Summary
Embryological manipulationer såsom extirpation och transplantation av celler är viktiga verktyg för att studera tidig utveckling. Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv transplantation enhet för att utföra dessa manipuleringar i zebrafisk embryon.
Abstract
Klassiska embryologiska manipuleringar, som att ta bort celler och transplantera celler inom eller mellan embryon, är kraftfulla tekniker för att studera komplexa utvecklingsprocesser. Zebrafiskembryon är idealiska för dessa manipuleringar eftersom de är lättillgängliga, relativt stora i storlek och transparenta. Tidigare utvecklade enheter för cellborttagning och transplantation är dock besvärliga att använda eller dyra att köpa. Däremot är transplantationsanordningen som presenteras här ekonomisk, lätt att montera och enkel att använda. I detta protokoll introducerar vi först hanteringen av transplantationsanordningen samt dess montering från kommersiellt och allmänt tillgängliga delar. Vi presenterar sedan tre tillämpningar för dess användning: generering av utomkvedshavande kloner för att studera signalspridning från lokaliserade källor, extirpation av celler för att producera storleksreducerade embryon och könscellstransplantation för att generera moderns zygotiska mutanter. Slutligen visar vi att verktyget också kan användas för embryologiska manipuleringar hos andra arter som den japanska risfiskmedaka.
Introduction
Från de klassiska experimenten av Mangold och Spemann som visade existensen av en organisatör som instruerar bildandet av en embryonal axel1, har transplantation av celler mellan embryon blivit en etablerad teknik för att studera embryonal utveckling2,3,4,5,6,7,8,9,10 . En vanlig installation för transplantation består av en mikrometerstyrd gastät spruta ansluten till en mikropipettehållare genom flexibla slangar och en reservoar fylld med mineralolja12,13. I denna inställning flyttas sprutans kolv genom en skruv. Trycket som genereras på detta sätt överförs till mikropipetten och används för att dra celler ut från ett embryo och deponera dem i ett annat. Denna hydrauliskt drivna enhet består dock av många delar och är mödosam att montera från början. Liknande enheter kan också köpas som en komplett arbetsuppsättning, vanligtvis säljs som manuella mikroinjektorer, och dessa kommersiella versioner kostar vanligtvis mer än 1500 US $. I både den hemgjorda och den kommersiella versionen separeras mikropipetten för embryomanipulation från den tryckgenererande enheten (den gastäta sprutan) genom oljefyllda slangar. Manipulering av mikropipetten och kolvens rörelse måste därför drivas separat med olika händer, vilket minskar genomströmningen och nyttan. Dessutom är enheterna besvärliga att förbereda för transplantation eftersom slangen måste fyllas noggrant med olja samtidigt som man undviker bildandet av bubblor. Här beskriver vi en alternativ pneumatiskt styrd enhet för cellborttagning och transplantation som är billig, lätt att montera och enkel att använda.
Enheten som presenteras här består av en 25 μL gastät spruta utrustad med en mikropipettehållare och kostar mindre än 80 US $ totalt. Enheten monteras enkelt genom att mikropipettens hållare förs in i sprutan via Luer-låskoppling (bild 1A). Enheten monteras sedan direkt på en mikromanipulator, så att användaren kan styra både sin position och suget med en enda hand direkt vid mikromanipulatorn. Detta lämnar bekvämt den andra handen fri att stabilisera och flytta transplantationsfatet som innehåller donator- och värdembryon. Enheten fungerar genom direkt sug med luft och behöver inte fyllas med mineralolja. På grund av de attraktiva krafterna mellan vattnet och glasnålens väggar översätts en stor rörelse i sprutans kolv till en mindre rörelse i vattennivån i nålen, så länge vattennivån är i glasnålens avsmalnande ände. Detta ger exakt kontroll över antalet aspirerade celler och platsen för deras insättning.
För att demonstrera nyttan av denna enhet presenterar vi tre applikationer i zebrafisk (Danio rerio) embryon. Först visar vi hur man genererar lokaliserade källor till utsöndrade signalmolekyler, som kan användas för att studera gradientbildning2,4,6. Här injiceras donatorembryon med mRNA som kodar en fluorescerande märkt signalmolekyl. De fluorescensmärkta donatorcellerna transplanteras sedan till värdembryon av vild typ där bildandet av en signalgradient kan avbildas och analyseras. För det andra beskriver vi hur enheten kan användas för att avlägsna celler genom extirpation för att generera storleksreducerade embryon5,13. Slutligen visar vi hur man robust producerar moderns zygotiska mutanter genom att transplantera celler som bär en ursprunglig bakteriecellsreporter till värdembryon där bakterielinjen hade ablated6,10. I framtiden kan transplantationsanordningen som beskrivs här enkelt anpassas till andra embryologiska manipuleringar som kräver avlägsnande eller transplantation av celler.
Protocol
1. Montering och användning av transplantationsanordningen
- Montering av transplantationsanordningen.
- Anslut Luerspetsen 25 μL gastät spruta och en mikropipettehållare med Luer-låskoppling för att montera transplantationsanordningen (figur 1A).
OBS: Att väta Luerspetsen med en tunn vattenfilm kan bidra till att förbättra anslutningen genom att hålla ihop delarna via vatten vidhäftning och sammanhållning. - Montera enheten direkt på en manuell mikromanipulator (bild 1B). Enheten kan styras med den dominerande handen ensam, vilket frigör den andra handen för ytterligare uppgifter.
- Anslut Luerspetsen 25 μL gastät spruta och en mikropipettehållare med Luer-låskoppling för att montera transplantationsanordningen (figur 1A).
- Förbereder transplantationsnålen.
- Producera en transplantationsnål genom att dra en glaskapillärpipetter (utan filament) med en mikropipettedragare.
- Bryt nålens spets så smidigt som möjligt, eftersom skarpa kanter ökar risken för repor vid transplantation, vilket är dödligt för embryot.
OBS: Spetsen kan enkelt brytas med ett rakblad med raksträcka under ett stereomikroscope. Men att använda en mikroforge gör det möjligt att generera en exakt öppning av önskad storlek. För ectopic source generation är en ytterdiameter på cirka 50-60 μm lämplig. För extirpation och bakterietransplantation bör nålens ytterdiameter mäta cirka 80-90 μm för att öka antalet transplanterade celler. - För in den färdiga nålen i transplantationsanordningen (figur 1A).
- Använda transplantationsanordningen.
- Placera mikromanipulatorn med transplantationsanordningen bredvid ett stereomikroscope (bild 1B).
- Ta bort kolven och sänk transplantationsnålen i transplantationsfatet fyllt med Ringers lösning (se steg 2.2.1) i 45° vinkel tills nålens spets är nedsänkt (bild 1B). Vatten kommer att rusa upp nålen på grund av kapillärverkan.
- Sätt i kolven ungefär halvvägs för att spola ut Ringers lösningar och lämna endast en liten volym vatten i den tunna, avsmalnande delen av nålen (figur 1C).
OBS: Detta är det neutrala läget, och vattennivån ska vara stabil där ett tag (>20 min). Om vattennivån är instabil läcker luften; återanslut Luer-låskopplingen eller byt ut sprutan. - När du använder en transplantationsnål för första gången, täck insidan genom att dra upp äggula från ett offrat embryo och sedan utvisa äggulamaterialet helt. Beläggningen hjälper till att minska cellernas vidhäftning till glaset under efterföljande procedurer.
- Placera försiktigt donatorembryon med hjälp av nålen och placera sedan nålens öppning ortogonal på embryots yta (figur 1D).
OBS: Positionen kommer att vara annorlunda för olika analyser. För ektopisk signalmolekylkällagenerering och cellextirpation kommer detta att vara toppen av djurpolen (figur 1E); För bakterietransplantation kommer detta att vara marginalen (figur 1D, F). - Dra långsamt och försiktigt upp kolven för att dra cellerna i nålen.
OBS: Om cellerna tas upp för snabbt kan de skadas. Om det görs korrekt bör cellerna komma ut som en cylindrisk kolumn. Undvik att ta upp äggula i nålen, eftersom den transplanterade äggulan är giftig för värdembryon. - Stoppa suget genom att försiktigt trycka ner kolven något när önskat antal celler har dragits in. Ta bort nålen från embryot genom att rycka nålen åt sidan i en kort och snabb rörelse. Lämna någon Ringers lösning på vardera sidan av cellkolonnen och begränsa cellerna till nålens avsmalnande ände (figur 1C,D).
OBS: Vätskan framför cellkolonnen hjälper till att tvinga isär cellerna i värdembryon när cellkolonnen deponeras. - Rensa eventuella återstående äggula eller cellrester genom att långsamt flytta kolven upp och ner - medan nålen förblir nedsänkt - för att tvätta cellerna med Ringers lösning. Om det görs korrekt kommer de oskadade cellerna att förbli klibbade tillsammans i en kolumn medan skräpet tvättas bort.
OBS: Stor försiktighet måste iakttas under detta steg eftersom vattennivån stiger förbi nålens avsmalnande ände. Detta kommer att orsaka en plötslig tillströmning av vatten, som kan användas för att tvätta cellerna. Men när vattennivån har passerat den avsmalnande änden kommer den fina kontrollen med kolven att minskas och kolven måste flyttas långsammare och mer noggrant. - Flytta transplantationsfatet med den icke-dominerande handen för att placera nålen ortogonal till ytan (antingen djurstång eller marginal) på värdembryon (figur 1D-F).
- Applicera försiktigt lätt tryck och ge sedan en snabb, skarp rörelse för att genomborra värdembryonets omslutande lager. Var försiktig så att du inte kliar äggulan med nålen.
OBS: Att applicera lätt tryck på embryot genom att försiktigt klämma det mot brunnens väggar ökar embryots ytspänning och underlättar därmed piercingen av det omslutande skiktet. - När nålen är inuti trycker du försiktigt kolven för att extrudera kolonnen av celler i embryot samtidigt som du långsamt drar tillbaka nålen samtidigt (figur 1D-F).
- Rengöring av transplantationsnålen.
- Skölj nålen genom att flytta kolven upp och ner medan nålen är nedsänkt i avjoniserat vatten.
OBS: Om nålen förblir smutsig, skölj den med 10 M natriumhydroxidlösning innan du sköljer den igen med vatten. - Förvara nålen i en lämplig låda för vidare användning.
- Skölj nålen genom att flytta kolven upp och ner medan nålen är nedsänkt i avjoniserat vatten.
2. Generera utomkvedskällor av utsöndrade signalmolekyler i zebrafiskembryon
- Förbereda värd- och donatorembryon.
- Samla nylagda embryon genom att para zebrafisk.
- Dechorionate 1-cellssteg zebrafiskembryon genom att inkubera upp till 100 embryon i 0,5 mg/ml pronaslösning i cirka 15 minuter i en petriskål i små glas (en detaljerad beskrivning av denna procedur har publicerats av Rogers, K. W. et al.14).
OBS: Alternativt kan embryona också dekonrioneras i det höga skedet strax före transplantation (steg 2.2), men detta kräver att de injicerade donatorembryon och oinsprutade värdembryon dechorioneras separat. - Dränk embryona i embryomedium i en 200 ml bägare.
OBS: Dechorionated blastula och gastrula stadium embryon är mycket känsliga. Deras exponerade äggula kommer att hålla fast vid plastytor och brista vid kontakt med luft. Därför måste de förbli helt nedsänkta i embryomedium, överföras med en glasrör och bibehållas i antingen agarosbelagda (1% i embryomedium) plasträtter eller petriskålar i glas. - Töm försiktigt ut det mesta av embryomediet och fyll långsamt bägaren med färskt embryomedium. Den milda agitationen som orsakas på detta sätt kommer att underlätta avlägsnandet av de försvagade kolionerna. Upprepa detta steg 2-3 gånger.
- Överför de dechorionerade embryona med en pasteurpipeett i glas till en agarosbelagd injektionsfat.
OBS: Att flamma spetsen på glaset Pasteur pipetter genom att utsätta den för en Bunsen brännarlåga kan smälta och släta ut kanten, vilket hjälper till att förhindra skador på embryona. - Injicera mRNA-kodningen av det fluorescerande märkta proteinet i en delmängd embryon (en detaljerad beskrivning av detta förfarande har publicerats av Rogers, K. W. et al.14). Injicera mRNA i cellen, inte äggulan, för nästan homogent uttryck. Injicerade embryon kommer att fungera som donatorer, medan oinsprutade embryon kommer att fungera som värdar.
OBS: Mängden och typen av injicerat mRNA beror på den signalmolekyl som studeras och varierar vanligtvis från 20 till 200 pg2,4,5,6 (men kan vara så hög som 1000 pg i vissa fall4). - Överför de injicerade embryona till en agarosbelagd sexbrunnrätt fylld med embryomedium. Inkubera vid 28 °C tills embryona når det tidiga sfärstadiet.
- Transplantera celler för att generera utomkvedskällor.
- Fyll en transplantationsfat (med individuella triangulära kilformade brunnar, se Materialtabell) med Ringers lösning (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; förvara HEPES-bufferten vid 4 °C).
OBS: Kalciumet i Ringers lösning främjar cell vidhäftning och hjälper embryot att läka från transplantationsförfarandet. - Överför embryona till transplantationsfatet.
- Placera värd- och donatorembryon i alternerande kolonner, i varje enskilt fall med djurstången riktad mot transplantationsnålen.
- Utför transplantationen enligt beskrivningen i avsnitt 1.3. För ectopic source transplantation, ta källceller från toppen av djurstången och deponera dem på samma plats i värdembryon (figur 1E).
OBS: Att tvätta cellerna med Ringers lösning enligt steg 1.3.8 är viktigt för den ektopiska källgenereringen för att säkerställa att redan utsöndrade signalmolekyler inte överförs till värden. Transplantera inte för många celler för att säkerställa att källan inte är spridd. En kolonn som är cirka 80 μm i diameter och 100 μm lång är lämplig för många tillämpningar. - Låt värdembryon stanna i Ringers lösning i 30 till 1 timme för att återhämta sig.
- Undersök om cellerna framgångsrikt transplanterades med hjälp av ett fluorescensstereomikroscope (figur 2).
- Efter återhämtning överför du embryona till en agarosbelagd sexbrunnstallrik fylld med embryomedium och inkuberar dem vid 28 °C.
- Fyll en transplantationsfat (med individuella triangulära kilformade brunnar, se Materialtabell) med Ringers lösning (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; förvara HEPES-bufferten vid 4 °C).
3. Generera storleksreducerade embryon genom cellextirpation
- Förbereder embryon för extirpation.
- Samla nylagda embryon från zebrafisk av önskad genotyp.
- Inkubera embryona vid 28 °C tills de når det höga stadiet.
- Dechorionate embryona enligt beskrivningen i steg 2.1.2-2.1.5 när embryona når det höga stadiet.
OBS: I det här exemplet utförs cellextirpation på sfärstadiet. Följaktligen dechorioneras embryon cirka 30 min till 1 h tidigare.
- Valfritt: Märka äggula syncytial lager (YSL).
OBS: Om så önskas, injicera fluorescerande dextrans i YSL innan du extirperar celler. Denna teknik gör det möjligt att avgöra om YSL förblir intakt efter cellborttagning, vilket är viktigt för normal embryogenesis15. Alternativt kan in vitro syntetiserade mRNAs eller proteiner också injiceras i YSL.- Använd en Pasteur-pipett för att överföra de dekonrionerade embryona till en agarosbelagd injektionsfat fylld med embryovatten.
- Orientera embryona i sidled, med blastodermmarginalen riktad mot injektionsnålen (figur 3A).
- Injicera 0,5 nL 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran i YSL, sikta på en region mellan blastodermcellerna och äggulan på ett djup av ungefär en tredjedel av embryots diameter. Injicera alla embryon i en rad.
OBS: Eftersom injektionsnålen inte behöver tränga igenom chorionen är en liten (~ 4 μm) och skarp öppning fördelaktig. - Rotera embryona med 180° så att den motsatta sidan av blastodermmarginalen pekar mot injektionsnålen (figur 3A).
- Injicera ytterligare 0,5 nL 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran i YSL enligt beskrivningen i steg 3,2, 3, vilket ger en total injektionsvolym på 1 nL per embryo.
OBS: Injicering från två sidor möjliggör en jämnare fördelning av fluorescerande dextran inom YSL. - Undersök resultatet av injektionen under ett fluorescensstereomikroscope. Om det görs på rätt sätt kommer fluorescerande signal att begränsas till YSL (figur 3B) och inte vara synlig i blastodermens intercellulära utrymme.
- Extirpating celler
- Fyll en transplantationsfat med Ringers lösning (se steg 2.2.1).
- Överför embryona till transplantationsfatet.
- Rikta embryona med djurstången mot transplantationsnålen (figur 3C).
- Ta försiktigt bort celler från djurpolområdet enligt beskrivningen i steg 1.3.5-1.3.7, vilket minskar blastodermen till önskad storlek.
- Kassera de borttagna cellerna genom att utvisa dem från transplantationsnålen.
- När proceduren är klar, låt embryona stanna i Ringers lösning i 30 min till 1 h för att återhämta sig.
- VALFRITT: Undersök YSL:s integritet under ett fluorescensstereomikroscope (bild 3D).
- Överför embryona till en agarosbelagd tallrik fylld med embryomedium och inkubera dem vid 28 °C.
4. Skapa moderns zygotiska mutanter genom bakteriell transplantation
- Förbereda värd- och donatorembryon.
- Samla nylagda embryon från både muterade och vilda zebrafiskar. Embryon från zebrafisk med muterad bakgrund kommer att fungera som donatorer, medan embryon från zebrafisk med vild bakgrund kommer att fungera som värdar.
OBS: Bakteriell transplantation kräver ett stort antal startembryon (~ 50 för donatorer, ~ 500 för värdar) för att säkerställa ett stort antal framgångsrika könstransplantationer som överlever till vuxen ålder. - Överför embryona till en agarosbelagd injektionsfat med embryomedium med hjälp av en Pasteur-pipett.
OBS: Injektioner görs före dechorionation för att öka genomströmningen. Nålar för injektion genom chorion måste vara trubbiga och ha en större öppning (~ 10 μm) för att förhindra igensättning. - Injicera donatorembryon med 1 nL 100 ng/μL mRNA-kodning GFP med en nos1 3'UTR. Injicera mRNA i äggulan för att öka genomströmningen.
OBS: Nos1 3'UTR stabiliserar mRNA i de ursprungliga könscellerna, vilket gör att könscellerna är starkt fluorescerande när de avbildas 1 dag efter befruktning10. - Injicera värdembryon med 1 nL 0,33 mM (3 μg/μL) återvändsgränd (dnd) morfolino. Injicera morfinin i äggulan för att öka genomströmningen.
OBS: Dnd morpholino blockerar ursprungliga könscellsbildning, vilket säkerställer att värdembryons könscell uteslutande fylls med celler från givaren efter transplantation10. - Överför de injicerade embryona till petriskålar av plast med embryomedium. Inkubera vid 28 °C tills embryona når det höga stadiet.
- Dechorionate embryona enligt beskrivningen i steg 2.1.2-2.1.5 när embryona når det höga stadiet.
- Samla nylagda embryon från både muterade och vilda zebrafiskar. Embryon från zebrafisk med muterad bakgrund kommer att fungera som donatorer, medan embryon från zebrafisk med vild bakgrund kommer att fungera som värdar.
- Transplantation av könsceller
- Fyll en transplantationsfat med Ringers lösning (se steg 2.2.1).
- Överför den dechorionerade sfären till embryon i kupolstadiet till transplantationsfatet.
- Placera värdembryon och donatorembryon i alternerande kolonner för att transplantera cellerna från ett donatorembryon till sex olika värdembryon. Detta ökar chansen att könsceller från ett givet värdembryon framgångsrikt transplanteras.
- Orientera embryona med marginalen mot transplantationsnålen och utför transplantationen enligt beskrivningen i avsnitt 1.3. För könstransplantationer (figur 1D, F) tar källcellerna från marginalen (där de ursprungliga könscellerna finns) och deponerar dem på samma plats i värdembryon.
OBS: Transplantation av en stor kolonn (cirka 80 μm i diameter och 600 μm i längd) ökar chansen att få en framgångsrik bakterietransplantation. - Låt embryot stanna kvar i Ringers lösning i 30 till 1 timme för att återhämta sig när transplantationen är klar.
OBS: Om inte alla donatorembryon förväntas vara homozygösa mutanter - t.ex. om de är resultatet av en heterozygous incross - måste de genotyperas efter transplantation för att bestämma genotypen av värdens transplanterade framtida bakterielinje. Se i så fall till att värd- och donatorembryonens positioner inte blandas ihop under hanteringen. - Använd ett fluorescensstereomikroscope för att undersöka om cellerna har transplanterats framgångsrikt (figur 4A, B).
- Överför embryona till en 24-väl agarosebelagd tallrik. Gruppera alla värdembryon som tog emot celler från samma donator i samma brunn och märka dem därefter. Inkubera dem till nästa dag vid 28 °C.
- Överför vid behov donatorembryon till märkta PCR-remsor för genotypning.
- Screening för lyckade bakterietransplantationer
- Screena värdembryon för framgångsrika könscellertransplantationer under ett fluorescensstereomikroskop cirka 30 h efter befruktning (hpf). Könscellerna finns på spåret ovanför äggulaförlängningen (figur 4C).
OBS: Typiska experiment med enheten och strategin som presenteras här kommer att ha en framgångsgrad på ~ 60%-80% för att få minst ett värdembryon som bär transplanterade könsceller per donatorembryon. En tidigare rapport beskrev en ~10% effektivitet10. - Kassera i tillämpliga fall embryon som tagit emot celler från donatorembryon med en felaktig genotyp. Odla larver med framgångsrikt transplanterade könsceller till vuxen ålder enligt vanliga djurhållningsförhållanden och följa institutionella riktlinjer.
- Screena värdembryon för framgångsrika könscellertransplantationer under ett fluorescensstereomikroskop cirka 30 h efter befruktning (hpf). Könscellerna finns på spåret ovanför äggulaförlängningen (figur 4C).
Representative Results
Framgång och misslyckande i användningen av transplantationsanordningen för de tre applikationer som beskrivs ovan kan lätt bedömas genom visuell inspektion under ett stereomikroscope. Vid framgångsrika transplantationer bör embryot se normalt och liknande ut i form och äggula klarhet till otransplanterade embryon, utan stora tårar i blastoderm. Om embryot är synligt skadat (figur 4B) kommer det inte att utvecklas normalt. Helst bör transplanterade celler som uttrycker en fluorescerande markör visas som en kontinuerlig kolumn när de ses under ett fluorescensstereomikroscope (figur 2A, figur 4A). Om kolonnen är fragmenterad indikerar detta att cellerna klipptes av suget i transplantationsnålen eller att cellernas nedfall gjordes för kraftigt. Detta kan förhindras genom att kolven flyttas långsammare och försiktigt.
Även om transplantationsanordningen huvudsakligen har använts på zebrafiskembryon i blastulastadier5,6, fungerar transplantation och cellextirpation lika bra för dechorionerade blastula-stegembryon från den japanska risfiskmedaka (Oryzias latipes) (figur 2B). Förutom embryodechorionation, som har beskrivits av Porazinski, S. R. et al.17, kan samma förfaranden som beskrivs ovan följas.
I det specifika fallet med bakteriell transplantation kommer en bra transplantation att resultera i ett embryo med en lång horisontell kolonn av celler direkt ovanför äggulamarginalen (figur 4A). Huruvida könsceller framgångsrikt transplanterades kan dock endast bedömas följande dag (figur 4C-F) på grund av bakgrundsuttryck av GFP i blastulastadier (figur 1F). De ursprungliga könscellerna kommer att visas som små fluorescerande sfärer i spåret direkt ovanför äggulaförlängningen (figur 4C-E). Förekomsten av dessa celler på rätt plats indikerar framgångsrika könsceller transplantation. Celler med en annan form är inte könsceller (t.ex. långsträckta celler är vanligtvis muskelceller, figur 4F). Om ursprungliga könsceller finns utanför spåret betyder det också att de har misslyckats med att migrera ordentligt, och de kommer inte att kunna bidra till embryots könscell. Slutligen bör den allmänna morfologin hos transplanterade embryon likna oöversatta embryon (figur 4D). Svansen får inte deformeras och huvudet får inte krympas eller saknade ögon (figur 4E). Dessa defekter beror i allmänhet på alltför höga morpholinokoncentrationer eller av embryoskador under transplantation. Könscellstransplantationsexperiment som beskrivs här resulterar vanligtvis i 1-2 av 6 värdembryon med framgångsrikt transplanterade könsceller för 60-80% av donatorembryon, beroende på experimentörens erfarenhet. Således måste celler från 40-50 homozygous donatorembryon transplanteras till 200-300 värdembryon för att höja cirka 30 individer med muterade könsceller.
Bild 1: Montering och användning av transplantationsanordningen. (A) Transplantationsanordningen monteras genom att en gastät spruta ansluts till en mikropipetthållare genom Luerlåskoppling. Glasnålen för transplantation sätts sedan in i mikropipettenhållaren. B) Fotografi av den monterade transplantationsanordningen monterad på en mikromanipulator (observera att bakgrund och etiketter har tagits bort från bilden). (C) Vid användning av transplantationsanordningen är det viktigt att se till att vattennivån i transplantationsnålen förblir i den avsmalnande änden. D) Anordningen används under ett stereomikroskop för att dra tillbaka och föra in celler från och i teleostembryon som placeras i enskilda brunnar i en transplantationsfat. e) För generering av utomkvedskällor tas celler från djurpolen på ett donatorembryon (i-ii) och överförs till djurpolen på ett värdembryon (iii-vi). F) Vid bakterietransplantation tas ett större antal celler från marginalen hos ett donatorembryon (i-ii), där könscellerna finns. Cellerna överförs sedan till marginalen av värdembryon (iii-vi). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Generera kloner genom celltransplantation. (A) Exempel på en dubbel klon som genereras genom sekventiell transplantation av fluorescerande celler (gröna) från en zebrafiskdonator till ett zebrafisk värdembryon. Enkla och dubbla kloner kan användas för att studera hur utsöndrade signalmolekyler bildar spatiotemporala gradienter2,4,5,6. (B) Exempel på en enda klon som genereras genom transplantation av celler från en transgen eGFP-uttryckande medakadonator (Wimbledon)17 till en medakavärd av vild typ. Skalningsstaplar representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Generera storleksreducerade embryon genom cellutplåning. B) Exempel på ett embryo efter YSL-injektion. C) För att generera storleksreducerade embryon avlägsnas celler från djurpolen genom extirpation5. D) Exempel på ett embryo efter cellextirpation. Observera att YSL förblir intakt. Skalningsstaplar representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bakteriell transplantation. (A) Exempel på framgångsrik transplantation av donatorceller (gröna) till värdens marginella zon. B) Exempel på misslyckad transplantation. Äggulan på värdembryon skadades allvarligt, och embryot kommer inte att kunna utvecklas normalt. (C) Vid 30 hpf kommer framgångsrikt transplanterade könsceller endast att hittas i gonadal mesoderm vid den främre regionen av äggula förlängning. (D) Exempel på en lyckad transplantation där flera GFP-märkta donatorgroddar har befolkat värdens framtida gonad. (E) Exempel på en misslyckad transplantation. Även om könsceller har nått gonadal mesoderm, är värdembryon allvarligt deformerat och kommer inte att utvecklas normalt. F) Exempel på en misslyckad transplantation. Fluorescerande könsceller som inte kunde migrera till rätt plats kommer inte att återbefolka gonaderna. Skalstänger representerar 100 μm. Bilder i D-F togs med en total förstoring på cirka 50x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Framgången för ett transplantationsexperiment beror starkt på experimenterarens finmotoriska färdigheter. För att framgångsrikt utföra förfarandena krävs övning. Det instrument som presenteras här är dock relativt lätt att lära sig och använda jämfört med andra på marknaden, och i allmänhet behövs bara några dagars övning.
Framgången med transplantationsförfarandet kan förbättras genom att vidta flera försiktighetsåtgärder. Ett steg är att se till att mikromanipulatorn är av god kvalitet och kan fungera smidigt. Att tillsätta en okulär med högre förstoring till stereomikroskopet kan hjälpa till att exakt placera nålen i förhållande till embryot. Att använda väl avel zebrafisk eller medaka för att förvärva friska embryon och se till att inte skada embryona under hanteringen (särskilt under och efter dechorionationssteget) kommer också att öka framgångsgraden.
Problem med fördröjd toxicitet kan vara svårare att felsöka. Om ett embryo dör efter några timmar - men inte omedelbart efter transplantation - kan äggulan ha skadats av nålen (t.ex. genom att komma in i embryot för djupt), eller kanske cellerna kastades ut för kraftfullt. Fördröjd toxicitet och embryonal död kan också bero på äggula eller cellrester injicerade tillsammans med donatorcellerna; en annan orsak kan försämra HEPES-bufferten i Ringers lösning. Dessa problem kan övervinnas genom att tvätta cellerna (se steg 1.3.8) eller genom att helt enkelt använda en ny sats buffert. Dessutom kan deformerade värdembryon i könsceller transplantation experiment vara resultatet av alltför höga morpholino koncentrationer. Det är viktigt att använda tillräckligt med morpholino för att helt ablatera värdens vilda könsceller, vilket förhindrar att dessa celler bidrar till avkomman - men samtidigt måste alltför höga morfolinokoncentrationer undvikas. Konsekventa morfinolino mängder över alla injicerade värdembryon (några hundra i ett typiskt experiment) är därför nyckeln till framgång av bakteriella transplantationer. Detta kan hjälpas genom att komplettera morpholino injektionsblandningen med ett väl synligt spårämne14, som kan spåras under ett fluorescensstereomikroscope för att säkerställa att alla embryon får samma injektionsvolym.
De förfaranden som beskrivs i detta protokoll omfattar uteslutande manipuleringar av celler i blastula-stadium zebrafisk eller medaka embryon, men i framtiden kommer det sannolikt att vara möjligt att anpassa enheten till olika stadier och arter genom att ändra diametern och formen på transplantationsnålen.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av Max Planck Society och fick finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 637840 (QUANTPATTERN) och bidragsavtal nr 863952 (ACE-OF-SPACE)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 1.0 mm glass capillary, ends cut with filament | To make injection needles | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
References
- Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
- Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
- Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
- Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
- Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , University of Oregon Press. (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
- Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
- Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).
