Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatiseret mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution ved hjælp af mikrobielt mikrodrøblekultursystem (MMC)

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/62800
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 4, 1,2,6, 1,2,5, 3, 1,2,5
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man bruger det mikrobielle mikrodropletkultursystem (MMC) til at udføre automatiseret mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution. MMC kan dyrke og underdyrke mikroorganismer automatisk og kontinuerligt og overvåge deres vækst online med relativt høj gennemstrømning og god parallelisering, hvilket reducerer arbejdskraft- og reagensforbruget.

Abstract

Konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder har normalt besværlige operationer, lav gennemstrømning, lav effektivitet og stort forbrug af arbejdskraft og reagenser. Desuden har mikropladebaserede dyrkningsmetoder med høj gennemstrømning, der er udviklet i de senere år, dårlig mikrobiel vækststatus og eksperimentparallalisering på grund af deres lave opløste ilt, dårlige blanding og alvorlige fordampning og termiske virkning. På grund af mange fordele ved mikrodråber, såsom lille volumen, høj gennemstrømning og stærk styrbarhed, kan den dråbebaserede mikrofluidiske teknologi overvinde disse problemer, som er blevet brugt i mange former for forskning i mikrobiel dyrkning, screening og evolution med høj gennemstrømning. De fleste tidligere undersøgelser forbliver dog på laboratoriets konstruktion og anvendelse. Nogle centrale spørgsmål, såsom høje driftskrav, høje konstruktionsvanskeligheder og mangel på automatiseret integrationsteknologi, begrænser den brede anvendelse af dråbemikrofluidisk teknologi i mikrobiel forskning. Her blev et automatiseret mikrobielt mikrodråbekultursystem (MMC) med succes udviklet baseret på dråbemikrofluidisk teknologi, der opnåede integration af funktioner som podning, dyrkning, online overvågning, underdyrkning, sortering og prøveudtagning, der kræves af processen med mikrobiel dråbedyrkning. I denne protokol blev vildtype Escherichia coli (E. coli) MG1655 og en methanol-essentiel E. coli-stamme (MeSV2.2) taget som eksempler for at introducere, hvordan man bruger MMC til at udføre automatiseret og relativt høj gennemstrømning mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution i detaljer. Denne metode er nem at betjene, bruger mindre arbejdskraft og reagenser og har høj eksperimentel gennemstrømning og god dataparallensitet, hvilket har store fordele sammenlignet med konventionelle dyrkningsmetoder. Det giver en billig, driftsvenlig og resultatpåståelig eksperimentel platform for videnskabelige forskere til at udføre relateret mikrobiel forskning.

Introduction

Mikrobiel dyrkning er et vigtigt fundament for mikrobiologisk videnskabelig forskning og industrielle anvendelser, som i vid udstrækning anvendes til isolering, identifikation, rekonstruktion, screening og udvikling af mikroorganismer 1,2,3. Konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder bruger hovedsageligt reagensglas, rystekolber og faste plader som dyrkningsbeholdere kombineret med rystende inkubatorer, spektrofotometre, mikropladelæsere og andet udstyr til mikrobiel dyrkning, detektion og screening. Disse metoder har imidlertid mange problemer, såsom besværlige operationer, lav gennemstrømning, lav effektivitet og stort forbrug af arbejdskraft og reagenser. De dyrkningsmetoder med høj kapacitet, der er udviklet i de senere år, er hovedsageligt baseret på mikropladen. Men mikropladen har et lavt niveau af opløst ilt, dårlig blandingsegenskab og alvorlig fordampning og termisk effekt, hvilket ofte fører til dårlig vækststatus og eksperimentparallalisering af mikroorganismer 4,5,6,7; på den anden side skal den udstyres med dyrt udstyr, såsom væskehåndteringsarbejdsstationer og mikropladelæsere, for at opnå automatiseret dyrkning og procesdetektion 8,9.

Som en vigtig gren af mikrofluidisk teknologi er dråbemikrofluidik blevet udviklet i de senere år baseret på traditionelle kontinuerlige flow mikrofluidiske systemer. Det er en diskret flowmikrofluidisk teknologi, der bruger to utilgængelige væskefaser (normalt olie-vand) til at generere dispergerede mikrodråber og fungere på dem10. Fordi mikrodråber har karakteristika som lille volumen, stort specifikt overfladeareal, høj intern masseoverførselshastighed og ingen krydskontaminering forårsaget af opdeling og fordelene ved stærk styrbarhed og høj gennemstrømning af dråber, har der været mange former for forskning, der anvender dråbemikrofluidisk teknologi i dyrkning, screening og udvikling af mikroorganismer med høj gennemstrømning11 . Der er dog stadig en række nøgleproblemer for at gøre dråbemikrofluidisk teknologi populariseret og bredt anvendt. For det første er driften af dråbemikrofluidik besværlig og indviklet, hvilket resulterer i høje tekniske krav til operatørerne. For det andet kombinerer dråbemikrofluidisk teknologi optiske, mekaniske og elektriske komponenter og skal forbindes med bioteknologiske applikationsscenarier. Det er vanskeligt for et enkelt laboratorium eller team at bygge effektive dråbemikrofluidiske kontrolsystemer, hvis der ikke er noget tværfagligt samarbejde. For det tredje kræver det på grund af den lille mængde mikrodråbe (fra picoliter (pL) til mikroliter (μL)) meget vanskelighed at realisere den præcise automatiserede kontrol og onlinedetektion i realtid af dråber til nogle grundlæggende mikrobielle operationer såsom underdyrkning, sortering og prøveudtagning, og det er også vanskeligt at konstruere et integreret udstyrssystem12.

For at løse ovenstående problemer blev der med succes udviklet et automatisk mikrobielt mikrodråbekultursystem (MMC) baseret på dråbemikrofluidisk teknologi13. MMC består af fire funktionelle moduler: et dråbegenkendelsesmodul, et dråbespektrumdetektionsmodul, et mikrofluidisk chipmodul og et prøveudtagningsmodul. Gennem systemintegration og kontrol af alle moduler etableres automatiseret driftssystem, herunder produktion, dyrkning, måling (optisk densitet (OD) og fluorescens), opdeling, fusion, sortering af dråber nøjagtigt, idet der opnås integration af funktioner såsom podning, dyrkning, overvågning, underdyrkning, sortering og prøveudtagning, der kræves ved processen med mikrobiel dråbedyrkning. MMC kan rumme op til 200 replikate dråbedyrkningsenheder på 2-3 μL volumen, hvilket svarer til 200 dyrkningsenheder for rystekolber. Mikrodråbedyrkningssystemet kan opfylde kravene til ikke-kontaminering, opløst ilt, blanding og masseenergiudveksling under vækst af mikroorganismer og opfylde de forskellige behov for mikrobiel forskning gennem flere integrerede funktioner, f.eks. vækstkurvemåling, adaptiv evolution, enkeltfaktoranalyse på flere niveauer og metabolitforskning og -analyse (baseret på fluorescensdetektion)13,14.

Her introducerer protokollen, hvordan man bruger MMC til at udføre automatiseret og mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution i detaljer (figur 1). Vi tog vildtype Escherichia coli (E. coli) MG1655 som et eksempel for at demonstrere vækstkurvemålingen og en methanol-essentiel E. coli-stamme MeSV2.215 for at demonstrere den adaptive udvikling i MMC. Der blev udviklet en driftssoftware til MMC, hvilket gør operationen meget enkel og klar. I hele processen skal brugeren forberede den oprindelige bakterieopløsning, indstille MMC-betingelserne og derefter injicere bakterieopløsningen og relaterede reagenser i MMC' tilstand. Derefter udfører MMC automatisk operationer såsom dråbegenerering, genkendelse og nummerering, dyrkning og adaptiv evolution. Det udfører også online detektion (OD og fluorescens) af dråberne med høj tidsopløsning og viser de relaterede data (som kan eksporteres) i softwaren. Operatøren kan til enhver tid stoppe dyrkningsprocessen i henhold til resultaterne og udtrække måldråberne til efterfølgende forsøg. MMC er let at betjene, bruger mindre arbejdskraft og reagenser og har relativt høj eksperimentel gennemstrømning og god dataparallensitet, hvilket har betydelige fordele sammenlignet med konventionelle dyrkningsmetoder. Det giver en billig, driftsvenlig og robust eksperimentel platform for forskere til at udføre relateret mikrobiel forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Installation af instrument og software

  1. Vælg et rent og sterilt miljø (såsom en ren bænk) som et dedikeret permanent rum til MMC. Installer MMC støt i rummet.
    BEMÆRK: Hold MMC væk fra interferens fra stærke elektriske felter, magnetfelter og stærke varmestrålingskilder. Undgå, at alvorlige vibrationer påvirker de optiske detektionskomponenter. Giv strømforsyningen til AC220 V, 50 HZ til MMC. For detaljer om MMC henvises til tabellen over materialer og hjemmesiden for MMC16.
  2. Installer driftssoftwaren fra filen MMC.zip
    BEMÆRK: Kontakt forfatterne til MMC.zip filen.
    1. Opret en dedikeret mappe, og gem zip-filen i den.
    2. Opret en anden dedikeret mappe som "Installation Directory". Pak MMC.zip ud, og gem filerne i den nye mappe.
      BEMÆRK: Computerkonfigurationen er bedst at opfylde: (1) Windows 7 64-bit operativsystem eller derover; (2) CPU: i5 eller derover; (3) hukommelse: 4 GB eller derover; (4) harddisk: 300 GB eller derover (rotationshastighed større end 7200 o / min eller solid state-disk).

2. Præparater

  1. Tilslut sprøjtenålen (indvendig diameter er 0,41 mm og den ydre diameter er 0,71 mm), hurtigstik A og reagensflaske (figur 2C), og autoklaver dem ved 121 °C i 15 minutter.
    BEMÆRK: Skru hætten på reagensflasken lidt af under steriliseringen. Et par flere reagensflasker kan fremstilles hver gang til brug.
  2. Brug et 0,22 μm polyvinylidenfluoridfilter (PVDF) til at filtrere MMC-olie. Sæt den mikrofluidiske chip (figur 2B) og MMC-olien i den rene bænk på forhånd, og steriliser dem ved ultraviolet bestråling i 30 minutter før brug.
    BEMÆRK: For detaljer om Quick connector A, reagensflaske, MMC-olie og mikrofluidisk chip henvises til tabellen over materialer.
  3. Installer den mikrofluidiske chip
    1. Åbn døren til operationskammeret (figur 2A), og løft den optiske fibersonde.
    2. Juster de elektriske felthuller med de elektriske feltnåle, og placer forsigtigt chippen på chippiedestalen. Indsæt derefter de to positioneringskolonner i positionshullerne, og læg den optiske fibersonde ned (figur 2D).
    3. Tilslut hurtigstikket A på chippen til den tilsvarende port på MMC i henhold til positionsnummeret (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Luk derefter døren til operationskammeret.
  4. Genopfyld MMC-olien (til ca. 80 ml) i olieflasken, og tøm affaldsvæsken i affaldsflasken inden brug.
    BEMÆRK: Affaldsvæsken er normalt organisk affald. Der henvises til regional lovgivning og regulering ved bortskaffelse, med forbehold for ændringer baseret på forsøgsopstilling.

3. Måling af vækstkurve i MMC

  1. Forberedelse til indledende bakterieopløsning
    1. Følg de relaterede standardbestemmelser for at forberede Luria-Bertani (LB) medium og autoklave ved 121 ° C i 15 minutter.
      BEMÆRK: Komponenter af LB-medium: NaCl (10 g/l), gærekstrakt (5 g/l) og trypton (10 g/l).
    2. E. coli MG1655-stammen ud af glycerolstammen tages ud, og den dyrkes i en 50 ml rystekolbe med 10 ml LB-medium i en rystende inkubator (200 o / min) ved 37 °C i 5-8 timer.
      BEMÆRK: Dyrkningstiden afhænger af de specifikke stammer. Det er optimalt at dyrke stammen til den logaritmiske periode/fase.
    3. Fortynd den dyrkede E. coli MG1655-opløsning med frisk medium til en OD600 på 0,05-0,1 for at opnå en indledende bakterieopløsning (forbered ca. 10 ml).
  2. Klik på Initialisering for at initialisere MMC. Når initialiseringsgrænsefladen vises, indstilles dyrkningstemperaturen til 37 °C og den fotoelektriske signalværdi til 0,6 (figur 3A). Initialisering tager cirka 20 minutter.
  3. Tænd UV-lampen (bølgelængde 254 nm) under initialisering.
  4. Injicer den oprindelige bakterieopløsning og MMC-olie i reagensflasken.
    1. Tag en steriliseret reagensflaske ud på den rene bænk og stram hætten.
    2. Brug en steril 10 ml sprøjte til at injicere 3-5 ml MMC-olie fra sprøjtenålen på siderøret. Vip og drej reagensflasken langsomt for at få olien til at infiltrere den indre væg fuldt ud.
    3. Injicer ca. 5 ml indledende bakterieopløsning, og fyld derefter reagensflasken ved at injicere 5-7 ml af olien igen.
    4. Træk det uafhængige hurtigstik A ud, og sæt reagensflaskens hurtigstik A i hurtigstikket B for at fuldføre prøveinjektionen (figur 4A).
  5. Vent på, at initialiseringen slutter, og sluk derefter UV-lampen (bølgelængde 254 nm).
  6. Åbn døren til operationskammeret, og sæt reagensflasken i metalbadet.
  7. Træk C2-stikket på chippen og hurtigstikket A på reagensflasken ud. Tilslut reagensflaskens siderørsstik til C2-stikket og det øverste rørstik til O2-stikket. Luk derefter døren til operationskammeret.
  8. Klik på Vækstkurve for at vælge funktionen af vækstkurvemåling (figur 3A). I parameterindstillingsgrænsefladen skal du indtaste tallet som 15, tænde OD-detektionskontakten og indstille bølgelængden til 600 nm. Klik på Start for at starte dråbegenerering. Det tager cirka 10 minutter.
    BEMÆRK: Her henviser tal til antallet af dråber, der skal genereres. Bølgelængde refererer til bølgelængden af OD, der skal detekteres. Indstil antallet (maksimalt 200) og bølgelængden (350-800 nm) i henhold til eksperimentets krav.
  9. Når der vises et pop op-vindue på hovedgrænsefladen, der beder om "Fjern reagensflasken mellem C2 og O2, skal du klikke på OK-knappen efter færdiggørelsen", skal du åbne døren til operationskammeret for at tage reagensflasken ud og tilslutte C2- og O2-stikkene.
  10. Luk døren, og klik på knappen OK i pop op-vinduet for automatisk at dyrke dråberne og registrere OD-værdierne.
    BEMÆRK: MMC registrerer OD-værdien, når dråben passerer den optiske fibersonde. Derfor afhænger detektionsperioden af antallet af genererede dråber.
  11. Når vækstkurven når den stationære fase, skal du klikke på knappen Dataeksport for at eksportere OD-dataene. Vælg datasparestien, og eksporter OD-værdien, der er registreret i dyrkningsperioden, i .csv formatet, som kan åbnes af passende software (f.eks. Microsoft Excel). Brug derefter en kortlægningssoftware (f.eks. EXCEL og Origin 9.0) til at plotte vækstkurven.
    BEMÆRK: Under dyrkningsprocessen er det til enhver tid muligt at klikke på Dataeksport for at eksportere OD-dataene for alle de aktuelle dråber.

4. Adaptiv udvikling i MMC

  1. Forberedelse til indledende bakterieopløsning
    1. Følg de relaterede standardbestemmelser for at forberede de specielle flydende medium og faste plader til MeSV2.2 og autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter.
      BEMÆRK: For komponenterne i det specielle medium henvises til tabel 1 og materialetabellen.
    2. Dyrk MeSV2.2 ved hjælp af den faste plade (diameter = 90 mm) i en 37 °C inkubator med konstant temperatur i 72 timer. Vælg derefter en uafhængig koloni og dyrk den i en 50 ml rystekolbe med 10 ml af det specielle flydende medium i en rystende inkubator (200 o / min) ved 37 ° C i 72 timer.
    3. Den dyrkede MeSV2.2-opløsning fortyndes med mediet til en OD600 på 0,1-0,2 (sørg for, at det samlede volumen ikke er mindre end 10 ml), og fortsæt med at dyrke den i rystekolben i 5 timer for at opnå den oprindelige bakterieopløsning.
      BEMÆRK: MeSV2.2 er en methanol-essentiel E. coli-stamme . Det specielle flydende medium indeholder 500 mmol/l metanol, hvilket er en stærk belastning for MeSV2.2, hvilket resulterer i meget langsom vækst. Bemærk, at opnåelse af den oprindelige bakterieopløsning her er forskellig fra den, der er beskrevet i trin 3.1.
  2. Initialiser MMC som forklaret i trin 3.2, 3.3 og 3.5.
  3. Tag to steriliserede reagensflasker ud, hvoraf den ene er til den oprindelige bakterieopløsning, og den anden er til det friske medium. Den oprindelige bakterieopløsning (5 ml), frisk medium (12-15 ml) og MMC-olie injiceres i reagensflaskerne som forklaret i trin 3.4.
    BEMÆRK: Da adaptiv evolution er en langsigtet proces, der involverer flere underdyrkninger, skal du opbevare så meget frisk medium som muligt i MMC. Mediet kan ikke genopfyldes under eksperimentets kørsel.
  4. De to reagensflasker installeres i MMC som forklaret i trin 3.6. Installer den ene til den oprindelige bakterieopløsning mellem C2- og O2-stikket og den anden til det friske medium mellem C4- og O4-stikket.
  5. Klik på ALE for at vælge funktionen af adaptiv evolution (figur 3B). Tænd for OD Detection-kontakten i parameterindstillingsgrænsefladen .
  6. Indstil tallet som 50, bølgelængden som 600 nm, koncentrationen som 0%, typen som tid, parameteren som 30 timer og gentagelserne som 99. Klik på Start for at starte dråbegenerering. Det tager cirka 25 minutter.
    BEMÆRK: Her henviser "Koncentration" til den maksimale koncentration af kemiske faktorer til adaptiv evolution. For forskellige dråber er det realiserbart i MMC at indføre forskellige koncentrationer af kemiske faktorer for at give forskellige vækstbetingelser. Beregn de indførte koncentrationer ved hjælp af følgende ligning:
    Equation 1
    Her refererer "C" til koncentrationen af kemiske faktorer indført i dråber; "a" henviser til koncentrationen af kemiske faktorer i reagensflaskerne mellem C4- og O4-stikket »b«: koncentrationen af kemiske faktorer i reagensflaskerne mellem C6- og O6-stikket og "i" henviser til den tilgængelige koncentration. Der er otte koncentrationer tilgængelige i MMC. Da den kemiske faktor her har en enkelt koncentration (500 mmol / l methanol), og det er en af ingredienserne i mediet, installeres kun en reagensflaske, der indeholder den kemiske faktor, her, og koncentrationen er indstillet til 0%. Type refererer til underdyrkningsmåde, som er opdelt i tre typer: tidstilstand, OD-værditilstand og fluorescenstilstand. Førstnævnte betyder at dyrke dråberne i en bestemt periode og derefter underdyrke, mens de to sidstnævnte betyder at dyrke dråberne til foruddefineret OD-værdi / fluorescensintensitet og derefter underdyrke. Parameter refererer til den relaterede parameter, der kræves, når man vælger en underdyrkningsform. Gentagelser refererer til antallet af underdyrkninger.
  7. Fjern reagensflasken, der er anbragt mellem C2- og O2-stikket som forklaret i trin 3.8.
  8. Overhold, om de maksimale OD-værdier for dråberne i hver deldyrkningsperiode er steget betydeligt. Hvis stigningen sker og opfylder eksperimentkravene, skal du klikke på knappen Dataeksport for at eksportere OD-dataene som forklaret i trin 3.9.
    BEMÆRK: Her afhænger underdyrkningsperioden af parameteren. For eksempel, når du indstiller Type som Tid og Parameter som 30 timer, er underdyrkningsperioden 30 timer. I løbet af hver underdyrkningsperiode er der de maksimale OD-værdier for dråberne. Vurder, om den adaptive evolution opfylder forsøgskravene ved forøgelse af maksimale OD-værdier (Stigningen afhænger af stammens faktiske dyrkningsproces, for eksempel øget med mere end 20%).
    FORSIGTIG: Vær opmærksom på, om det lagrede friske medium er opbrugt. Hvis den signifikante stigning ikke er sket, selv efter at mediet er opbrugt, skal du udtrække de bedre voksende dråber og udføre en ny runde af adaptiv evolution.
  9. Uddrag måldråberne fra MMC.
    1. Klik på knappen Screening for at vælge funktionen af dråbeekstraktion (figur 3C). Vælg indstillingen Saml , klik på antallet af måldråber, og klik derefter på OK.
      BEMÆRK: Dråbescreening omfatter "Collect", "Discard" og "Extract seed solution". Ved »ekstraktfrøopløsning« forstås opsamling af de resterende dråber13 efter underdyrkningen.
    2. Vent på, at pop op-vinduet spørger: "Træk CF-hurtigstikket ud og sæt det i EP-røret". Sæt CF-hurtigstikket i mikrocentrifugerøret til opsamling i henhold til softwareprompten, og klik derefter på OK (figur 4D).
    3. Efter 1-2 minutter vises softwaregrænsefladen et nyt vindue, der beder om, "Indsæt stikket tilbage, og klik på OK , hvis det er færdigt". Indsæt derefter CF-hurtigstikket tilbage, og klik på OK for at få MMC til at fortsætte med at køre (figur 4D). Når den næste måldråbe når dråbegenkendelsesstedet, skal du gentage 4.9.2-4.9.3 for at indsamle den.
      BEMÆRK: Når alle måldråberne er indsamlet, vil MMC fortsætte med at dyrke de resterende dråber. Hvis dyrkningen ikke er nødvendig, skal du klikke på Stop for direkte at afslutte operationen.
    4. Uddrag dråben ved hjælp af en 2,5 μL pipette, slip den på 90 mm agarosepladen, og fordel den jævnt med en trekantet glasspredestang med en sidelængde på 3 cm. Dyrk det derefter i en 37 °C inkubator med konstant temperatur i 72 timer.
    5. Vælg 3-5 uafhængige kolonier, og dyrk dem separat i 50 ml rystekolber med 10 ml frisk medium i en rystende inkubator (200 o / min) ved 37 ° C i 48-72 timer. Følg de relaterede standardbestemmelser for at opbevare den dyrkede bakterieopløsning i glycerolrøret til efterfølgende forsøg.

5. Rengør MMC

  1. Når eksperimentet er afsluttet, skal du klikke på Stop for at stoppe alle operationerne. Klik derefter på Rens for at rengøre chippen og rørene. Det tager cirka 15 minutter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol bruger E. coli MG1655 og en MeSV2.2-stamme som eksempler til at demonstrere den mikrobielle dyrkning og methanol-essentielle adaptive evolution med en automatiseret og relativt høj gennemstrømningsstrategi i MMC. Vækstkurvemålingen blev hovedsageligt brugt til at karakterisere mikrobiel dyrkning. Den adaptive evolution blev udført ved automatiseret kontinuerlig underdyrkning og tilsætning af en høj koncentration af methanol som det selektive tryk under hver underdyrkning. Hvorvidt adaptiv evolution var blevet realiseret, blev estimeret gennem variationstendensen for dråbernes maksimale OD-værdi i hver deldyrkningsperiode. MmC's indstillelige parametre og nøjagtighedsparametre er vist i tabel 2.

Resultater af måling af vækstkurve
OD600-værdierne af de 15 dråber, der blev påvist under dyrkningsprocessen, blev eksporteret fra MMC efter dyrkning i ca. 20 timer (figur 5A). Det kan observeres, at påvisningen blev udført ca. hvert 14. minut. Denne detektionsperiode afhænger af antallet af dråber, der genereres, fordi dråberne cykles frem og tilbage i rørene til dyrkning, og detektionsmodulet registrerer kun OD-værdierne (påvisning og beregning af OD-værdi er vist i supplerende figur 1), når dråberne passerer den optiske fibersonde. Derfor er de 14 minutter en meget kort detektionsperiode, hvilket giver en detektionsproces med høj tidsopløsning for at afspejle væksten af mikroorganismer mere præcist.

Ifølge de eksporterede data blev de gennemsnitlige OD600-værdier og standardafvigelsen (SD) på 15 dråber på hvert tidspunkt beregnet, og vækstkurven for E. coli MG1655 blev afbildet (figur 5B). Resultaterne viser, at vækstkurven præsenterer en "S" -form, herunder lagfase, logaritmisk fase og stationær fase, hvilket er meget i overensstemmelse med den klassiske mikrobielle vækstmodel. Samtidig er standardafvigelserne på 15 dråber meget små, hvilket indikerer god vækstkonsistens og parallelitet. Således demonstrerer det fuldt ud MMC's gode mikrobielle dyrknings- og detektionsevne. Desuden blev det også verificeret, at der er lidt krydstale mellem dråber under dyrkning (supplerende figur 2 og supplerende tabel 1).

Resultater af adaptiv evolution
Vi har udført en langsigtet adaptiv udvikling af MeSV2.2 i MMC. På den 18. dag troede vi i henhold til den stigende tendens til de maksimale OD600-værdier af dråberne i hver underdyrkningsperiode fra vækstkurverne, der blev vist på softwaregrænsefladen, at der blev opnået en god adaptiv udvikling i de 50 dråber. OD600-dataene blev eksporteret, og 8 dråber (inklusive dråbe 6) med relativt god vækstpræstation blev ekstraheret13. Figur 6A viser vækstkurverne for 50 dråber i hele den adaptive udviklingsproces. På 18 dage har MMC automatisk udført 13 deldyrkningsoperationer. Det fremgår af figur 6A , at MeSV2.2 vokser langsomt først og hurtigt bagefter, hvilket indikerer sporet af adaptiv evolution i MeSV2.2. For at levere et udvælgelsestryk blev methanolen tilsat MeSV2.2-mediet. Indledningsvis hæmmede methanol cellevæksten. Efter den adaptive udvikling havde de berigede celler, der var tilpasset methanol, en højere vækstrate. Vækstkurven for dråbe 6 i hele den adaptive udviklingsproces blev afbildet separat (figur 6B). De maksimale OD600-værdier i første generation og sidste deldyrkningsperiode var henholdsvis 0,37 og 0,58, steget med 56,8%. Det indikerer, at stammen i dråbe 6 har realiseret en åbenlys adaptiv udvikling.

Efterfølgende blev dråbe 6-stamme og den oprindelige stamme i rystekolber dyrket, og deres vækstkurver blev sammenlignet (figur 6C). Ifølge metoderne i litteraturen17,18 blev de maksimale specifikke vækstrater (μmax) for dråbe 6-stammen og den oprindelige stamme beregnet, som var henholdsvis 0,096 h-1 og 0,072 h-1. Figur 6C viser, at dråbe 6-stammen udviste en højere maksimal specifik væksthastighed (stigende med 54,8%) og havde en højere cellekoncentration i den stationære fase (stigende med 20,0%) end den oprindelige stamme, når den blev dyrket i rystekolber, hvilket yderligere antydede, at den adaptive udvikling i MeSV2.2 er blevet realiseret.

Figure 1
Figur 1: Samlet arbejdsgang for vækstkurvemåling og adaptiv udvikling i MMC. A) Måling af vækstkurve i MMC. For det første dyrkes stammen i rystekolbe for at forberede den oprindelige bakterieopløsning. Derefter injiceres den oprindelige bakterieopløsning i reagensflasken. Generer derefter dråberne i MMC. MMC får dråberne til at cykle frem og tilbage i den mikrofluidiske chip og rør for at dyrke dem. Når dråber passerer detektionsstedet, registreres od-dataene og registreres. Til sidst skal du eksportere dataene til analyse. B) Adaptiv udvikling i MMC. Vælg en enkelt koloni fra agarosepladen og dyrk den i en rystekolbe for at forberede den oprindelige bakterieopløsning. Efter injektion af den oprindelige bakterieopløsning i reagensflasken skal du udføre den adaptive udvikling i MMC. Adaptiv evolution involverer kontinuerlig underdyrkning, som automatisk kan betjenes gennem dråbespaltning og fusion. Efter den adaptive udvikling skal du eksportere dataene til analyse. Måldråber kan ekstraheres og derefter spredes på pladen for at opnå enkelte kolonier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Struktur og væsentlige værktøjer i MMC. A) MMC's eksterne kammer og driftskammer. B) MMC's mikrofluidiske chip. Chippen har syv kanaler (C1-C6 og CF). (C) Reagensflaske. Det har et toprør og et siderør. Før prøven injiceres i reagensflasken, skal den først tilslutte en sprøjtenål til et hurtigt stik A og derefter tilslutte hurtigstikket A til siderøret. D) Installation af den mikrofluidiske chip. Den mikrofluidiske chip er installeret på piedestalen. Derefter forbindes de syv kanaler (C1-C6 og CF) til henholdsvis de tilsvarende porte i MMC (O1-O6 og OF).

1 - Mmc's driftskammer.
2 - Olieflaske indeholdende MMC-olie.
3 - Affaldsflaske til opsamling af affaldsvæske.
4 - UV-lampe (bølgelængde 254 nm) til sterilisering. Denne lampe kan tændes på forhånd for at sterilisere chippen og rørene.
5 - Laser (620 nm) til dråbegenkendelse. Det punkt, hvor laseren bestråles på chippen, er dråbegenkendelsesstedet.
6 - Temperatursonde til måling af temperaturen inde i driftskammeret.
7 - Varmelegeme til driftskammeret. Det kan bruges til at opretholde temperaturen på mikrobiel dyrkning. Temperaturområdet, der kan indstilles, er 25 ± 0,5 °C til 40 ± 0,5 °C.
8 - Optisk fibersonde til måling af OD eller fluorescens af dråber.
9 - Chip piedestal til installation af Microfluidic chip.
10 - Metalbad til fastgørelse af reagensflaskerne og opvarmning af dem for hurtigt at hæve temperaturen på et reagens til temperaturen på mikrobiel dyrkning.
11 - Porte til den mikrofluidiske chip (O1-O6 og OF). Den mikrofluidiske chip er forbundet til MMC gennem disse porte.
12 - Rør til opbevaring og dyrkning af dråber.
13 - Magnetblokke til hurtigt at lokalisere den mikrofluidiske chip under installationen.
14 - Sprøjtenål til injektion af prøverne i reagensflaskerne. Dens indvendige diameter er 0,41 mm, og dens ydre diameter er 0,71 mm.
15 - Hurtigstik A. Tilslut med hurtigstik B.
16 - Hurtigstik B. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Betjeningssoftwaregrænseflade til MMC. (A) Softwarens hovedgrænseflade. (1) Temperatur i driftskammeret. (2) Fotoelektrisk signalværdi af dråbegenkendelse. Når dråben passerer, er signalværdien høj (>2 V). Når olien passerer, er signalværdien lav (<1 V). (3) Valg af funktion. Der er fire funktioner at vælge imellem: vækstkurvemåling (vækstkurve), adaptiv laboratorieudvikling (ALE), enkeltfaktoranalyse på flere niveauer (enfaktor) og tilpasning af operationerne efter eksperimentelle behov (tilpasning). (4) Grænseflade til indstilling af parametre. Indstil de tilsvarende eksperimentelle parametre her efter valg af en funktion. (5) Kommandokørselsområde. (6) Skift af kamera. Kameraet er installeret direkte over chippen, som kan bruges til online at observere dråberne i chippen. (7) Procesvisningsområde. Viser køretiden, overvågningsdata og den handling, der udføres. (B) Parameterindstillingsgrænsefladen for adaptiv evolution. (C) Grænsefladen til screening af dråber. MMC kan automatisk nummerere dråberne. Her kan måldråberne vælges og ekstraheres fra MMC. (D) Kameraobservationsgrænseflade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Prøveinjektion, dråbegenerering og dråbeekstraktion. A) Reagensflasken efter injektion af bakterieopløsning og MMC-olie. Både bakterieopløsningen og MMC-olien injiceres fra siderøret. Oliefasen er i det øverste lag, og bakterieopløsningen er i det nederste lag. Efter injektionen skal du tilslutte hurtigstikket A og B og derefter installere det i MMC. B) Dråbegenerering i den mikrofluidiske chip. For at øge synligheden af dråber blev en rød pigmentopløsning brugt til at demonstrere processen med dråbegenerering. (C) Dråbe opbevaret i røret observeret ved mikroskop. Skalabjælke: 400 μm. (D) Pop-up-vinduesprompter og de tilsvarende handlinger. Når prompten "Træk CF-hurtigstikket ud og læg det i EP-røret" vises, skal du trække CF-stikket ud og sætte det i EP-røret for at samle måldråben; når prompten " Indsæt stikket tilbage" vises, er dråbeopsamlingen afsluttet, indsæt CF-stikket tilbage i OF-porten. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Dataeksport og figurplotning af vækstkurve. (A) Skærmbillede af en del af de eksporterede data. De eksporterede data omfatter hvert registreringstidspunkt for de 15 genererede dråber og de tilsvarende OD600-værdier. B) Vækstkurven for E. coli MG1655 afbildet på grundlag af de eksporterede data. Beregn de gennemsnitlige OD600-værdier og standardafvigelse (SD) på 15 dråber på hvert tidspunkt, og plot vækstkurven. Det er tydeligt at se, at denne vækstkurve omfatter forsinkelsesfasen, logaritmisk fase og stationær fase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Resultater af den adaptive udvikling af MeSV2.2 i MMC. (A) Vækstkurver på 50 dråber i hele den adaptive udviklingsproces. OD600-detektionsdataene for 50 dråber i løbet af den 18-dages adaptive udviklingsproces blev eksporteret fra MMC og plottet. På den 18. dag blev 8 dråber, herunder dråbe 6 ekstraheret. B) Vækstkurven for dråben 6 i hele den adaptive udviklingsproces. De maksimale OD600-værdier i første generation og sidste deldyrkningsperiode var henholdsvis 0,37 og 0,58, steget med 56,8%. C) Sammenligning af dråbe 6-stammen og den oprindelige stamme i rystekolben. Stammen af dråbe 6 og den oprindelige stamme blev dyrket i rystekolber, og vækstkurverne (inklusive SD, n = 3) blev målt. Dette tal er blevet modificeret fra Jian X. J. et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.

Komponenter Koncentration
Na2HPO4·12H2O 6,78 g/l
KH2PO4 3 g/l
NaCl 0,5 g/l
44kr. 1 g/l
vitamin B1 (steriliseret ved filtrering) 0,34 g/l
MgSO4·7H2O 0,049 g/l
CaCl2·2H2O 1,5 mg/l
Mikroelementer:
FeCl3·6H2O 0,5 mg/l
ZnSO4·7H2O 0,09 mg/l
CuSO4·5H2O 0,088 mg/l
MnCl2 0,045 mg/l
CoCl2·6H2O 0,09 mg/l
Gluconat 1,09 g/l
methanol 500 mmol/L
isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid 0,1 mmol/l
streptomycinsulfat 20 μg/ml
kanamycinsulfat 50 μg/ml
Tilsæt ekstra 15 g / l agarose for at forberede fast medium.

Tabel 1: Komponenter i det specielle medium til MeSV2.2.

Justerbare parametre
Parameter Interval
Temperatur af dyrkning 25-40 °C ± 0,5 °C
Antal dråber 0–200
Koncentration af inokulum 13.3–86.7 %
Koncentration af kemisk faktor 8 forskellige koncentrationer, op til den maksimale koncentration af lagret kemisk faktor
Tidspunktet for sub-dyrkning Op til brugeren
Antallet af underdyrkninger Op til brugeren
Bølgelængde af OD-detektion 350-800 nm
Bølgelængde af fluorescensdetektion Ophidselse: 470, 528 nm
Emission: 350-800 nm
Nøjagtighedsparametre
Parameter C.V
Volumen af dråber 1.88%
Koncentration af inokulum <5,0%

Tabel 2: Justerbare parametre og nøjagtighedsparametre for MMC. Justerbare parametre henviser til de parametre, der kan justeres i henhold til brugernes specifikke krav; nøjagtighedsparametre henviser til de parametre, der afspejler nøjagtigheden og reproducerbarheden af de forskellige fluidiske operationer.

Supplerende figur 1: Genkendelse og påvisning af dråber i MMC. A) Bølgeformen af en dråbe i MMC. Denne bølgeform kommer fra MMC-spektrometerets rå spektraldata. Efter behandling af de rå spektrale data i baggrunden vil MMC give den målte OD-værdi. B) OD-beregning af dråber i MMC. I dråbens bølgeform repræsenterer »a« dråbens maksimale længde, »c« repræsenterer den bueformede grænseflade dannet af oliefase og vandfase, og »b« repræsenterer hoveddelen af dråben. Baseret på Lambert-Beer-loven beregnes OD-værdien af dråben ved hjælp af følgende formel: OD-værdi = lg (E / D) × 10. »E«: den gennemsnitlige spektrale signalværdi for oliefasen »D« henviser til den gennemsnitlige spektrale signalværdi for dråbens hoveddel b. Det skal bemærkes, at OD-værdien målt ved MMC er forskellig fra den, der måles med et spektrofotometer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Test af krydstale mellem dråberne. For at kontrollere, om der er krydstale mellem dråberne under den langsigtede dyrkning, blev E. coli MG1655-opløsningen fortyndet til en meget lav koncentration (ifølge Poisson-distribution, λ = 0,1), og derefter blev 200 dråber genereret og dyrket i 5 dage. Efter måling af OD blev det konstateret, at E. coli MG1655 voksede i et lille antal dråber. Og der var næsten ingen bakterievækst i dråberne omkring disse dråber. Resultatet viser også foreløbigt, at der er lidt krydstale mellem dråber. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Stabilitet i dråbegenerering i MMC. Som vist i supplerende figur 1 har dråben en fast bølgeform. MMC's spektrometer genererer et vist antal datapunkter pr. Sekund, så antallet af datapunkter i dråbebølgeformen kan afspejle dråbens størrelse. Den røde farvestofopløsning blev brugt til at generere 397 dråber i MMC, og OD-værdien blev målt. De rå spektrale data blev eksporteret, datapunkterne for hver dråbebølgeform blev talt, og variationskoefficienten (C.V) for dråbedatapunkterne blev beregnet. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Dråbefordampning i MMC. Her blev den røde farvestofopløsning brugt til at generere dråber i MMC, og dråberne blev opbevaret i dyrkningsrøret. Røret blev derefter anbragt i en 37 ° C konstant temperaturinkubator i 30 dage, og dråbelængden blev regelmæssigt målt (tag fotos under et mikroskop og mål længden med en skalastang). Det viser, at dråbens volumen blev reduceret med ca. 12, 3% efter 30 dage, hvilket indikerer, at fordampningen af dråben er meget lille i MMC. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol præsenterer, hvordan man bruger det mikrobielle mikrodropletkultursystem (MMC) til at udføre automatiseret mikrobiel dyrkning og langsigtet adaptiv evolution. MMC er et miniaturiseret, automatiseret og mikrobielt dyrkningssystem med høj gennemstrømning. Sammenlignet med konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder og instrumenter med høj gennemstrømning har MMC mange fordele såsom lavt arbejds- og reagensforbrug, enkel betjening, online detektion (OD og fluorescens), dataindsamling med høj tidsopløsning og overlegen parallelisering. MMC har også nogle særlige fordele, der adskiller sig fra den konventionelle dråbemikrofluidiske teknologi, som normalt bruger pL- og nL-dråberne. De fleste tidligere rapporterede systemer, der brugte pL- og nL-dråber, har dårlig dyrkningsevne og få påviselige parametre (normalt kun fluorescens)18,19,20,21. Selvom der har været nogle platforme, der kan opnå bedre dyrkningsydelse og detektion af flere parametre, er det vanskeligt og kræver en stor indsats. For eksempel rapporterede nogle forskere OD-påvisning af pL-dråber. Det er baseret på billedgenkendelse, som ikke kun har falske positiver, men også har brug for yderligere verifikation af nøjagtighed22. MMC kan dog opnå disse på en relativt enkel måde. MMC bruger mikroliter (μL) dråber, der sjældent rapporteres. MMC's overlegne mikrobielle dyrkningsevne er blevet verificeret, og den kan også direkte detektere OD og fluorescens. På grund af det store volumen af μL-dråberne er dråbegenereringen mindre modtagelig for interferens, hvilket har højere stabilitet. I mellemtiden kan mere forskelligartede operationer udføres i mikroliterdråberne, hvilket fremmer realiseringen af automatiserede operationer. Da dråberne er indkapslingsrum, kan indholdets flygtighed desuden undertrykkes (supplerende tabel 2), hvilket bidrager til at udføre den langsigtede mikrobielle dyrkning og adaptive udvikling, når der findes flygtige stoffer i mellem14. Dette er vanskeligt at opnå i rystekolber og mikroplader.

Visse kritiske punkter i protokollen er dog værd at understrege. For det første skal det bemærkes, at OD-værdien målt ved MMC er forskellig fra værdien for et spektrofotometer, fordi deres optiske banelængder for OD-måling er forskellige (henholdsvis 1 mm og 10 mm). Når MAN sammenligner OD-værdien for MMC med værdien af rystekolben, er det derfor nødvendigt at måle kalibreringskurven13. Heldigvis kræver den adaptive udviklingsproces ikke kalibreringskurver, fordi vi fokuserer på de relative tendenser blandt vækstkurverne. Dernæst udyrkes visse mikroorganismer i MMC. Dråberne er afhængige af overfladespændingen i olie-vand-grænsefladen for at opretholdestabiliteten 23. Hvis mikroorganismerne producerer visse stoffer, der forstyrrer overfladespændingen i olie-vand-grænsefladen, såsom nogle Bacillus subtilis-stammer , der producerer overfladeaktive stoffer24, kan dråberne ikke opretholde stabiliteten. Hvis mediet i sig selv er en hindring for dannelsen af dråber, er det desuden ikke levedygtigt at anvende i MMC, for eksempel meget viskøst medium eller medium, der indeholder store partikler. På nuværende tidspunkt omfatter de arter, vi med succes har dyrket i MMC, E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, gær, Methylobacterium extorquens, Aspergillus oryzae, mikroalger og så videre. Det anbefales at dyrke stammen i MMC til indledende forsøg. Endelig skal stikkene og portene mellem chippen, reagensflasken og MMC'en tilsluttes i nøje overensstemmelse med protokollen. Ellers kan bakterieopløsningen strømme ind i MMC og forurene interiøret. Derudover skal det påpeges, at den nuværende gennemstrømning af MMC er begrænset (0-200) på grund af den tid, det tager for driften af underdyrkning. I fremtiden vil vi optimere kontrolsoftwaren og størrelsen på chippen for at forkorte tiden og forbedre gennemstrømningen. Da MMC er et modulært system, er det kun relaterede dele eller software, der skal udskiftes uden krav om nyt udstyr.

På nuværende tidspunkt kan MMC ikke kun udføre vækstkurvemåling, adaptiv laboratorieudvikling og enkeltfaktoranalyse på flere niveauer, men også bruges til at tilpasse forskellige dråbedriftsprocedurer til at imødekomme eksperimentelle behov. I fremtiden er det nødvendigt yderligere at berige MMC-systemets anvendelsesfunktioner som reaktion på de forskellige behov for mikrobiel forskning, såsom udførelse af multifaktor-ortogonale eksperimenter på flere niveauer, automatisk prøveudtagningsteknologi med flere prøver til samtidig måling af vækstkurverne for flere bakteriearter og nøjagtigt detektere og kontrollere flere parametre (f.eks. opløst ilt (DO) og pH). Samtidig er det også nødvendigt at udvikle flere funktioner inden for mikrobiologi for at anvende MMC på mere praktiske scenarier, såsom optimering af mediumsammensætninger, bestemmelse af minimum hæmmende koncentration (MIC), samdyrkning af mikroorganismer25 osv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project fra National Natural Science Foundation of China (21627812) og Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi takker også professor Julia A. Vorholt (Institut for Mikrobiologi, Biologisk Institut, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) for leveringen af den methanol-essentielle E. coli-stamme version 2.2 (MeSV2.2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PVDF filter membrane Merck Millipore Ltd. SLGPR33RB Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator Haier BCD-289BSW For reagent storage
Agar Becton, Dickinson and Company 214010 For solid plate preparation
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20011160 Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. DL-CJ-INDII For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10007216 Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer Lenovo E450 Software installation and MMC control
Constant temperature incubator Shanghai qixin scientific instrument co., LTD LRH 250 For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10008218 Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance OHAUS AR 3130 For reagent weighing
EP tube Thermo Fisher 1.5 mL For droplet collection
FeCl3·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10011928 Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube Thermo Fisher 2.0 mL For strain preservation
Gluconate Sigma-Aldrich S2054 Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol GENERAL-REAGENT G66258A For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot SANYO Electric MLS3020 For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) Biotopped 420322 Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate Solarbio K8020 Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4 MACKLIN P815661 Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol MACKLIN M813895 Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O BIOBYING 1305715 Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-ALE-OD For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-M/S-OD The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20026118 Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl GENERAL-REAGENT G81793J Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O GENERAL-REAGENT G10267B Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10001518 Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish Corning Incorporated 90 mm For the preparation of solid medium
Pipette eppendorf 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL For liquid handling
Quick connector A Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. — For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-PCB Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask Union-Biotech 50 mL For microbial cultivation
Shaking incubator Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. SKY-210 2B For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate Solarbio S8290 Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD 10 mL Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle OUBEL Hardware Store 22G Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone Oxoid Ltd. LP0042 Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator SANYO Ultra-low MDF-U4086S For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer General Electric Company Ultrospec 3100 pro For the measurement of OD values
Vitamin B1 Solarbio SV8080 Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract Oxoid Ltd. LP0021 Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10024018 Component of the special medium for MeSV2.2.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).

Tags

Bioengineering udgave 180 mikrobielt mikrodrømmekultursystem automatiserede operationer høj gennemstrømning mikrobiel dyrkning adaptiv laboratorieudvikling onlinedetektion
Automatiseret mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution ved hjælp af mikrobielt mikrodrøblekultursystem (MMC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. … More

Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. L., Xing, X. h., Wang, L., Zhang, C. Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC). J. Vis. Exp. (180), e62800, doi:10.3791/62800 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter