Summary
Ce protocole décrit une procédure de construction de réseaux de microélectrodes en fibre de carbone pour des enregistrements électrophysiologiques in vivo chroniques et aigus chez la souris (Mus musculus) et le furet (Mustela putorius furo) à partir de plusieurs régions du cerveau. Chaque étape, après l’achat de fibres de carbone brutes pour l’implantation de réseaux de microélectrodes, est décrite en détail, en mettant l’accent sur la construction de réseaux de microélectrodes.
Abstract
Les réseaux d’électrodes multicanaux offrent un aperçu du cerveau en fonctionnement et servent à élucider les processus neuronaux au niveau de la cellule unique et du circuit. Le développement de ces outils est crucial pour comprendre les comportements complexes et la cognition et pour faire progresser les applications cliniques. Cependant, il reste difficile d’enregistrer densément les populations cellulaires de manière stable et continue sur de longues périodes. De nombreuses électrodes populaires, telles que les tétrodes et les réseaux de silicium, présentent de grands diamètres croisés qui produisent des dommages lors de l’insertion et provoquent des réponses tissulaires réactives chroniques associées à la mort neuronale, entravant l’enregistrement d’une activité neuronale stable et continue. En outre, la plupart des faisceaux de fils présentent un large espacement entre les canaux, ce qui empêche l’enregistrement simultané à partir d’un grand nombre de cellules regroupées dans une petite zone. Les réseaux de microélectrodes en fibre de carbone décrits dans ce protocole offrent une solution accessible à ces préoccupations. L’étude fournit une méthode détaillée pour la fabrication de réseaux de microélectrodes en fibre de carbone qui peuvent être utilisés pour des enregistrements aigus et chroniques in vivo. Les propriétés physiques de ces électrodes les rendent idéales pour des enregistrements stables et continus à long terme à des densités cellulaires élevées, permettant au chercheur de réaliser des enregistrements robustes et sans ambiguïté à partir d’unités individuelles au fil des mois.
Introduction
Les électrodes et les réseaux d’électrodes sont des outils précieux pour comprendre comment le cerveau traite l’information au niveau neuronal. Bien que les enregistrements électrophysiologiques soient réalisables depuis plus de deux siècles1,il n’est toujours pas possible de mesurer simultanément l’activité de circuits neuronaux entiers à la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer le pic de neurones individuels. Bien que les méthodes non invasives, telles que l’électroencéphalographie2,la topographie par émission de positons3et l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle4 permettent des mesures du cerveau entier, elles ne peuvent pas atteindre la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour résoudre l’activité des circuits neuronaux2,5. En revanche, les méthodes d’imagerie telles que l’imagerie optique utilisant des colorants sensibles à la tension ou des indicateurs de calcium génétiquement codés peuvent atteindre une résolution spatiale unitaire, mais elles posent des problèmes tels qu’une faible résolution temporelle et une mauvaise sélectivité3,4,5,6. Les enregistrements électriques sont une alternative puissante à ces méthodes. Les électrodes d’enregistrement offrent une résolution temporelle inégalée et permettent à l’utilisateur d’effectuer des mesures avec une précision de temps de pointe dans n’importe quelle région du cerveau7. De plus, les réseaux multiélectrodes (MEA) implantés de manière chronique permettent des enregistrements unicellulaires à grande échelle (des dizaines à des centaines de cellules) chez des animaux se comportant sur une période de jours à des mois8,9. Cependant, les sondes en silicium qui enregistrent à des densités plus élevées ont une grande empreinte et sont très invasives, et les réseaux implantés de manière chronique génèrent souvent une réponse inflammatoire, une encapsulation tissulaire et une mort neuronale10,11,12,13.
Les limites des électrodes existantes ont donné lieu à des innovations récentes qui permettent des enregistrements stables, à haute résolution et à long terme. Les électrodes typiques sont constituées d’un conducteur métallique, tel que le tungstène ou le platine-iridium, ou sont à base de silicium ou de polymère. Bien que les réseaux de microfils à base de métal puissent maintenir des enregistrements stables à long terme, ils ont un encombrement beaucoup plus important, avec un diamètre de fil unique allant de 10 à 200 μm14. En revanche, les réseaux d’électrodes à base de silicium produisent des enregistrements à haute résolution spatiale, mais en raison de leur conception relativement rigide, ils sont généralement incapables de maintenir le signal et d’enregistrer à partir des mêmes neurones pendant de nombreux mois15. Les développements récents dans les réseaux à base de silicium ont abouti à des électrodes capables d’effectuer de manière fiable des enregistrements chroniques, mais ces réseaux ne peuvent pas être utilisés pour enregistrer à partir de régions cérébrales profondes chez des animaux plus grands et sont destinés à des enregistrements linéaires9. Les progrès dans les réseaux de polymères ont entraîné une flexibilité et une stabilité d’enregistrement accrues des unités individuelles et offrent le potentiel d’enregistrements à haute densité dans un proche avenir, mais avec une disponibilité limitée àl’heureactuelle8,16,17. Les fibres de carbone permettent des enregistrements à haute densité avec des matériaux prêts à l’emploi décrits ici.
Les microélectrodes d’enregistrement en fibre de carbone sont utilisées depuis des décennies, les premières électrodes en fibre de carbone étant constituées d’une seule fibre de carbone insérée dans une micropipette en verre. Ces microélectrodes ont été utilisées pour des enregistrements extracellulaires unitaires, et bien que le rapport signal/bruit soit comparable aux meilleures microélectrodes en tungstène dans le verre, elles étaient avantageuses en raison de leur flexibilité, de leurs valeurs d’impédance inférieures et de leur simplicité de fabrication18,19. Les efforts visant à développer des réseaux d’électrodes en fibre de carbone se sont récemment accélérés en raison des capacités de biodétection des fibres de carbone. En plus de leur biocompatibilité accrue et de leur conductivité électrique exceptionnelle, ils présentent un ensemble unique de propriétés, notamment une résistance à haute température, une faible densité relative, une résistance élevée à la traction, une faible rigidité en flexion, une sensibilité de détection élevée et une petite section transversale10,12. Toutes ces propriétés ont motivé le développement de réseaux de microélectrodes en fibre de carbone (CFA) qui facilitent les enregistrements chroniques, stables et à haut rendement de neurones uniques. De tels CFA peuvent maintenant être fabriqués à la main20,21 ( Figure1), produisant des réseaux de microélectrodes pouvant contenir des neurones uniques pendant des mois. Décrit ici est un processus de construction accessible pour les CFEA qui a été adapté de deux façons pour les enregistrements aigus et chroniques de neurones individuels chez deux espèces.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Brandeis University ou le Washington University Animal Care and Use Committee. Les données présentées ont été recueillies auprès d’un furet femelle et d’une souris mâle.
1. Préparation des fibres de carbone et des outils
- Préparation de fibres de carbone commerciales
- Coupez des bandes de 8 cm dans le faisceau de fibres de la taille d’un époxy. Déposer les bandes parallèlement dans un creuset et cuire dans un four à 400 °C pendant 6 h pour éliminer l’époxy des fibres commerciales. Ensuite, conservez les fibres cuites dans une boîte de Petri standard ou un tube conique.
REMARQUE: Des fibres d’un diamètre de 7 μm ont été utilisées. D’autres groupes ont utilisé des fibres de 4μm 20,21. - Préparez des cassettes pour contenir des fibres individuelles. Utilisez une imprimante 3D ou une découpeuse laser pour créer les cassettes et le support de cassette associé (voir Figure 2).
- Chargez les fibres sur les cassettes. Commencez par poser un morceau de ruban adhésif double face sur les deux côtés longs de la cassette, en alignant le bord de la bande avec le bord intérieur de la cassette. Séparez les fibres individuelles du paquet cuit et posez-les parallèlement avec le côté court de la cassette, en gardant 2-3 mm entre les fibres. Assurez-vous d’installer 20 à 30 fibres sur chaque cassette. Scellez les fibres en place en posant du ruban adhésif transparent sur le ruban adhésif double. Placez les cassettes remplies dans le porte-cassette.
REMARQUE: Pour un constructeur expérimenté, le remplissage d’une cassette de fibres prendra environ 1 h. Pour le constructeur novice, ce processus prendra probablement ~ 1,5-3 h. Il y a dix cassettes dans une boîte, et deux supports de cassettes peuvent tenir dans la chambre de dépôt de parylène. - Enduire les fibres individuelles de parylène C à l’aide d’une chambre de dépôt sous vide commerciale. Une seule course est nécessaire pour le revêtement. Mesurez 2,3 g de parylène pour chaque course. Deux supports de cassettes tiennent dans la chambre à la fois. La procédure de revêtement prend environ 2 h par course.
REMARQUE: Une mesure de 2,3 g de parylène C fournit environ 1 μm de revêtement. Les fibres enduites peuvent être stockées indéfiniment.
- Coupez des bandes de 8 cm dans le faisceau de fibres de la taille d’un époxy. Déposer les bandes parallèlement dans un creuset et cuire dans un four à 400 °C pendant 6 h pour éliminer l’époxy des fibres commerciales. Ensuite, conservez les fibres cuites dans une boîte de Petri standard ou un tube conique.
- Préparation de l’outil de manipulation en fibre de carbone
- Enroulez un petit morceau de film adhésif flexible autour d’une aiguille de 30 G, formant un point pointu mais flexible avec le film adhésif.
REMARQUE: Envelopper une pointe d’aiguille avec un parafilm et étirer le parafilm en créant un léger effet adhésif qui permet à l’utilisateur de ramasser et de manœuvrer des fibres individuelles.
- Enroulez un petit morceau de film adhésif flexible autour d’une aiguille de 30 G, formant un point pointu mais flexible avec le film adhésif.
2. Conception et fabrication
- Sélectionnez la conception de gabarit appropriée nécessaire en fonction des spécifications de l’électrode à construire. Cela sera basé sur le nombre de canaux nécessaires, ainsi que sur les ajouts de conception.
REMARQUE: Jig fait référence au bloc imprimé en 3D qui fournit une ancre pour les électrodes et les connexions électriques. - Créez ou modifiez la conception spécifique du gabarit à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO).
- Utilisez une société d’impression 3D ou le laboratoire de fabrication institutionnelle pour imprimer les gabarits à l’aide d’une imprimante 3D SLA haute résolution.
3. Assemblage du réseau de microélectrodes en fibre de carbone (CFEA)
REMARQUE: Cette étape prend ~2 h pour un constructeur expérimenté et ~6 h pour un constructeur novice. Effectuez toutes les étapes d’assemblage CFEA et les étapes de regroupement de fibres sous un stéréomicroscope 10x. Terminer l’assemblage du CFEA dans un environnement avec un mouvement d’air minimal, car cela pourrait perturber le processus de construction.
- Choisissez le gabarit approprié nécessaire pour construire l’électrode souhaitée.
- À l’aide de coupe-fils métalliques, coupez deux morceaux de fil de tungstène de diamètre 0,003 po (76,2 μm), soit environ 7 cm de longueur.
- Alimentez chaque fil à travers le canal approprié à l’extrémité du connecteur du gabarit (GND et REF). Nourrissez suffisamment jusqu’à ce que les deux extrémités soient de longueur égale, puis tordez-les ensemble pour les fixer sur le gabarit.
REMARQUE: Pour la conception aiguë à 16 canaux, assurez-vous que le fil métallique s’insère dans la crête du gabarit.- Appliquez du ciment dentaire durci aux UV pour fixer le fil. Assurez-vous de ne pas obtenir de ciment dentaire dans le canal ouvert à travers lequel le fil est alimenté.
REMARQUE: L’utilisateur doit porter une protection oculaire filtrante UV pendant toutes les procédures liées aux UV pour prévenir les dommages oculaires potentiels. De nombreuses baguettes de durcissement UV ont des filtres de visualisation intégrés. - À l’aide de la baguette de durcissement UV, durcissez le ciment dentaire pendant 20 s.
- Fixez le gabarit dans l’étau à bijoux par l’un des bras du gabarit. Orientez le gabarit de manière à ce que l’une des faces latérales soit parallèle au sol.
- Orientez le gabarit et l’étau sous le microscope de sorte que l’extrémité du connecteur, le bassin et la pointe de l’entonnoir soient visibles. Orientez le gabarit de sorte que l’entonnoir pointe loin de l’utilisateur et que l’extrémité du connecteur soit orientée vers l’utilisateur.
- Rassemblez les outils en fibre de carbone et une aiguille de 25 G à pointe pointue.
- Placez une cassette avec des fibres enduites de parylène-C sur une feuille de papier blanche, côté ruban adhésif vers le haut afin que les fibres ne soient pas directement sur le papier.
- Utilisez l’aiguille 25 G pour découper une seule fibre de carbone de la cassette. Pour ce faire, faites glisser la pointe de l’aiguille contre la cassette d’où émerge la fibre à retirer.
- Si vous construisez en utilisant des demi-fibres, coupez une extrémité de la fibre comme décrit ci-dessus. Orientez la fibre de manière à ce qu’elle soit droite et, à l’aide de l’aiguille, coupez la fibre en deux en coupant la fibre contre le papier. Afin de couper l’autre moitié, qui est toujours connectée à la cassette, maintenez l’extrémité libre de la fibre avec l’outil en fibre de carbone qui a été fabriqué précédemment, puis utilisez l’aiguille pour couper la fibre encore connectée à la cassette comme décrit ci-dessus.
- Si vous construisez en utilisant des fibres complètes, coupez une extrémité de la fibre comme décrit ci-dessus. Utilisez l’outil en fibre de carbone fabriqué précédemment et maintenez l’extrémité libre de la fibre qui vient d’être coupée. À l’aide de l’aiguille, coupez l’autre extrémité de la fibre loin de la cassette.
- Ramassez la fibre de carbone à l’aide de l’outil en fibre de carbone fabriqué précédemment. Ramassez la fibre de sorte qu’une extrémité ait environ 1 cm de longueur de l’outil.
- Utilisez l’outil en fibre de carbone avec la fibre attachée et alimentez l’extrémité la plus courte de la fibre à travers la pièce en entonnoir à partir du bassin central du gabarit. Utilisez un microscope pour visualiser.
- Continuez à alimenter la fibre à travers l’entonnoir de gabarit jusqu’à ce que la majeure partie de la longueur de la fibre soit traversée (voir la figure 3A).
- Alimentez la partie arrière de la fibre à travers un canal disponible à l’aide de l’outil en fibre de carbone précédemment fabriqué. Alimentez la fibre par l’arrière jusqu’à ce qu’environ 5 mm de fibre dépassent à l’arrière. Couper à la taille si nécessaire (voir Figure 3B).
REMARQUE: N’introduisez pas de fibres dans les canaux contenant les fils métalliques.
- Remplissez le reste des canaux avec des fibres d’un côté du gabarit, en suivant les instructions données ci-dessus.
REMARQUE: Lorsque vous alimentez des fibres dans l’entonnoir, alimentez la moitié des fibres dans chaque division de l’entonnoir, avec la moitié droite des canaux dans la division droite et la moitié gauche des canaux dans la division gauche. Lorsque les fibres sont en contact étroit dans l’entonnoir, il y a une friction défavorable entre les fibres qui conduit à des fibres existantes soit arrachées, soit cassées lors de l’alimentation de nouvelles fibres dans le gabarit. Cette division en quatre sections apporte un certain soulagement, car les fibres sont conservées en petits faisceaux jusqu’à une étape ultérieure. - Utilisez un briquet à roue à étincelles standard et passez rapidement la flamme sur les fibres exposées à l’extrémité du connecteur. Assurez-vous que l’isolation de toutes les fibres est retirée aux extrémités (voir Figure 3C).
REMARQUE: La partie des fibres qui ont été exposées à la flamme devrait sembler être légèrement plus mince que le reste de la fibre. - Alimentez la fibre flammée à travers le gabarit de sorte que la partie de la fibre exposée à la flamme soit maintenant dans le canal. Assurez-vous qu’aucune fibre ne dépasse à l’arrière du gabarit (voir la figure 3D).
REMARQUE: Utilisez l’outil en fibre de carbone pour saisir la fibre à l’intérieur du bassin et alimenter la fibre enflammée à travers le gabarit. Ne touchez pas la partie des fibres exposée à la flamme, car cette partie est plus fragile. - Appliquez du ciment dentaire durci aux UV sur les fibres dans le bassin du gabarit. Remplissez tout le bassin pour couvrir les ouvertures des canaux et l’ouverture de l’entonnoir (voir Figure 3E).
- Utilisez la lumière UV et durcissez le ciment dentaire pendant 20 s. Durcissez pendant 20 s supplémentaires si le ciment dentaire n’est pas complètement durci.
REMARQUE: Assurez-vous que le ciment dentaire ne se déplace pas à l’intérieur des canaux.
- Utilisez la lumière UV et durcissez le ciment dentaire pendant 20 s. Durcissez pendant 20 s supplémentaires si le ciment dentaire n’est pas complètement durci.
- Retirez le gabarit de l’étau, retournez-le et fixez le gabarit dans l’étau comme précédemment fixé. Assurez-vous que le côté contenant les fibres est maintenant face cachée.
- Remplissez le côté vide du gabarit avec des fibres de carbone exactement comme décrit ci-dessus.
- Une fois que tous les canaux ont des fibres et que les fibres sont fixées avec du ciment dentaire, retirez le gabarit de l’étau et orientez le gabarit de sorte que l’entonnoir pointe vers le bas. Fixez le gabarit dans l’étau de sorte que l’extrémité du connecteur pointe vers le haut.
- Rassemblez une aiguille de 25 G à pointe pointue, une seringue de 1 mL, de la peinture conductrice argentée, des applicateurs à pointe de coton, un diluant à peinture, des lingettes en tissu et le connecteur de scène de tête approprié.
REMARQUE: Assurez-vous que la peinture conductrice d’argent est bien mélangée et constitue une solution homogène. Ne laissez pas la peinture sécher. - Déposez 0,3 mL de peinture argentée dans la seringue de 1 mL, puis fixez l’aiguille de 25 G à pointe pointue.
- Insérez soigneusement l’aiguille dans un canal jusqu’à ce qu’elle soit arrêtée par le ciment dentaire. Appuyez lentement sur la seringue tout en retirant l’aiguille du canal pour remplir le canal de peinture (voir Figure 3E).
- Essuyez toute peinture de l’aiguille, puis passez au canal suivant.
- Remplissez tous les canaux avec de la peinture.
REMARQUE: Des passages supplémentaires dans les canaux peuvent être nécessaires car la peinture se fixe dans les canaux pendant les premières minutes.
- Remplissez tous les canaux avec de la peinture.
- Trempez un applicateur à pointe de coton dans le diluant à peinture, puis nettoyez la base du gabarit de toute peinture sur la surface. Quelques applicateurs à pointe de coton peuvent être nécessaires pour cela.
REMARQUE: Les applicateurs à pointe de coton non trempés dans le diluant à peinture peuvent également être utiles pour nettoyer le gabarit. - Insérez le connecteur de la tête dans la bonne orientation en alignant les broches sur les canaux. Assurez-vous que le connecteur de la scène de tête est droit droit et qu’il est aussi affleurant que possible au gabarit (voir Figure 3F).
- Laissez le gabarit durcir pendant 24 h.
- Fixez le connecteur de la tête au gabarit à l’aide de ciment dentaire durci aux UV en appliquant du ciment dentaire le long du bord où le connecteur de la tête rencontre le gabarit. Durcissement UV à l’aide d’une lumière UV pendant 20 s.
- Appliquez du ciment dentaire durci aux UV pour fixer le fil. Assurez-vous de ne pas obtenir de ciment dentaire dans le canal ouvert à travers lequel le fil est alimenté.
4. Emballage en faisceau de fibres
REMARQUE: Il faut environ 30 minutes pour effectuer cette étape. Complétez cette étape pour les électrodes utilisées dans les modèles animaux avec une épaisse couche de pia mater. Renforcez le faisceau de fibres pour minimiser la flexion. Dans les procédures de souris, cette étape peut ne pas être nécessaire.
- Rassemblez le faisceau de fibres dans un seul arbre en utilisant la tension de l’eau. Utilisez une pipette de transfert pour faire couler une goutte d’eau de la pointe de l’entonnoir à la pointe du faisceau pendant que l’électrode est fixée verticalement dans une visière.
- Commencez par appliquer une couche de ciment dentaire d’environ 1,5 mm d’épaisseur autour du faisceau à l’extrémité de l’entonnoir. Durcir le ciment dentaire avec 20 s de lumière UV.
REMARQUE: Pour les enregistrements corticaux, aucun autre emballage n’est nécessaire. Pour les régions cérébrales plus profondes, fixez un tube de guidage autour du faisceau. - Construction du tube de guidage et insertion du faisceau dans le tube de guidage
- Mesurez et coupez la longueur souhaitée des tubes en polyimide. Assurez-vous que la longueur du tube en polyimide laisse 2 mm d’embouts en fibre de carbone libres. Mesurez et coupez un morceau de tube métallique de 30 G 2 mm plus court que le tube en polyimide. Utilisez un outil rotatif pour enlever les arêtes vives sur le tube métallique. Insérez le tube en polyimide à l’intérieur du tube métallique.
- Positionnez l’électrode dans un étau avec le faisceau de fibre de carbone pointant vers le haut. Fixez le tube assemblé à un micromanipulateur et, à l’aide d’un microscope, abaissez-le soigneusement sur le faisceau de fibres. Fixez le tube à la base de ciment dentaire existante à l’aide d’une couche supplémentaire de ciment dentaire. Durcir le ciment dentaire avec 20 s de lumière UV.
REMARQUE: Le processus de construction peut être mis en pause ici.
5. Préparation de la pointe de l’électrode
REMARQUE : cette étape prend environ 30 minutes par baie.
- Coupez les électrodes à la longueur souhaitée.
- En préparation de la découpe de la pointe de l’électrode, empilez des notes autocollantes pour construire une plate-forme d’environ 1,5 mm de haut. Mesurez, à partir du bord de la plate-forme, la longueur d’électrode souhaitée et marquez cette distance. La plate-forme servira de guide pour la coupe.
- Abaissez l’électrode dans un bécher d’eau désionisée ou distillée jusqu’à ce que la pointe de l’entonnoir soit complètement immergée, la pointe en premier et maintenue normale à la surface. Rassemblez les fibres de carbone individuelles en retirant l’électrode de l’eau. La tension superficielle rassemblera le ou les faisceaux. Laissez l’électrode sécher à l’air libre pendant 30 min.
- Fixez la lame de scalpel #10 au manche. Congelez le scalpel et l’électrode en les plaçant dans un congélateur à -18 °C pendant au moins 5 min.
- Posez l’électrode de manière à ce que les fibres soient au ras de la surface du guide (préparée à l’étape 5.1.1). Coupez les fibres à la longueur souhaitée avec le scalpel, en utilisant un mouvement de roulement. Effectuez cette étape rapidement pour vous assurer que l’électrode et le scalpel sont toujours gelés (voir Figure 3G).
- Injecter du courant positif pour réduire l’impédance des pointes d’électrode.
- Fixez l’électrode au testeur d’impédance multiélectrode à l’aide de l’adaptateur approprié (voir Tableau des matériaux). Extrémité inférieure de l’électrode ~ 2 mm dans un tube de microcentrifugation de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M. Insérez le fil de mise à la terre dans le tube de microcentrifugation.
- Injectez du courant avec l’amplitude et la durée choisies.
REMARQUE : Cette étape vise à réduire les valeurs d’impédance à l’extrémité du CFEA. Dans cette étude, les paramètres suivants ont été saisis dans l’interface utilisateur graphique du logiciel de galvanoplastie : Courant : 0,100 μA ; Durée: 10 s; Pause: 1 s. Ce processus peut être répété si nécessaire, par canal, jusqu’à ce que les impédances des électrodes atteignent les valeurs souhaitées (voir Figure 4C). - Une fois que les valeurs d’impédance sont comme souhaité, rincez les fibres dans de l’eau désionisée ou distillée pour les nettoyer.
- Plaque électro dans la solution de placage d’or.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée peu de temps avant l’implantation (le jour même).
ATTENTION : Certains des produits chimiques utilisés dans la préparation des embouts CFEA sont corrosifs, y compris la solution de placage d’or. Consultez la FDS avant utilisation et déterminez les mesures de précaution appropriées à prendre pour manipuler la solution en toute sécurité.
REMARQUE: Pour assurer la rigidité du faisceau de fibres, l’utilisateur peut créer une solution de placage d’or en solubilisant d’abord le PEG8000 dans de l’eau désionisée ou distillée à 1 mg / mL. Ensuite, mélanger 625 μL de PEG8000 solubilisé et 375 μL de solution de placage d’or et une solution de vortex pendant 10 s pour mélanger. Le PEG8000 se dissoudra après l’insertion de fibres dans le cerveau.- Abaissez l’extrémité du faisceau d’électrodes d’environ 2 mm dans le tube de microcentrifugation du mélange de placage. Insérez le fil de mise à la terre dans le tube de microcentrifugation.
- Définissez les paramètres appropriés pour la galvanoplastie. Dans cette étude, les paramètres suivants ont été saisis dans l’interface utilisateur graphique du logiciel de galvanoplastie : Courant : -0,05 μA ; Durée: 30 s; Pause: 5 s.
- Rincez soigneusement les fibres à l’eau désionisée ou distillée. À ce stade, mesurez à nouveau les valeurs d’impédance si vous le souhaitez.
6. Insertion dans le cerveau: chirurgie de survie, souris (Mus musculus) et chirurgie de non-survie, furet (Mustela putorius furo)
REMARQUE: Les procédures chirurgicales doivent suivre le protocole standard conformément à l’IACUC. Pour des informations détaillées, voir Ma et al.22 pour le protocole de chirurgie de survie et Popovic et al.23 pour le protocole de chirurgie de non-survie. Suivez les procédures chirurgicales aseptiques selon les directives de l’ASC pour la chirurgie de survie chez les espèces de rongeurs. Il s’agit notamment de l’autoclavage de tous les outils et matériaux chirurgicaux à 135 °C pendant 15 minutes et du traitement de l’appareil stéréotaxique et de la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70%. Utilisez des gants chirurgicaux stériles, une blouse jetable et un masque facial pendant la procédure.
- Chirurgie de survie, souris (Mus musculus).
- Anesthésiez les souris avec 2,5% d’isoflurane dans une boîte d’induction pendant environ 1 min, jusqu’à ce que la fréquence respiratoire atteigne 55-65 respirations / min. Ensuite, administrer 2,0% d’isoflurane à travers un cône de nez pour maintenir l’anesthésie. Appliquez une pommade vétérinaire sur les deux yeux pour prévenir les dommages à la cornée. Effectuez un pincement des orteils pour vérifier le bon degré d’anesthésie.
- Après vérification, suivez les procédures de chirurgie de survie détaillées dans Ma et al.22. Surveillez la fréquence respiratoire et maintenez-la à 60 respirations/ min. Maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant thermostatique. Voir les étapes 6.3 à 6.5 (détaillées ci-dessous) pour obtenir des instructions sur la préparation du crâne pour la craniotomie, la duromtomie et l’implantation d’électrodes.
- Après la chirurgie, ramenez les souris dans une cage de récupération, équipée d’un coussin chauffant à 37 °C, isolée des autres animaux.
- Couvrir les plaies chirurgicales dans la pommade antibiotique. Surveillez les animaux jusqu’à ce qu’ils reprennent suffisamment conscience pour maintenir le repos sternal et leur permettre de récupérer pendant une période de 2 à 5 jours. Hébergez-les individuellement et surveillez en permanence les signes d’infection ou d’inconfort. Administrer aux animaux une dose de buprénorphine à libération prolongée de 72 h (0,5 à 1,0 mg/kg) le jour de la chirurgie en tant qu’analgésique.
- Chirurgie de non-survie, furet (Mustela putorius furo)
- Anesthésier le furet d’abord avec de la kétamine (20 mg/kg, i.m.), puis ventiler avec 1,0% à 2,0% d’isoflurane dans un mélange 2:1 d’oxyde nitreux et d’oxygène à travers un masque. Effectuez un pincement des orteils pour vérifier le bon degré d’anesthésie.
- Après vérification, suivre les procédures chirurgicales de non-survie détaillées dans Popovic et al.23. Effectuer une trachéostomie et ventiler les animaux avec 1,0% à 2,0% d’isoflurane dans un mélange 2:1 d’oxyde nitreux et d’oxygène. Appliquez une pommade vétérinaire sur les deux yeux pour prévenir les dommages à la cornée.
- Maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant thermostatique. Surveillez la fréquence cardiaque, les niveaux de CO2 en fin de marée et la fréquence respiratoire. Maintenir le taux de respiration dans la plage physiologique appropriée (3,5% -4,0%). Voir les étapes 6.3 à 6.5 (détaillées ci-dessous) pour obtenir des instructions sur la préparation du crâne pour la craniotomie, la duromtomie et l’implantation d’électrodes.
- Surveillez en permanence l’ECG de l’animal pour assurer une anesthésie adéquate et augmenter le pourcentage d’isoflurane si l’ECG indique une détresse.
- À la fin de l’expérience, administrer 1 mL de pentobarbital sodique et de phénytoïne sodique au furet et surveiller jusqu’à ce que la fréquence cardiaque et le CO2 de fin de marée mesurent 0.
- Préparation du crâne
- À l’aide d’une bavure de forage de 0,8 mm, percez une seule craniotomie de 4 mm x 4 mm à l’endroit souhaité pour l’implantation. Pour la souris, percez un trou de bavure supplémentaire sur un site controlatéral pour l’insertion de vis de terre en acier inoxydable.
REMARQUE: N’effectuez pas de durotomie tant que l’électrode n’est pas prête pour l’implantation. - Établissez un terrain/une référence. Dans les expériences de furet aigu, utilisez une aiguille de 18 G pour percer la peau et la couche de muscle entourant le crâne sur le côté de la tête de l’animal opposé à la craniotomie. Insérez l’extrémité du fil de l’électrode de référence Ag/Cl dans la pointe de l’aiguille, puis rétractez l’aiguille du muscle / de la peau de sorte que la pastille soit maintenant solidement assise entre le muscle et le crâne. Dans la souris, enroulez le fil de terre argenté autour de la vis de mise à la terre en acier inoxydable. Sécurisé avec du ciment dentaire durci aux UV.
- Fixez l’électrode au porte-électrode à l’aide d’une fine bande de ruban d’étiquetage et fixez le porte-électrode dans le micromanipulateur. Fixez le fil de terre à une source de mise à la terre via un clip en alligator. Fixez le fil de référence à l’électrode de référence intégrée dans le muscle de l’animal.
- À l’aide d’une bavure de forage de 0,8 mm, percez une seule craniotomie de 4 mm x 4 mm à l’endroit souhaité pour l’implantation. Pour la souris, percez un trou de bavure supplémentaire sur un site controlatéral pour l’insertion de vis de terre en acier inoxydable.
- Durotomie et pénétration de pia
- Retirez la dure-mère de la craniotomie à l’aide d’un pic à dura.
- Créez un petit trou dans la pia. Pour ce faire, insérez et retirez une microélectrode métallique (recommandée dans le furet). Alternativement, abaissez l’orthogonal CFEA à la surface du cerveau pour éviter toute vascularisation. Une fois cet emplacement déterminé, soulevez l’électrode et entaillez doucement la surface du cerveau à cet endroit avec un pic à dure-batteuse, en tirant vers le haut avec le pic (recommandé à la souris).
- Implantation d’électrodes
- Abaissez la pointe de l’électrode au même endroit et, en mode fin, commencez à enfoncer l’électrode dans le cerveau à une vitesse d’environ 2 μm / s. Utilisez un microscope pour vous assurer que l’électrode pénètre en douceur et ne se plie pas.
REMARQUE: Si l’électrode n’entre pas en douceur, soulevez-la hors du cerveau et réajustez l’angle. S’il continue à se plier sans entrer en douceur, ajustez l’emplacement et répétez le processus de entaille de la surface du cerveau pour le nouvel emplacement d’entrée. - Effectuez l’implantation chronique et aiguë en suivant les étapes suivantes.
- Pour l’implantation chronique : Cimentez l’électrode en place à l’aide de ciment dentaire durci aux UV.
- Fermez l’incision à l’aide de sutures chirurgicales 5-0 et construisez la coiffe.
- Pour construire un capuchon, ajoutez du ciment dentaire supplémentaire autour du site de l’implant. Assurez-vous de couvrir le nez du gabarit.
- Tirez la peau vers le haut et autour de la coiffe. Suturez l’incision derrière la coiffe avec 5-0 sutures chirurgicales.
- Appliquez la crème de lidocaïne et la pommade antibiotique.
- Arrêtez l’anesthésique et suivez les procédures de récupération standard.
- Pour l’implantation aiguë: Après avoir abaissé l’électrode et atteint la profondeur souhaitée, attendez au moins 30 minutes avant de commencer l’enregistrement électrophysiologique pour permettre à l’électrode de se déposer en place.
- Pour l’implantation chronique : Cimentez l’électrode en place à l’aide de ciment dentaire durci aux UV.
- Abaissez la pointe de l’électrode au même endroit et, en mode fin, commencez à enfoncer l’électrode dans le cerveau à une vitesse d’environ 2 μm / s. Utilisez un microscope pour vous assurer que l’électrode pénètre en douceur et ne se plie pas.
Representative Results
Avec l’achèvement de ce protocole, des enregistrements stables de l’activité de pointe d’une seule unité seront possibles. Ces réseaux de microélectrodes sont personnalisables en termes de matériau, de nombre de canaux et d’adaptateur de scène en fonction des besoins du chercheur. La galvanoplastie des fibres dans l’or entraîne une diminution des impédances adaptées à l’enregistrement(Figure 4 et Figure 5). Si l’utilisateur a l’intention d’enregistrer de manière chronique, des mesures peuvent être effectuées après que l’animal se soit remis de l’intervention chirurgicale. Les procédures chroniques ont donné lieu à des enregistrements stables d’une seule unité pendant au moins 120 jours. Un enregistrement représentatif est montré à la figure 6, illustrant l’activité électrophysiologique stable à 64 canaux dans le cortex rétrosplénial d’une souris mâle adulte se comportant librement. Si une préparation aiguë est prévue, les enregistrements peuvent commencer peu de temps après l’implantation (~ 30 min). Cela laissera le temps à l’électrode de s’installer dans le cerveau. La figure 7 fournit un exemple représentatif d’un enregistrement CFEA aigu à 16 canaux acquis à partir du cortex visuel primaire d’un furet femelle adulte. Le tri des pointes à la souris et au furet a été effectué à l’aide d’un logiciel de tri des pointes (voir Tableau des matériaux).
Figure 1: Anatomie des réseaux de microélectrodes en fibre de carbone (CFA) à 16 et 32 canaux. (A) Schémas des CFEA à 32 canaux (en haut) et à 16 canaux (en bas) à partir de trois vues différentes. Le CFEA à 16 canaux présente une conception étendue à des fins de manipulation. La conception à 32 canaux comporte une face plate qui permet de combiner deux gabarits pour un CFEA à 64 canaux. Les deux diagrammes ont des structures d’identification étiquetées avec des dimensions. L’extrémité du connecteur indique l’emplacement de l’insertion du connecteur et les canaux GND/REF indiquent où le fil de mise à la terre est inséré. Le bassin de l’entonnoir fait référence à l’emplacement traversé par les fibres pour être recouvert de ciment dentaire durci à la lumière UV, et la pointe de l’entonnoir signifie le site d’où les fibres sortent du gabarit. La pointe de l’entonnoir est divisée en quadrants pour minimiser les fibres qui s’accrochent ensemble et créent des dommages. Les fibres sont ensuite tirées en un seul faisceau avec l’utilisation du ciment dentaire. Les gabarits sont imprimés en 3D à l’aide d’imprimantes à résine SLA. Les diagrammes sont agrandis pour afficher les détails. b) Construit l’AEFC. Le diagramme a des structures d’identification étiquetées. La pointe bleue du faisceau représente le segment des fibres de carbone qui acquièrent des mesures d’enregistrement. Le gris à l’intérieur du bassin de l’entonnoir et entourant le connecteur indique un ciment dentaire durci à la lumière UV qui maintient les fibres de carbone en place dans le bassin de l’entonnoir et fixe le connecteur au gabarit. Le fil violet représente le fil de mise à la terre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Chargement des fibres de carbone brutes dans des cassettes pour le revêtement en parylène C. (A) Les fibres de carbone sont chargées sur des cartouches recouvertes de deux bandes de ruban adhésif double face (bleu). Chaque cassette est chargée d’environ 25 fibres. (B) Les cassettes sont chargées dans un support découpé au laser (gris) en préparation du revêtement de parylène C. Chacun contient dix cassettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Schéma deconstruction du faisceau de microélectrodes en fibre de carbone (CFEA). (A) 16 fibres de carbone individuelles revêtues (noir) sont filetées à travers le gabarit imprimé en 3D à 32 canaux (gris). (B) Les pointes en fibre de carbone sont coupées avec des micro-ciseaux, laissant l’excès de fibre égal à la hauteur de la base du gabarit, s’étendant hors de la base du gabarit. (C) Un briquet de roue à étincelles en plastique standard est rapidement passé sur l’excès de fibre pour éliminer l’isolation parylène C. Le schéma en haut à droite montre l’élimination du parylène de 9 des 12 fibres. (D) Les fibres sont réinsérées dans le gabarit jusqu’à ce que l’extrémité de la fibre soit au ras de la base. Le schéma en haut à droite montre la réinsertion de 9 fibres avec des pointes de fibres non isolées (grises) logées à l’intérieur de la base du gabarit. Le gabarit est ensuite retourné et les étapes A-D sont répétées pour enfiler les 16 canaux opposés. (E) Le gabarit est rempli de ciment dentaire pour sécuriser les fibres. L’impression argentée est injectée dans chaque puits de la base du gabarit. (F) Le connecteur mâle est inséré dans la base du gabarit. (G) Le CFEA et le scalpel sont congelés dans un congélateur à -20 °C. La pointe de la matrice est coupée à la longueur souhaitée, laissant 32 fibres paires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Traitement de la pointe et galvanoplastie. (A) Les pointes des électrodes sont d’abord placées dans un PBS de 0,1 M, où le courant est passé à travers chaque électrode. Les embouts sont ensuite rincés et transférés dans une solution de placage d’or, où ils sont galvanisés avec le courant. (B) Les images SEM de fibre de carbone préparée montrent une solution de placage d’or concentrée à la pointe. La barre d’échelle représente 4 μm. (C) Les valeurs d’impédance de 168 canaux après la coupe initiale (violet; 3,11 MΩ ± 0,42 MΩ, médiane ± SE, n = 168 fibres), l’injection de courant positif (rose; 1,23 MΩ ± 0,36 MΩ, médiane ± SE, n = 168 fibres) et la galvanoplastie (orange; 0,19 MΩ ± 0,15 MΩ, médiane ± SE, n = 168 fibres) montrent des valeurs d’impédance réduites après chaque étape de traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Les durées modérées de galvanoplastie de l’or produisent de petits dépôts arrondis sur les pointes des faisceaux de fibres de carbone. Les pointes en fibre de carbone illustrées proviennent toutes de différents réseaux de microélectrodes, reflétant différentes durées de courant injecté pour la réduction de l’impédance ou le placage d’or. Les images représentent également le revêtement de parylène C, qui isole les fibres de carbone et empêche toute acquisition de signal à partir d’un endroit autre que les extrémités des fibres. (A) Image de microscopie électronique à balayage des pointes en fibre de carbone après congélation et faisant une seule coupe avec une lame de rasoir. Les barres d’échelle représentent 10 μm. (B) Identique à A mais ensuite suivi d’une injection de courant positif pendant 10 s. (C) Identique à B mais ensuite galvanisé avec de l’or pendant 5 s. (D) Identique à B mais ensuite galvanisé avec de l’or pendant 15 s. (E) Identique à B mais ensuite galvanisé avec de l’or pendant 30 s. (F) Identique à B mais ensuite galvanisé avec de l’or pendant 120 s. Nous avons constaté que la galvanoplastie pendant 30 s à un courant de -0,05 μA était optimale pour les enregistrements électrophysiologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Les enregistrements extracellulaires chroniques dans le cortex rétrosplénial de souris se comportant librement avec des réseaux de microélectrodes en fibre de carbone montrent une activité neuronale persistante et stable. (A) Onze traces de tension transmises ont été enregistrées simultanément. Les traces suivantes enregistrées à partir du premier canal (rangée du haut) sont tracées en B pour montrer la durabilité dans le temps. Les dix lignes restantes démontrent la cohérence de la qualité d’enregistrement et montrent une activité robuste sur l’ensemble de la baie. La barre d’échelle à gauche de chaque trace représente un potentiel de 200 μV. (B) Données transmises par bande passante provenant de la même fibre que dans la trace supérieure en A, étendues pour montrer une activité robuste sur un enregistrement continu de 120 jours. (C) Le clustering révèle une détection robuste d’une seule unité sur des mois. Les traces représentent la forme d’onde moyenne d’une unité unique représentative observable en continu sur 120 jours, extraite de la fibre tracée en B à chaque point temporel. (D) Formes d’onde moyennes de pointe non normalisées de C empilées pour démontrer la cohérence dans le temps. (E) Les enregistrements en fibre de carbone démontrent un plancher de bruit stable pendant de nombreux mois. L’écart-type du plancher de bruit (trace moins activité de pointe) dans B ne montre aucun changement progressif du bruit. Les barres représentent la contamination moyenne. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. (F) Dessin à l’échelle d’une souris avec un CFEA et une scène de tête implantés de manière chronique. (G) La trace de tension brute (en haut) 11 mois après l’implantation montre une LFP robuste. La trace de tension passe-bande (en bas) montre une activité neuronale constante. (H) Forme d’onde moyenne du pic du neurone enregistrée sur la fibre de C, sous-tendue par les 1 000 premières incidences d’activité de pointe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Enregistrements du réseau de microélectrodes en fibre de carbone (CFEA) du cortex visuel primaire du furet. (A) Formes d’onde d’unités uniques triées par pointe enregistrées à partir d’un CFEA à 16 canaux. Les potentiels d’action d’un seul neurone étaient souvent évidents sur plusieurs canaux à des amplitudes légèrement différentes. (B) Courbes de réglage de direction à partir de neurones sélectionnés. Les couleurs correspondent aux unités enregistrées dans A. Les flèches indiquent la direction du mouvement du stimulus. Les barres d’échelle indiquent le taux de réponse. Les barres d’erreur indiquent la réponse moyenne avec erreur type. La ligne pointillée horizontale représente la vitesse de tir spontanée de la même cellule lors de l’exposition à un écran vide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ce protocole décrit chaque étape nécessaire à la construction d’un CFEA fonctionnel pour une utilisation aiguë et chronique. Le processus décrit est personnalisable en fonction des besoins du chercheur, ce qui en fait une option accessible et peu coûteuse pour surveiller des neurones individuels pendant des mois. Le protocole démontre la faisabilité d’enregistrer à la fois une activité robuste d’une seule unité dans les minutes suivant l’implantation chez un animal anesthésié et pendant quatre mois chez un animal éveillé et se comportant, illustrant le potentiel de ces CFEA pour étudier les changements à court et à long terme dans les réponses neuronales.
Les étapes du protocole décrit ont été soigneusement testées et améliorées au fil du temps pour donner une procédure efficace qui peut être complétée rapidement, à un faible coût marginal (< 100,00 $), avec la capacité d’enregistrer des unités uniques sans ambiguïté, de manière dense et stable pendant des mois. Les étapes de construction peuvent être achevées en moins d’une journée et produiront des signaux électrophysiologiques comparables à n’importe quel réseau commercial de premier plan. Les CFA ont également un encombrement beaucoup plus faible (un faisceau de fibres à 16 canaux a un diamètre d’environ 26 μm) que des réseaux commerciaux similaires, et leur biocompatibilité les rend adaptés à une utilisation à long terme13. Il est important de noter qu’il y a plusieurs étapes et instructions critiques qui doivent être suivies afin de produire un CFEA fonctionnel avec des performances comparables.
En raison de la fragilité des fibres de carbone, elles doivent être manipulées avec le plus grand soin. Les manipuler avec des pinces tranchantes ou d’autres outils peut entraîner la rupture des fibres. De plus, il est important de construire les CFEA dans un espace avec un mouvement d’air limité afin que les fibres ne s’envolent pas. Lors de l’allumage de la partie arrière des fibres, le briquet n’a besoin que d’être déplacé dans un mouvement de va-et-vient très brièvement, pendant environ 1 s. Les étapes qui suivent ce retrait de l’isolation sont cruciales pour la construction d’une électrode avec des canaux de travail. Les pointes enflammées doivent être introduites dans le gabarit sans aucun contact supplémentaire. Ensuite, lors du remplissage du bassin avec du ciment dentaire, il est important que le ciment soit soigneusement appliqué et remplisse complètement les canaux et le bassin en entonnoir, en fermant les ouvertures sans les remplir. Le ciment dentaire doit ensuite être complètement durci à la lumière UV avant de continuer. Une fois cela terminé, la peinture argentée doit être injectée dans chaque canal jusqu’à ce qu’elle soit complètement remplie mais ne déborde pas. Il s’agit de l’étape la plus variable du processus. Tout remplissage excessif peut produire une diaphonie entre les canaux, et un remplissage insuffisant peut entraîner une défaillance de la connexion. S’il est impossible d’injecter de la peinture argentée à l’aide d’une aiguille de 25 G, il est probable que la solution soit trop visqueuse et, dans ce cas, une petite quantité de diluant à peinture peut être ajoutée pour créer une solution plus fluide. Une fois que tous les canaux sont remplis et que le connecteur de la tête est inséré, il est important de laisser durcir le réseau pendant 24 heures avant de fixer le connecteur avec du ciment dentaire. Nous avons constaté que le fait de ne pas le faire réduisait le nombre de canaux connectés. L’application d’une quantité généreuse de ciment dentaire est également importante pour que le connecteur ne se déconnecte pas lors de l’interfaçage avec le système d’acquisition de signal. S’ils se détachent, il est possible de tenter de se reconnecter avec le remplissage répété des canaux avec de la peinture argentée, mais l’utilisateur doit tester les valeurs d’impédance du CFEA pour évaluer le nombre de canaux connectés. Permettre au ciment dentaire de durcir pendant la nuit sert également à prévenir le détachement potentiel.
La mesure de l’impédance de l’électrode fournira une estimation précise des canaux connectés. Cela peut être fait après avoir submergé les fils de terre et de référence et les pointes en fibre de carbone dans PBS. Nous avons observé qu’une impédance élevée (>15 MΩ) est révélatrice d’un canal ouvert et non connecté. Avant d’injecter du courant et de la galvanoplastie, un canal connecté peut avoir une gamme de valeurs d’impédance qui devraient diminuer considérablement avec ce processus. Le nombre moyen de canaux connectés (impédance < 4 MΩ après injection de courant) par électrode à 16 canaux était de 12,96 ± 2,74 (moyenne ± SD; N = 48 électrodes). Un certain nombre de temps de galvanoplastie ont été testés, et 30 s ont produit une isolation de signal supérieure parmi les sites d’enregistrement (Figure 5). Bien qu’il ait été bien établi que PEDOT-pTS12,24,25,26 et PEDOT-TFB21 fournissent des options fiables pour la préparation de sites d’enregistrement de fibre de carbone, nous avons constaté que le placage avec de l’or, une méthode éprouvée et fiable pour la galvanoplastie des électrodes pour l’implantation chronique27,28 , a augmenté la facilité d’implantation et empêché les extrémités des électrodes de s’agglutiner. En produisant des valeurs d’impédance finales inférieures à 0,2 MΩ en moyenne, cette méthode s’avère comparable aux valeurs obtenues en utilisant PEDOT-TFB21 et PEDOT-pTS26.
Lors de l’implantation du réseau de microélectrodes, il est important de suivre visuellement l’insertion des pointes en fibre de carbone sous le microscope. Une insertion réussie doit être apparente, sans flexion des fibres. Si les fibres semblent flamber, il est peu probable qu’elles pénètrent avec succès dans le cerveau. Dans ce cas, l’angle de la sonde doit être ajusté pour une deuxième tentative. Ce processus peut se poursuivre jusqu’à ce que l’insertion de la sonde réussisse. Une fois l’électrode à la profondeur souhaitée, nous avons constaté qu’attendre au moins 30 minutes permettra à la sonde de se contenter d’une acquisition optimale du signal (enregistrements aigus).
Les CFA décrits, en plus de leur faible encombrement et de leur biocompatibilité, offrent une alternative robuste et personnalisable aux réseaux commerciaux en raison de leur facilité de construction et de leur faible coût. La plus grande limitation des CFA détaillées dans ce protocole est leur évolutivité. En raison de la nature manuelle de leur construction, la mise à l’échelle des conceptions avec des centaines de sites d’enregistrement peut ne pas être pratique. En outre, les progrès réalisés dans la fabrication de réseaux de microélectrodes à l’aide de la nanotechnologie permettront des enregistrements de population à plus grande échelle que les méthodes décrites ici. Cependant, ce protocole offre une accessibilité CFEA aux laboratoires intéressés par la fabrication d’électrodes en fibre de carbone sur paillasse. Nous n’avons observé aucune perte de stabilité ou diminution de la robustesse de l’amplitude des pics sur la durée des expériences chroniques de 120 jours, comme l’indique un canal unique représentatif typique de nos observations sur cette échelle de temps(Figure 6A-E). De plus, les CFA montrent la capacité d’activité persistante d’une seule unité, car quatre unités individuelles sont restées discernables 11 mois après l’implantation chez la souris(Figure 6G,H). Il est également possible d’obtenir des enregistrements stables à une seule unité de manière aiguë(Figure 7),ce qui offre un avantage par rapport à de nombreuses autres électrodes commerciales pour l’étude de neurones uniques sur de courtes périodes. À l’avenir, le développement de telles sondes flexibles et biocompatibles avec des diamètres minimaux permettra d’étudier des processus complexes. Ces outils fourniront une utilité substantielle dans l’avancement de la technologie neuronale, y compris des applications dans les interfaces cerveau-machine (IMC), qui nécessitent une stabilité continue et à long terme29.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts financier.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Greg Guitchounts pour ses conseils en matière de conception et de construction d’électrodes et Tim Gardner pour nous avoir ouvert son laboratoire et ses installations. Nous tenons à remercier Christos Michas pour son aide à l’utilisation de PDS dans l’installation centrale de Bio-Interface and Technology et Neil Ritter, Jon Spyreas et David Landesman pour leur aide dans la conception des premières versions du gabarit à 16 canaux. Nous tenons à remercier Tim Cavanaugh pour son aide en imagerie SEM au Center for Harvard Nanoscale Systems à Harvard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
| 16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool - sharp-tipped |
| 30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
| 31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
| 32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
| 6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
| AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
| Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
| Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
| Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Deionized water | Electroplating component | ||
| Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
| Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
| Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
| JRClust | Ferret spike sorting software | ||
| Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
| Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
| Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
| MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
| NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
| NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
| NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
| Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
| Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
| Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
| Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
| Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
| Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
| Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
| Sticky notes | Post-it | Building tool | |
| Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
| UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
| Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |
References
- Galvani, L. De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. , Academy of Sciences. Bologna. (1791).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Ledochowitsch, P., et al. On the correspondence of electrical and optical physiology in in vivo population-scale two-photon calcium imaging. bioRxiv. , 800102 (2019).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems and Nanoengineering. 3 (1), 16066 (2017).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature reviews. Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
- Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nature reviews. Neuroscience. 20 (6), 330-345 (2019).
- Chung, J. E., et al. High-density, long-lasting, and multi-region electrophysiological recordings using polymer electrode arrays. Neuron. 101 (1), 21-31 (2019).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Kozai, T. D., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).
- Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
- Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics. Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).
- Subbaroyan, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 103-113 (2005).
- Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nature Neuroscience. 20 (4), 612-619 (2017).
- Guo, Y., et al. Polymer composite with carbon nanofibers aligned during thermal drawing as a microelectrode for chronic neural interfaces. ACS Nano. 11 (7), 6574-6585 (2017).
- Armstrong-James, M., Millar, J. Carbon fibre microelectrodes. Journal of Neuroscience Methods. 1 (3), 279-287 (1979).
- Garris, P. A., Ciolkowski, E. L., Pastore, P., Wightman, R. M. Efflux of dopamine from the synaptic cleft in the nucleus accumbens of the rat brain. Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 14 (10), 6084-6093 (1994).
- Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording. Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).
- Guitchounts, G., Cox, D. 64-channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology. Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).
- Ma, Z., Turrigiano, G. G., Wessel, R., Hengen, K. B. Cortical circuit dynamics are homeostatically tuned to criticality in vivo. Neuron. 104 (4), 655-664 (2019).
- Popovic, M., et al. Development of cross-orientation suppression and size tuning and the role of experience. Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 38 (11), 2656-2670 (2018).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Welle, E. J., et al. Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).
- Patel, P. R., et al. Insertion of linear 8.4 µm diameter 16 channel carbon fiber electrode arrays for single unit recordings. Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046009 (2015).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators. A, Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Vafaiee, M., Vossoughi, M., Mohammadpour, R., Sasanpour, P. Gold-plated electrode with high scratch strength for electrophysiological recordings. Scientific Reports. 9 (1), 2985 (2019).
- Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-machine interfaces: From basic science to neuroprostheses and neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
