Summary
本プロトコルは、マウス(Mus musculus)およびフェレット(ムステラ・プトリウス・フロ)を複数の脳領域から慢性および急性の生体内電気生理学的記録に対して炭素繊維微小電極アレイを構築する手順を説明する。各ステップは、マイクロ電極アレイ移植に生炭素繊維を購入した後、微小電極アレイ構築に重点を置いて詳細に説明される。
Abstract
多チャンネル電極アレイは、働く脳に関する洞察を提供し、単一細胞および回路レベルで神経プロセスを解明するのに役立ちます。これらのツールの開発は、複雑な行動や認知を理解し、臨床応用を進めるために重要です。しかし、長期間にわたって細胞集団を安定的かつ継続的に記録することは依然として課題である。テトロードやシリコンアレイなどの多くの一般的な電極は、挿入時に損傷を引き起こす大きな交差直径を特徴とし、神経死に関連する慢性反応性組織応答を引き出し、安定した連続的な神経活動の記録を妨げる。さらに、ほとんどのワイヤバンドルはチャネル間の広い間隔を示し、小さな領域に集まった多数の細胞からの同時記録を排除する。このプロトコルに記載されている炭素繊維微小電極アレイは、これらの懸念に対するアクセス可能なソリューションを提供します。本研究は 、生体内の急性および慢性記録の両方に使用できる炭素繊維微小電極アレイを作製するための詳細な方法を提供する。これらの電極の物理的特性は、高いセル密度で安定した連続的な長期記録に最適であり、研究者は数ヶ月にわたって単一のユニットから堅牢で明確な録音を行うことを可能にします。
Introduction
電極と電極アレイは、脳が神経レベルで情報を処理する方法を理解するための貴重なツールです。電気生理学的記録は2世紀以上にわたって達成されてきましたが、個々のニューロンのスパイクを捉えるために必要な空間的および時間的解像度で神経回路全体の活性を同時に測定することはまだ不可能です。脳波2、陽電子放射地形3、および機能的磁気共鳴画像4のような非侵襲的な方法は、脳全体の測定を可能にするが、それらは、神経回路2、5の活動を解決するために必要な空間的および時間的分解能を達成することができない。対照的に、電圧感受性色素や遺伝的にコード化されたカルシウム指標を用いた光学イメージング法は、単一単位の空間分解能を達成することができるが、低い時間的分解能と低い選択性3、4、5、6などの問題を引き起こす。電気録音は、これらの方法に代わる強力な方法です。記録電極は比類のない時間分解能を提供し、ユーザーが脳の任意の領域でスパイク時間の精度で測定を行うことを可能にする 7.さらに、慢性的に埋め込まれた多電極アレイ(MEA)は、大規模な(数十〜数百の細胞)、1つの細胞記録を、数日から8ヶ月にわたって動物を振る舞うことを可能にする。しかし、高密度で記録するシリコンプローブは、フットプリントが大きく、非常に侵襲性が高く、かつ慢性的に埋め込まれたアレイは炎症応答、組織カプセル化、および神経死10、11、12、13を生成することが多い。
既存の電極の限界は、安定した、高解像度、長期的な記録を可能にする最近の革新をもたらしました。典型的な電極は、タングステンや白金イリジウムなどの金属導体から成り、またはシリコンまたはポリマーベースである。金属ベースのマイクロワイヤアレイは、長期間、安定した録音を維持することができますが、10-200 μm14の範囲の単一のワイヤの直径で、はるかに大きなフットプリントを持っています。対照的に、シリコンベースの電極アレイは、高い空間分解能で記録を得るが、比較的堅い設計のために、それらは一般に、15ヶ月にわたって同じニューロンからの信号および記録を維持することができない。シリコン系アレイの最近の発展は、慢性的な記録を確実に行うことができる電極をもたらしたが、これらのアレイは、より大きな動物の深部脳領域からの記録に使用することができず、線形記録9を目的としている。ポリマーアレイの進歩により、単一ユニットの柔軟性と記録安定性が向上し、近い将来に高密度記録の可能性を提供しますが、現時点では可用性は限られています8,16,17.炭素繊維は、ここで説明する既製材料で高密度の記録を可能にします。
炭素繊維記録マイクロ電極は、ガラスマイクロピペットに挿入された単一の炭素繊維からなる最初の炭素繊維電極で、何十年も使用されてきました。これらの微小電極は、単一単位の細胞外記録に使用され、シグナル対ノイズ比は最高のタングステンガラス微小電極に匹敵するものであったが、柔軟性、低インピーダンス値、および18,19を製造する簡素さのために有利であった。炭素繊維のバイオセンシング能力により、炭素繊維電極アレイの開発が加速しました。生体適合性の増加と優れた電気伝導性に加えて、高温抵抗、低相対密度、高い引張強度、低屈曲剛性、高検出感度、および小さな断面積10、12を含むユニークな特性のセットを備えています。これらの特性のすべては、単一のニューロンの慢性的で安定した、高収率の記録を容易にする炭素繊維微小電極アレイ(CFEAs)の開発を動機づけています。このようなCFEAは、手で作製することができます20,21 (図 1), 数ヶ月にわたって単一のニューロンを保持することができる微小電極アレイを生成.ここに記載されているCFEAのアクセス可能な構築プロセスは、2つの種における個々のニューロンの急性および慢性の記録のために2つの方法で適応されている。
Protocol
すべての実験手順は、ブランダイス大学またはワシントン大学動物ケアと使用委員会によって承認されました.示されたデータは、1匹の雌フェレットと1匹の雄マウスから収集された。
炭素繊維・工具の製造
- 商業用炭素繊維の製造
- エポキシサイズの繊維束から8cmのストリップを切ります。水片を円で平行に敷き、400°Cの窯で6時間焼き、市販の繊維からエポキシを取り除きます。次に、標準的なペトリ皿または円錐形の管に焼いた繊維を貯えます。
注:直径7μmの繊維を使用しました。他のグループは4 μmの繊維20、21を使用している。 - 個々の繊維を保持するためのカセットを準備します。3D プリンタまたはレーザーカッターを使用して、カセットと関連するカセット ホルダーを作成します( 図 2を参照)。
- カセットに繊維を積み込みます。カセットの2つの長い側面に両面テープを敷き、テープの端をカセットの内側の端に合わせることから始めます。個々の繊維を焼いた束から分離し、カセットの短い側と平行に置き、繊維間に2〜3mmを保ちます。各カセットに20~30本の繊維を装着してください。二重棒テープの上に透明なテープを敷いて、繊維を所定の位置に密封します。充填したカセットをカセットホルダーに入れる。
注意:経験豊富なビルダーのために、繊維の1カセットを充填する場合は〜1時間かかります。初心者ビルダーの場合、このプロセスは〜1.5-3時間かかる可能性があります。箱に10カセットがあり、2つのカセットホルダーは、パリレン蒸着室に収めることができます。 - 市販の真空蒸着チャンバを使用して、個々の繊維にパリレンCを塗布します。コーティングには1回の実行が必要です。各ランの2.3gのパリレンを測定します。2つのカセットのホールダーは一度に部屋に入る。塗布の手順は、1回の実行につき約2時間かかります。
注:2.3 gのパリレンCの測定は、コーティングのおよそ1 μmを提供します。被覆繊維は無期限に保存することができます。
- エポキシサイズの繊維束から8cmのストリップを切ります。水片を円で平行に敷き、400°Cの窯で6時間焼き、市販の繊維からエポキシを取り除きます。次に、標準的なペトリ皿または円錐形の管に焼いた繊維を貯えます。
- 炭素繊維操作ツールの作成
- 30G針の周りに柔軟な粘着フィルムの小片を包み、接着剤フィルムで鋭いが柔軟な点を形成する。
注:針の先端をパラフィルムで包み、その際にパラフィルムを伸ばして、ユーザーが個々の繊維を拾って操縦することを可能にする穏やかな接着効果を生み出します。
- 30G針の周りに柔軟な粘着フィルムの小片を包み、接着剤フィルムで鋭いが柔軟な点を形成する。
2. 設計と製作
- 構築する電極の仕様に基づいて、必要な適切な治具設計を選択します。これは、必要なチャネル数と、設計の追加に基づいて行われます。
注:ジグは、電極と電気接続のためのアンカーを提供する3Dプリントブロックを指します。 - コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、ジグの特定の設計を作成または変更します。
- 高解像度の SLA 3D プリンターを使用して治具を印刷するには、3D 印刷会社または機関メーカーのラボを使用します。
3. 炭素繊維微小電極アレイ(CFEA)の組み立て
注:このステップは、経験豊富なビルダーのために〜2時間、初心者ビルダーのために〜6時間かかります。10xステレオ顕微鏡でCFEAアセンブリのステップと繊維の束縛のステップをすべて実行します。これは、建物のプロセスを妨げる可能性があるため、最小限の空気の動きで環境でCFEAを組み立てます。
- 望ましい電極を構築するために必要な適切な治具を選択してください。
- 金属ワイヤーカッターを使用して、直径0.003インチ(76.2 μm)のタングステン線2本を、長さ約7cmで切り取ります。
- 各ワイヤを、治具のコネクタ端にある適切なチャネルを通して供給します(GND および REF)。2つの端が等しい長さになるまで十分に供給し、それらを一緒にねじって治具に固定します。
注: 16 チャンネルの急性設計では、金属ワイヤが治具のリッジ内に収まることを確認します。- UV硬化歯科用セメントを適用してワイヤーを固定します。ワイヤーが通って供給される開いているチャネルの中で歯科用セメントを得ないようにしてください。
注:ユーザーは、潜在的な目の損傷を防ぐために、すべてのUV関連の手順中にUVフィルタリングアイプロテクションを着用する必要があります。多くの UV 硬化杖には、表示フィルターが組み込まれています。 - UV硬化杖を使用して、20 sの歯科用セメントを硬化させる。
- ジグの腕の1つでジュエリーバイスのジグを固定します。側面の 1 つが地面に平行になるように、ジグの方向を設定します。
- コネクタの端、洗面器、漏斗先端が見えるように、顕微鏡の下でジグと粘り角を向けます。じょうごがユーザーから離れ、コネクタの端がユーザーの向きに向かるように、治具の向きを変えます。
- 炭素繊維工具と鋭利な25G針を集める。
- パリレン-Cコーティングされた繊維を含むカセットを白紙の上に置き、テープサイドを上に置き、繊維が紙の上に直接置かないようにします。
- 25G針を使用して、カセットから単一の炭素繊維を切断します。これを行うには、取り除く繊維が出てくるカセットに対して針の先端をスライドさせてください。
- ハーフファイバーを使用して構築する場合は、上述のように繊維の一端を切断する。繊維をまっすぐに向け、針を使って、紙に対して繊維を切断して半分に切ります。カセットにまだ接続されている残りの半分をカットするために、以前に作られた炭素繊維工具で繊維の自由先端を保持し、針を使用して前述のようにカセットに接続された繊維を切断する。
- フルファイバーを使用して構築する場合は、上述のように繊維の一方の端を切断します。以前に作られた炭素繊維ツールを使用し、ちょうど切断した繊維の自由端を保持します。針を使用して、カセットから繊維のもう一方の端を切り取ります。
- 以前に作られた炭素繊維ツールを使用して炭素繊維を拾います。一方の端部が工具から約1cmの長さを持たるようにファイバーを拾います。
- ファイバーを取り付けた炭素繊維工具を使用し、ジグの中央流域から漏斗片を通して繊維の短い端を供給します。顕微鏡を使って視覚化します。
- ファイバーの長さの大部分が終わるまで、ジグ漏斗を通して繊維を供給し続けます( 図3Aを参照)。
- 以前に作られた炭素繊維ツールを使用して、利用可能なチャネルを通してファイバーの背面部分を供給します。約5mmの繊維が背面に突き出るまで、繊維を背部に通します。必要に応じてサイズに切り取ります( 図 3Bを参照)。
注: 金属ワイヤを含むチャネルにファイバーを供給しないでください。
- 上記の指示に従って、チャネルの残りの部分をジグの片側にファイバーで埋めます。
注:漏斗に繊維を供給する場合は、右の分割のチャネルの右半分と左の分割のチャネルの左半分で、漏斗の各分割に繊維の半分を供給します。繊維が漏斗内で密接に接触している場合、既存の繊維が緩んだり壊れたりして、新しい繊維をジグに供給する際に、繊維間に好ましくない摩擦が発生します。この4つのセクションへの分割は、後のステップまで繊維が小さな束に保たれ、いくつかの救済を提供する。 - 標準のスパークホイールライターを使用し、コネクタの端にある露出したファイバーの上に炎をすばやく渡します。すべてのファイバーの絶縁材が両端で取り外されていることを確認します( 図3Cを参照)。
注: 炎にさらされたファイバーの部分は、残りのファイバーよりもわずかに薄く見えるはずです。 - 炎に露出した繊維の部分がチャネル内に入るように、炎の繊維を治具に送ります。ジグの背面に繊維が突き出していないことを確認します( 図 3Dを参照)。
注:カーボンファイバーツールを使用して、洗面器内から繊維をつかみ、炎の繊維を治具に送ります。この部分はより壊れやすいので、炎にさらされた繊維の部分に触れないでください。 - 治具の洗面器の繊維にUV硬化歯科用セメントを塗布します。チャネルの開口部と漏斗の開口部をカバーするために、流域全体を埋めます( 図 3Eを参照)。
- UV光を使用し、20 sの歯科用セメントを硬化させる。歯科用セメントが完全に硬化していない場合は、追加の20 sを治療します。
注:歯科用セメントがチャネル内を移動しないことを確認します。
- UV光を使用し、20 sの歯科用セメントを硬化させる。歯科用セメントが完全に硬化していない場合は、追加の20 sを治療します。
- ジグを万力から取り出し、ひっくり返し、以前に確保したように、ジグを万力で固定します。ファイバーを含む側が、今すぐ下向きになっていることを確認します。
- 上述のとおりに、ジグの空面に炭素繊維を充填します。
- すべてのチャネルに繊維があって、繊維が歯科用セメントで固定されたら、ジグを万力から取り出し、ジグの向きを変えて漏斗が下を向いるようにします。コネクタの端が上向きになるように、フィス内のジグを固定します。
- 鋭利な25G針、1mLの注射器、銀導電性塗料、綿先端のアプリケーター、塗料シンナー、ティッシュワイプ、適切なヘッドステージコネクタを収集します。
注:銀の導電性塗料が十分に混合され、均質なソリューションであることを確認してください。塗料を乾かさないで下してください。 - 0.3mLの銀色の塗料を1mLのシリンジに引き出し、鋭利な25G針を取り付けます。
- 歯科用セメントに止まるまで針を1つのチャネルに慎重に挿入します。チャネルから針を取り外しながらゆっくりとスポイトを押し下げ、チャネルをペイントで塗りつぶします( 図 3Eを参照)。
- 針から任意の塗料を拭き取り、次のチャネルに進みます。
- すべてのチャンネルをペイントで塗りつぶします。
注: 最初の数分間は、チャネルにペイント セットが設定されている場合、チャネルへの追加パスが必要になる場合があります。
- すべてのチャンネルをペイントで塗りつぶします。
- 塗料の薄い部分にコットンチップのアプリケーターを浸し、表面の任意の塗料の治具のベースをきれいにします。これには、いくつかの綿の先端のアプリケーターが必要な場合があります。
注:塗料シンナーに浸さないコットンチップのアプリケーターは、治具をきれいにするのにも役立ちます。 - ピンをチャンネルに合わせて適切な方向にヘッドステージコネクタを挿入します。ヘッドステージ コネクタが直立して、できるだけジグに対して高い位置にあることを確認します( 図 3Fを参照)。
- 治具を24時間治します。
- ヘッドステージコネクタが治具と出会うエッジに沿って歯科用セメントを塗布することで、UV硬化デンタルセメントを使用して、ヘッドステージコネクタを治具に固定します。20 sのUV光を使用してUV硬化。
- UV硬化歯科用セメントを適用してワイヤーを固定します。ワイヤーが通って供給される開いているチャネルの中で歯科用セメントを得ないようにしてください。
4. 繊維バンドル包装
注: この手順を実行するには約 30 分かかります。ピアマーターの厚い層を持つ動物モデルで使用される電極のためにこのステップを完了します。繊維束を補強して曲げを最小限に抑えます。マウスの手順では、この手順は必要ありません。
- 水張力を使用して、繊維の束を1本のシャフトにまとめます。電極が万力で直立して固定されている間、漏斗の先端からバンドル先端に水の滴を実行するために移管ピペットを使用してください。
- じょうご先端の束の周りに厚さ約1.5mmの歯科用セメントの層を塗布することから始めます。20 sのUV光で歯科用セメントを硬化させろ。
注: 皮質の録音のために、それ以上の包装は必要ありません。より深い脳領域については、バンドルの周りにガイドチューブを固定します。 - ガイドチューブの構築とガイドチューブへのバンドルの挿入
- ポリイミドチューブの所望の長さを測定し、カットします。ポリイミドチューブの長さが2mmの炭素繊維チップを自由に残すようにしてください。ポリイミドチューブより2mm短い30G金属チューブを測定してカットします。回転ツールを使用して、金属チューブの鋭いエッジを除去します。ポリイミドチューブを金属チューブの内側に挿入します。
- カーボンファイバーバンドルを上向きにして、電極を万力に置きます。組み立てたチューブをマイクロマニピュレータに固定し、顕微鏡を使用して慎重に繊維束の上に下げます。歯科用セメントの追加層を使用して、既存の歯科用セメントベースにチューブを固定します。20 sのUV光で歯科用セメントを硬化させろ。
注: ここで、構築プロセスを一時停止することができます。
5. 電極先端の準備
メモ:このステップを実行するには、アレイあたり約30分かかります。
- 電極を所望の長さに切ります。
- 電極先端を切る準備として、スタック付箋は、約1.5ミリメートルの高さプラットフォームを構築するために。プラットフォームの端から、所望の電極長さを測定し、この距離をマークします。プラットフォームは切断のためのガイドとして機能します。
- 漏斗先端が完全に水没するまで脱イオンまたは蒸留水のビーカーに電極を下げ、先端を先に、表面に垂直に保持する。水から電極を取り除くことによって、個々の炭素繊維を一緒に持って来ます。表面張力はバンドルを一緒に持って来る。電極を30分間空気乾燥させます。
- #10メスブレードをハンドルに取り付けます。メスと電極を-18°Cの冷凍庫に5分以上入れて、凍結します。
- ファイバーがガイドの表面にフラッシュされるように電極を置きます(ステップ5.1.1で用意)。転動を使用して、メスで目的の長さに繊維をカットします。電極とメスが凍結していることを確認するには、このステップを素早く完了してください( 図 3Gを参照)。
- 電極先端のインピーダンスを低減するために正の電流を注入します。
- 適切なアダプタを使用して、電極を多電極インピーダンステスターに取り付けます( 材料表を参照)。電極先端を0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のマイクロ遠心チューブに約2mm下げる。マイクロ遠心分離管にアース線を挿入します。
- 選択した振幅と持続時間で電流を注入します。
注: このステップは CFEA の先端のインピーダンス値を減らすことを目的としています。本研究では、次のパラメータが、エレクトロめっきソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースに入力されました: 現在: 0.100 μA;所要時間:10 s;一時停止: 1 s.このプロセスは、必要に応じて、電極インピーダンスが所望の値を満たすまで、チャネルごとに繰り返すことができます( 図4Cを参照)。 - インピーダンス値が望ましいときは、繊維を脱イオンまたは蒸留水で洗い流して洗浄します。
- 金めっき液中の電気プレート。
注:このステップは、移植の直前(同じ日)に行う必要があります。
注意:CFEAチップの調製に使用される化学物質の一部は、金めっき液を含む腐食性です。使用前にSDSに相談し、ソリューションを安全に処理するために適切な予防措置を決定してください。
注:繊維束に剛性を提供するために、ユーザは、最初に1mg/mLで脱イオンまたは蒸留水中のPEG8000を可溶化することによって金めっき溶液を作成することができる。次に、625 μL可溶化PEG8000と375 μLの金めっき液とボルテックス溶液を10 sに混合して混合します。PEG8000 は脳内の繊維の挿入後に溶解します。.- 電極束先端をめっき混合物のマイクロ遠心チューブに2mm下げます。マイクロ遠心チューブに接地線を挿入します。
- 電気めっきに適切なパラメータを設定します。この研究では、次のパラメータが、エレクトロめっきソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースに入力されました: 現在: -0.05 μA;所要時間:30 s;一時停止:5 s.
- 繊維を脱イオンまたは蒸留水で十分に洗い流します。このとき、必要に応じてインピーダンス値を再度測定します。
6.脳内の挿入:生存手術、マウス(筋筋肉)と非生存手術、フェレット(ムスレ・プトリウス・フロ)
注: 外科手術は、IACUC に準拠した標準プロトコルに従う必要があります。詳細については、生存手術プロトコルのMaら22および非生存手術プロトコルのためのポポビッチら23を参照してください。げっ歯類の種の生存手術のためのASCガイドラインに従って無菌外科的処置に従ってください。これらには、135°Cで15分間の手術用ツールと材料のオートクレーブ、70%エタノールによる立体化装置と手術領域の治療が含まれます。手術中に滅菌手術用手袋、使い捨てガウン、フェイスマスクを使用してください。
- サバイバル手術、マウス(筋筋肉)
- 2.5%のイオブルランを誘導ボックスに入れ、呼吸数が55~65呼吸/分になるまで麻酔します。次いで、2.0%のイオブルランを鼻コーンを介して投与し、麻酔を維持する。角膜損傷を防ぐために両眼に獣医軟膏を塗布する。つま先ピンチを実行して、麻酔の適切な程度を確認します。
- 検証後、Maら22に詳述されている生存手術手順に従ってください。呼吸数を監視し、60呼吸/分で維持します。サーモスタット制御の加熱パッドを使用して、37°Cで体温を維持します。頭蓋骨切り出し、尿素切診、電極注入のための頭蓋骨の準備手順については、手順6.3-6.5(下記の詳細)を参照してください。
- 手術後、マウスを回復ケージに戻し、37°Cの加熱パッドを備え、他の動物から分離する。
- 抗生物質軟膏の外科的創傷を覆う。彼らは胸骨の不備を維持し、彼らは2-5日間の期間の回復を可能にするのに十分な意識を取り戻すまで、動物を監視します。それらを一人で収容し、感染や不快感の兆候を継続的に監視します。動物に1回のブプレノルフィン72時間の持続放出(0.5-1.0 mg/kg)を鎮痛剤として手術当日に与える。
- 非生存手術、フェレット(ムスレ・プトリウス・フロ)
- 最初にケタミン(20mg/kg、i.m.)でフェレットを麻酔し、マスクを通して亜酸化窒素と酸素の2:1混合物で1.0%〜2.0%のイオブルランで換気する。つま先ピンチを実行して、麻酔の適切な程度を確認します。
- 検証後、ポポビッチら23で詳述された非生存手術手順に従ってください。気管切開術を行い、亜酸化窒素と酸素の2:1混合物でイソフルランの1.0%〜2.0%で動物を換気します。角膜損傷を防ぐために両眼に獣医軟膏を塗布する。
- サーモスタット制御の加熱パッドを使用して、37°Cで体温を維持します。心拍数、終潮CO2 レベル、呼吸速度を監視します。呼吸率を適切な生理学的範囲(3.5%~4.0%)に保ちます。頭蓋骨切り出し、尿素切診、電極注入のための頭蓋骨の準備手順については、手順6.3-6.5(下記の詳細)を参照してください。
- 十分な麻酔を確実にするために動物のECGを継続的に監視し、ECGが何らかの苦痛を示すならばイオブルランの割合を増加させる。
- 実験の完了時に、1mLのペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウム溶液をフェレットに投与し、心拍数および終潮CO2が0を測定するまで監視する。
- 頭蓋骨の準備
- 0.8 mmドリルバリを使用して、単一の4 mm x 4 mm 開出用の場所で開きます。マウスの場合は、ステンレス鋼のグランドスクリュー挿入のために、対側のサイトで追加のバリ穴を開けます。
注:電極が移植の準備ができるまで、尿素検査を行わないで下さい。 - 地盤/基準を確立します。急性フェレット実験では、18Gの針を使用して、皮膚と頭蓋骨を取り巻く筋肉の層を、開頭術とは反対の動物の頭の側に突き刺す。Ag/Cl参照電極のワイヤーエンドを針先に挿入し、ペレットが筋肉と頭蓋骨の間にしっかりと座るように、針を筋肉/皮膚から引き込みます。マウスで、ステンレス製のアースネジにシルバーのアース線を巻き付けます。UV硬化歯科用セメントで安全。
- 薄いラベルテープを使用して電極を電極ホルダに取り付け、電極ホルダーをマイクロマニピュレータに固定します。アリゲーター クリップを使用してアース 線を接地ソースに接続します。動物の筋肉に埋め込まれた参照電極に参照ワイヤーを取り付けます。
- 0.8 mmドリルバリを使用して、単一の4 mm x 4 mm 開出用の場所で開きます。マウスの場合は、ステンレス鋼のグランドスクリュー挿入のために、対側のサイトで追加のバリ穴を開けます。
- デュロトミーとピアの浸透
- 硬膜摘みで頭蓋術から硬膜を取り除きます。
- ピアに小さな穴を作成します。これを行うには、金属マイクロ電極(フェレットで推奨)を挿入し、撤回します。あるいは、CFEAを脳の表面に直交して下げて、脈管構造を避ける。この位置が決定されたら、電極を上げ、その位置の脳の表面を硬膜ピックで優しくニックし、ピックで上向きに引っ張ります(マウスで推奨)。
- 電極注入
- 電極先端を同じ位置に下げ、ファインモードで、電極を約2μm/sの速度で脳内に駆動し始めます。顕微鏡を使用して、電極がスムーズに入り、曲がらないようにします。
注:電極がスムーズに入っていない場合は、脳から上げ、角度を再び再取り付けしてください。スムーズに入らずに曲がり続ける場合は、位置を調整し、新しいエントリ位置に対して脳の表面をニッキングするプロセスを繰り返します。 - 以下の手順で慢性および急性移植を行います。
- 慢性移植のために:UV硬化歯科セメントを使用して所定の位置に電極をセメント。
- 5-0外科縫合糸を使用して切開を閉じ、ヘッドキャップを構築します。
- ヘッドキャップを構築するには、インプラント部位の周りに追加の歯科用セメントを追加します。治具の鼻を覆うことを確認してください。
- ヘッドキャップの周りと皮膚を引き上げます。5-0外科縫合糸でヘッドキャップの後ろの切開を縫合する。
- リドカインクリームと抗生物質軟膏を適用します。
- 麻酔薬を停止し、標準的な回復手順に従ってください。
- 急性移植の場合:電極を下げて所望の深さに達した後、電気生理学的記録を開始する前に少なくとも30分待って電極が所定の位置に落ち着くようにします。
- 慢性移植のために:UV硬化歯科セメントを使用して所定の位置に電極をセメント。
- 電極先端を同じ位置に下げ、ファインモードで、電極を約2μm/sの速度で脳内に駆動し始めます。顕微鏡を使用して、電極がスムーズに入り、曲がらないようにします。
Representative Results
このプロトコルの完成により、単一ユニットのスパイク活動の安定した記録が可能になります。これらの微小電極アレイは、研究者のニーズに基づいて、材料、チャネル数、およびヘッドステージアダプターでカスタマイズ可能です。金の電気めっき繊維は、記録に適したインピーダンスの減少をもたらす(図4 および 図5)。ユーザーが慢性的に記録する場合は、動物が外科的処置から回復した後に測定を行うことができます。慢性的な手順は、少なくとも120日間、安定した単一ユニットの記録をもたらしました。図 6に代表的な記録を示す、自由に振る舞う成人雄マウスの後splenial皮質における安定な64チャネル電気生理活性を示す。急性の調製が意図されている場合、記録は、移植後すぐに開始することができます(〜30分)。これは、電極が脳に落ち着く時間を可能にします。 図7 は、成人雌フェレットの一次視覚皮質から取得した急性16チャネルCFEA記録の代表例を示す。マウスとフェレットでのスパイクソートは、スパイクソートソフトウェアで行いました( 資料表を参照)。
図1:16チャネルおよび32チャネルの炭素繊維微小電極アレイ(CFEA)の解剖学(A)32チャネル(上)および16チャンネル(下)CFEAの3つの異なる図からの回路図。16チャネルCFEAは処理を目的とした拡張設計を特徴としています。32チャネル設計は64チャネルCFEAのために2つのジグを結合することを可能にする平らな面を特色にする。どちらの図にも、ディメンションでラベル付けされた識別構造があります。コネクタの端点はコネクタ挿入の位置を示し、GND/REF チャネルは接地線が挿入される場所を示します。漏斗流域は、繊維がUV光硬化歯科セメントで重ね合わされる場所を指し、漏斗先端は繊維が治具から出る場所を意味する。じょうごチップは、繊維が一緒にしがみつき、損傷を引き起こし最小限に抑えるために、象限に分割されます。繊維は後で歯科用セメントの使用と単一の束に引っ張られる。ジグはSLA樹脂プリンターを使用して3Dプリントされています。図は、詳細を表示するために拡大されます。(B) CFEA を構築した。図には、ラベル付けされた識別構造があります。青い束の先端は記録測定を得るカーボン繊維の区分を表す。漏斗盆地内およびコネクタの周囲の灰色は、漏斗盆地に炭素繊維を保持し、ジグへのコネクタを固定するUV光硬化歯科セメントを示しています。紫色のワイヤーは接地線を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:パリレンCコーティング用のカセットへの生炭素繊維のローディング(A)カーボンファイバーは、両面テープ(青)の2つのストリップを重ねたカートリッジに積み込まれます。各カセットには~25繊維が積まれています。(B)カセットは、パリレンCコーティングの準備としてレーザーカットホルダー(グレー)に積み込まれます。それぞれに10個のカセットが入っています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:炭素繊維微小電極アレイ(CFEA)束構造図:(A)16個体、被覆炭素繊維(黒)を32チャンネル3Dプリントジグ(グレー)に通す。(B)カーボンファイバーチップをマイクロハサミで切断し、余剰繊維を治具ベースの高さに等しく残し、治具ベースから伸びる。(C)標準のプラスチック製スパークホイールライターは、パリレンC絶縁体を除去するために、余分な繊維の上に素早く渡されます。右上の図は、12繊維のうち9本からパリレンを除去した図である。(D)繊維は、繊維の端部がベースと同じになるまで、治具に再挿入されます。右上の図は、治具ベースの内側に収納された非絶縁(灰色)繊維チップを持つ9本の繊維の再挿入を示しています。その後、ジグが反転し、ステップA-Dが逆の16チャンネルをスレッド化するために繰り返されます。(E) 治具は繊維を固定するために歯科用セメントで満たされている。銀のプリントは、治具ベースの各ウェルに注入されます。(F) オスコネクタが治具ベースに挿入される。(G)CFEAおよびメスは-20 °Cの冷凍庫で凍結される。配列の先端は望ましい長さに切り取り、32個の繊維を残す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:先端処理と電気めっき(A)電極先端は、まず0.1MPBSに入れ、そこで電流が各電極を通過する。その後、チップをすすいで金メッキ溶液に移し、電流で電気メッキします。(B)調製炭素繊維のSEM画像は、先端に濃縮された金めっき液を示す。スケールバーは、最初の切断後の168チャンネルからの4μm(C)インピーダンス値を表します(紫色; 3.11 MΩ ± 0.42 MΩ、中央値±SE、n = 168繊維、正の電流注入(ピンク;1.23 MΩ±0.36 MΩ、中央値±SE、n =168繊維)、および電気めっき(オレンジ;0.19 MΩ±0.15 MΩ、±中央値SE、n=16繊維)が各インプダンス値を減少させます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:適度な金の電気めっき期間は炭素繊維束の先端に小さく、丸みを帯びた沈着物を作り出す。描かれている炭素繊維の先端はすべて異なるマイクロ電極アレイから、インピーダンス低減または金めっきのために注入された電流の異なる持続時間を反映しています。画像はさらに、炭素繊維を絶縁し、繊維の先端以外の場所からの信号の取得を防ぐパリレンCコーティングを示しています。(A)凍結後の炭素繊維先端の走査型電子顕微鏡画像を、カミソリの刃で1回カットした。スケールバーは10 μmを表しますが、その後10秒(C)Bに正の電流を注入した後、5秒(C)の金で電気メッキを行い、Bと同じですが、15s(E)の金で電気メッキを行いました。我々は、-0.05μAの電流で30sの電気めっきが電気生理学的記録に最適であることを発見した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:炭素繊維微小電極アレイを用いたマウス後splenialの自由な振る舞いにおける慢性細胞外記録は、持続的で安定した神経活動を示す。(A)11個のバンド通過電圧トレースが同時に記録された。最初のチャンネル(上の行)から記録された後続のトレースは、時間の持続性を示すためにBにプロットされます。残りの 10 行は、記録品質の一貫性を示し、アレイ全体での堅牢なアクティビティを示します。各トレースの左側にあるスケールバーは、200 μVの電位を表します。(B) A の上部トレースと同じファイバーからのバンドパス データが拡張され、120 日間の連続記録での活動が安定して表示されます。(C) クラスタリングは、数ヶ月にわたって堅牢な単一ユニット検出を明らかにします。トレースは、120日間にわたって連続観測可能な代表単一ユニットの平均波形を表し、各時点でBでプロットされた繊維から抽出される。(D) C からの平均、正規化されていないスパイク波形は、時間の経過に関する一貫性を示すために積み重ねられます。(E)炭素繊維の記録は、何ヶ月もの間安定したノイズフロアを示します。Bのノイズフロアの標準偏差(トレース-スパイク活動)は、ノイズにプログレッシブ変化を示しません。バーは平均汚染を表します。誤差範囲は標準偏差を表します。(F)慢性的に埋め込まれたCFEAとヘッドステージを持つマウスのスケール描画。(G)埋め込み後11ヶ月の生電圧トレース(上)は、堅牢なLFPを示す。バンドパス電圧トレース(下)は、安定した神経活動を示します。(H)Cから繊維に記録されたニューロンの平均スパイク波形は、スパイク活性の最初の1,000の発生率によって下敷きである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:フェレット原型視皮質からの炭素繊維微小電極アレイ(CFEA)の記録 (A) 16チャンネルCFEAから記録されたスパイクソートされた単一ユニットの波形。単一ニューロンからの作用電位は、多くの場合、わずかに異なる振幅で複数のチャネルで明らかであった。(B)選択したニューロンからの方向調整曲線。色は Aの記録された単位に対応しています。矢印は刺激運動の方向を示す。スケール バーは応答率を示します。誤差範囲は、標準誤差を伴う平均応答を示します。水平破線は、空白スクリーンへの露出中の同じセルの自発的な発射率を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、急性および慢性使用の両方に対して機能CFEAを構築するために必要な各ステップを記述する。説明されたプロセスは、研究者のニーズに合わせてカスタマイズ可能であり、数ヶ月にわたって単一のニューロンを監視するためのアクセス可能で安価なオプションとなっています。このプロトコルは、麻酔動物への移植から数分以内に堅牢な単一ユニット活性を記録し、目を覚まし、動物を振る舞い、これらのCFEAが神経応答の短期的および長期的な変化を研究する可能性を示す可能性を示す。
記述されたプロトコルのステップは、数ヶ月にわたって密かつ安定的に明確な単一ユニットを記録する機能を備えた、低限界コスト(<$100.00)で迅速に完了できる効率的な手順を実現するために、時間の経過とともに徹底的にテストされ、改善されました。建設ステップは1日未満で完了することができ、任意の主要な商業アレイに匹敵する電気生理学的信号を生成します。CFEAは、同様の商用アレイよりもはるかに小さなフットプリント(繊維の16チャネルバンドルは直径が〜26μm)を有し、その生体適合性は、それらを長期使用13に適している。重要なのは、同等のパフォーマンスを持つ機能する CFEA を生成するために従わなければならないいくつかの重要なステップと指示があることです。
炭素繊維の脆弱性のため、細心の注意を払って取り扱う必要があります。鋭利な鉗子や他の道具で取り扱うと、繊維が破損する可能性があります。また、繊維が吹き飛ばされないように、空気の動きが限られた空間にCFEAを構築することが重要です。繊維の背面部分を炎上する場合、ライターは約1 sの間、非常に短く前後の動きで移動する必要があります。絶縁のこの除去に続くステップは、作業チャネルを持つ電極を構築するために重要です。炎の先端は付加的な接触なしで治具に供給されるべきである。次に、洗面器を歯科用セメントで満たす場合、セメントを慎重に塗布し、チャネルと漏斗流域を完全に満たし、それらを充填せずに開口部を閉じることが重要です。歯科用セメントは、続行する前にUV光で完全に硬化する必要があります。これが完了したら、銀色の塗料は、完全に充填されたが、こぼれ落ちるまで、各チャネルに注入する必要があります。これはプロセスの中で最も可変的なステップです。オーバー充填は、チャネル間のクロストークを生成することができ、不十分な充填は、接続障害につながる可能性があります。25G針を使用して銀色の塗料を注入できない場合、溶液が粘性過多である可能性が高く、この場合、少量の塗料シンナーを添加してより流動的な溶液を作成することができます。すべてのチャネルが充填され、ヘッドステージコネクタが挿入されたら、歯科用セメントでコネクタを固定する前に、アレイが24時間硬化できるようにすることが重要です。そうしないと、接続されたチャンネルの数が減少することがわかりました。信号取得システムとの接続時にコネクタが切れないように、寛大な量の歯科用セメントを塗布することも重要です。それらが切り離された場合、銀色のペンキでチャンネルの繰り返し充填で再接続を試みることは可能ですが、ユーザーはCFEAのインピーダンス値をテストして、接続されたチャンネルの数を評価する必要があります。歯科用セメントを一晩硬化させることは、潜在的な剥離を防ぐのにも役立ちます。
電極のインピーダンスを測定すると、接続されたチャンネルの正確な推定が得られます。これは、地盤と参照線と炭素繊維先端をPBSに浸した後に行うことができます。高インピーダンス(>15 MΩ)は、開いた未接続のチャネルを示しています。電流と電気めっきを注入する前に、接続されたチャネルは、このプロセスで大幅に減少する必要があるインピーダンス値の範囲を持つことができます。16チャンネル電極あたりの接続チャネル数(電流インジェクション後のインピーダンス<4 MΩ)の平均は12.96±2.74(平均sD±。N = 48電極)。多数の電気めっき時間を試験し、30sが記録部位間で優れた信号絶縁を生み出した(図5)。PEDOT-pTS12、24、25、26およびPEDOT-TFB21が炭素繊維記録部位を準備するための信頼できるオプションを提供することは十分に確立されているが、我々は金でめっき、慢性注入のための電気めっき電極のための実証済みで信頼できる方法27、28を発見した。、移植の容易さを増加させ、電極先端が一緒に凝集するのを防いだ。この方法は、平均で0.2MΩ未満の最終インピーダンス値を生成する上で、PEDOT-TFB21およびPEDOT-pTS26を使用して達成された値に匹敵することを証明する。
マイクロ電極アレイを埋め込む際には、顕微鏡下での炭素繊維先端の挿入を視覚的に追うことが重要です。正常な挿入は、繊維の曲げなしで、明らかであるべきです。繊維が座屈しているように見える場合は、脳に正常に入る可能性は低いです。この場合、プローブの角度は 2 回目の試行に合わせて調整する必要があります。このプロセスは、プローブの挿入が成功するまで続行できます。電極が所望の深さになると、少なくとも30分待つと、プローブが最適な信号取得(急性記録)のために解決できることがわかりました。
CFEAは、小型フットプリントとバイオ互換性に加えて、建設の容易さと低コストのために、商用アレイに対して堅牢でカスタマイズ可能な代替手段を提供します。このプロトコルで詳細に説明されている CFEA の最大の制限は、そのスケーラビリティです。その構造の手動の性質のために、何百もの記録サイトを持つ設計にスケールアップすることは実用的ではないかもしれません。さらに、ナノテクノロジーを用いた微小電極アレイ製造の進歩により、ここで説明する方法よりも大規模な集団記録が可能になります。しかし、このプロトコルは、炭素繊維電極のベンチトップ製造に関心のあるラボにCFEAアクセシビリティを提供します。我々は、その時間スケールでの我々の観測の典型的な代表的な単一チャネルによって示されるように、120日間の慢性実験の間にスパイク振幅の安定性の損失または減少した堅牢性を観察しなかった(図6A-E)。さらに、CFEAは、マウスに移植してから11ヶ月後に4つの単一ユニットが識別可能であったため、持続的な単一ユニット活動の能力を示しています(図6G,H)。また、短期間での単一ニューロンの研究において、他の多くの市販電極に対して利点を提供する、安定した単一ユニットの記録を鋭く得ることができる(図7)。将来的には、このような柔軟で生体適合性の低いプローブの開発は、複雑なプロセスの研究を可能にします。これらのツールは、継続的で長期的な安定性を必要とする脳と機械のインターフェース(BM)でのアプリケーションを含む、神経技術の進歩に大きな有用性を提供します。
Disclosures
著者らは金銭的な利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
グレッグ・ギッチュンツの電極設計と建設に関する指導と、研究室と施設を開放してくれたティム・ガードナーに感謝します。私たちは、16チャンネルのジグの初期バージョンを設計する際に、バイオインターフェイスとテクノロジーのコア施設とニール・リッター、ジョン・スパイレアス、デビッド・ランデスマンでのPDS使用に関する彼の支援をしてくれたクリスト・ミハスに感謝したいと思います。ハーバード大学ナノスケールシステムセンターでのSEMイメージングの支援に対するティム・キャバナウの支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
| 16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool - sharp-tipped |
| 30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
| 31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
| 32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
| 6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
| AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
| Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
| Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
| Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Deionized water | Electroplating component | ||
| Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
| Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
| Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
| JRClust | Ferret spike sorting software | ||
| Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
| Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
| Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
| MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
| NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
| NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
| NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
| Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
| Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
| Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
| Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
| Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
| Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
| Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
| Sticky notes | Post-it | Building tool | |
| Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
| UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
| Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |
References
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