Summary
세포의 해출 및 이식과 같은 배아 조작은 초기 발달을 연구하기 위한 중요한 도구입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 이러한 조작을 수행하기 위해 간단하고 효과적인 이식 장치를 설명합니다.
Abstract
세포를 제거하고 배아 내부 또는 배아 사이를 이식하는 것과 같은 고전적인 배아 조작은 복잡한 발달 과정을 연구하는 강력한 기술입니다. Zebrafish 배아는 쉽게 접근할 수 있고 크기가 상대적으로 크고 투명하기 때문에 이러한 조작에 이상적입니다. 그러나, 세포 제거 및 이식을 위한 이전에 개발된 장치는 사용하기 가소하거나 구입하는 비용이 많이 듭니다. 대조적으로, 여기에 제시된 이식 장치는 경제적이고 조립하기 쉽고 사용하기 쉽습니다. 이 프로토콜에서는 먼저 이식 장치의 처리뿐만 아니라 상업적및 널리 사용되는 부품의 조립을 소개합니다. 그런 다음 현지화된 소스에서 신호 분산을 연구하는 ectopic 클론 생성, 크기 감소배아를 생성하는 세포의 해각, 모계 자고딕 돌연변이를 생성하기 위한 생식선 이식 등 세 가지 용도를 제시합니다. 마지막으로, 일본 쌀생선 메다카와 같은 다른 종의 배아 조작에도 이 도구를 사용할 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
배아축1의 형성을 지시하는 주최자의 존재를 입증한 Mangold와 Spemann의 고전 실험에서 배아 축1의 형성을 지시하는 것에서, 배아 발달을 연구하기 위한 확립된 기술이 되었습니다2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 이식에 일반적으로 사용되는 설정은 유연한 튜브와 미네랄 오일12,13로 채워진 저수지를 통해 마이크로 피펫 홀더에 연결된 마이크로미터 드라이브 제어 가스 타이트 주사기로 구성됩니다. 이 설정에서는 주사기의 플런저가 나사를 통해 이동됩니다. 이러한 방식으로 생성된 압력은 마이크로피펫으로 옮겨져 한 배아에서 세포를 끌어내고 다른 배아로 증착하는 데 사용됩니다. 그러나 이 유압 작동 장치는 많은 부품으로 구성되며 처음부터 조립하기가 힘들다. 유사한 장치는 또한 완전한 작업 세트로 구입할 수 있습니다, 일반적으로 수동 마이크로 인젝터로 판매, 이러한 상용 버전은 일반적으로 이상 비용 1500 US$. 집에서 만든 및 상용 버전 모두에서, 배아 조작을 위한 마이크로피펫은 기름이 채워진 튜브를 통해 압력 발생 장치(가스 팽팽한 주사기)에서 분리됩니다. 마이크로피펫의 조작과 플런저의 움직임은 다른 손으로 별도로 작동하여 처리량과 유틸리티를 줄여야 합니다. 또한 튜브가 거품의 형성을 피하면서 조심스럽게 기름으로 채워져야하기 때문에 장치는 이식을 준비하는 번거롭습니다. 여기서는 저렴하고 조립하기 쉽고 사용하기 쉬운 세포 제거 및 이식을 위한 대체 공압 작동 장치를 설명합니다.
여기에 제시된 장치는 마이크로 피펫 홀더가 장착된 25 μL 가스 가루 주사기로 구성되어 있으며 80 달러 미만의 비용이 듭니다. 이 장치는 Luer 잠금 피팅(그림 1A)을 통해 주사기에 마이크로파이펫 홀더를 삽입하여 쉽게 조립할 수 있습니다. 그런 다음 장치가 마이크로 조작기에 직접 장착되어 사용자가 마이크로 조작기에서 한 손으로 위치와 흡입을 모두 제어 할 수 있습니다. 이것은 편리하게 다른 손을 자유롭게 떠나 기증자및 호스트 배아를 포함하는 이식 접시를 안정시키고 움직일 수 있습니다. 이 장치는 공기흡입에 의해 작동하며 미네랄 오일로 채워질 필요가 없습니다. 유리 바늘의 물과 벽 사이의 매력적인 힘으로 인해, 주사기의 플런저에서의 큰 움직임은 수위가 유리 바늘의 테이퍼 끝에있는 한 바늘 내의 수수준에서 작은 움직임으로 변환됩니다. 이를 통해 흡인 셀 수와 삽입 위치를 정밀하게 제어할 수 있습니다.
이 장치의 유용성을 입증하기 위해, 우리는 제브라피시 (Danio rerio) 배아에 있는 3개의 응용프로그램을 제시합니다. 첫째, 그라데이션 형성2,4,6을 연구하는 데 사용할 수 있는 분비된 신호 분자의 국소화된 소스를 생성하는 방법을 보여줍니다. 여기서, 기증자 배아는 형광표지 신호 분자를 인코딩하는 mRNA로 주입됩니다. 형광 표지 기증자 세포는 신호 그라데이션의 형성이 심상화되고 분석될 수 있는 야생형 호스트 배아로 이식됩니다. 둘째, 크기 감소 배아5,13을 생성하기 위해 절제하여 세포를 제거하는 데 장치를 어떻게 사용할 수 있는지 설명합니다. 마지막으로, 우리는 생식선이 축약된 호스트 배아로 원시 세균 세포 기자를 운반하는 세포를 이식하여 모계 자고딕 돌연변이를 강력하게 생성하는 방법을 보여줍니다6,10. 미래에, 여기에 설명된 이식 장치는 세포의 제거 또는 이식을 요구하는 그밖 배아 학적 조작에 쉽게 적응될 수 있다.
Protocol
1. 이식 장치를 조립하고 사용
- 이식 장치를 조립합니다.
- Luer tip 25 μL 가스 가결 주사기와 Luer 잠금 피팅을 사용하여 마이크로 피펫 홀더를 연결하여 이식 장치를 조립합니다(그림 1A).
참고: 루어 팁을 얇은 물 필름으로 적시면 물 접착과 응집력을 통해 부품을 함께 유지하여 연결을 향상시킬 수 있습니다. - 장치를 수동 미세 조작기(그림 1B)에 직접 장착합니다. 이 장치는 지배적인 손으로 단독으로 제어하여 추가 작업을 위해 다른 손을 확보할 수 있습니다.
- Luer tip 25 μL 가스 가결 주사기와 Luer 잠금 피팅을 사용하여 마이크로 피펫 홀더를 연결하여 이식 장치를 조립합니다(그림 1A).
- 이식 바늘을 준비합니다.
- 마이크로 피펫 풀러와 유리 모세관 파이펫 (필라멘트없이)을 당겨 이식 바늘을 생성합니다.
- 날카로운 가장자리가 이식하는 동안 노른자를 긁을 확률이 높아지므로 바늘끝을 가능한 한 원활하게 깨뜨리면 배아에 치명적입니다.
참고: 팁은 스테레오현미경 으로 직선 면도날로 쉽게 깨질 수 있습니다. 그러나 마이크로포지를 사용하면 원하는 크기의 정확한 개구부를 생성할 수 있습니다. 자궁 외원 생성의 경우 약 50-60 μm의 외지름이 적절합니다. 축출 및 생식선 이식의 경우, 바늘의 외부 직경은 이식 된 세포의 수를 증가시키기 위해 약 80-90 μm을 측정해야합니다. - 즉시 사용할 수 있는 바늘을 이식 장치에 삽입합니다(그림 1A).
- 이식 장치를 사용 하 여.
- 이식 장치와 함께 미세 조작기를 스테레오 현미경(도 1B) 옆에 놓습니다.
- 플런저를 제거하고 이식 바늘을 링거의 용액으로 채워진 이식 접시에 낮춥니다(2.2.1 단계 참조) 바늘끝이 침지될 때까지 45° 각도로(그림 1B). 모세관 작용으로 인해 물이 바늘위로 돌진합니다.
- 플런저를 중간쯤 삽입하여 링거의 용액을 플러시하고 바늘의 얇고 테이퍼된 부분에 소량의 물만 남깁니다(그림 1C).
참고: 이것은 중립 위치이며 수위는 잠시 동안 안정되어야합니다 (>20 분). 수위가 불안정하면 공기가 누출됩니다. Luer 잠금 피팅을 다시 연결하거나 주사기를 교체합니다. - 처음으로 이식 바늘을 사용하는 경우, 희생 된 배아에서 노른자를 끌어 올린 다음 노른자 물질을 완전히 추방하여 내부를 코팅하십시오. 코팅은 후속 절차 도중 유리에 세포의 준수를 감소시키는 것을 도울 것입니다.
- 기증자 배아를 바늘의 도움으로 부드럽게 배치한 다음 바늘 개구부 직교를 배아 표면에 배치합니다(도 1D).
참고: 위치는 다른 에세이에 대해 다를 것입니다. 자궁 외 신호 분자 소스 생성 및 세포 해출의 경우, 이것은 동물 극의 상단이 될 것입니다 (도 1E); 생식선 이식의 경우 마진이 됩니다(그림 1D,F). - 천천히 조심스럽게 플런저를 당겨 바늘에 세포를 그립니다.
참고: 세포가 너무 빨리 차지하면 손상될 수 있습니다. 올바르게 수행하면 세포가 원통형 열로 나와야 합니다. 이식된 노른자가 숙주 배아에 독성이 있기 때문에 노른자를 바늘로 복용하지 마십시오. - 원하는 셀 수가 유입되면 플런저를 약간 아래로 밀어 흡입을 중지합니다. 짧고 신속한 움직임으로 바늘을 옆으로 흔들어 배아에서 바늘을 제거합니다. 셀 컬럼의 양쪽에 일부 링거의 용액을 두고 세포를 바늘의 테이퍼 끝으로 제한합니다(그림 1C,D).
참고: 세포 기둥 앞의 액체는 세포 열을 증착할 때 숙주 배아의 세포를 강제로 떼어 놓는 데 도움이 됩니다. - 바늘이 침지되는 동안 플런저를 위아래로 천천히 움직여 남은 노른자 나 세포 파편을 제거하여 링거의 용액으로 세포를 씻으려면 하십시오. 올바르게 완료되면 손상되지 않은 셀이 열에 함께 부착된 상태로 유지되며 파편은 세척됩니다.
참고 : 수위가 바늘의 테이퍼 끝을 지나 상승하기 때문에이 단계에서 세심한주의를 기울여야합니다. 이것은 세포를 세척하는 데 사용할 수있는 물의 갑작스런 유입을 일으킬 것입니다. 그러나 수위가 테이퍼 끝을 통과하면 플런저를 사용하여 미세 한 제어가 줄어들고 플런저를 더 느리고 신중하게 이동해야합니다. - 비지배적인 손으로 이식 접시를 이동하여 바늘 직교를 숙주 배아의 표면(동물 극 또는 마진)에 배치합니다(도 1D-F).
- 약간의 압력을 부드럽게 적용한 다음, 숙주 배아의 포위층을 관통하기 위해 신속하고 날카로운 움직임을 제공합니다. 바늘로 노른자를 긁지 않도록주의하십시오.
참고: 우물의 벽에 조심스럽게 압착하여 배아에 약간의 압력을 가하면 배아의 표면 장력이 증가하므로 포위 층의 피어싱을 용이하게합니다. - 바늘이 내부에 들어가면 플런저를 부드럽게 밀어 세포 컬럼을 배아로 돌이게 하는 동시에 바늘을 천천히 후퇴시킵니다(그림 1D-F).
- 이식 바늘을 청소합니다.
- 바늘이 탈이온물에 침지되는 동안 플런저를 위아래로 움직여 바늘을 헹구는 다.
참고: 바늘이 더러워지면 수산화 나트륨 용액 10M로 헹구고 다시 물로 헹구십시오. - 바늘을 적절한 상자에 보관하여 추가 사용을 위해 보관하십시오.
- 바늘이 탈이온물에 침지되는 동안 플런저를 위아래로 움직여 바늘을 헹구는 다.
2. 제브라피시 배아에서 분비된 신호 분자의 자궁 외원인 생성
- 호스트 및 기증자 배아를 준비합니다.
- 제브라피시를 결합하여 갓 낳은 배아를 수집합니다.
- 1세포 단계 제브라피쉬 배아는 작은 유리 페트리 접시에서 약 15분 동안 pronase 용액의 0.5 mg/mL에서 최대 100개의 배아를 배양하여 배양합니다(이 절차에 대한 자세한 설명은 로저스, K. W. 외.14)에 의해 출판되었다.
참고: 대안적으로, 배아는 이식 직전(단계 2.2) 고단계에서 점진될 수 있지만, 이것은 주입된 기증자 배아와 주입되지 않은 숙주 배아를 별도로 비반향할 것을 요구한다. - 200mL 비커에서 배아 배지에 배아를 침수한다.
참고: 점액 이탈라와 가스트룰라 단계 배아는 매우 섬세합니다. 노출된 노른자는 플라스틱 표면을 고수하고 공기와 접촉하면 파열됩니다. 따라서, 그들은 완전히 배아 매체에 침지 유지해야, 유리 파이프로 전송, 아가로즈 코팅 (배아 매체에서 1 %) 플라스틱 접시 또는 유리 페트리 접시 중 하나에 유지. - 조심스럽게 배아 매체의 대부분을 비우고 천천히 신선한 배아 매체로 비커를 채웁니다. 이러한 방식으로 인한 가벼운 동요는 약화된 축색의 제거를 용이하게 합니다. 이 단계를 2-3번 반복합니다.
- 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 반향을 불러온 배아를 아가로즈 코팅 주입 접시에 옮기다.
참고: 분젠 버너 화염에 노출시켜 유리 파스퇴르 파이펫 끝을 불태우면 가장자리가 녹아 서 배아의 손상을 방지할 수 있습니다. - 형광 태그단백질을 배아의 하위 집합에 인코딩하는 mRNA를 주입하십시오(이 절차의 상세한 설명은 로저스, K. W. 외.14)에 의해 간행되었습니다. mRNA를 노른자가 아닌 세포에 주입하여 거의 균일한 발현을 합니다. 주입된 태아는 기증자로 봉사할 것이고, 주입되지 않은 태아는 호스트역할을 할 것입니다.
참고: 주입된 mRNA의 양 그리고 모형은 연구되는 신호 분자에 달려 있고 일반적으로 20에서 200 pg2,4,5,6까지 구역수색합니다 (그러나 특정 경우에 1000 pg만큼 높을 수 있습니다4). - 주입된 배아를 아가로즈 코팅 6웰 접시에 배아 배지로 채운 배아로 옮겨. 배아가 초기 구 단계에 도달할 때까지 28°C에서 배양한다.
- 자궁 외 소스를 생성하기 위해 세포를 이식.
- 링거의 용액(116m NaCl, 2.8m KCl, 1mM CaCl2, 5mM HEPES; HEPES 버퍼를 4°C에서 저장)로 이식 접시(개별 삼각형 쐐기 모양의 우물, 재료 표 참조)를 채웁니다.
참고: 링거의 용액에 있는 칼슘은 세포 접착을 촉진하고 태아가 이식 절차에서 치유하는 것을 돕습니다. - 배아를 이식 접시에 옮기.
- 이식 바늘을 지향하는 동물 극과 각각의 경우에, 교대 열에 호스트와 기증자 배아를 배치합니다.
- 섹션 1.3에 설명된 바와 같이 이식을 수행한다. 자궁 외 원 이식의 경우, 동물 극의 상단에서 소스 세포를 가져 와서 숙주 배아의 동일한 위치로 증착하십시오 (그림 1E).
참고: 1.3.8 단계에서 자세히 설명된 대로 링거의 용액으로 세포를 세척하는 것은 이미 분비된 신호 분자가 호스트로 이월되지 않도록 하는 데 중요합니다. 소스가 분산되지 않도록 너무 많은 세포를 이식하지 마십시오. 직경 약 80μm, 길이 100 μm의 컬럼은 많은 응용 분야에 적합합니다. - 호스트 태아가 30분에서 1시간 동안 링거의 용액에 머무르도록 허용하여 회복합니다.
- 형광 스테레오현미경을 사용하여 세포가 성공적으로 이식되었는지 여부를 검사합니다(그림 2).
- 회복 후, 배아 배지로 채워진 아가로즈 코팅 6웰 플레이트로 배아를 옮기고 28°C에서 배양한다.
- 링거의 용액(116m NaCl, 2.8m KCl, 1mM CaCl2, 5mM HEPES; HEPES 버퍼를 4°C에서 저장)로 이식 접시(개별 삼각형 쐐기 모양의 우물, 재료 표 참조)를 채웁니다.
3. 세포 내수에 의한 크기 감소 배아 생성
- 해저편을 위한 배아를 준비한다.
- 원하는 유전자형의 제브라피시로부터 갓 낳은 배아를 수집합니다.
- 높은 단계에 도달할 때까지 배아를 28°C에서 배양합니다.
- 배아가 높은 단계에 도달할 때 단계 2.1.2-2.1.5에 설명된 바와 같이 배아를 데초리오네이트한다.
참고: 이 예제에서는 구 단계에서 셀 절제가 수행됩니다. 따라서, 배아는 약 30 분 내지 1 시간 전에 비반향된다.
- 선택 사항: 노른자 동기화 레이어(YSL)에 레이블을 지정합니다.
참고: 원하는 경우 세포를 내세이리하기 전에 형광 덱스트랜스를 YSL에 주입하십시오. 이 기술은 YSL이 일반적인 배아발생15를 위해 중요한 세포 제거 후에 온전하게 남아 있는지 여부를 결정할 수 있습니다. 대안적으로, 체외 합성 mRNA 또는 단백질은 또한 YSL로 주입될 수 있다.- 파스퇴르 파이펫을 사용하여 비반향된 배아를 배아 물로 채워진 아가로즈 코팅 주입 접시로 옮겨 넣습니다.
- 주사 바늘을 가리키는 blastoderm 마진으로 배아를 측면으로 방향을 지정합니다(도 3A).
- YSL에 1.5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran의 0.5 nL을 주입하여 배아 직경의 약 1/3 깊이에서 블래스트덤 세포와 노른자 사이의 영역을 목표로 합니다. 한 행 내에 모든 배아를 주입합니다.
참고: 주사 바늘이 초리온을 관통할 필요가 없기 때문에, 작은(~4μm)과 날카로운 개구부가 유리하다. - 배아를 180° 회전시켜 블라스트덤 마진의 반대쪽이 주사 바늘을 가리키도록 한다(도 3A).
- 단계 3.2.3에 기술된 바와 같이 YSL에 1.5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran의 0.5 nL을 추가로 주입하여 배아당 1nL의 총 사출 부피를 산출한다.
참고: 양면에서 주입하면 YSL 내에서 형광 드엑스트라의 균등한 분포가 가능합니다. - 형광 스테레오 현미경의 밑에 주입의 결과를 검토합니다. 올바르게 수행되면 형광 신호가 YSL(도 3B)으로 제한되고 blastoderm의 세포 간 공간에서 볼 수 없습니다.
- 세포 내외
- 링거의 용액으로 이식 접시를 채우세요(2.2.1단계 참조).
- 배아를 이식 접시에 옮기.
- 이식 바늘쪽으로 동물 극으로 배아를 지향 (도 3C).
- 단계 1.3.5-1.3.7에 설명된 바와 같이 동물 극 영역에서 세포를 조심스럽게 제거하여 블라스트로름을 원하는 크기로 감소시킵니다.
- 이식 바늘에서 그들을 추방 하 여 제거 된 세포를 폐기.
- 절차가 완료되면 배아가 링거의 용액에 30 분에서 1 시간 동안 머물수 있도록 하여 복구하십시오.
- 선택 사항: 형광 스테레오현미경(그림 3D)에서 YSL의 무결성을 검사합니다.
- 배아 배지로 채워진 아가로즈 코팅 판으로 배아를 옮기고 28°C에서 배양한다.
4. 생식선 이식에 의한 모계 자고트 돌연변이 만들기
- 호스트 및 기증자 배아를 준비합니다.
- 돌연변이와 야생 형 제브라피시 모두에서 갓 낳은 배아를 수집하십시오. 돌연변이 배경을 가진 제브라피시의 배아는 기증자역할을 하며, 야생형 배경을 가진 제브라피시의 배아는 호스트역할을 합니다.
참고: 생식선 이식은 성인기에 살아남는 성공적인 생식선 이식의 좋은 수를 보장하기 위해 많은 수의 시작 배아(기증자의 경우~500, 호스트의 경우 ~500)가 필요합니다. - 파스퇴르 파이펫을 사용하여 배아 배지를 사용하여 아가로즈 코팅 주입 접시에 배아를 전달합니다.
참고: 주사는 처리량을 증가시키기 위해 점초전에 수행됩니다. 초리온을 통해 주입을위한 바늘은 무딘해야하고 막힘을 방지하기 위해 더 큰 개구부 (~10 μm)가 있어야합니다. - nos1 3'UTR로 GFP를 인코딩하는 100 ng/μL mRNA의 1nL로 기증자 배아를 주입하십시오. 노른자에 mRNA를 주입하여 처리량을 증가시면 됩니다.
참고: NOs1 3'UTR은 원시 세균 세포에서 mRNA를 안정화시켜 1일 후 수정을 이미지할 때 세균 세포가 강하게 형광이 됩니다. - 0.33 mM (3 μg/μL) 막다른 끝 (dnd) 모르폴리노의 1 nL로 호스트 배아를 주입하십시오. 모폴리노를 노른자에 주입하여 처리량을 늘립니다.
참고: dnd morpholino 블록 원시 세균 세포 형성, 호스트 태아의 생식기 이식 후 기증자에서 세포로 독점적으로 채워집니다 보장10. - 주입된 배아를 배아 배지로 플라스틱 페트리 접시에 옮기다. 배아가 높은 단계에 도달할 때까지 28°C에서 배양한다.
- 배아가 높은 단계에 도달할 때 단계 2.1.2-2.1.5에 설명된 바와 같이 배아를 데초리오네이트한다.
- 돌연변이와 야생 형 제브라피시 모두에서 갓 낳은 배아를 수집하십시오. 돌연변이 배경을 가진 제브라피시의 배아는 기증자역할을 하며, 야생형 배경을 가진 제브라피시의 배아는 호스트역할을 합니다.
- 세균 세포의 이식
- 링거의 용액으로 이식 접시를 채우세요(2.2.1단계 참조).
- 반향된 구체를 돔 스테이지 배아로 이식 접시로 옮킨다.
- 호스트 배아및 기증자 배아를 교대로 열에 배치하여 1개의 기증자 태아에서 6개의 다른 호스트 태아로 세포를 이식합니다. 이것은 주어진 호스트 태아에게서 세균 세포가 성공적으로 이식될 확률을 증가시킵니다.
- 이식 바늘을 향한 여백을 가진 배아를 방향을 지정하고 섹션 1.3에 설명된 바와 같이 이식을 수행한다. 생식선 이식(도 1D,F)의 경우, 원근생식세포가 있는 여백(원시 세균 세포가 있는 곳)에서 소스 세포를 꺼내 숙주 배아의 동일한 위치로 증착한다.
참고: 큰 컬럼(직경 약 80μm 및 길이 600 μm)을 이식하면 성공적인 생식선 이식을 받을 확률이 높아집니다. - 이식이 완료되면 배아가 링거의 용액에 30분에서 1시간 동안 머무를 수 있도록 하십시오.
참고: 모든 기증자 배아가 동종가성 돌연변이체가 될 것으로 예상되는 경우 ( 예 : 이종화구산에서 유래하는 경우 - 그들은 호스트의 이식 된 미래 세균의 유전자형을 결정하기 위해 이식 후 유전자형이 필요합니다. 이 경우, 호스트와 기증자 배아의 위치가 취급 하는 동안 혼합 되지 않습니다 있는지 확인 합니다. - 형광 스테레오 현미경을 사용하여 세포가 성공적으로 이식되었는지 여부를 검사하십시오 (그림 4A, B).
- 배아를 24웰 아가로 코팅 플레이트로 옮기다. 동일한 기증자로부터 세포를 동일한 우물로 받은 모든 숙주 배아를 그룹화하고 그에 따라 라벨을 부착합니다. 28 °C에서 다음 날까지 배양하십시오.
- 필요한 경우 기증자 배아를 지노티핑을 위해 표지된 PCR 스트립으로 이송하십시오.
- 성공적인 생식선 이식을 위한 검열
- 약 30시간 후 수정(hpf)의 형광 스테레오현미경으로 성공적인 생식선 이식을 위한 숙주 배아를 검사한다. 세균 세포는 노른자 확장 위의 홈에서 발견된다 (그림 4C).
참고: 여기에 제시된 장치 및 전략을 가진 일반적인 실험은 기증자 태아 당 이식한 세균 세포를 운반하는 적어도 1개의 호스트 태아를 얻기 위하여 ~60%-80%의 성공률을 가질 것입니다. 이전 보고서는 ~10% 효율10을 설명했습니다. - 적용 가능한 경우 잘못된 유전자형을 가진 기증자 배아로부터 세포를 받은 배아를 폐기하십시오. 표준 축산 조건에 따라 성인기에 성공적으로 이식 된 생식 세포와 기관 지침에 따라 유충을 성장.
- 약 30시간 후 수정(hpf)의 형광 스테레오현미경으로 성공적인 생식선 이식을 위한 숙주 배아를 검사한다. 세균 세포는 노른자 확장 위의 홈에서 발견된다 (그림 4C).
Representative Results
전술한 세 가지 응용 분야에 대한 이식 장치의 사용 실패는 스테레오현미경에 따른 육안 검사에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 성공적인 이식에서, 태아는 blastoderm에 큰 눈물 없이 이식되지 않은 태아에 모양 및 노른자 선명도에 있는 정상 및 유사한 봐야 합니다. 배아가 눈에 띄게 손상된 경우(도 4B), 정상적으로 발달하지 않습니다. 이상적으로, 형광 마커를 표현하는 이식된 세포는 형광 스테레오현미경(도 2A, 도 4A)에서 볼 때 연속 컬럼으로 나타나야 한다. 컬럼이 단편화되면, 이것은 세포가 이식 바늘로 흡입에 의해 전염되거나 세포의 증착이 너무 격렬하게 수행되었다는 것을 나타낸다. 이것은 플런저를 더 천천히 부드럽게 이동하여 방지 할 수 있습니다.
이식 장치는 주로 블라툴라 단계에서 제브라피쉬 배아에 사용되어 왔지만5,6, 이식 및 세포 해출 작업뿐만 아니라 일본 쌀 물고기 메다카 (Oryzias latipes)의 굴절 된 블라발라 단계 배아에 대한 효과가 있습니다 (그림 2B). Porazinski, S. R. 외.17에 의해 기술된 배아 비초와는 별개로, 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 따를 수 있다.
생식선 이식의 특정 경우에, 좋은 이식은 노른자 여백 의 바로 위에 세포의 긴 수평 컬럼을 가진 태아귀착될 것입니다 (그림 4A). 그러나, 세균 세포가 성공적으로 이식되었는지 여부는 블라술라 단계에서 GFP의 배경 발현으로 인해 다음 날(도 4C-F)에만 평가될 수 있다(도 1F). 원시 세균 세포는 노른자 확장(도 4C-E)바로 위에 있는 홈에 작은 형광구로 나타납니다. 올바른 위치에 이 세포의 존재는 성공적인 생식선 이식을 나타냅니다. 다른 형상을 가진 세포는 생식 세포가 아닙니다 (예를 들어, 길쭉한 세포는 전형적으로 근육 세포, 도 4F). 또한, 원시 세균 세포가 홈 외부에서 발견되는 경우, 이것은 그들이 제대로 마이그레이션하지 못했고, 배아의 생식선에 기여할 수 없다는 것을 의미합니다. 마지막으로, 이식된 배아의 일반적인 형태는 이식되지 않은 배아와 유사하게 나타나야 합니다(도 4D); 꼬리를 변형해서는 안되며 머리를 수축하거나 눈이 없어서는 안됩니다(그림 4E). 이러한 결함은 일반적으로 지나치게 높은 모르폴리노 농도 또는 이식 중 배아 손상으로 인해 발생합니다. 여기서 설명한 바와 같이 생식선 이식 실험은 전형적으로 실험자의 경험에 따라 기증자 배아의 60%-80%를 위해 성공적으로 이식된 세균 세포를 가진 6개의 숙주 배아 중 1-2가 귀착될 것이다. 따라서, 40-50 homozygous 기증자 태아에서 세포는 돌연변이 세균 세포를 가진 대략 30명의 개별을 올리기 위하여 200-300 호스트 태아로 이식될 필요가 있습니다.
도 1: 이식 장치의 조립 및 사용. (A) 이식 장치는 Luer 잠금 피팅을 통해 마이크로 피펫 홀더와 가스 가결 주사기를 연결하여 조립된다. 이식용 유리 바늘은 마이크로피펫 홀더에 삽입됩니다. (B) 마이크로 조작기에 장착 된 조립 이식 장치의 사진 (배경 및 라벨이 사진에서 제거되었음을 유의하십시오). (C) 이식 장치를 사용하는 경우, 이식 바늘의 수위가 테이퍼 엔드에 남아 있는지 확인하는 것이 중요하다. (D) 이 장치는 이식 접시의 개별 우물에 놓인 텔레오스트 배아에서 세포를 철수하고 삽입하기 위해 스테레오현미경으로 사용된다. (E) 자궁 외 원인의 생성을 위해, 세포는 기증자 태아 (i-ii)의 동물 극에서 채취되고 호스트 태아 (iii-vi)의 동물 극으로 옮겨져 있습니다. (F) 생식선 이식의 경우, 더 많은 수의 세포가 생식 세포가 있는 기증자 배아(i-ii)의 여백에서 채취된다. 세포는 그 때 호스트 태아의 여백으로 옮겨질 것입니다 (iii-vi). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 세포 이식에 의한 클론 생성. (A) 제브라피쉬 기증자로부터 형광세포(green)를 순차적으로 이식하여 생성되는 이중 클론의 예. 단일 및 이중 클론은 분비된 신호 분자가 현면 적 그라데이션을 형성하는 방법을 연구하는 데 사용할 수 있습니다2,4,5,6. (B) 형질전환 eGFP-발현 메다카 기증자(윔블던)17로부터 세포를 야생형 메다카 숙주로 이식하여 생성된 단일 클론의 예. 배율 막대는 100 μm을 나타냅니다.
도 3: 세포 제거에 의한 크기 감소 배아를 생성합니다. (A) 제거에 의해 세포를 제거하기 전에, YSL은 YSL의 두 개의 반대면에 형광 염료를 주입하여 표지될 수 있다. (B) YSL 주입 후 배아의 예. (C) 크기 감소 배아를 생성하기 위해 동물 극에서 세포를 제거합니다5. (D) 세포 절제 후 배아의 예. YSL은 그대로 유지됩니다. 배율 막대는 100 μm 을 나타냅니다.
그림 4: 생식선 이식. (A) 기증자 세포(녹색)를 숙주의 한계 영역으로 성공적으로 이식한 예. (B) 실패한 이식의 예. 숙주 태아의 노른자는 심하게 손상되었고, 태아는 정상적으로 발전할 수 없을 것입니다. (C) 30hpf에서 성공적으로 이식된 세균 세포는 노른자 확장의 전방 부위에서 고나달 중소에서만 발견될 것이다. (D) 몇몇 GFP 표지된 기증자 세균 세포가 호스트의 미래 gonad를 채우는 성공적인 이식의 예. (E) 실패한 이식의 예. 세균 세포가 gonadal mesoderm에 도달했더라도, 호스트 태아는 가혹하게 변형되고 정상적으로 발전하지 않을 것입니다. (F) 실패한 이식의 예. 올바른 위치로 마이그레이션하지 못한 형광 세균 세포는 생식샘을 다시 채우지 않습니다. 스케일 바는 100 μm을 나타냅니다. D-F의 이미지는 약 50배의 총 배율로 촬영되었습니다 .
Discussion
이식 실험의 성공은 실험자의 미세 운동 능력에 크게 의존합니다. 절차를 성공적으로 수행하려면 연습이 필요합니다. 그러나 여기에 제시 된 악기는 시장에서 다른 사람에 비해 배우고 사용하기가 비교적 쉬우며 일반적으로 며칠 의 연습만 필요합니다.
이식 절차의 성공은 몇 가지 예방 조치를 취함으로써 향상 될 수있다. 한 단계는 마이크로 조작기의 품질이 좋고 원활한 작동이 가능한지 확인하는 것입니다. 스테레오현미경에 더 높은 배율을 가진 안구를 첨가하면 배아에 비해 바늘을 정확하게 배치하는 데 도움이 될 수 있습니다. 잘 번식하는 제브라피쉬 나 메다카를 사용하여 건강한 배아를 획득하고 취급 중 배아를 손상시키지 않도록주의를 기울이면 (특히 비반향 단계 중 및 후) 성공률도 향상됩니다.
지연된 독성 에 대한 문제는 문제를 해결하기가 더 어려울 수 있습니다. 배아가 몇 시간 후에 죽는 경우 - 그러나 이식 직후 - 노른자는 바늘에 의해 손상되었을 수 있습니다 (예를 들어, 너무 깊이 배아를 입력하여), 또는 아마도 세포가 너무 강제로 배출되었다. 지연된 독성 및 배아 죽음은 또한 기증자 세포와 함께 주입된 노른자 또는 세포 파편에서 유래할 수 있습니다; 또 다른 원인은 링어의 솔루션에서 HEPES 버퍼를 악화시킬 수 있습니다. 이러한 문제는 세포를 세척(단계 1.3.8 참조) 또는 버퍼의 신선한 배치를 사용하여 극복할 수 있습니다. 더욱이, 생식선 이식 실험에 있는 변형된 호스트 태아는 지나치게 높은 모르폴리노 사격량에서 유래할 수 있습니다. 숙주의 야생형 세균을 완전히 축축시키기에 충분한 모르폴리노를 사용하는 것이 중요하지만, 동시에 지나치게 높은 모르폴리노 농도를 피해야 합니다. 모든 주입 된 숙주 배아 (일반적인 실험에서 수백)에 걸쳐 일관된 모르폴리노 양은 따라서 생식선 이식의 성공의 열쇠입니다. 이것은 쉽게 보이는 트레이서 염료14와 모르폴리노 주입 믹스를 보충해서 도움이 될 수 있습니다, 이는 모든 배아가 동일한 주사 볼륨을 수신하도록 하기 위하여 형광 스테레오 현미경의 밑에 추적될 수 있는.
이 프로토콜에 기술된 절차는 독점적으로 블라발라 단계 제브라피시 또는 메다카 배아에 있는 세포의 조작을 관련시킵니다, 그러나 미래에, 이식 바늘의 직경 그리고 모양을 변경하여 다른 단계 및 종에 장치를 적응하는 것이 가능할 것입니다.
Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 막스 플랑크 소사이어티의 지원을 받았으며 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 (보조금 계약 번호 637840 (QUANTPATTERN) 및 보조금 계약 no. 863952 (ACE-OF-SPACE)에 따라 유럽 연구 위원회 (ERC)로부터 자금을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 1.0 mm glass capillary, ends cut with filament | To make injection needles | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
References
- Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
- Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
- Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
- Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
- Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , University of Oregon Press. (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
- Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
- Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).
