Dieses Protokoll beschreibt, wie das mikrobielle Mikrotröpfchenkultursystem (MMC) verwendet wird, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution durchzuführen. MMC kann Mikroorganismen automatisch und kontinuierlich kultivieren und subkultivieren und ihr Wachstum online mit relativ hohem Durchsatz und guter Parallelisierung überwachen, wodurch der Arbeits- und Reagenzienverbrauch reduziert wird.
Herkömmliche mikrobielle Kultivierungsmethoden haben in der Regel umständliche Operationen, einen geringen Durchsatz, eine geringe Effizienz und einen hohen Verbrauch an Arbeitskräften und Reagenzien. Darüber hinaus haben mikrotiterplattenbasierte Hochdurchsatz-Kultivierungsmethoden, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, aufgrund ihres geringen gelösten Sauerstoffs, ihrer schlechten Mischung und ihrer starken Verdunstungs- und Wärmewirkung einen schlechten mikrobiellen Wachstumsstatus und eine schlechte Experimentparallelisierung. Aufgrund vieler Vorteile von Mikrotröpfchen, wie z. B. geringes Volumen, hoher Durchsatz und starke Kontrollierbarkeit, kann die tröpfchenbasierte mikrofluidische Technologie diese Probleme überwinden, die in vielen Arten der Erforschung der mikrobiellen Kultivierung, des Screenings und der Evolution mit hohem Durchsatz eingesetzt wurde. Die meisten früheren Studien befinden sich jedoch noch im Stadium des Laboraufbaus und der Anwendung. Einige Schlüsselthemen, wie hohe betriebliche Anforderungen, hohe Bauschwierigkeiten und das Fehlen automatisierter Integrationstechnologie, schränken die breite Anwendung der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie in der mikrobiellen Forschung ein. Hier wurde erfolgreich ein automatisiertes mikrobielles Mikrotropfenkultursystem (MMC) entwickelt, das auf der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie basiert und die Integration von Funktionen wie Impfung, Kultivierung, Online-Überwachung, Subkultivierung, Sortierung und Probenahme erreicht, die für den Prozess der mikrobiellen Tröpfchenkultivierung erforderlich sind. In diesem Protokoll wurden Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) MG1655 und ein Methanol-essentieller E. coli-Stamm (MeSV2.2) als Beispiele genommen, um vorzustellen, wie die MMC verwendet werden kann, um automatisierte und relativ durchsatzfähige mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution im Detail durchzuführen. Diese Methode ist einfach zu bedienen, verbraucht weniger Arbeit und Reagenzien und hat einen hohen experimentellen Durchsatz und eine gute Datenparallelität, was im Vergleich zu herkömmlichen Anbaumethoden große Vorteile hat. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und ergebnissichere experimentelle Plattform für wissenschaftliche Forscher, um verwandte mikrobielle Forschung durchzuführen.
Die mikrobielle Kultivierung ist eine wichtige Grundlage für die mikrobiologische wissenschaftliche Forschung und industrielle Anwendungen, die bei der Isolierung, Identifizierung, Rekonstruktion, dem Screening und der Evolution von Mikroorganismen weit verbreitet ist 1,2,3. Herkömmliche mikrobielle Kultivierungsmethoden verwenden hauptsächlich Reagenzgläser, Schüttelkolben und feste Platten als Kultivierungsbehälter, kombiniert mit Schüttelinkubatoren, Spektralphotometern, Mikroplattenlesern und anderen Geräten für die mikrobielle Kultivierung, Detektion und das Screening. Diese Methoden haben jedoch viele Probleme, wie umständliche Operationen, geringen Durchsatz, geringe Effizienz und großen Verbrauch von Arbeit und Reagenzien. Die in den letzten Jahren entwickelten Hochdurchsatz-Anbaumethoden basieren hauptsächlich auf der Mikrotiterplatte. Aber die Mikrotiterplatte hat einen geringen Gehalt an gelöstem Sauerstoff, eine schlechte Mischeigenschaft und eine starke Verdampfung und thermische Wirkung, die oft zu einem schlechten Wachstumsstatus und einer Experimentparallelisierung von Mikroorganismen führen 4,5,6,7; Auf der anderen Seite muss es mit teuren Geräten wie Liquid-Handling-Arbeitsplätzen und Mikroplattenlesern ausgestattet werden, um eine automatisierte Kultivierung und Prozesserkennung zu erreichen 8,9.
Als wichtiger Zweig der mikrofluidischen Technologie wurde die Tröpfchenmikrofluidik in den letzten Jahren auf der Grundlage traditioneller mikrofluidischer Systeme mit kontinuierlicher Strömung entwickelt. Es ist eine diskrete mikrofluidische Technologie, die zwei nicht mischbare flüssige Phasen (normalerweise Öl-Wasser) verwendet, um dispergierte Mikrotröpfchen zu erzeugen und an ihnenzu arbeiten 10. Da Mikrotröpfchen die Eigenschaften eines kleinen Volumens, einer großen spezifischen Oberfläche, einer hohen internen Stoffaustauschrate und keiner Kreuzkontamination durch Kompartimentierung sowie die Vorteile einer starken Kontrollierbarkeit und eines hohen Durchsatzes von Tröpfchen aufweisen, gab es viele Arten von Forschungen, die die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie in der Hochdurchsatzkultivierung, dem Screening und der Evolution von Mikroorganismen anwenden11 . Es gibt jedoch immer noch eine Reihe von Schlüsselfragen, um die mikrofluidische Tröpfchentechnologie populär und weit verbreitet zu machen. Erstens ist die Bedienung der Tröpfchenmikrofluidik umständlich und kompliziert, was zu hohen technischen Anforderungen an die Bediener führt. Zweitens kombiniert die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie optische, mechanische und elektrische Komponenten und muss mit biotechnologischen Anwendungsszenarien in Verbindung gebracht werden. Es ist schwierig für ein einzelnes Labor oder Team, effiziente mikrofluidische Tröpfchenkontrollsysteme zu bauen, wenn es keine multidisziplinäre Zusammenarbeit gibt. Drittens ist es aufgrund des geringen Volumens an Mikrotröpfchen (von Picolitor (pL) bis Mikroliter (μL)) sehr schwierig, die präzise automatisierte Steuerung und Echtzeit-Online-Erkennung von Tröpfchen für einige grundlegende mikrobielle Operationen wie Subkultivierung, Sortierung und Probenahme zu realisieren, und es ist auch schwierig, ein integriertes Ausrüstungssystemzu konstruieren 12.
Um die oben genannten Probleme anzugehen, wurde erfolgreich ein automatisches mikrobielles Tröpfchenkultursystem (MMC) entwickelt, das auf der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie13 basiert. Das MMC besteht aus vier Funktionsmodulen: einem Tröpfchenerkennungsmodul, einem Tröpfchenspektrum-Detektionsmodul, einem mikrofluidischen Chipmodul und einem Probenahmemodul. Durch die Systemintegration und Steuerung aller Module wird ein automatisiertes Betriebssystem einschließlich der Erzeugung, Kultivierung, Messung (optische Dichte (OD) und Fluoreszenz), Spaltung, Fusion und Sortierung von Tröpfchen genau etabliert, wodurch die Integration von Funktionen wie Impfung, Kultivierung, Überwachung, Subkultivierung, Sortierung und Probenahme erreicht wird, die für den Prozess der mikrobiellen Tröpfchenkultivierung erforderlich sind. MMC kann bis zu 200 Replikat-Tröpfchen-Kultivierungseinheiten mit einem Volumen von 2-3 μL aufnehmen, was 200 Schüttelkolben-Anbaueinheiten entspricht. Das Mikrotröpfchen-Kultivierungssystem kann die Anforderungen an Nichtkontamination, gelösten Sauerstoff, Vermischung und Massen-Energie-Austausch während des Wachstums von Mikroorganismen erfüllen und die verschiedenen Anforderungen der mikrobiellen Forschung durch mehrere integrierte Funktionen erfüllen, z. B. Wachstumskurvenmessung, adaptive Evolution, Einzelfaktor-Mehrebenenanalyse und Metabolitenforschung und -analyse (basierend auf Fluoreszenzdetektion)13,14.
Hier stellt das Protokoll vor, wie die MMC verwendet werden kann, um automatisierte und mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution im Detail durchzuführen (Abbildung 1). Wir nahmen den Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) MG1655 als Beispiel, um die Messung der Wachstumskurve zu demonstrieren, und einen methanolessentiellen E. coli-Stamm MeSV2.215, um die adaptive Entwicklung in MMC zu demonstrieren. Für MMC wurde eine Bediensoftware entwickelt, die die Bedienung sehr einfach und übersichtlich macht. Während des gesamten Prozesses muss der Benutzer die anfängliche Bakterienlösung vorbereiten, die Bedingungen der MMC festlegen und dann die Bakterienlösung und die zugehörigen Reagenzien in die MMC injizieren. Anschließend führt die MMC automatisch Operationen wie Tröpfchengenerierung, Erkennung und Nummerierung, Kultivierung und adaptive Evolution durch. Es wird auch eine Online-Detektion (OD und Fluoreszenz) der Tröpfchen mit hoher Zeitauflösung durchführen und die zugehörigen Daten (die exportiert werden können) in der Software anzeigen. Der Bediener kann den Kultivierungsprozess je nach den Ergebnissen jederzeit stoppen und die Zieltröpfchen für nachfolgende Experimente extrahieren. Die MMC ist einfach zu bedienen, verbraucht weniger Arbeit und Reagenzien und verfügt über einen relativ hohen experimentellen Durchsatz und eine gute Datenparallelität, was im Vergleich zu herkömmlichen Anbaumethoden erhebliche Vorteile hat. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und robuste experimentelle Plattform für Forscher, um verwandte mikrobielle Forschung durchzuführen.
Dieses Protokoll zeigt, wie das mikrobielle Tröpfchenkultursystem (MMC) verwendet werden kann, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und langfristige adaptive Evolution durchzuführen. MMC ist ein miniaturisiertes, automatisiertes und mikrobielles Hochdurchsatz-Kultivierungssystem. Im Vergleich zu herkömmlichen mikrobiellen Hochdurchsatz-Kultivierungsmethoden und -instrumenten bietet MMC viele Vorteile wie geringen Arbeits- und Reagenzverbrauch, einfache Bedienung, Online-Detektion (OD und Fluoreszenz), hochz…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), dem National Key Scientific Instrument and Equipment Project der National Natural Science Foundation of China (21627812) und dem Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108) unterstützt. Wir danken auch Prof. Julia A. Vorholt (Institut für Mikrobiologie, Departement Biologie, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) für die Bereitstellung des methanolessentiellen E. coli-Stammes Version 2.2 (MeSV2.2).
0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |