ajustaron entre anticuerpos y tejidos. Las gráficas muestran la cuantificación como recuentos celulares por campo de visión (FOV) (media ± SEM; n = 3/grupo; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey; solo se indican diferencias significativas). (K) Macho C57BL/6J c-fms-EGFP Los ratones de 8 a 11 semanas de edad tenían una ventana de imágenes de silicona insertada sobre el lóbulo derecho del hígado. La lectina marcada con fluorescencia (100 μL) se inyectó por vía intravenosa inmediatamente antes de cada sesión de imágenes. Las imágenes son de un solo ratón, en el mismo locus de la rejilla en los días 1, 3 y 5 después de la cirugía, aproximadamente a 200 μm por debajo de la rejilla. Barra de escala = 30 μm. Fotografiado usando una longitud de onda de excitación de 960 nm, potencia láser 10%. Los vasos sanguíneos aparecen en rojo. Los macrófagos aparecen en verde (flechas blancas). Representante de tres ratones fotografiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Los tumores se pueden visualizar en múltiples puntos de tiempo durante semanas después de la inserción de la ventana. Imágenes representativas de un ratón C57BL/6J masculino de 7 semanas de edad inyectado ortotópicamente con 1,5 x 10⁴ células de cáncer de páncreas iGFP-1199 en el momento de la inserción de la ventana pancreática, y fotografiadas en los días 11 y 14 después de la inserción de la ventana. Barras de escala = 30 μm. Fotografiado usando una longitud de onda de excitación de 960 nm, potencia láser 10%. Representante de 6 ratones fotografiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Cambios dinámicos en la infiltración de células inmunes durante la involución normal de la glándula mamaria. Usando la rejilla metálica incrustada en la ventana de imágenes, se puede obtener una imagen de la misma ubicación durante la remodelación normal del tejido, como durante la involución de la glándula mamaria. Para evaluar más a fondo la funcionalidad de las ventanas de silicona en el monitoreo de cambios dinámicos como la infiltración de células inmunes, una hembra de 12 semanas C57BL / 6J x BALB / c ACTB-ECFP; El ratón LysM-eGFP con una ventana de imagen insertada sobre la glándula mamaria abdominal se tomó una imagen en los días 2 y 4 después de la involución de la glándula mamaria. Los neutrófilos aparecen en verde (flechas blancas). La actividad de la elastasa de neutrófilos se visualizó inyectando una sonda fluorescente neutrofil elastasa 4 horas antes de comenzar la obtención de imágenes, y aparece en rojo (o amarillo cuando se colocaliza con neutrófilos). Las células epiteliales aparecen en azul. Las instantáneas son una proyección de intensidad máxima de cinco imágenes a lo largo del eje Z (100–150 mm de profundidad). Las imágenes son de las películas 3A y 3B, y en las imágenes de la fila inferior, solo se muestra la señal CFP y las imágenes se marcan con una línea discontinua roja para visualizar las mismas ubicaciones dentro del tejido en los dos puntos de tiempo diferentes. Barras de escala = 30 μm. Fotografiado utilizando longitudes de onda de excitación de 960 nm y 1080 nm, potencia láser al 10% y 15% respectivamente. Representante de cuatro ratones fotografiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: La formación de metástasis cancerosas se puede rastrear a lo largo del tiempo. Un ratón macho C57BL/6J de 10 semanas de edad inyectado con 1 x 10⁵ células de cáncer de páncreas KPC-BL/6-1199 que expresan histona nuclear localizada H2B conjugada con proteína fluorescente cian (H2B-CFP) a través de la vena porta en el momento de la inserción de la ventana. La obtención de imágenes hepáticas se realizó a través de una ventana lateral 24 h (día 1) después de la inyección y en tres puntos de tiempo posteriores (hasta 9 días), según lo indicado. Una sola célula cancerosa visible en los días 1 y 3 después de la inyección está indicada con flechas blancas. La segunda señal armónica de las fibras de colágeno también se visualizó en el canal cian (flechas amarillas). Las imágenes son del mismo ratón en cada punto de tiempo diferente. Imágenes de un solo plano z tomadas entre 300 μm y 350 μm de profundidad. Barras de escala = 30 μm. Fotografiado usando una longitud de onda de excitación de 880 nm. Potencia láser al 8%.. Representante de tres ratones fotografiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: Las ventanas de silicona imaginaciónson bien toleradas en ratones. La película muestra un ratón C57BL/6J masculino de 9 semanas de edad 14 días después de la inserción de la ventana. El ratón no exhibe ninguno de los comportamientos estándar asociados con el dolor (por ejemplo, mal aseo, ojos cerrados o letargo). Representativo de seis ratones registrados, y consistente con más de 100 ratones observados después de la implantación exitosa de ventanas. Haga clic aquí para descargar este video.

