Mikropladeføderanalysen tilbyder en økonomisk, høj gennemløbsmetode til kvantificering af flydende fødevareforbrug i Drosophila. En 3D-printet enhed forbinder en 96-brønd mikroplade, hvor fluer er anbragt til en 1536-brønd mikroplade, hvorfra fluer forbruger en fodringsopløsning med et sporstofstof. Opløsningsvolumenfaldet måles spectrophotometrisk.
Kvantificering af fødeindtagelse i Drosophila bruges til at studere de genetiske og fysiologiske fundamenter af forbrugsrelaterede træk, deres miljømæssige faktorer og de toksikologiske og farmakologiske virkninger af mange stoffer. Få metoder, der i øjeblikket er implementeret, kan bruges til måling af høj overførselshastighed. Microplate Feeder Assay (MFA) blev udviklet til kvantificering af forbruget af flydende fødevarer til individuelle fluer ved hjælp af absorbans. I denne analyse, fluer forbruge flydende mad medium fra udvalgte brønde af en 1536-brønd mikroplade. Ved at inkorporere et fortyndet sporstofstof i det flydende fødevaremedium og lægge et kendt volumen i hver brønd afspejler absorbansmålinger af det velerhvervede før og efter forbrug den deraf følgende ændring i volumen (dvs. volumenforbrug). For at muliggøre analyse af høj gennemløb med denne metode blev der designet en 3D-printet kobling, der gør det muligt at sortere fluer individuelt i 96-brønd mikroplader. Denne enhed orienterer præcist 96- og 1536-brønd mikroplader for at give hver flue adgang til op til 4 brønde til forbrug, hvilket muliggør kvantificering af fødevarepræferencer ud over regelmæssigt forbrug. Desuden har enheden barriere strimler, der skifter mellem åbne og lukkede positioner for at give mulighed for kontrolleret indeslutning og frigivelse af en kolonne af prøver ad gangen. Denne metode muliggør høje gennemløbsmålinger af forbruget af vandige opløsninger af mange fluer samtidigt. Det har også potentiale til at blive tilpasset andre insekter og til at screene forbruget af næringsstoffer, toksiner eller lægemidler.
Drosophila melanogaster har set bred anvendelse som en genetisk model organisme til at studere de biologiske fundamenter af fødeindtagelse og træk forbundet med forbrug1. Det anslås, at 65% af menneskets sygdomsfremkaldende gener har funktionelle homologer i fluer, med en betydelig andel af dem, der udtrykkes i funktionelt ækvivalente væv mellem fluer og mennesker2. Desuden gør D. melanogasters størrelse, kort tid mellem generationerne, simpel vedligeholdelse og genetisk tractability det til en attraktiv model for undersøgelser af forbruget af næringsstoffer3,4 og toksikologiske og farmakologiske virkninger af en række stoffer, herunder insekticider5, forurenende stoffer6, lægemidler7og misbrugsmedicin8,9,10.
I mange tilfælde kræver undersøgelsen af sådanne træk præcis kvantificering af forbruget. Metoder til kvantificering af forbruget er forskellige og omfatter CApillary FEeder (CAFE) assay11, MAnual FEeding (MAFE) assay12, Snabel Extension Response (PER) assay13, sporstofstof udvinding14,15, oligonucleotid tracer ekstraktion16,og radio-isotop ekstraktion5,17. De seneste bestræbelser har fokuseret på at øge gennemløbet af disse assays, som i Expresso assay18 eller plade-baserede Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) system19. På trods af deres nytte, disse analyser kan være kompliceret, dyrt, eller arbejdskrævende, hindrer deres anvendelse i høj gennemløb undersøgelser.
Figur 1: Komponenter i mikropladeføderanalysen. (A) 3D-gengivelse af den samlede mikropladeføderanalyse. Den 1536-brønd mikroplade er orienteret af 3D-printet kobling således, at hver brønd af den nederste 96-brønd mikroplade har adgang til fire brønde af den øverste 1536-brønd mikroplade. Adgang til brøndene kan styres ved at justere placeringen af barriere strimler slidset gennem koblingen. (B) En grafisk gengivelse af hver brønd i mikropladeføderanalysen. Forbrugsløsninger opbevares i hver brønd ved hjælp af en forseglingsfilm, der er perforeret for at give adgang til fluen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over procedurerne i mikropladeføderanalysen. Figuren viser et flowdiagram, der svarer til trin 4.1-5.8 i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at overvinde disse forhindringer, microplate Feeder Assay (MFA; Figur 1) blev udviklet. I denne analyse er fluer anbragt individuelt i 96-brønd mikroplader. Hver mikroplade er koblet til en 1536-brønd mikroplade ved hjælp af en brugerdefineret, 3D-printet enhed. Enheden orienterer præcist de to plader, så hver flyve i sin respektive brønd af 96-brøndspladen har adgang til 4 brønde af den 1536-brønd mikroplade. Ved at bruge en bundløs 1536-brønd plade og forsegling film, er løsninger dispenseret i udvalgte brønde og perforeret med præcise 0,25 mm diameter nåle til at give adgang til fluerne. Kritisk, tillader forbrug direkte fra en mikroplade giver mulighed for øjeblikkelig absorbans-baserede målinger ved hjælp af en mikropladelæser. Et fortyndet sporstofstof indarbejdes i forbrugsmediet, og ændringen i absorbansen efter eksponering anvendes til at bestemme det forbrugte volumen (figur 2 og figur 3). Da væsken i hver brønd tilnærmer en kolonne af væske, vil volumetriske forskelle manifestere sig som forskelle i kolonnens højde. (Figur 3A) Ifølge Beer-Lambert lov20:
hvor A er absorbansen, ε er molarabsorptionskoefficienten for den formildende analysand, l er den optiske stilængde, og c er koncentrationen af den formildende analysand. Således, med konstant molar absorption koefficient og koncentration, ændringer i absorbans skyldes udelukkende ændringer i den optiske lys sti, dvs væskeniveauet i en given brønd. Ved at måle absorbansen før og efter eksponering afspejler den proportionale ændring i absorbansen den proportionale ændring i volumen (figur 3B).
Figur 3: Absorbansbaseret kvantificering af brøndvolumen. (A) Hændelseslys af kendt inputintensitet (I0) krydser hver brønd. Dæmpning af lys ved forskellige fyldmængder giver forskellige outputintensiteter(I),der udviser en lineær sammenhæng mellem volumen og absorbans. (B) Empirisk måling af absorbans vs. volumen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Baseret på ændringen i volumen kan mængden af enhver indtaget forbindelse beregnes ud fra dens kendte koncentration i foderopløsningen. De dele, der er nødvendige for analysen er lave i omkostninger og har en høj grad af genanvendelighed, væsentligt at reducere de tilbagevendende omkostninger ved analysen. Således tilbyder denne procedure en overkommelig, høj gennemløbsmetode til præcist kvantificering af forbruget.
Undersøgelsen beskriver en ny protokol til kvantificering af forbruget i Drosophila:Microplate Feeder Assay (MFA). I denne analyse forbruger fluer fra forseglede brønde af en mikroplade på 1536 brønde gennem perforeringer i kontrolleret størrelse (figur 1, figur 2; Supplerende video S.1). Da flydende fødevarer farves og leveres via mikroplade, kan målinger af fødevarens optiske absorbans opnås ved hjælp af et mikropladespektrofotometer (figur 3). På denne måde bestemmes forbruget ved at sammenligne absorbansen før og efter forbrug og derefter anvende denne andel på den kendte mængde, der udleveres før forbrug. Dette blev verificeret empirisk ved at måle absorbansen af forskellige mængder af det farvede medium (figur 3B).
For at udvikle denne analyse var der behov for en anordning, der kunne udnytte den absorberende kvantificering af forbruget. Test fluer i et mikropladeformat er tiltalende, fordi det supplerer den mikroplade, der bruges til at dispensere mad og giver mulighed for fleksibilitet i udvælgelsen fra flere pladeformater (f.eks. 6-, 12-, 48- eller 96-brøndformater) ved at justere koblingsgeometrien. Et 96-brønds mikropladeformat blev valgt for at give mulighed for individuel flyvekultur.
Den 3D-printede enhed (Figur 1) orienterer præcist 1536-brøndsfødepladen med 96-brøndskulturpladen, hvilket giver hver flue adgang til op til 4 brønde af fødepladen til forbrug. Desuden, at give tilstrækkelig tid til distribution af fluer i huset plade og til at kontrollere assay indledning, enheden omfatter tilsende barriere strimler, der indeholder fluerne i deres respektive brønde og forhindre brud. De filer, der er nødvendige for at fremskaffe eller ændre disse dele, leveres (Supplerende filer S.2–S.3) samt de nødvendige fabrikationsinstruktioner for de relevante stykker (Supplerende fil S.4).
MFA giver en simpel høj gennemløbsmetode, der supplerer mere udførlige metoder til at overvåge Drosophila fodringsadfærd18,21,22. MFA tilbyder flere fordele i forhold til andre metoder, der anvendes til at kvantificere fødeindtagelse. Gennemløbet øges ved at kvantificere forbruget ved hjælp af en pladelæser. Dette eliminerer manuelle målinger og undgår manuel dataindtastning. Data er også modtagelige for programmatisk udvinding og behandling. Derudover øger den højere gennemløb det mulige antal biologiske kopier, især sammenlignet med kommunale feederdesign, hvilket øger kraften til at opdage små forskelle i forbruget betydeligt. Ved hjælp af MFA kan en enkelt eksperimentator kvantificere forbruget eller præferencen for over 500 fluer pr. natten over af analysen. Ved overlappende kørsler af analysen, over 2.000 fluer kan testes i en 5-dages periode. Endelig er der langsigtede omkostningsbesparelser på grund af genanvendeligheden af mikroplader og koblinger (Supplerende fil S.5). Ved hjælp af MFA, den anslåede pris pr assay kan være så lavt som $14.80, med en $127.60 up-front omkostninger for udstyret. Ved hjælp af den klassiske CApillary FEeder (CAFE) assay, som kræver dyre præcision mikrokapillærer, den anslåede pris pr assay for et sammenligneligt antal replikper er $46.08. Selv om der på forhånd investeres i at erhverve det nødvendige udstyr, kan reduktionen af tilbagevendende omkostninger føre til betydelige besparelser, navnlig i tilfælde, hvor der udføres gentagne test.
Som med alle analyser har MFA visse begrænsninger. Det kræver først og fremmest adgang til et mikropladespektrofotometer, der kan læse 1536-brønde mikroplader. Derudover gør afhængigheden af absorbansmålinger til kvantificering metoden modtagelig for optisk interferens. Dette manifesterer sig som negative forbrugsværdier for en lille delmængde af testede prøver. Næringsstoffer, lægemidler, lægemidler, eller toksiner af interesse skal også være vandopløselige at være forenelige med analysen.
På trods af sine begrænsninger tilbyder denne metode en høj gennemløbsmetode til kvantificering af forbrugsadfærd i Drosophila. Desuden kunne koblingsanordningen let ændres for at acceptere mange pladeformater, så den kan rumme en række insektarter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) til TFCM og RRHA.
0.25 mm Diameter Needers | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | – | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | – | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | – | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
Polystyrene, Bottomless, 15396-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
Rubber Bands | |||
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |