Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Published: August 2, 2021 doi: 10.3791/62767
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society, 2University of Konstanz

Summary

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

Abstract

מניפולציות עובריות קלאסיות, כגון הסרת תאים והשתלת תאים בתוך העוברים או בין, הן טכניקות רבות עוצמה לחקר תהליכים התפתחותיים מורכבים. עוברים דגי זברה מתאימים באופן אידיאלי למניפולציות אלה מכיוון שהם נגישים בקלות, גדולים יחסית בגודלם ושקופים. עם זאת, מכשירים שפותחו בעבר להסרת תאים והשתלה מסורבלים לשימוש או יקרים לרכישה. לעומת זאת, מכשיר ההשתלה המוצג כאן הוא חסכוני, קל להרכבה ופשוט לשימוש. בפרוטוקול זה, אנו מציגים לראשונה את הטיפול במכשיר ההשתלה, כמו גם את הרכבו מחלקים זמינים מסחרית ונרחבת. לאחר מכן אנו מציגים שלושה יישומים לשימוש בו: יצירת שיבוטים חוץ רחמיים לחקר פיזור אותות ממקורות מקומיים, פירוק תאים לייצור עוברים מופחתי גודל, והשתלת נבטים כדי ליצור מוטציות אימהיות-זיגוטיות. לבסוף, אנו מראים כי הכלי יכול לשמש גם עבור מניפולציות עובריות במינים אחרים כגון medaka דג אורז יפני.

Introduction

מהניסויים הקלאסיים של מנגולד ושפמן שהדגימו את קיומו של מארגן המורה על היווצרות ציר עוברי1, השתלת תאים בין עוברים הפכה לטכניקה מבוססת לחקר התפתחות עוברית2,3,4,5,6,7,8,9,10 . התקנה נפוצה להשתלה מורכבת ממזרק גז הדוק בכונן מיקרומטר המחובר למחזיק מיקרופיפט באמצעות צינורות גמישים ומאגר מלא בשמן מינרלי12,13. במערך זה, הבוכנה של המזרק מועברת דרך בורג. הלחץ שנוצר באופן זה מועבר למיקרופיט ומשמש לשאוב תאים מעובר אחד ולהפקיד אותם בעובר אחר. עם זאת, מכשיר זה המופעל הידראולי מורכב מחלקים רבים והוא מייגע להרכיב מאפס. מכשירים דומים ניתן לרכוש גם כסט עבודה מלא, נמכר בדרך כלל כמו Microinjectors ידני, וגרסאות מסחריות אלה בדרך כלל עולה יותר מ 1500 US$. הן בגרסה הביתית והן בגרסה המסחרית, המיקרופיט למניפולציה עוברית מופרד מהמכשיר לייצור לחץ (המזרק ההדוק בגז) באמצעות צינורות מלאים בנפט. המניפולציה של micropipette ואת התנועה של הבוכנה, ולכן, צריך להיות מופעל בנפרד עם ידיים שונות, הפחתת התפוקה ואת השירות. יתר על כן, המכשירים מסורבלים כדי להתכונן להשתלה מאז הצינורות צריך להיות מלא בזהירות עם שמן תוך הימנעות היווצרות של בועות. כאן, אנו מתארים מכשיר חלופי המופעל פנאומטית להסרת תאים והשתלה שהוא זול, קל להרכבה ופשוט לשימוש.

המכשיר המוצג כאן כולל מזרק 25 μL גז הדוק מצויד מחזיק micropipette ועולה פחות מ 80 $ בסך הכל. המכשיר מורכב בקלות על-ידי החדרת מחזיק המיקרופייט למזרק באמצעות התאמת מנעול לוהר (איור 1A). לאחר מכן המכשיר מותקן ישירות על מיקרו-מניפולטור, ומאפשר למשתמש לשלוט הן במיקום שלו והן בשאיבה ביד אחת ישירות במיקרו-מניפולטור. זה משאיר בנוחות את היד השנייה חופשית לייצב ולהזיז את צלחת ההשתלה המכילה עוברים תורם ומארח. המכשיר עובד על ידי יניקה ישירה עם אוויר ולא צריך להיות מלא בשמן מינרלי. בשל הכוחות האטרקטיביים בין המים לקירות מחט הזכוכית, תנועה גדולה בבוכנה של המזרק מתורגמת לתנועה קטנה יותר במפלס המים בתוך המחט, כל עוד מפלס המים נמצא בקצה המחודד של מחט הזכוכית. זה מאפשר שליטה מדויקת על מספר התאים השאפתניים ועל מיקום הכניסה שלהם.

כדי להדגים את התועלת של מכשיר זה, אנו מציגים שלושה יישומים בעוברי דגי זברה (דניו ריו). ראשית, אנו מראים כיצד ליצור מקורות מקומיים של מולקולות איתות מופרשות, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור היווצרות הדרגתית2,4,6. כאן, עוברים תורמים מוזרקים עם קידוד mRNA מולקולת איתות פלואורסצנטית. התאים התורמים המסומנים בפלואורסצנטיות מושתלים לאחר מכן בעוברים מארחים מסוג בר, שם ניתן לדמיין ולנתח את היווצרותו של שיפוע אות. שנית, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש במכשיר כדי להסיר תאים על ידי extirpation על מנת ליצור עוברים מופחת גודל5,13. לבסוף, אנו מראים כיצד לייצר מוטציות אימהיות-זיגוטיות על ידי השתלת תאים הנושאים כתב תא נבט קדמוני לעוברים מארחים שבהם קו הנבט היה אבלה 6,10. בעתיד, מכשיר ההשתלה המתואר כאן יכול להיות מותאם בקלות למניפולציות עובריות אחרות הדורשות הסרה או השתלה של תאים.

Protocol

1. הרכבה ושימוש במכשיר ההשתלה

  1. הרכבת מכשיר ההשתלה.
    1. חברו את קצה Luer 25 מזרק גז μL חזק ומחזיק micropipette עם מנעול Luer מתאים להרכיב את מכשיר ההשתלה (איור 1A).
      הערה: הרטבת קצה Luer עם סרט דק של מים יכול לעזור לשפר את החיבור על ידי החזקת החלקים יחד באמצעות הידבקות מים ול לכידות.
    2. טען את ההתקן ישירות על מיקרו-מניפולטור ידני (איור 1B). המכשיר יכול להיות נשלט עם היד הדומיננטית לבד, לשחרר את היד השנייה עבור משימות נוספות.
  2. מכין את מחט ההשתלה.
    1. לייצר מחט השתלה על ידי משיכת פיפטה נימי זכוכית (ללא חוט) עם פולר מיקרופיפט.
    2. לשבור את קצה המחט בצורה חלקה ככל האפשר, כמו קצוות חדים להגדיל את הסיכוי לגרד את החלמון בעת ההשתלה, וזה קטלני לעובר.
      הערה: ניתן לשבור את הקצה בקלות עם סכין גילוח ישר מתחת לסטריומיקרוסקופ. עם זאת, באמצעות microforge מאפשר ליצור פתיחה מדויקת של הגודל הרצוי. עבור ייצור מקור חוץ רחמי, קוטר חיצוני של כ 50-60 מיקרומטר מתאים. עבור extirpations השתלת נבט, הקוטר החיצוני של המחט צריך למדוד כ 80-90 מיקרומטר כדי להגדיל את מספר התאים המושתלים.
    3. הכנס את המחט המוכנה לשימוש למכשיר ההשתלה (איור 1A).
  3. באמצעות מכשיר ההשתלה.
    1. מקם את המיקרו-מניפולטור עם מכשיר ההשתלה ליד סטריאומיקרוסקופ (איור 1B).
    2. הסירו את הבוכנה והוריכו את מחט ההשתלה לתוך צלחת ההשתלה המלאה בתמיסה של רינגר (ראו שלב 2.2.1) בזווית של 45° עד שקצה המחט שקוע (איור 1B). מים ימהרו במעלה המחט עקב פעולה נימית.
    3. הכנס את הבוכנה בערך באמצע הדרך כדי לשטוף את הפתרונות של הצלצול, והשאר רק נפח קטן של מים בחלק הדק והמחודד של המחט (איור 1C).
      הערה: זוהי המיקום הניטרלי, ומפלס המים צריך להיות יציב שם לזמן מה (>20 דקות). אם מפלס המים אינו יציב, האוויר דולף; חבר מחדש את מתאים מנעול Luer או להחליף את המזרק.
    4. בעת שימוש במחט השתלה בפעם הראשונה, מצפים את החלק הפנימי שלה על ידי ציור חלמון מעובר שהוקרב ולאחר מכן גירוש החומר החלמון לחלוטין. הציפוי יעזור להפחית את הדבקות של תאים על הזכוכית במהלך ההליכים הבאים.
    5. מקם בעדינות את העובר התורם בעזרת המחט ולאחר מכן מקם את המחט פותחת אורתוגונל לפני השטח של העובר (איור 1D).
      הערה: המיקום יהיה שונה עבור תימודות שונות. עבור ייצור מקור מולקולות איתות חוץ רחמי וחילוצי תאים, זה יהיה החלק העליון של עמוד החיות (איור 1E); עבור השתלת נבטים, זה יהיה השוליים (איור 1D,F).
    6. לאט ובזהירות למשוך את הבוכנה כדי למשוך את התאים לתוך המחט.
      הערה: אם התאים נלקחים מהר מדי, הם עלולים להיפגע. אם נעשה כראוי, התאים צריכים לצאת כעמודה גלילית. הימנע לוקח חלמון לתוך המחט, כמו החלמון המושתל הוא רעיל עבור העובר המארח.
    7. עצור את היניקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות כלפי מטה מעט ברגע שמספר התאים הרצוי נמשך פנימה. הסר את המחט מן העובר על ידי jerking המחט לצד בתנועה קצרה ומהירה. השאר פתרון כלשהו של רינגר משני צדי עמודת התא, והגבילו את התאים לקצה המחודד של המחט (איור 1C,D).
      הערה: הנוזל מול עמודת התא יעזור להפריד בין התאים של העוברים המארחים בעת הפקדת עמודת התא.
    8. נקה את כל החלמון או פסולת התא הנותרים על ידי הזזה איטית של הבוכנה למעלה ולמטה - בעוד המחט נשארת שקועה - לשטוף את התאים עם הפתרון של רינגר. אם נעשה כראוי, התאים שלא ניזוקו יישארו דבוקים יחד בעמודה בזמן שהפסולת נשטפת.
      הערה: יש לנקוט זהירות רבה במהלך שלב זה שכן מפלס המים יעלה מעבר לקצה המחודד של המחט. זה יגרום זרם פתאומי של מים, אשר ניתן להשתמש בו כדי לשטוף את התאים. עם זאת, ברגע שמפלס המים עבר את הקצה המחודד, השליטה העדין עם הבוכנה תופחת, ויש להזיז את הבוכנה לאט ובזהירות רבה יותר.
    9. הזיזו את צלחת ההשתלה עם היד הלא דומיננטית כדי למקם את המחט אורתוגונלית לפני השטח (מוט בעלי חיים או שוליים) של העובר המארח (איור 1D-F).
    10. יש להפעיל בעדינות לחץ קל ולאחר מכן לתת תנועה מהירה וחדה כדי לנקב את השכבה העוטפת של העובר המארח. יש להקפיד לא לגרד את החלמון עם המחט.
      הערה: הפעלת לחץ קל על העובר על ידי סחיטה בזהירות על קירות הבאר מגבירה את מתח פני השטח של העובר ובכך מקלה על פירסינג של השכבה העוטפת.
    11. ברגע שהמחט בפנים, דחפו בעדינות את הבוכנה כדי להחדיר את עמוד התאים לעובר, תוך כדי ביטול איטי של המחט בו-זמנית (איור 1D-F).
  4. מנקה את מחט ההשתלה.
    1. לשטוף את המחט על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה בזמן המחט שקועה במים deionized.
      הערה: אם המחט נשארת מלוכלכת, לשטוף אותו עם 10 M תמיסת נתרן הידרוקסיד לפני לשטוף אותו שוב עם מים.
    2. יש לאחסן את המחט בקופסה מתאימה לשימוש נוסף.

2. יצירת מקורות חוץ רחמיים של מולקולות איתות מופרשות בעוברי דגי זברה

  1. מכין את העוברים המארחים והתורמים.
    1. לאסוף עוברים טריים על ידי הזדווגות דגי זברה.
    2. Dechorionate 1-cell שלב עוברי דגי זברה על ידי דגירה עד 100 עוברים ב 0.5 מג / מל של פתרון פרונאז במשך כ 15 דקות בצלחת פטרי קטנה (תיאור מפורט של הליך זה פורסם על ידי רוג'רס, K. W. et al.14).
      הערה: לחלופין, העוברים עשויים גם להיות dechorionated בשלב הגבוה ממש לפני ההשתלה (שלב 2.2), אבל זה דורש עוברים תורם מוזרק ועוברים מארחים uninjated להיות dechorionated בנפרד.
    3. תטביעו את העוברים במדיום עוברי בכוס של 200 מ"ל.
      הערה: פיצוץ dechorionated ועוברי שלב gastrula הם עדינים מאוד. החלמון החשוף שלהם יידבק למשטחי פלסטיק ויתקרע במגע עם האוויר. לפיכך, הם חייבים להישאר שקועים לחלוטין בעובר בינוני, מועבר עם צינור זכוכית, ומתוחזקים בציפוי אגרוז (1% בעובר בינוני) כלי פלסטיק או כלים פטרי זכוכית.
    4. מרוקנים בזהירות את רוב המדיום העובר וממלאים לאט את הכיס במדיום עובר טרי. התסיסה הקלה הנגרמת בדרך זו תאפשר את הסרת chorions מוחלשים. חזור על שלב זה 2-3 פעמים.
    5. מעבירים את העוברים המודבקים באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית לצלחת הזרקה מצופה אגרוז.
      הערה: להצתת קצה זכוכית פסטר פיפטה על ידי חשיפתה ללהבת מבער בונזן יכולה להמיס ולהחליק את הקצה, ובכך לסייע במניעת נזק לעוברים.
    6. הזריקו את קידוד ה- mRNA לחלבון המתויג פלואורסצנטית לתת-קבוצה של עוברים (תיאור מפורט של הליך זה פורסם על ידי רוג'רס, K. W. et al.14). הזרק את ה-mRNA לתא, לא לחלמון, לביטוי כמעט הומוגני. עוברים מוזרקים ישמשו כתורמים, ואילו עוברים לא מוזרקים ישמשו כמארחים.
      הערה: הכמות והסוג של mRNA מוזרק יהיה תלוי מולקולת איתות נחקרת בדרך כלל נע בין 20 ל 200 pg2,4,5,6 (אבל יכול להיות גבוה ככל 1000 pg במקרים מסוימים4).
    7. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת ששת בארות מצופה אגרוז במילוי מדיום עובר. דגירה ב 28 °C (50 °F) עד העוברים להגיע לשלב הכדור המוקדם.
  2. השתלת תאים כדי ליצור מקורות חוץ רחמיים.
    1. מלא צלחת השתלה (עם בארות חד-זוויתיות בצורת טריז, ראה טבלת חומרים) עם הפתרון של רינגר (116 מ"מ NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; לאחסן את מאגר HEPES ב 4 °C (C).
      הערה: הסידן בתמיסה של רינגר מקדם הידבקות תאים ומסייע לעובר להחלים מהליך ההשתלה.
    2. מעבירים את העוברים לצלחת ההשתלה.
    3. מקם את העוברים המארחים והתורמים בעמודים מתחלפים, בכל מקרה כאשר מוט החיה מכוון לכיוון מחט ההשתלה.
    4. בצע את ההשתלה כמתואר בסעיף 1.3. להשתלת מקור חוץ רחמי, יש לקחת תאי מקור מראש עמוד החיה ולהפקיד אותם באותו מיקום בעובר המארח (איור 1E).
      הערה: שטיפת התאים עם הפתרון של רינגר כמפורט בשלב 1.3.8 חשובה ליצירת מקור חוץ רחמי כדי לוודא שמולקולות איתות שכבר מופרשות אינן מועברות אל הפונדקאי. אין להשתיל תאים רבים מדי כדי להבטיח שהמקור לא יפוזר. עמודה בקוטר של כ-80 מיקרומטר ואורך של 100 מיקרומטר מתאימה ליישומים רבים.
    5. אפשר לעובר המארח להישאר בתמיסה של רינגר למשך 30 דקות עד שעה כדי להתאושש.
    6. בדוק אם תאים הושתלו בהצלחה באמצעות סטריאוטירוסקופ פלואורסצנטי (איור 2).
    7. לאחר ההחלמה, מעבירים את העוברים לצלחת בעלת שש בארות מצופה אגרוז, המלאה במדיום עוברי ודגרה אותם ב-28 מעלות צלזיוס.

3. יצירת עוברים מופחתים בגודל על ידי סילוק תאים

  1. מכין עוברים לחירוש.
    1. לאסוף עוברים טריים הניח דגי זברה של הגנוטיפ הרצוי.
    2. לדגור על העוברים ב 28 °C (50 °F) עד שהם מגיעים לשלב הגבוה.
    3. Dechorionate העוברים כמתואר בשלבים 2.1.2-2.1.5 כאשר העוברים מגיעים לשלב הגבוה.
      הערה: בדוגמה זו, extirpation התא מבוצע בשלב הכדור. בהתאם, עוברים הם dechorionated כ 30 דקות עד 1 שעה מוקדם יותר.
  2. אופציונלי: סימון השכבה הסינכיטלית של החלמון (YSL).
    הערה: אם תרצה, הזריקו דקסטרנים פלואורסצנטיים לתוך YSL לפני כיבוי תאים. טכניקה זו מאפשרת לקבוע אם YSL נשאר שלם לאחר הסרת התא, וזה חשוב עבור עובר נורמלי15. לחלופין, mRNAs מסונתז במבחנה או חלבונים ניתן גם להזריק לתוך YSL.
    1. השתמש פיפטה פסטר להעביר את העוברים dechorionated לצלחת הזרקה מצופה אגרוז מלא במי עובר.
    2. כוונו את העוברים לרוחב, כאשר שולי ההזרקה מצביעים לכיוון מחט ההזרקה (איור 3A).
    3. הזרק 0.5 nL של 1.5 מיקרוגרם / μL 10 kDa Alexa568-Dextran לתוך YSL, מכוון לאזור בין תאי blastoderm לבין החלמון בעומק של כשליש מהקוטר של העובר. הזריקו את כל העוברים בשורה אחת.
      הערה: מאז מחט הזרקה לא צריך לנקב דרך chorion, קטן (~ 4 מיקרומטר) ופתח חד הוא יתרון.
    4. סובבו את העוברים ב-180° כך שהצד הנגדי של שולי ההזרקה יצביע לכיוון מחט ההזרקה (איור 3A).
    5. הזרק עוד 0.5 nL של 1.5 מיקרוגרם / μL 10 kDa Alexa568-Dextran לתוך YSL כמתואר בשלב 3.2.3, מניב נפח הזרקה כולל של 1 nL לכל עובר.
      הערה: הזרקה משני צדדים מאפשרת הפצה אחידה יותר של דקסטרן פלואורסצנטי בתוך YSL.
    6. בדוק את התוצאה של הזריקה תחת סטריאוטמיקוסקופ פלואורסצנטי. אם נעשה כראוי, האות הפלואורסצנטי יוגבל ל- YSL (איור 3B) ולא יהיה גלוי במרחב הבין-תאי של הפיצוץ.
  3. משמיד תאים
    1. מלאו צלחת השתלה בתמיסה של רינגר (ראו שלב 2.2.1).
    2. מעבירים את העוברים לצלחת ההשתלה.
    3. כוון את העוברים עם מוט החיות לכיוון מחט ההשתלה (איור 3C).
    4. הסר בזהירות תאים מאזור מוט החיות כמתואר בשלבים 1.3.5-1.3.7, ובכך להפחית את blastoderm לגודל הרצוי.
    5. להשליך את התאים שהוסרו על ידי גירושם ממחט ההשתלה.
    6. לאחר השלמת ההליך, אפשר לעוברים להישאר בתמיסה של רינגר במשך 30 דקות עד שעה כדי להתאושש.
    7. אופציונלי: בחן את שלמות ה- YSL תחת סטריאופיקוסקופ פלואורסצנטי (איור 3D).
    8. מעבירים את העוברים לצלחת מצופה אגרוז מלאה בעובר בינוני ודגרים אותם ב-28 מעלות צלזיוס.

4. יצירת מוטציות אימהיות-זיגוטיות על ידי השתלת נבטים

  1. מכין עוברים מארחים ותורם.
    1. אסוף עוברים טריים הן ממוטנטים והן מדגי זברה מסוג בר. עוברים מדגי זברה עם רקע מוטנטי ישמשו כתורמים, ואילו עוברים מדגי זברה עם רקע פראי ישמשו כמארחים.
      הערה: השתלת Germline דורשת מספר גבוה של עוברים מתחילים (~ 50 לתורמים, ~ 500 עבור פונדקאים) כדי להבטיח מספר רב של השתלות נבט מוצלחות ששרדו עד הבגרות.
    2. מעבירים את העוברים לצלחת הזרקה מצופה אגרוז עם מדיום עובר באמצעות פיפטה פסטר.
      הערה: זריקות נעשות לפני dechorionation כדי להגדיל את התפוקה. מחטים להזרקה דרך chorion צריך להיות בוטה יש פתח גדול יותר (~ 10 מיקרומטר) כדי למנוע סתימה.
    3. הזרק את העוברים התורם עם 1 nL של 100 ng / μL קידוד mRNA GFP עם nos1 3'UTR. הזריקו את ה-mRNA לחלמון כדי להגדיל את התפוקה.
      הערה: nos1 3'UTR ייצב את ה- mRNA בתאי הנבט הקדמוניים, ויגרום לתאי הנבט להיות פלואורסצנטיים מאוד כאשר הם מוזלים יום אחד לאחר ההפריה10.
    4. הזרק את העוברים המארחים עם 1 nL של 0.33 mM (3 מיקרוגרם / μL) מבוי סתום (dnd) מורפולינו. הזריקו את המורפולינו לחלמון כדי להגדיל את התפוקה.
      הערה: dnd morpholino חוסם היווצרות תאי נבט ראשוניים, אשר מבטיח כי החיידק של העובר המארח יהיה מאוכלס באופן בלעדי עם תאים מן התורם לאחר ההשתלה10.
    5. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחות פטרי מפלסטיק עם מדיום עובר. דגירה ב 28 °C (70 °F) עד העוברים להגיע לשלב הגבוה.
    6. Dechorionate העוברים כמתואר בשלבים 2.1.2-2.1.5 כאשר העוברים מגיעים לשלב הגבוה.
  2. השתלת תאי נבט
    1. מלאו צלחת השתלה בתמיסה של רינגר (ראו שלב 2.2.1).
    2. מעבירים את הכדור המופחת לעוברים בשלב הכיפה לצלחת ההשתלה.
    3. מקם את העוברים המארחים ואת העוברים התורמים בעמודים מתחלפים להשתלת התאים מעובר תורם אחד לשישה עוברים מארחים שונים. זה מגדיל את הסיכוי שתאי נבט מעובר מארח נתון יושתלו בהצלחה.
    4. כוון את העוברים עם השוליים לכיוון מחט ההשתלה ולבצע את ההשתלה כמתואר בסעיף 1.3. להשתלות נבטים (איור 1D,F), קחו את תאי המקור מהשוליים (היכן נמצאים תאי הנבט הקדמונים) והפקידו אותם באותו מיקום בעובר המארח.
      הערה: השתלת עמודה גדולה (כ 80 מיקרומטר קוטר ו 600 מיקרומטר אורך) יגדיל את הסיכוי להשיג השתלת נבט מוצלחת.
    5. אפשר לעובר להישאר בתמיסה של רינגר במשך 30 דקות עד שעה כדי להתאושש לאחר השלמת ההשתלה.
      הערה: אם לא כל העוברים התורמים צפויים להיות מוטציות הומוזיגוס - למשל, אם הם נובעים מחדירה הטרוזיגוס - הם צריכים להיות genotyped לאחר ההשתלה כדי לקבוע את הגנוטיפ של נבט העתיד המושתל של הפונדקאי. במקרה זה, ודא כי עמדות המארח העוברים התורמים אינם מעורבים במהלך הטיפול.
    6. השתמש סטריאוטמיקוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחון אם התאים הושתלו בהצלחה (איור 4A,B).
    7. מעבירים את העוברים לצלחת מצופה אגרוז 24.... קבץ את כל העוברים המארחים שקיבלו תאים מאותו תורם לאותה באר ותייגו אותם בהתאם. לדגור אותם עד למחרת ב 28 °C (50 °F).
    8. במידת הצורך, העבר את העוברים התורמים לרצועות PCR מסומנות עבור genotyping.
  3. הקרנה להשתלות נבט מוצלחות
    1. מסך העוברים המארחים להשתלות נבט מוצלחות תחת סטריאוטמיקוסקופ פלואורסצנטי כ 30 שעות לאחר ההפריה (hpf). תאי הנבט נמצאים בחריץ שמעל הרחבת החלמון (איור 4C).
      הערה: ניסויים אופייניים עם המכשיר והאסטרטגיה המוצגים כאן יהיה שיעור הצלחה של ~ 60%-80% כדי להשיג לפחות עובר מארח אחד נושא תאי נבט מושתלים לכל עובר תורם. דו"ח קודם תיאר יעילות של ~ 10%.
    2. אם ישים, יש להשליך עוברים שקיבלו תאים מעוברים תורמים עם גנוטיפ שגוי. לגדל זחלים עם תאי נבט מושתלים בהצלחה לבגרות על פי תנאי גידול סטנדרטיים ובהתאם להנחיות המוסדיות.

Representative Results

הצלחה וכישלון בשימוש במכשיר ההשתלה עבור שלושת היישומים שתוארו לעיל ניתן להעריך בקלות על ידי בדיקה חזותית תחת סטריאומיקוסקופ. בהשתלות מוצלחות, העובר צריך להיראות נורמלי ודומה בצורתו ובהירות החלמון לעוברים לא מושתלים, ללא קרעים גדולים בפיצוץ. אם העובר ניזוק באופן ניכר (איור 4B), הוא לא יתפתח כרגיל. באופן אידיאלי, תאים מושתלים המבטאים סמן פלואורסצנטי אמורים להופיע כעמודה רציפה כאשר הם נצפים תחת סטריאוטירסקופ פלואורסצנטי (איור 2A, איור 4A). אם העמודה מקוטעת, זה מצביע על כך שהתאים נטענו על ידי היניקה למחט ההשתלה או שהתצהיר של התאים נעשה במרץ רב מדי. ניתן למנוע זאת על ידי הזזת הבוכנה לאט ובעדינות רבה יותר.

למרות שמכשיר ההשתלה שימש בעיקר על עוברים של דגי זברה בשלבי בלטולה 5,6, השתלה וכיבוי תאים פועלים באותה מידה עבור עוברים בשלבי בלטולה של דג האורז היפני מדאקה (Oryzias latipes) (איור 2B). מלבד dechorionation העובר, אשר תואר על ידי פורזינסקי, S. R. et al.17, ניתן לעקוב אחר אותם הליכים כפי שתואר לעיל ניתן לעקוב אחר.

במקרה הספציפי של השתלת נבטים, השתלה טובה תגרום לעובר עם עמוד אופקי ארוך של תאים ישירות מעל שולי החלמון (איור 4A). עם זאת, ניתן להעריך אם תאי נבט הושתלו בהצלחה רק למחרת (איור 4C-F) בשל ביטוי רקע של GFP בשלבי בלטולה (איור 1F). תאי הנבט הקדמוניים יופיעו כספירות פלואורסצנטיות קטנות בחריץ ישירות מעל הרחבת החלמון (איור 4C-E). נוכחותם של תאים אלה במיקום הנכון מצביעה על השתלת נבט מוצלחת. תאים בעלי צורה שונה אינם תאי נבט (למשל, תאים מוארכים הם בדרך כלל תאי שריר, איור 4F). כמו כן, אם תאי נבט קדמוניים נמצאים מחוץ לחריץ, משמעות הדבר היא שהם לא הצליחו לנדוד כראוי, והם לא יוכלו לתרום לנבט של העובר. לבסוף, המורפולוגיה הכללית של עוברים מושתלים צריכה להיראות דומה לעוברים לא מושתלים (איור 4D); אין לעוות את הזנב, ואין לכווץ את הראש או חסר עיניים (איור 4E). פגמים אלה נובעים בדרך כלל ריכוזי מורפולינו גבוהים מדי או מנזק עוברי במהלך ההשתלה. ניסויי השתלת נבטים כמתואר כאן בדרך כלל יגרמו ל-1-2 מתוך 6 עוברים מארחים עם תאי נבט שהושתלו בהצלחה עבור 60%-80% מהעוברים התורמים, בהתאם לניסיון של הנסיין. לכן, תאים מ 40-50 עוברים תורם הומוזיגוס צריך להיות מושתל לתוך 200-300 עוברים מארחים לגדל כ 30 אנשים עם תאי נבט מוטנטי.

Figure 1
איור 1: הרכבה ושימוש במכשיר ההשתלה. (א) מכשיר ההשתלה מורכב על ידי חיבור מזרק הדוק בגז עם מחזיק מיקרופיפט באמצעות התאמת מנעול לור. מחט הזכוכית להשתלה מוכנסת לאחר מכן למחזיק המיקרופיט. (ב) צילום של מכשיר ההשתלה שהורכב מותקן על מיקרו-מניפולטור (שים לב שהרקע והתוויות הוסרו מהתמונה). (ג) בעת שימוש במכשיר ההשתלה, חשוב לוודא כי מפלס המים במחט ההשתלה נשאר בקצה המחודד. (D) המכשיר משמש תחת סטריאומיקוסקופ כדי לסגת ולהכניס תאים מעוברי טלוסט ואליו המוצבים בבארות בודדות של צלחת השתלה. (ה) עבור הדור של מקורות חוץ רחמיים, תאים נלקחים מקוטב החיה של עובר תורם (i-ii) ומועברים לקוטב החיה של עובר מארח (iii-vi). (ו) להשתלת נבטים, מספר גדול יותר של תאים נלקח משולי העובר התורם (i-ii), שבו נמצאים תאי הנבט. לאחר מכן, התאים מועברים לשולי העוברים המארחים (iii-vi). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: יצירת שיבוטים על ידי השתלת תאים. (A) דוגמה לשיבוט כפול שנוצר על ידי השתלה רציפה של תאים פלואורסצנטיים (ירוקים) מתורם דגי זברה לעובר מארח של דגי זברה. ניתן להשתמש בשיבוטים יחידים וכפולים כדי לחקור כיצד מולקולות איתות מופרשות יוצרות שיפועים spatiotemporal2,4,5,6. (ב) דוגמה לשיבוט יחיד שנוצר על ידי השתלת תאים מתורם מדאקה מהונדס (ווימבלדון)17 למארח מדאקה מסוג בר. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יצירת עוברים מופחתי גודל על ידי סילוק תאים. (A) לפני הסרת תאים על ידי extirpation, YSL יכול להיות מתויג על ידי הזרקת צבעים פלואורסצנטיים לשני צדדים מנוגדים של YSL. (ב) דוגמה לעובר לאחר הזרקת YSL. (C) כדי ליצור עוברים מופחתים בגודל, תאים מקוטב החיות מוסרים על ידי extirpation5. (D) דוגמה לעובר לאחר כיבוי תאים. שים לב כי YSL נשאר שלם. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השתלת נבטים. (א) דוגמה להשתלה מוצלחת של תאים תורמים (ירוקים) לאזור השולי של הפונדקאי. (ב) דוגמה להשתלה לא מוצלחת. החלמון של העובר המארח נפגע קשות, והעובר לא יוכל להתפתח כרגיל. (C) ב 30 כ"ס, תאי נבט מושתלים בהצלחה יימצאו אך ורק ב mesoderm גונדל באזור העורפי של הרחבת החלמון. (ד) דוגמה להשתלה מוצלחת שבה מספר תאי נבט תורמים המסומנים על ידי GFP אכלסו את תולם העתיד של הפונדקאי. (ה) דוגמה להשתלה לא מוצלחת. למרות שתאי הנבט הגיעו למסודרם הגונאדל, העובר המארח מעוות קשות ולא יתפתח כרגיל. (ו) דוגמה להשתלה לא מוצלחת. תאי נבט פלואורסצנטיים שלא הצליחו לעבור למיקום הנכון לא יאכלסו מחדש את חטיפים. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. תמונות ב- D-F צולמו בהגדלה כוללת של כ - 50x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ההצלחה של ניסוי השתלה מסתמכת מאוד על הכישורים המוטוריים העדינים של הנסיין. כדי לבצע בהצלחה את ההליכים, יש צורך בתרגול. עם זאת, המכשיר המוצג כאן קל יחסית ללמוד ולהשתמש בהשוואה לאחרים בשוק, ובכלל, רק כמה ימים של תרגול נדרשים.

ההצלחה של הליך ההשתלה ניתן לשפר על ידי נקיטת מספר אמצעי זהירות. צעד אחד הוא להבטיח כי micromanipulator הוא באיכות טובה ומסוגל לפעולה חלקה. הוספת עינית עם הגדלה גבוהה יותר לסטריאומיקוסקופ יכולה לעזור למקם במדויק את המחט ביחס לעובר. שימוש בדגי זברה או מדאקה רבייה היטב כדי לרכוש עוברים בריאים ודואג לא לפגוע בעוברים במהלך הטיפול (במיוחד במהלך שלב ההפחתה ואחריו) ישפר גם את שיעור ההצלחה.

בעיות עם רעילות מושהית יכול להיות קשה יותר לפתור. אם עובר מת לאחר כמה שעות - אך לא מיד לאחר ההשתלה - ייתכן שהחלמון נפגע מהמחט (למשל, על ידי כניסה עמוקה מדי לעובר), או אולי התאים נפלטו בכוח רב מדי. רעילות מאוחרת ומוות עוברי יכולים לנבוע גם חלמון או פסולת תאים מוזרקים יחד עם התאים התורמים; סיבה נוספת יכולה להיות חיץ HEPES מתדרדר בפתרון של הצלצול. ניתן להתגבר על בעיות אלה על ידי שטיפת התאים (ראה שלב 1.3.8) או פשוט על ידי שימוש באצווה חדשה של חוצץ, בהתאמה. יתר על כן, עוברים מארח מעוות בניסויים השתלת נבטים עלול לנבוע ריכוזי מורפולינו גבוהים מדי. זה חיוני להשתמש מספיק מורפולינו כדי לפטור לחלוטין את הנבט מסוג הפרא של המארח, ובכך למנוע תאים אלה לתרום לצאצאים - אבל באותו זמן, ריכוזי מורפולינו גבוהים מדי יש להימנע. כמויות מורפולינו עקביות בכל העוברים המארחים המוזרקים (כמה מאות בניסוי טיפוסי) הן אפוא המפתח להצלחת השתלות נבטים. זה יכול להיות עזר על ידי שכשהם את תערובת הזרקת מורפולינו עם צבע מעקב גלוי בקלות14, אשר ניתן לעקוב תחת סטריאופיקוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח כי כל העוברים מקבלים את אותו נפח הזרקה.

ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה כוללים באופן בלעדי מניפולציות של תאים בדגי זברה בשלב blastula או בעוברי מדאקה, אך בעתיד, סביר להניח שניתן יהיה להתאים את המכשיר לשלבים ומינים שונים על ידי שינוי הקוטר והצורה של מחט ההשתלה.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

פרויקט זה נתמך על ידי חברת מקס פלאנק וקיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 637840 (QUANTPATTERN) והסכם מענק מס ' 863952 (ACE-OF-SPACE)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament To make the transplantation needle
1.0 mm glass capillary, ends cut with filament To make injection needles
200 mL glass beaker For embryo dechorionation
24-well plastic plate To be coated with agarose in order to incubate embryos
5 cm diameter glass Petri dish For embryo dechorionation
6-well plastic plate To be coated with agarose in order to incubate embryos
Agarose To coat plastic dishes
dnd1 morpholino Gene Tools Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC
CAT
Embryo medium 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source To assess YSL injections and germ-line transplantations
Glass micropipette puller Sutter Instrument Company P-1000 To make the transplantation needle
Glass pasteur pipette Kimble Chase (via Fisher) 63A53WT For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge
Incubator at 28 °C For incubating zebrafish embryos
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series Hamilton Ref: 80201 Part of the transplantation device
Manual micromanipulator with 3 axes of movement Narishige M-152 For controlling the transplantation device
Manual pipetting pump Bio-Tek Cat. # 641 For use with the glass pipettes to transfer embryos
Metal dissecting probe For moving and rotating zebrafish embryos
Microforge Narishige MF2 To make the transplantation needle
Microinjection apparatus For injection of mRNA and morpholino into embryos
Microinjection molds, triangular grooves Adaptive Science Tools TU-1 To prepare microinjection plates with agarose
Microinjection-molds, single wells Adaptive Science Tools PT-1 To prepare transplantation plates with agarose
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary World Precision Instruments MPH6S10 Part of the transplantation device
mMessage mMachine Sp6
transcription kit		 Life Technologies AM1340M To generate capped mRNA for injection into embryos
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1
Plastic petri dish 100 mm To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes
Protease from Streptomyces griseus Sigma P5147 For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos
Ringer’s solution For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration
Stereomicroscope For injection and transplantation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
  2. Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
  3. Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
  4. Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
  5. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  6. Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
  7. Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
  8. Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
  9. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  10. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , University of Oregon Press. (2000).
  12. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
  13. Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
  14. Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
  15. Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
  16. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
  17. Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 174 השתלת תאים extirpation השתלת נבטים הזרקת YSL עוברים טלוסט דג זברה medaka
מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soh, G. H., Kögler, A. C.,… More

Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (174), e62767, doi:10.3791/62767 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter