Summary
Este artigo apresenta um método único para analisar as interações hospedeiro-microbioma usando um novo sistema de cultura de órgãos intestinais para experimentos ex vivo.
Abstract
A estrutura do tecido intestinal facilita interações próximas e mutualísticas entre o hospedeiro e a microbiota intestinal. Essas conversas cruzadas são cruciais para a manutenção da homeostase local e sistêmica; alterações na composição da microbiota intestinal (disbiose) associam-se a uma ampla gama de doenças humanas. Os métodos de dissecar as interações hospedeira-microbiota englobam uma troca inerente entre a preservação da estrutura tecidual fisiológica (ao usar modelos animais in vivo) e o nível de controle sobre os fatores experimentais (como em sistemas simples de cultura celular in vitro). Para lidar com essa troca, Yissachar et al. desenvolveram recentemente um sistema de cultura de órgãos intestinais. O sistema preserva uma construção ingênua de tecido de cólon e mecanismos celulares e também permite um controle experimental rigoroso, facilitando experimentações que não podem ser prontamente realizadas in vivo. É ideal para dissecar respostas de curto prazo de vários componentes intestinais (como elementos epiteliais, imunológicos e neuronais) a perturbações luminais (incluindo micróbios anaeróbicos ou aeróbicos, amostras inteiras de microbiota de camundongos ou humanos, drogas e metabólitos). Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um protocolo otimizado para a cultura de órgãos de múltiplos fragmentos de intestino usando um dispositivo de cultura intestinal feito sob medida. As respostas do hospedeiro às perturbações luminais podem ser visualizadas pela coloração da imunofluorescência de seções de tecido ou fragmentos de tecido de montagem total, hibridização de fluorescência in-situ (FISH) ou imagens de lapso de tempo. Este sistema suporta uma ampla gama de leituras, incluindo sequenciamento de próxima geração, citometria de fluxo e vários ensaios celulares e bioquímicos. No geral, este sistema tridimensional de cultura de órgãos apoia a cultura de grandes tecidos intestinais intactos e possui amplas aplicações para análise de alta resolução e visualização de interações hospedeira-microbiota no ambiente intestinal local.
Introduction
O intestino é um órgão altamente complexo que contém uma ampla gama de tipos celulares (células epiteliais, células do sistema imunológico, neurônios e muito mais) organizado em uma estrutura particular que permite que as células interajam e se comuniquem entre si e com o conteúdo luminoso (microbiota, alimentos, etc.) 1. Atualmente, a caixa de ferramentas de pesquisa disponível para análise de interações host-microbiota inclui culturas in vitro células e modelos in vivo animais2. Os modelos in vivo animal fornecem uma construção fisiológica de tecido3, mas com baixo controle experimental e capacidade limitada de manipular as condições do experimento. Sistemas de cultura in vitro, por outro lado, usam células primárias ou linhas celulares que podem ser complementadas com micróbios4,oferecendo controle rigoroso sobre os parâmetros do experimento, mas não têm a complexidade celular e a arquitetura tecidual. Ensaios in vitro modernos permitem o uso avançado de amostras de tecido humano saudável e patológico, como organoides epiteliais derivados de fontes humanas ou camundongos5,6, e amostras que imitam o microambiente mucosal7. Outro exemplo é o ensaio "intestino em um chip", que inclui a linha celular epitelial cólon humana (Caco2), matriz extracelular e canais microfluidos para imitar a condição fisiológica do intestino invariante8. No entanto, por mais avançados e inovadores que as amostras in vitro possam ser, elas não mantêm uma arquitetura de tecido normal ou uma composição celular ingênua.
Para lidar com isso, Yissachar et al. desenvolveram recentemente um sistema de cultura de órgãos ex vivo 9 (Figura 1) que mantém fragmentos intestinais intactos ex vivo,beneficiando-se das vantagens tanto dos modelos in vivo quanto in vitro. Este sistema de cultura de órgãos ex vivo gut é baseado em um dispositivo de cultura personalizado que suporta uma cultura multiplexada de seis tecidos de cólon, permitindo examinar entradas experimentais em condições comparáveis enquanto controla as entradas e saídas do sistema. Trabalhos recentes demonstraram que esse sistema é valioso para analisar respostas intestinais a bactérias intestinais individuais9, amostras inteiras de microbiota humana10 e metabólitos microbianos11. Este sistema permite, pela primeira vez, o estudo dessas interações entre hospedeiros e microbiotas precoces com alto nível de controle sobre os componentes hospedeiros, microbianos e ambientais. Além disso, permite monitorar e manipular o sistema durante todo o experimento, em tempo real.
Figura 1: Esquemas do dispositivo de cultura intestinal. Todo um fragmento de tecido intestinal é anexado às portas de saída e entrada da câmara (superior), com bombas regulando o fluxo médio dentro do lúmen e na câmara média externa. Todo o dispositivo (inferior) contém 6 dessas câmaras. Este número foi modificado a partir de Yissachar et al. 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal aprovadas pelo comitê de ética para o bem-estar animal.
1. Preparação do experimento
- Fabricação do dispositivo de cultura de órgãos intestinais (3 dias)
- Usando uma impressora 3D, imprima os moldes de plástico reutilizáveis para o dispositivo de cultura de órgãos (o dispositivo tem 6 poços, com 24 pequenos e grandes furos, e para a tampa da tampa do dispositivo) (arquivos 3D conectados).
NOTA: Estes moldes plásticos podem ser usados para fabricação de inúmeros dispositivos. - Insira as agulhas de extremidade bruta (22 G & 18 G) na posição apropriada dentro do molde do dispositivo e lance aproximadamente 20 g de mistura de polidimimetilsiloxano (PDMS) (razão de peso de 1:10, base para catalisador) para um conjunto do dispositivo e da tampa.
- Coloque os moldes em uma câmara de vácuo por 30 minutos, para remover bolhas de ar da mistura PDMS.
- Incubar os moldes a 55 °C durante a noite, para completar a polimerização PDMS.
- Quando o PDMS estiver pronto, retire as agulhas do molde e solte cuidadosamente o dispositivo de cultura e a tampa dos moldes de plástico.
- Remova os resíduos PDMS do contorno do poço usando uma lâmina cirúrgica. Conecte o dispositivo PDMS e a tampa do dispositivo em um vidro de cobertura (micro lâminas de 75 mm x 50 mm) usando adesivo de silício não tóxico e deixe as peças para definir durante a noite (aplique a cola no lado liso do dispositivo).
- Insira doze agulhas de 22 G para o lúmen e doze agulhas de 18 G para o poço. Conserte todas as agulhas no lugar usando silicone e deixe-a definida durante a noite. Insira duas agulhas de 18 G na tampa para obter um fluxo de ar adequado dentro e fora do dispositivo de cultura do órgão intestinal.
- Verifique todas as agulhas quanto a vazamentos usando uma seringa cheia de água. Verifique se não há vazamento dos poços enchendo os poços com água.
- Coloque dois nós cirúrgicos em cada agulha de 22 G que serão conectados ao cólon. Coloque o dispositivo e a tampa em um saco de papel autoclave e esterilize em uma autoclave.
- Usando uma impressora 3D, imprima os moldes de plástico reutilizáveis para o dispositivo de cultura de órgãos (o dispositivo tem 6 poços, com 24 pequenos e grandes furos, e para a tampa da tampa do dispositivo) (arquivos 3D conectados).
- Meio de cultura (0,5 h)
- Em um capuz biológico, misturar o seguinte (em tubo de 50 mL): 37 mL do Meio Modificado de Dulbecco (IMDM) de Iscove, 10 mL de substituição de soro KSR, 1 mL de suplemento B27, 0,5 mL de suplemento N2, 0,5 mL de tampão HEPES de 1 M e 0,5 mL de aminoácidos não essenciais.
- Filtre e armazene o meio completo a 4 °C.
- Tubulação e preparação de ferramentas cirúrgicas
- Corte o comprimento apropriado dos tubos para o lúmen de entrada, bem de entrada, lúmen de saída e saída bem (12 tubos curtos e 12 tubos longos). Conecte um adaptador apropriado a cada lado do tubo.
- Prepare as ferramentas cirúrgicas: tesoura reta, fórceps finos 4x e fórceps afiados de 2x.
- Coloque os tubos e as ferramentas cirúrgicas em um saco de papel autoclave e esterilize-os usando uma autoclave.
- Prepare a entrada luminal (estimulação desejada - bactérias, fezes, drogas, etc.).
- Antes do experimento, determine a carga bacteriana da cultura bacteriana, por diluições seriais12, e cultura sob condições aeróbicas e/ou anaeróbicas.
- Após calcular a carga bacteriana, diluir as culturas bacterianas em meio de cultura tecidual estéril para obter a concentração bacteriana necessária. Para amostras fecais, filtrar usando um coador de 100 μm.
NOTA: Para estimulação não bacteriana (drogas, metabólitos, etc.), diluir a substância à concentração necessária utilizando o meio de cultura intestinal.
2. Preparação de configuração de experimento
- Dentro da incubadora de cultura de órgãos, ligue a unidade de aquecimento e coloque-a a 37 °C.
- Configure as bombas, bem como as seringas de entrada e saída.
- Entrada média de cultura de tecido
- Em uma capa de fluxo biológica ou laminar, encha as seringas de poço de entrada com meio de cultura completa. O volume final depende da duração do experimento e da taxa de fluxo; geralmente 1 mL/h mais meio adicional para expurgo.
- Conecte os tubos às seringas usando o adaptador Luer-lock. Coloque as seringas enchidas nas bombas de seringa.
- Limpe as seringas de entrada. Certifique-se de que o meio do poço flua de todos os tubos para um copo de lixo.
- Entrada luminal
- Encha as seringas de entrada luminal com tratamento de estimulação (bactérias, drogas, etc.). O volume depende da duração do experimento e da taxa de fluxo (geralmente 30 μL/h mais meio adicional para expurgo).
- Conecte os tubos às seringas usando o adaptador Luer-lock. Coloque as seringas enchidas nas bombas de seringa.
- Purgue as seringas de entrada. Certifique-se de que a estimulação flua de todos os tubos em um copo de lixo. Tenha cuidado para não contaminar as diferentes estimulações.
- Saídas
- Coloque as seringas vazias nas bombas de seringa de saída (ajuste o modo de bomba para 'retirada').
- Configuração do dispositivo
- Defina a taxa de fluxo do regulador que controla a mistura de gás (95% O2 + 5% CO2) para um fluxo suave e mínimo.
- Examine o dispositivo em um capô laminar.
- Lave as agulhas do dispositivo com IMDM estéril para lavar as agulhas.
- Adicione 500 μL de meio de cultura estéril em cada poço do dispositivo.
- Preparação para dissecção tecidual
- Coloque as ferramentas cirúrgicas estéreis dentro do capô laminar.
- Encha uma seringa de 10 mL com IMDM estéril e conecte uma agulha estéril (autoclaved) de 22 G para descarga do cólon.
3. Culturas de órgãos
- Sacrifício de camundongos e dissecção de tecido
- Em um bairro laminar, sacrifício ratos de 12 a 14 dias de idade por decapitação. Borrife os ratos com 70% de etanol e coloque os ratos em uma placa de plástico.
- Usando tesouras afiadas e fórceps, disseca o rato e retire o trato digestivo do estômago para o ânus cortando toda a gordura e tecidos conjuntivos. Corte o cólon e coloque-o em um prato novo.
NOTA: Minimize o contato com o tecido do cólon. Não toque na parte do meio do tecido do cólon. Segure o tecido suavemente e apenas nas bordas do tecido.
- Lavagem e lavagem de cólon
- Sob um microscópio de dissecção, lave suavemente o teor de cólon com IMDM estéril (no lado proximal) com a seringa preparada de 10 mL (passo 2.7.2). Depois de remover as fezes do tecido intestinal, coloque o cólon em uma nova placa de 6 poços preenchida com 0,5 mL de IMDM estéril.
- Conectando o cólon ao dispositivo
- Pegue o tecido e conecte-o cuidadosamente à agulha de 22 G e faça uma gravata apertada com os dois fios. Neste ponto, é imprescindível manter a orientação correta do cólon para o fluxo de lúmen (proximal = entrada, distal = saída). Repita as etapas 3.2-3.3 para todos os 6 tecidos.
- Verifique se as travas luer da agulha de entrada estão vazias do meio. Se não, esvazie-os. Adicione estímulos à agulha de entrada Trava luer (para evitar a entrada de bolhas de ar no lúmen). Repita esta etapa para cada cólon com a estimulação apropriada.
- Verifique se todos os tecidos estão conectados e coloque a tampa na parte superior do dispositivo.
- Conectando o dispositivo de cultura de órgãos às bombas
- Coloque o dispositivo na câmara pré-aquecida controlada pela temperatura (37 °C).
- Conecte o fluxo de gás
- Conecte o adaptador de gás à tampa da tampa usando a agulha de entrada apropriada.
- Conecte os tubos de entrada e saída ao dispositivo.
NOTA: Conecte o lado do cólon proximal às banheiras de entrada.
- Purgue o lúmen com as entradas de estimulação.
- Flua suavemente a estimulação luminal através do intestino e verifique o fluxo médio nos tubos de saída.
- Lave o meio externo.
- Lave o meio externo 3 vezes (coloque as bombas a uma taxa de 600 μL/min tanto para entrada quanto para saída). Cada lavagem leva 1 min (começando esvaziando o poço).
- Comece a experiência.
- Inicie as bombas nas seguintes taxas:
Taxa de fluxo: lúmen: entrada- 30 μL/h, saída- 35 μL/h
Meio externo: entrada- 1000 μL/h, saída- 950 μL/h
NOTA: O tempo de experiência pode variar entre 30 min e 24 h.
- Inicie as bombas nas seguintes taxas:
- Fim do experimento (até 24 h para culturas de órgãos de cólon)
- Desconecte todos os tubos do dispositivo.
- Desconecte os tecidos das agulhas e continue para as leituras desejadas.
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Representative Results
O sistema de cultura de órgãos intestinais mantém a viabilidade tecidual ex vivo. A avaliação da viabilidade tecidual foi feita durante todo o período cultural. Fragmentos de tecido de cólon foram incubados no sistema de cultura de órgãos intestinais e fixados após a cultura de 2/12/24 h. A integridade da camada da célula epitelial intestinal (IEC) foi validada pela coloração da imunofluorescência usando anticorpos E-cadherin e citokeratin-18. Da mesma forma, foram detectadas células de cálice cheias de muco no epitélio colonico e secreção de muco dentro do lúmen, bem como a proliferação de IEC nas criptas coloniais, conforme indicado pela mancha ki-67(Figura 2). Esses resultados e outros9 mostram que o sistema de cultura intestinal mantém a função intestinal e a estrutura ex vivo.
A resposta rápida do hospedeiro transcricional foi desencadeada pela colonização intestinal com bactérias filamentosas segmentadas (SFB). A colonização por dois micróbios intestinais imunomoduladores diferentes foram usados para examinar os eventos iniciais induzidos no intestino. O micróbio primário foi segmentado por bactérias filamentosas (SFB) que foi anteriormente demonstrada para induzir a diferenciação da célula Th17 no intestino delgado13. Os camundongos SFB-negativos spf foram sacrificados e segmentos do intestino delgado (SI) (íleo) foram dissecados e conectados ao sistema de cultura de órgãos intestinais. Como a SFB é difícil de cultivar in vitro14,as culturas de órgãos foram infundidas com a suspensão de pelotas fecais de camundongos monocolonizados SFB15 ou pelotas fecais de camundongos GF como controle. A SFB induziu Th17 através da adesão ao epitélio intestinal13,16. Assim, foi necessária a avaliação da localização espacial da SFB logo após a colonização ex vivo do tecido intestinal. Como mostrado na(Figura 3a),filamentos típicos de SFB foram detectados em estreita associação com o VILLI si usando fluorescência na hibridização situ (FISH), 2 h após a introdução do SFB. Além disso, uma microscopia eletrônica de transmissão apresentou SFB dentro de alguns mícrons da borda do pincel de epitélio SI(Figura 3b). Nesse ponto, Yissachar et al. examinaram se a associação primária da SFB com o epitélio do intestino delgado ativou uma resposta transcricional no tecido. Perfis de expressão genética de amostras de tecido inteiro foram produzidos, em triplicado, 2 h após infusão com SFB. As culturas de controle foram infundidas com suspensões fecais de camundongos monocolonizados GF ou B.fragilis(como um controle não indutor de Th17). A Figura 3c mostra que as mudanças persuadidas pelo SFB foram principalmente de pequena amplitude, em comparação com o controle gf.
Figura 2: O sistema de cultura de órgãos intestinais mantém a viabilidade tecidual ex vivo. Mancha de imunofluorescência de Mucin-2 e Cytokeratin-18 (superior), E-cadherin (meio) e Ki-67 (inferior). Imagens confocal de tecidos e tecidos de cólon recém-dissecados cultivados por 2/12/24 h no dispositivo de cultura de órgãos intestinais. Barra de escala, 40 mm. Este número foi modificado a partir de Yissachar et al. 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Associação mucosa e ativação transcricional rápida de uma assinatura típica pela SFB. (A, B) SFB associa-se ao epitélio intestinal após 2 h no segmento de intestino delgado cultivado visualizado por (A) FISH com uma sonda específica SFB (vermelho) ou (B) microscopia eletrônica. (C) Indução da expressão genética intestinal pela SFB. As culturas de órgãos SI foram infundidas com micróbios contendo sobrenascer de fezes de camundongos monocolonizados SFB ou controles GF e cultivadas por 2 h antes do perfil de microarray de expressão genética em todo o tecido. Modificações na expressão genética em um ''enredo vulcão'' comparando culturas infundidas SFB ou GF. As transcrições para cima ou para baixo reguladas pela SFB em todo o SI in vivo são destacadas (vermelho e azul, respectivamente). Este número foi modificado a partir de Yissachar et al. 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve um protocolo otimizado para culturas de órgãos ex vivo gut que Yissachar et al. desenvolveram recentemente (dados publicados9 e inéditos). O sistema de cultura de órgãos intestinais suporta a cultura multiplexada de fragmentos intestinais intactos, mantendo o fluxo luminal. Fornece controle total sobre o ambiente intra e extra-luminal (incluindo dose de estimulação, tempo de exposição e taxa de fluxo) e preserva a estrutura ingênua do tecido intestinal e sua complexidade celular9.
As etapas críticas do protocolo incluem o seguinte. (1) A dissecção tecidual deve ser realizada em tempo mínimo e muito suavemente, para minimizar os danos teciduais (que podem levar à morte celular e ao vazamento de conteúdo luminal através de locais danificados). (2) Mantenha a orientação tecidual no dispositivo conectando a porta de entrada ao cólon proximal e a porta de saída à extremidade distal do cólon. (3) Depois de conectar o intestino ao dispositivo, certifique-se de que o tecido está intacto e que a conexão aponta para as portas intra-luminal não estão vazando. Isso manterá a estimulação bacteriana dentro do lúmen e não contaminará o ambiente externo, que deve ser mantido o mais estéril possível. (4) Os tecidos devem ser dissecados de camundongos de 12 a 14 dias. Em camundongos mais jovens, o cólon é menor e mais suave e requer diferentes condições de manuseio e cultura (dados não mostrados). Tecidos de camundongos mais velhos são significativamente maiores, o que afeta a viabilidade tecidual e a duração da cultura. (5) Para reduzir a variabilidade nas respostas intestinais, utilize tecidos dissecados de camundongos de ninhadas em cada dispositivo (reduza a variabilidade na composição do microbioma endógeno, semelhante ao design experimental in vivo).
As limitações atuais do sistema de cultura intestinal incluem o seguinte. (1) Cada dispositivo contém seis canais, que limitam o número de condições diferentes que podem ser testadas em um experimento. (2) Os tecidos devem ser dissecados de camundongos de 12 a 14 dias (ver acima); assim, o sistema imunológico entérico e a barreira epitelial não atingiram o amadurecimento final. (3) A viabilidade tecidual na cultura é prejudicada se a duração da cultura exceder 24 h (para tecidos de cólon, menos para intestino delgado). (4) Este protocolo requer a compra de equipamentos especiais (ou seja, bombas de seringa, incubadora personalizada, entre outros).
Em resumo, o sistema de cultura de órgãos intestinais serve como um passo experimental intermediário entre ensaios in vitro simples para experimentos in vivo complexos. Oferece uma combinação de alta controlabilidade (como em ensaios in vitro simples) com preservação da fisiologia intestinal (muito se assemelha a modelos in vivo) - uma vantagem significativa e única deste sistema. Essa vantagem facilita experimentações que não podem ser prontamente realizadas em camundongos (ou seja, o rastreamento de respostas precoces de células residentes pelo intestino em alta resolução temporal). Recentemente, permitiu-nos descobrir algumas conexões surpreendentes entre o microbioma intestinal (micróbios específicos e microbiota inteira derivada do homem) e os sistemas imunológicos e nervosos intestinais9,10. No geral, essa ferramenta poderosa e única pode ser combinada com uma ampla gama de técnicas de leitura (incluindo sequenciamento de última geração, imagem, classificação celular e muito mais) e fornece algumas novas percepções sobre interações hospedeira-microbioma em saúde e doenças.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do passado e presente do laboratório Yissachar por suas valiosas contribuições na otimização do protocolo do sistema de cultura de órgãos intestinais. Agradecemos a Yael Laure pela edição crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Israel Science Foundation (grant No. 3114831), pela Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (grant No. 8165162) e pelo Fundo Gassner para Pesquisa Médica, Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
References
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