Summary

Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit mikrobiellem Mikrotröpfchenkultursystem (MMC)

Published: February 18, 2022
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie das mikrobielle Mikrotröpfchenkultursystem (MMC) verwendet wird, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution durchzuführen. MMC kann Mikroorganismen automatisch und kontinuierlich kultivieren und subkultivieren und ihr Wachstum online mit relativ hohem Durchsatz und guter Parallelisierung überwachen, wodurch der Arbeits- und Reagenzienverbrauch reduziert wird.

Abstract

Herkömmliche mikrobielle Kultivierungsmethoden haben in der Regel umständliche Operationen, einen geringen Durchsatz, eine geringe Effizienz und einen hohen Verbrauch an Arbeitskräften und Reagenzien. Darüber hinaus haben mikrotiterplattenbasierte Hochdurchsatz-Kultivierungsmethoden, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, aufgrund ihres geringen gelösten Sauerstoffs, ihrer schlechten Mischung und ihrer starken Verdunstungs- und Wärmewirkung einen schlechten mikrobiellen Wachstumsstatus und eine schlechte Experimentparallelisierung. Aufgrund vieler Vorteile von Mikrotröpfchen, wie z. B. geringes Volumen, hoher Durchsatz und starke Kontrollierbarkeit, kann die tröpfchenbasierte mikrofluidische Technologie diese Probleme überwinden, die in vielen Arten der Erforschung der mikrobiellen Kultivierung, des Screenings und der Evolution mit hohem Durchsatz eingesetzt wurde. Die meisten früheren Studien befinden sich jedoch noch im Stadium des Laboraufbaus und der Anwendung. Einige Schlüsselthemen, wie hohe betriebliche Anforderungen, hohe Bauschwierigkeiten und das Fehlen automatisierter Integrationstechnologie, schränken die breite Anwendung der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie in der mikrobiellen Forschung ein. Hier wurde erfolgreich ein automatisiertes mikrobielles Mikrotropfenkultursystem (MMC) entwickelt, das auf der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie basiert und die Integration von Funktionen wie Impfung, Kultivierung, Online-Überwachung, Subkultivierung, Sortierung und Probenahme erreicht, die für den Prozess der mikrobiellen Tröpfchenkultivierung erforderlich sind. In diesem Protokoll wurden Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) MG1655 und ein Methanol-essentieller E. coli-Stamm (MeSV2.2) als Beispiele genommen, um vorzustellen, wie die MMC verwendet werden kann, um automatisierte und relativ durchsatzfähige mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution im Detail durchzuführen. Diese Methode ist einfach zu bedienen, verbraucht weniger Arbeit und Reagenzien und hat einen hohen experimentellen Durchsatz und eine gute Datenparallelität, was im Vergleich zu herkömmlichen Anbaumethoden große Vorteile hat. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und ergebnissichere experimentelle Plattform für wissenschaftliche Forscher, um verwandte mikrobielle Forschung durchzuführen.

Introduction

Die mikrobielle Kultivierung ist eine wichtige Grundlage für die mikrobiologische wissenschaftliche Forschung und industrielle Anwendungen, die bei der Isolierung, Identifizierung, Rekonstruktion, dem Screening und der Evolution von Mikroorganismen weit verbreitet ist 1,2,3. Herkömmliche mikrobielle Kultivierungsmethoden verwenden hauptsächlich Reagenzgläser, Schüttelkolben und feste Platten als Kultivierungsbehälter, kombiniert mit Schüttelinkubatoren, Spektralphotometern, Mikroplattenlesern und anderen Geräten für die mikrobielle Kultivierung, Detektion und das Screening. Diese Methoden haben jedoch viele Probleme, wie umständliche Operationen, geringen Durchsatz, geringe Effizienz und großen Verbrauch von Arbeit und Reagenzien. Die in den letzten Jahren entwickelten Hochdurchsatz-Anbaumethoden basieren hauptsächlich auf der Mikrotiterplatte. Aber die Mikrotiterplatte hat einen geringen Gehalt an gelöstem Sauerstoff, eine schlechte Mischeigenschaft und eine starke Verdampfung und thermische Wirkung, die oft zu einem schlechten Wachstumsstatus und einer Experimentparallelisierung von Mikroorganismen führen 4,5,6,7; Auf der anderen Seite muss es mit teuren Geräten wie Liquid-Handling-Arbeitsplätzen und Mikroplattenlesern ausgestattet werden, um eine automatisierte Kultivierung und Prozesserkennung zu erreichen 8,9.

Als wichtiger Zweig der mikrofluidischen Technologie wurde die Tröpfchenmikrofluidik in den letzten Jahren auf der Grundlage traditioneller mikrofluidischer Systeme mit kontinuierlicher Strömung entwickelt. Es ist eine diskrete mikrofluidische Technologie, die zwei nicht mischbare flüssige Phasen (normalerweise Öl-Wasser) verwendet, um dispergierte Mikrotröpfchen zu erzeugen und an ihnenzu arbeiten 10. Da Mikrotröpfchen die Eigenschaften eines kleinen Volumens, einer großen spezifischen Oberfläche, einer hohen internen Stoffaustauschrate und keiner Kreuzkontamination durch Kompartimentierung sowie die Vorteile einer starken Kontrollierbarkeit und eines hohen Durchsatzes von Tröpfchen aufweisen, gab es viele Arten von Forschungen, die die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie in der Hochdurchsatzkultivierung, dem Screening und der Evolution von Mikroorganismen anwenden11 . Es gibt jedoch immer noch eine Reihe von Schlüsselfragen, um die mikrofluidische Tröpfchentechnologie populär und weit verbreitet zu machen. Erstens ist die Bedienung der Tröpfchenmikrofluidik umständlich und kompliziert, was zu hohen technischen Anforderungen an die Bediener führt. Zweitens kombiniert die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie optische, mechanische und elektrische Komponenten und muss mit biotechnologischen Anwendungsszenarien in Verbindung gebracht werden. Es ist schwierig für ein einzelnes Labor oder Team, effiziente mikrofluidische Tröpfchenkontrollsysteme zu bauen, wenn es keine multidisziplinäre Zusammenarbeit gibt. Drittens ist es aufgrund des geringen Volumens an Mikrotröpfchen (von Picolitor (pL) bis Mikroliter (μL)) sehr schwierig, die präzise automatisierte Steuerung und Echtzeit-Online-Erkennung von Tröpfchen für einige grundlegende mikrobielle Operationen wie Subkultivierung, Sortierung und Probenahme zu realisieren, und es ist auch schwierig, ein integriertes Ausrüstungssystemzu konstruieren 12.

Um die oben genannten Probleme anzugehen, wurde erfolgreich ein automatisches mikrobielles Tröpfchenkultursystem (MMC) entwickelt, das auf der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie13 basiert. Das MMC besteht aus vier Funktionsmodulen: einem Tröpfchenerkennungsmodul, einem Tröpfchenspektrum-Detektionsmodul, einem mikrofluidischen Chipmodul und einem Probenahmemodul. Durch die Systemintegration und Steuerung aller Module wird ein automatisiertes Betriebssystem einschließlich der Erzeugung, Kultivierung, Messung (optische Dichte (OD) und Fluoreszenz), Spaltung, Fusion und Sortierung von Tröpfchen genau etabliert, wodurch die Integration von Funktionen wie Impfung, Kultivierung, Überwachung, Subkultivierung, Sortierung und Probenahme erreicht wird, die für den Prozess der mikrobiellen Tröpfchenkultivierung erforderlich sind. MMC kann bis zu 200 Replikat-Tröpfchen-Kultivierungseinheiten mit einem Volumen von 2-3 μL aufnehmen, was 200 Schüttelkolben-Anbaueinheiten entspricht. Das Mikrotröpfchen-Kultivierungssystem kann die Anforderungen an Nichtkontamination, gelösten Sauerstoff, Vermischung und Massen-Energie-Austausch während des Wachstums von Mikroorganismen erfüllen und die verschiedenen Anforderungen der mikrobiellen Forschung durch mehrere integrierte Funktionen erfüllen, z. B. Wachstumskurvenmessung, adaptive Evolution, Einzelfaktor-Mehrebenenanalyse und Metabolitenforschung und -analyse (basierend auf Fluoreszenzdetektion)13,14.

Hier stellt das Protokoll vor, wie die MMC verwendet werden kann, um automatisierte und mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution im Detail durchzuführen (Abbildung 1). Wir nahmen den Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) MG1655 als Beispiel, um die Messung der Wachstumskurve zu demonstrieren, und einen methanolessentiellen E. coli-Stamm MeSV2.215, um die adaptive Entwicklung in MMC zu demonstrieren. Für MMC wurde eine Bediensoftware entwickelt, die die Bedienung sehr einfach und übersichtlich macht. Während des gesamten Prozesses muss der Benutzer die anfängliche Bakterienlösung vorbereiten, die Bedingungen der MMC festlegen und dann die Bakterienlösung und die zugehörigen Reagenzien in die MMC injizieren. Anschließend führt die MMC automatisch Operationen wie Tröpfchengenerierung, Erkennung und Nummerierung, Kultivierung und adaptive Evolution durch. Es wird auch eine Online-Detektion (OD und Fluoreszenz) der Tröpfchen mit hoher Zeitauflösung durchführen und die zugehörigen Daten (die exportiert werden können) in der Software anzeigen. Der Bediener kann den Kultivierungsprozess je nach den Ergebnissen jederzeit stoppen und die Zieltröpfchen für nachfolgende Experimente extrahieren. Die MMC ist einfach zu bedienen, verbraucht weniger Arbeit und Reagenzien und verfügt über einen relativ hohen experimentellen Durchsatz und eine gute Datenparallelität, was im Vergleich zu herkömmlichen Anbaumethoden erhebliche Vorteile hat. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und robuste experimentelle Plattform für Forscher, um verwandte mikrobielle Forschung durchzuführen.

Protocol

1. Geräte- und Softwareinstallation Wählen Sie eine saubere und sterile Umgebung (z. B. eine saubere Bank) als dedizierten permanenten Raum für MMC. Installieren Sie die MMC stetig im Raum.HINWEIS: Halten Sie die MMC von der Interferenz starker elektrischer Felder, Magnetfelder und starker Wärmestrahlungsquellen fern. Vermeiden Sie starke Vibrationen, die die optischen Detektionskomponenten beeinträchtigen. Stellen Sie die Stromversorgung von AC220 V, 50 HZ für die MMC bereit. Weitere…

Representative Results

Dieses Protokoll verwendet E. coli MG1655 und einen MeSV2.2-Stamm als Beispiele, um die mikrobielle Kultivierung und die methanolessentielle adaptive Evolution mit einer automatisierten und relativ hohen Durchsatzstrategie in MMC zu demonstrieren. Die Messung der Wachstumskurve wurde hauptsächlich zur Charakterisierung der mikrobiellen Kultivierung verwendet. Die adaptive Evolution wurde durch automatisierte kontinuierliche Subkultivierung und Zugabe einer hohen Konzentration von Methanol als Selektionsdruck w?…

Discussion

Dieses Protokoll zeigt, wie das mikrobielle Tröpfchenkultursystem (MMC) verwendet werden kann, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und langfristige adaptive Evolution durchzuführen. MMC ist ein miniaturisiertes, automatisiertes und mikrobielles Hochdurchsatz-Kultivierungssystem. Im Vergleich zu herkömmlichen mikrobiellen Hochdurchsatz-Kultivierungsmethoden und -instrumenten bietet MMC viele Vorteile wie geringen Arbeits- und Reagenzverbrauch, einfache Bedienung, Online-Detektion (OD und Fluoreszenz), hochz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), dem National Key Scientific Instrument and Equipment Project der National Natural Science Foundation of China (21627812) und dem Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108) unterstützt. Wir danken auch Prof. Julia A. Vorholt (Institut für Mikrobiologie, Departement Biologie, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) für die Bereitstellung des methanolessentiellen E. coli-Stammes Version 2.2 (MeSV2.2).

Materials

0.22 μm PVDF filter membrane Merck Millipore Ltd. SLGPR33RB Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator Haier BCD-289BSW For reagent storage
Agar Becton, Dickinson and Company 214010 For solid plate preparation
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20011160 Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. DL-CJ-INDII For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10007216 Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer Lenovo E450 Software installation and MMC control
Constant temperature incubator Shanghai qixin scientific instrument co., LTD LRH 250 For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10008218 Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance OHAUS AR 3130 For reagent weighing
EP tube Thermo Fisher 1.5 mL For droplet collection
FeCl3·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10011928 Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube Thermo Fisher 2.0 mL For strain preservation
Gluconate Sigma-Aldrich S2054 Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol GENERAL-REAGENT G66258A For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot SANYO Electric MLS3020 For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) Biotopped 420322 Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate Solarbio K8020 Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4 MACKLIN P815661 Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol MACKLIN M813895 Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O BIOBYING 1305715 Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-ALE-OD For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-M/S-OD The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20026118 Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl GENERAL-REAGENT G81793J Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O GENERAL-REAGENT G10267B Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10001518 Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish Corning Incorporated 90 mm For the preparation of solid medium
Pipette eppendorf 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL For liquid handling
Quick connector A Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-PCB Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask Union-Biotech 50 mL For microbial cultivation
Shaking incubator Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. SKY-210 2B For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate Solarbio S8290 Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD 10 mL Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle OUBEL Hardware Store 22G Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone Oxoid Ltd. LP0042 Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator SANYO Ultra-low MDF-U4086S For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer General Electric Company Ultrospec 3100 pro For the measurement of OD values
Vitamin B1 Solarbio SV8080 Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract Oxoid Ltd. LP0021 Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10024018 Component of the special medium for MeSV2.2.

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Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. L., Xing, X., Wang, L., Zhang, C. Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC). J. Vis. Exp. (180), e62800, doi:10.3791/62800 (2022).

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