Película 2: Imágenes subcelulares de células de cáncer de páncreas implantadas ortotópicamente. Las células iGFP-1199 se inyectaron ortotópicamente en el páncreas de un ratón C57BL/6J masculino de 7 semanas de edad y se tomaron imágenes el día 11 después de la inyección de células cancerosas y la inserción de ventanas. La película es una proyección de máxima intensidad de seis imágenes a lo largo del eje Z y extraídas de un período de imágenes de 2 horas. Marca de tiempo (h:min:s:ms). Representante de seis ratones fotografiados. Haga clic aquí para descargar este video.

Película 3: Cambios en la infiltración de células inmunes en ACTB-ECFP; Ratones LysM-eGFP durante la involución. Hembra C57BL/6J x BALB/c ACTB-ECFP; Los ratones LysM-eGFP que expresan GFP en células mieloides (principalmente en granulocitos pero también en macrófagos), y ECFP en todas las células (pero más alta en células epiteliales) se criaron a las 8 semanas de edad. Después del parto, los cachorros se normalizaron a seis cachorros por ratón. El día 10 después del parto, los cachorros fueron destetados y se insertaron ventanas de imágenes de la glándula mamaria abdominal. Las células mieloides aparecen en verde; la actividad de la elastasa de neutrófilos, marcada con la sonda Neutrophil Elastase 680 FAST inyectada 4 h antes del inicio de la obtención de imágenes, aparece en rojo (aparecerá amarilla cuando se coloque con neutrófilos); y las células epiteliales aparecen en azul. Las películas son una proyección de intensidad máxima de cinco imágenes a lo largo del eje Z (100–150 μm de profundidad). (A) Imágenes en el día 2 de la involución de la glándula mamaria. Barra de escala = 20 μm. Fotografiado utilizando longitudes de onda de excitación de 960 nm y 1080 nm, potencia láser al 10% y 15% respectivamente. (B) Imágenes en el día 4 de la involución de la glándula mamaria. Barra de escala = 20 μm. La película es de la misma región de ratón y tejido que la película 3A. (C) Mayor aumento de una región de interés de la película 3B, que muestra dos neutrófilos interactuando entre sí y las células epiteliales de la glándula mamaria. La formación de protuberancias transitorias de membrana se puede observar en el borde de ataque durante la migración de neutrófilos. Marca de tiempo (h:min:s:ms). Representante de cuatro ratones fotografiados. Haga clic aquí para descargar la película 3A. Haga clic aquí para descargar La película 3B. Haga clic aquí para descargar Movie 3C.     

Película 4: Cambios en la infiltración de células inmunes en ratones c-fms-EGFP durante la involución. Los ratones hembra C57BL/ 6J c-fms-EGFP, con macrófagos marcados con GFP, fueron criados a las 8 semanas de edad. Después del parto, las camadas se ajustaron a seis cachorros por ratón. El día 10 después del parto, los cachorros fueron destetados y se insertaron ventanas de imágenes de la glándula mamaria abdominal. La película, adquirida el día 1 de la involución (un día después de la inserción de la ventana), destaca el prominente infiltrado de macrófagos durante la involución. Los macrófagos aparecen en verde, las fibras de colágeno (segunda generación armónica) aparecen en azul y los vasos sanguíneos aparecen en rojo (Lectin-DyLight 594). Barra de escala = 20 μm. Las imágenes son proyecciones de máxima intensidad de cinco imágenes a lo largo del eje Z (100-150 um de profundidad). Fotografiado utilizando longitudes de onda de excitación de 960 nm y 800 nm, potencia láser al 10% y 15% respectivamente. Marca de tiempo (h:min:s:ms). Representante de tres ratones fotografiados. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Las ventanas de imágenes intravitales son herramientas importantes para visualizar directamente los procesos fisiológicos y patológicos a resolución celular a medida que se desarrollan con el tiempo. El novedoso procedimiento descrito para fundir e insertar ventanas de imágenes de silicona flexibles en ratones supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente (exudado, rotura e interferencia con la movilidad normal), proporciona seguridad adicional para el ratón y aumenta la accesibilidad de esta técnica.

Las ventanas de imagen más utilizadas comprenden un marco de metal que sostiene una cubierta de vidrio. Un obstáculo importante para el uso de estas ventanas prototípicas es que asegurar el anillo de metal implica procedimientos de costura laboriosos, lo que requiere personal con capacitación quirúrgica avanzada. Además, la fabricación de los marcos es costosa y requiere equipos especializados. Las ventanas de PDMS superan ambos problemas. El procedimiento para insertar las ventanas PDMS elimina las costuras, reduciendo significativamente la barrera para el aprendizaje de la técnica. Los materiales para producir las ventanas también son baratos y se pueden comprar fácilmente. Además, tanto la forma de la ventana como el procedimiento quirúrgico se pueden adaptar para obtener imágenes de diferentes órganos, incluida la glándula mamaria, el hígado, el páncreas, el bazo y el intestino.

Mientras que las ventanas de imágenes intravitales actuales permiten imágenes longitudinales durante unos pocos días, varios problemas comunes limitan el uso de estas ventanas durante largos períodos de tiempo. El peso y el tamaño de las ventanas de vidrio pueden interferir con el libre movimiento de los ratones, y el exudado puede acumularse contra la ventana. Los ratones también pueden dañar la cubierta de vidrio, lo que resulta en heridas e infecciones. Por el contrario, el procedimiento descrito aquí mantiene el mismo nivel de accesibilidad al tejido al tiempo que minimiza la angustia de los animales. PDMS es un polímero sintético seguro, bioestable y ampliamente utilizado para aplicaciones biomédicas en humanos, como dispositivos de administración de medicamentos, cirugía de reconstrucción facial e implantes mamarios. Más allá de aumentar la tolerancia de los animales a la ventana, el uso de un material biológicamente inerte, a diferencia del vidrio, es particularmente importante para los estudios que involucran el sistema inmunológico, donde la inflamación local sería un efecto de confusión. Además, una mejora importante es la eliminación de los puntos de sutura, ya que los ratones los morderán y tirarán de ellos, lo que puede hacer que las ventanas de imágenes de vidrio con marco de metal se caigan. Este problema fue parcialmente abordado por una nueva generación de ventanas que fueron diseñadas para que los puntos estén ocultos en una ranura⁹. Sin embargo, esta última estrategia requiere la sutura de la cuerda del bolso, que es un procedimiento complicado y propenso a errores que a menudo hace que los puntos se aprieten demasiado, lo que resulta en necrosis del tejido y dolor. Por lo tanto, la capacidad de pegar la ventana en su lugar constituye una gran ventaja del enfoque de ventana de silicona. Además, la ventana está hecha de un material flexible, duradero con un peso insignificante, lo que disminuye su impacto en el movimiento del animal, como se evaluó previamente en una comparación de ventanas que usaban silicona en lugar de metal para sostener un cobertor de vidrio¹⁷. Al eliminar por completo la cubierta de vidrio, la ventana de silicona elimina los problemas tanto con los marcos de metal como con el vidrio. Además, la flexibilidad de la ventana permite insertarla con facilidad y disminuye la fuerza de estrés causada por pegar una superficie rígida a los órganos, disminuyendo así el riesgo de daño permanente al tejido que se observa. Además, debido a que la ventana es mucho más fácil de insertar y mantener en su lugar, el procedimiento general lleva menos tiempo, lo que limita los posibles efectos secundarios debido a la anestesia prolongada. Para la inserción sobre el hígado, la diferencia en el tiempo del procedimiento es particularmente sustancial, de 45 minutos para las ventanas con marco de metal a 15 minutos para las ventanas de silicona. De hecho, mientras que la inserción del marco de metal sobre el hígado requiere la disección del proceso xifoide (el cartílago al final del esternón), que también es potencialmente doloroso y causa inflamación sostenida, esta disección es innecesaria para insertar la ventana de silicona. Por último, la ventana de imagen presentada en este trabajo proporciona ventajas adicionales con respecto a las posibles aplicaciones. Por ejemplo, a diferencia de las ventanas de vidrio, las ventanas de silicona proporcionan un fácil acceso al tejido, por lo que las células cancerosas, los tintes fluorescentes o los medicamentos se pueden inyectar directamente a través de la ventana.

Recientemente se describió otra ventana de imágenes de silicona basada en PDMS adecuada para la inserción en una variedad de ubicaciones anatómicas, incluida la glándula mamaria,¹⁸. Esa ventana está moldeada para generar una forma y borde especializado que permita la implantación rápida de la ventana sin necesidad de puntos de sutura o pegamento. Por el contrario, la ventana de silicona presentada aquí no requiere ningún molde especial y, lo que es más importante, se puede cortar para dar forma durante el procedimiento quirúrgico para adaptarse a la ubicación anatómica y al ratón individual. Aunque el protocolo descrito en este documento requiere el uso de pegamento, este requisito adicional permite la obtención de imágenes de los órganos abdominales, incluidos el hígado y el bazo. Además, la ventana de silicona descrita aquí permite incrustar una rejilla de acero inoxidable dentro de la ventana, lo que proporciona puntos de referencia. Estos puntos de referencia permiten el rastreo de la misma ubicación exacta a lo largo del tiempo y facilitan la obtención repetida de imágenes del mismo sitio durante múltiples sesiones (imágenes longitudinales) para estudiar procesos que toman días o semanas, como el desarrollo de lesiones metastásicas.

En resumen, se desarrolló una ventana de imágenes de silicona para su uso en IVM longitudinal de la glándula mamaria u órganos abdominales. La ventana es ópticamente clara, altamente duradera y económica. La simplicidad del procedimiento de inserción de ventanas reduce las habilidades técnicas requeridas para implementar enfoques de imágenes intravitales basados en ventanas. La adaptabilidad de la ventana a diversos sitios de tejido permite la implementación de IVM en una amplia gama de estudios biológicos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453