Summary

FluorescensMikroskopi til ATP Internalization medieret af makropinocytose i menneskelige tumorceller og tumor-xenografted mus

Published: June 30, 2021
doi:

Summary

Vi udviklede en reproducerbar metode til at visualisere internaliseringen af ikkehydrolyzable fluorescerende adenosin triphosphat (ATP), en ATP surrogat, med høj cellulær opløsning. Vi validerede vores metode ved hjælp af uafhængige in vitro og in vivo assays-human tumor celle linjer og immundefekt mus xenografted med human tumor væv.

Abstract

Adenosin triphosphat (ATP), herunder ekstracellulær ATP (eATP), har vist sig at spille en betydelig rolle i forskellige aspekter af tumorigenese, såsom lægemiddelresistens, epitel-mesenkymal overgang (EMT), og metastaser. Intratumoral eATP er 103 til 104 gange højere i koncentration end i normalt væv. Mens eATP fungerer som en messenger til at aktivere purinergisk signalering for EMT induktion, det er også internaliseret af kræftceller gennem opreguleret makropinocytose, en bestemt type endokytose, til at udføre en bred vifte af biologiske funktioner. Disse funktioner omfatter at levere energi til ATP-kræver biokemiske reaktioner, donere fosfat grupper under signal transduktion, og lette eller fremskynde genekspression som en transskriptionel cofaktor. ATP er let tilgængelig, og dens undersøgelse af kræft og andre områder vil uden tvivl stige. EATP-undersøgelsen er dog stadig på et tidligt stadium, og uløste spørgsmål forbliver ubesvarede, før de vigtige og alsidige aktiviteter, der spilles af eATP og internaliseret intracellulær ATP, kan optrævle fuldt ud.

Disse forfatteres laboratoriers bidrag til disse tidlige eATP-undersøgelser omfatter mikroskopisk billeddannelse af ikke-hydrolyserbar lysstofrørs-ATP, kombineret med lysstofrør med høj og lav molekylvægt, der tjener som makropinocytose og endokytosesporere samt forskellige endokytosehæmmere, til at overvåge og karakterisere eATP-internaliseringsprocessen. Denne billeddannelse modalitet blev anvendt til tumor cellelinjer og immundefekt mus, xenografted med human kræft tumorer, at studere eATP internalisering in vitro og in vivo. Dette papir beskriver disse in vitro og in vivo protokoller, med vægt på at ændre og finjustere assay betingelser, således at makropinocytosis-/endocytosis-medieret eATP internalisering assays kan udføres med succes i forskellige systemer.

Introduction

Den opportunistiske optagelse af intratumoral ekstracellulære (dvs.) næringsstoffer er for nylig blevet udnævnt til et centralt kendetegn for kræftmetabolisme1. Et af disse vigtige næringsstoffer er ATP, da koncentrationen af ieATP er 103 og 104 gange højere end den, der findes i normalt væv, i området på flere hundrede μM til lav mM2,3,4,5. Som et centralt energi- og signalmolekyle spiller ATP en central rolle i cellulær metabolisme i kræft og sunde celler6,7,8. Ekstracellulær ATP er ikke kun involveret i kræftcellevækst, men det fremmer også lægemiddelresistens9. Tidligere ukendt funktioner ATP, såsom hydrotropisk aktivitet, er for nylig blevet identificeret, hvilket implicerer ATP involvering i sygdomme som Alzheimers10. Faktisk ser det ud til, at vores forståelse af ATP og dens funktioner i kræftceller, raske celler og andre syge celler langt fra er komplet. Men på grund af ATP’s ustabilitet og høje omsætning i celler er det teknisk udfordrende at overvåge ATP’s bevægelse på tværs af cellemembranen og ind i cellen.

For at løse dette problem og udfylde behovet for dette forskningsområde blev der udviklet en metode, hvor ikkehydrolyzable fluorescerende ATP (NHF-ATP) (Figur 1) blev brugt som surrogat til at visualisere internaliseringen af ATP og observere den intracellulære rumlige lokalisering af internaliseret ATP, både in vitro og in vivo11,12 . NHF-ATP har vist sig at erstatte endogene ATP til at undersøge ATP bevægelse på tværs af dyrecellemembraner, både i kræft cellelinjer og i human tumorvæv xenografted på immundefekt mus11,12. Desuden blokerede administration af makropinocytosehæmmere til celler eATP-internalisering, hvilket tyder på, at intracellulær optagelse af eATP indebærer en makropinocytotisk mekanisme9,11,12. Denne protokol tillader immunbaseret colabeling mod cellespecifikke proteiner og dermed identifikation af, hvilken celletype internaliserer NHF-ATP. Ved hjælp af in vivo tumor xenografts og høj opløsning mikroskopi, NHF-ATP kan visualiseres rumligt på tværs af vævsprøven og endda inden for en enkelt celle. Disse metoder tillader også kvantitativ analyse, såsom procentdelen af cellulær optagelse, antallet af makropinocytotiske vesikler og internalisering kinetik. Dette papir beskriver i detaljer, hvordan NHF-ATP, der arbejder alene eller sammen med endokritose-tracer fluorescerende dextrans13,14,15,16, kan bruges i forskellige eksperimentelle indstillinger til at studere ATP’s internalisering og intracellulære lokalisering, efter internalisering i celler.

Figure 1
Figur 1: Strukturer af ikkehydrolyzable fluorescerende ATP og tetramethylrhodamin mærket høj molekylvægt fluorescerende dextran. (A) Struktur nhf-ATP. (B) Skematisk repræsentation af HMWFD. Forkortelser: ATP = adenosin triphosphat; NHF-ATP = ikkehydrolyzable fluorescerende ATP; TMR = tetramethylrhodamin; HMWFD = høj molekylvægt fluorescerende dextran. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle procedurer rapporteret heri blev udført i overensstemmelse med Ohio University’s IACUC og med NIH. 1. Udvælgelse af ikkehydrolyzable fluorescerende ATP (NHF-ATP) og dextrans Vælg en fluorophore-konjugeret NHF-ATP (Figur 1A) og endopse tracers, høj og lav molekylvægt fluorescerende dextrans (TMR-HMWFD og TMR-LMWFD) (Figur 1B), baseret på de foretrukne emissionsbølgelængder (f.eks. billedbehandlingssystem udstyret…

Representative Results

In vitro-undersøgelse Intracellulær internalisering af NHF-ATP blev demonstreret ved co-lokalisering af NHF-ATP med HMWFD eller LMWFD (Figur 4). Denne procedures succes afhænger primært af anvendelsen af passende koncentrationer af NHF-ATP og dextrans og af fastsættelsen af den eller desetype (polylyset vs. neutral). For eksempel, for at undersøge makropinocytose, HMWFD blev valgt, da det er internaliseret kun af makropinosomer<sup class=…

Discussion

En metode blev udviklet til rumlig, tidsmæssig og kvantitativ analyse af cellulær internalisering af ikkehydrolyzable ATP. Denne metode er bredt anvendelig til brug i forskellige biologiske systemer, herunder forskellige tumorigenic modeller, som vi leverer teknisk instruktion og repræsentative data. For at opnå fortolkelige data under in vivo ATP-internaliseringsundersøgelser (protokollens afsnit 4) er det afgørende at begrænse den eksperimentelle tid, der er gået fra intratumoral dextran-injektion til …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cryosectioning blev udført på stedet på Ohio University Histopathology Core. Dette arbejde blev delvist støttet af start-up midler (Ohio University College of Arts &Sciences) til C Nielsen; NIH giver R15 CA242177-01 og RSAC-prisen til X Chen.

Materials

A549 cells, human lung epithelial, carcinoma National Cancer Institute n/a Less expensive source
Acetone Fisher Scientific S25904
Aluminum foil, Reynolds Grainger 6CHG6
Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent ThermoFisher P36930
ATP analog Jena Biosciences NK-101
Autoclave, sterilizer Grainger 33ZZ40
Blades, cryostat, high profile C. L. Sturkey, Inc. DT554550
Calipers, vernier Grainger 4KU77
Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free Millipore Sigma 51651C-1000ML
Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor Eppendorf 5810R
Chloroform Acros Organics 423555000
Conical tube, 15 mL VWR 21008-216
Conical tube, 50 mL VWR 21008-242
Coverslips, glass, 12 mm Corning 2975-245
Cryostat, Leica CM1950 Leica Biosystems CM1950
Delicate task wipe, Kim Wipes Kimberly-Clark 34155
Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) Invitrogen D1818 MW = 70,000, Tetramethylrhodamine
Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) Invitrogen D1819
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free Fisher Scientific 11885076
Dry ice Local delivery Custom order
Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software Nikon Custom order
Ethanol Fisher Scientific BP2818-4
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher 16000044
Forceps, Dumont #7, curved Fine Science Tools 11274-20
Forceps, Dumont #5, straight Fine Science Tools 11254-20
Gloves (small, medium, large) Microflex N191, N192, N193
Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) Fisher Scientific 19-046-563
Hemocytometer Daigger EF16034F EA
Incubator, cell culture Eppendorf Galaxy 170 S
Labelling tape Fisher Scientific 159015R
Marking pen, Sharpie (ultra-fine) Staples 642736
Mice, immunodeficient (Nu/J) Jackson Laboratory 2019
Microcentrifuge, accuSpin Micro17 Fisher Scientific 13-100-675
Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) Axygen MCT-150-C
Microscope slide box Fisher Scientific 50-751-4983
Needle, 27 gauge Becton-Dickinson 752 0071
Paintbrush Grainger 39AL12
Paper towels Staples 33550
Paraformaldehyde Acros Organics 416785000
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length Roboz Surgical Instrument Co. RS-6162
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP3991
Pipet tips (10 μL) Fisher Scientific 02-707-438
Pipet tips (200 μL) Fisher Scientific 02-707-411
Pipet tips (1000 μL) Fisher Scientific 02-707-403
Pipets, serological (10 mL) VWR 89130-910
Pippetor, Gilson P2 Daigger EF9930A
Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) Daigger EF9931A
Platform shaker – orbital, benchtop Cole-Parmer EW-51710-23
Positively-charged microscope slides, Superfrost Fisher Scientific 12-550-15
Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. Fisher Scientific 22-079-707
Scissors, surgical – sharp, curved Fine Science Tools 14005-12
Software for image analysis, Nikon Elements Nikon Custom order
Software for image analysis, ImageJ (FIJI) National Institutes of Health n/a Download online (free)
Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory Leica Biosystems 14047740044
Staining tray, 245 mm BioAssay Dish Corning 431111
Syringe, 1 cc Becton-Dickinson 309623
Tape, laboratory, 19 mm width Fisher Scientific 15-901-5R
Timer Fisher Scientific 14-649-17
Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter Fisher Scientific 08-757-100D
Tissue culture flask, 225 cm2 ThermoFisher 159933
Tissue culture plate, 24-well Becton-Dickinson 353226
Tissue embedding mold, stainless steel Tissue Tek 4161
Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) Fisher Scientific 4585
Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% Gibco 25200072
Water bath, Precision GP 2S ThermoFisher TSGP2S

References

  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
  3. Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
  4. Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
  5. Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
  6. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  7. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
  8. Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
  9. Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
  10. Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
  11. Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
  12. Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
  13. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  14. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  15. Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
  16. Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
  17. Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
  18. Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
  19. Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
  20. Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
  21. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
  22. Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
  23. Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
  24. Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
  25. Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).

Play Video

Cite This Article
Nielsen, C. M., Qian, Y., Adhicary, S., Li, Y., Shriwas, P., Wang, X., Bachmann, L., Chen, X. Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice. J. Vis. Exp. (172), e62768, doi:10.3791/62768 (2021).

View Video