Geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie met behulp van microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC)
Summary
Dit protocol beschrijft hoe het Microbial Microdroplet Culture-systeem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie uit te voeren. MMC kan micro-organismen automatisch en continu cultiveren en subcultureren en online hun groei volgen met een relatief hoge doorvoer en goede parallellisatie, waardoor het arbeids- en reagensverbruik wordt verminderd.
Abstract
Conventionele microbiële teeltmethoden hebben meestal omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. Bovendien hebben microplaatgebaseerde teeltmethoden met hoge doorvoer die in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, een slechte microbiële groeistatus en experimentparallellisatie vanwege hun lage opgeloste zuurstof, slechte mengsel en ernstige verdamping en thermisch effect. Vanwege de vele voordelen van microdruppels, zoals een klein volume, een hoge doorvoer en een sterke controleerbaarheid, kan de op druppels gebaseerde microfluïdische technologie deze problemen overwinnen, die is gebruikt in vele soorten onderzoek naar microbiële teelt, screening en evolutie met hoge doorvoer. De meeste eerdere studies bevinden zich echter nog in het stadium van laboratoriumconstructie en -toepassing. Enkele belangrijke kwesties, zoals hoge operationele vereisten, hoge constructiemoeilijkheden en gebrek aan geautomatiseerde integratietechnologie, beperken de brede toepassing van druppelmicrofluïdische technologie in microbieel onderzoek. Hier werd met succes een geautomatiseerd microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie, waarmee de integratie van functies zoals inenting, teelt, online monitoring, subteelt, sortering en bemonstering werd bereikt die vereist zijn voor het proces van microbiële druppelteelt. In dit protocol werden wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 en een methanol-essentiële E. coli-stam (MeSV2.2) als voorbeelden genomen om te introduceren hoe de MMC kan worden gebruikt om geautomatiseerde en relatief hoge doorvoer microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren. Deze methode is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat grote voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en resultaatbetrouwbaar experimenteel platform voor wetenschappelijke onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.
Introduction
Microbiële teelt is een belangrijke basis voor microbiologisch wetenschappelijk onderzoek en industriële toepassingen, die veel wordt gebruikt bij de isolatie, identificatie, reconstructie, screening en evolutie van micro-organismen 1,2,3. Conventionele microbiële teeltmethoden gebruiken voornamelijk reageerbuizen, schudkolven en vaste platen als teeltcontainers, gecombineerd met schudincubators, spectrofotometers, microplaatlezers en andere apparatuur voor microbiële teelt, detectie en screening. Deze methoden hebben echter veel problemen, zoals omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. De teeltmethoden met hoge doorvoer die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, zijn voornamelijk gebaseerd op de microplaat. Maar de microplaat heeft een laag niveau van opgeloste zuurstof, slechte mengeigenschappen en ernstige verdamping en thermisch effect, wat vaak leidt tot een slechte groeistatus en experimentlillaatologie van micro-organismen 4,5,6,7; aan de andere kant moet het worden uitgerust met dure apparatuur, zoals vloeistofbehandelingswerkstations en microplaatlezers, om geautomatiseerde teelt- en procesdetectiete bereiken 8,9.
Als een belangrijke tak van microfluïdische technologie is de afgelopen jaren druppelmicrofluïdica ontwikkeld op basis van traditionele continustromende microfluïdische systemen. Het is een discrete flow microfluïdische technologie die twee onmengbare vloeibare fasen (meestal olie-water) gebruikt om gedispergeerde microdruppels te genereren en erop te werken10. Omdat microdruppels de kenmerken hebben van een klein volume, een groot specifiek oppervlak, een hoge interne massaoverdrachtsnelheid en geen kruisbesmetting veroorzaakt door compartimentering, en de voordelen van sterke controleerbaarheid en hoge doorvoer van druppels, zijn er vele soorten onderzoek geweest waarbij druppelmicrofluïdische technologie wordt toegepast in de teelt, screening en evolutie van micro-organismen met hoge doorvoer11 . Er zijn echter nog steeds een aantal belangrijke problemen om druppelmicrofluïdische technologie populair te maken en op grote schaal toe te passen. Ten eerste is de werking van druppelmicrofluïdica omslachtig en ingewikkeld, wat resulteert in hoge technische vereisten voor operators. Ten tweede combineert druppelmicrofluïdische technologie optische, mechanische en elektrische componenten en moet deze worden geassocieerd met biotechnologische toepassingsscenario’s. Het is moeilijk voor een enkel laboratorium of team om efficiënte druppelmicrofluïdische controlesystemen te bouwen als er geen multidisciplinaire samenwerking is. Ten derde kost het vanwege het kleine volume microdruppels (van picoliter (pL) tot microliter (μL)) veel moeite om de nauwkeurige geautomatiseerde controle en real-time online detectie van druppels te realiseren voor enkele elementaire microbiële bewerkingen zoals subteelt, sortering en bemonstering, en het is ook moeilijk om een geïntegreerd apparatuursysteem te bouwen12.
Om de bovenstaande problemen aan te pakken, werd met succes een automatisch microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie13. Het MMC bestaat uit vier functionele modules: een druppelherkenningsmodule, een druppelspectrumdetectiemodule, een microfluïdische chipmodule en een bemonsteringsmodule. Door de systeemintegratie en -controle van alle modules wordt het geautomatiseerde besturingssysteem inclusief de generatie, teelt, meting (optische dichtheid (OD) en fluorescentie), splitsen, fusie, sortering van druppels nauwkeurig vastgesteld, waardoor de integratie van functies zoals inenting, teelt, monitoring, subteelt, sortering en bemonstering die nodig is voor het proces van microbiële druppelteelt wordt bereikt. MMC kan tot 200 replicerende druppelteelteenheden van 2-3 μL volume bevatten, wat overeenkomt met 200 schudkolf teelteenheden. Het microdruppelteeltsysteem kan voldoen aan de vereisten van niet-contaminatie, opgeloste zuurstof, mengen en massa-energie-uitwisseling tijdens de groei van micro-organismen, en voldoen aan de verschillende behoeften van microbieel onderzoek door middel van meerdere geïntegreerde functies, bijvoorbeeld groeicurvemeting, adaptieve evolutie, single factor multi-level analyse en metabolietonderzoek en -analyse (gebaseerd op fluorescentiedetectie)13,14.
Hier introduceert het protocol hoe de MMC te gebruiken om geautomatiseerde en microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren (figuur 1). We namen wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 als voorbeeld om de groeicurvemeting en een methanol-essentiële E. coli-stam MeSV2.215 aan te tonen om de adaptieve evolutie in MMC aan te tonen. Er is een bedieningssoftware voor MMC ontwikkeld, die de bediening zeer eenvoudig en duidelijk maakt. In het hele proces moet de gebruiker de initiële bacterieoplossing bereiden, de voorwaarden van de MMC instellen en vervolgens de bacterieoplossing en gerelateerde reagentia in de MMC injecteren. Vervolgens zal de MMC automatisch bewerkingen uitvoeren zoals druppelgeneratie, herkenning en nummering, teelt en adaptieve evolutie. Het zal ook online detectie (OD en fluorescentie) van de druppels met een hoge tijdresolutie uitvoeren en de gerelateerde gegevens (die kunnen worden geëxporteerd) in de software weergeven. De operator kan het teeltproces op elk moment stoppen op basis van de resultaten en de doeldruppels extraheren voor volgende experimenten. De MMC is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een relatief hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat aanzienlijke voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en robuust experimenteel platform voor onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol presenteert hoe het microbiële microdruppelcultuursysteem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie op lange termijn uit te voeren. MMC is een geminiaturiseerd, geautomatiseerd en high-throughput microbieel teeltsysteem. In vergelijking met conventionele microbiële teeltmethoden en -instrumenten met hoge doorvoer heeft MMC veel voordelen, zoals een laag arbeids- en reagensverbruik, eenvoudige bediening, online detectie (OD en fluorescentie), gegevensverzameling m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2018YFA0901500), het National Key Scientific Instrument and Equipment Project van de National Natural Science Foundation of China (21627812) en het Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). We danken ook Prof. Julia A. Vorholt (Instituut voor Microbiologie, Afdeling Biologie, ETH Zürich, Zürich 8093, Zwitserland) voor de levering van de methanol-essentiële E. coli stam versie 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
References
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
