微生物微小液滴培養システム(MMC)を用いた微生物の自動培養と適応進化
Summary
このプロトコルは、微生物微小液滴培養システム(MMC)を使用して、自動微生物培養および適応進化を行う方法を説明しています。MMCは、微生物を自動的かつ継続的に培養および再培養し、比較的高いスループットと良好な並列化で微生物の成長をオンラインで監視し、労力と試薬の消費を削減することができます。
Abstract
従来の微生物培養方法は、通常、煩雑な操作、低スループット、低効率、および労力および試薬の大量消費を有する。また、近年開発されたマイクロプレートベースのハイスループット培養法は、溶存酸素が低く、混合性が悪く、蒸発や熱の影響が激しいため、微生物の生育状況や実験の並列化が劣っています。小容量、高スループット、強力な制御性などの微小液滴の多くの利点により、液滴ベースのマイクロ流体技術は、ハイスループット微生物培養、スクリーニング、および進化の多くの種類の研究に使用されているこれらの問題を克服することができます。しかし、ほとんどの先行研究は実験室の建設と応用の段階にとどまっています。高い運用要件、高い建設難易度、自動統合技術の欠如などのいくつかの重要な問題は、微生物研究における液滴マイクロ流体技術の幅広い適用を制限しています。ここでは、液滴マイクロ流体技術をベースとした自動微生物微小液滴培養システム(MMC)の開発に成功し、微生物液滴培養の過程で必要な接種、培養、オンラインモニタリング、副耕栽培、選別、サンプリングなどの機能の統合を実現しました。本プロトコールでは、野生型大腸菌(E. coli)MG1655とメタノール必須大腸菌株(MeSV2.2)を例にとり、MMCを用いて自動化された比較的ハイスループットな微生物培養と適応進化を行う方法を詳細に紹介した。この方法は、操作が容易であり、労力および試薬の消費が少なく、高い実験スループットおよび良好なデータ並列性を有し、従来の培養方法と比較して大きな利点を有する。これは、科学研究者が関連する微生物研究を行うための低コストで操作に優しく、結果信頼性の高い実験プラットフォームを提供します。
Introduction
微生物培養は、微生物の単離、同定、再構成、スクリーニング、および進化に広く使用されている微生物学的科学的研究および産業応用のための重要な基盤である1,2,3。従来の微生物培養方法は、主に試験管、振とうフラスコ、固体プレートを培養容器として使用し、振とう培養器、分光光度計、マイクロプレートリーダーなどの微生物培養・検出・スクリーニング装置と組み合わせていました。しかしながら、これらの方法は、煩雑な操作、低スループット、低効率、および労力および試薬の大量消費など、多くの問題を有する。近年開発されているハイスループット栽培法は、主にマイクロプレートをベースとしています。しかし、マイクロプレートは、低レベルの溶存酸素、貧弱な混合特性、および重度の蒸発および熱効果を有し、これはしばしば微生物の増殖状態および実験並列化をもたらす4,5,6,7;一方、自動栽培とプロセス検出を達成するためには、液体処理ワークステーションやマイクロプレートリーダーなどの高価な機器を装備する必要があります8,9。
マイクロ流体技術の重要な分野として、液滴マイクロ流体は、従来の連続流マイクロ流体システムに基づいて近年開発されている。これは、2つの非混和性液相(通常は油水)を使用して分散マイクロ液滴を生成し、それらを操作する離散流マイクロ流体技術です10。微小液滴は、小体積、大比表面積、高い内部物質移動速度、区画化による交差汚染がないという特徴と、液滴の強力な制御性と高スループットの利点を有するため、微生物のハイスループット培養、スクリーニング、進化に液滴マイクロ流体技術を適用した多くの種類の研究が行われています11.しかし、液滴マイクロ流体技術を普及させ、広く適用するための一連の重要な課題がまだあります。第一に、液滴マイクロフルイディクスの操作は煩雑で複雑であり、オペレータにとって高い技術的要件をもたらす。第二に、液滴マイクロ流体技術は、光学、機械、および電気コンポーネントを組み合わせており、バイオテクノロジーの応用シナリオに関連付ける必要があります。学際的なコラボレーションがなければ、単一の研究室やチームが効率的な液滴マイクロ流体制御システムを構築することは困難です。第3に、微小液滴量(ピコリター(pL)からマイクロリットル(μL)まで)が少ないため、転耕栽培、選別、サンプリングなどのいくつかの基本的な微生物操作において、液滴の正確な自動制御とリアルタイムのオンライン検出を実現することは非常に困難であり、統合機器システム12を構築することも困難である。
上記課題に対処するため、液滴マイクロ流体技術13に基づく微生物自動微小液滴培養システム(MMC)の開発に成功した。MMCは、液滴認識モジュール、液滴スペクトル検出モジュール、マイクロ流体チップモジュール、サンプリングモジュールの4つの機能モジュールで構成されています。すべてのモジュールのシステム統合と制御により、液滴の生成、培養、測定(光学密度(OD)と蛍光)、分割、融合、選別などの自動操作システムを正確に確立し、微生物液滴培養の過程で必要な接種、培養、監視、副耕作、選別、サンプリングなどの機能の統合を実現します。MMCは、2〜3μL容量の200複製液滴培養ユニットまで保持することができ、これは200シェイクフラスコ栽培ユニットに相当する。微小液滴培養システムは、微生物の増殖中の非汚染、溶存酸素、混合、および質量エネルギー交換の要件を満たすことができ、成長曲線測定、適応進化、単一因子マルチレベル分析、代謝産物研究および分析(蛍光検出に基づく)13,14などの複数の統合機能を通じて微生物研究のさまざまなニーズを満たすことができます。
ここでは、MMCを使用して自動微生物培養と適応進化を行う方法を詳細に紹介しています(図1)。増殖曲線測定を実証するために野生型大腸菌(E. coli)MG1655を例にとり、MMCにおける適応進化を実証するためにメタノール必須大腸菌株MeSV2.215を採った。MMC用の操作ソフトウェアを開発し、操作を非常に簡単で明確にしました。全プロセスにおいて、ユーザーは最初の細菌溶液を調製し、MMCの条件を設定し、次いで細菌溶液および関連試薬をMMCに注入する必要がある。その後、MMCは液滴生成、認識とナンバリング、栽培、適応進化などの操作を自動的に実行します。また、液滴のオンライン検出(ODおよび蛍光)を高い時間分解能で実行し、関連データ(エクスポート可能)をソフトウェアに表示します。操作者は、結果に応じていつでも培養工程を停止し、その後の実験のために標的液滴を抽出することができる。MMCは操作が容易で、労力と試薬の消費が少なく、比較的高い実験スループットと良好なデータ並列性を有し、従来の培養方法と比較して大きな利点を有する。これは、研究者が関連する微生物研究を行うための低コストで操作に優しく、堅牢な実験プラットフォームを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、微生物微小液滴培養システム(MMC)を使用して、自動微生物培養および長期的な適応進化を実行する方法を提示する。MMCは、小型化、自動化、ハイスループットの微生物培養システムです。従来の微生物ハイスループット培養方法や機器と比較して、MMCは、低労力および試薬消費、簡単な操作、オンライン検出(ODおよび蛍光)、高時間分解能データ収集、および優れた並列化?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家基幹研究開発プログラム(2018YFA0901500)、中国国家自然科学財団国家基幹科学機器プロジェクト(21627812)、清華大学イニシアチブ科学研究プログラム(20161080108)の支援を受けた。我々はまた、メタノール必須 大腸菌 株バージョン2.2(MeSV2.2)の提供について、ジュリア・A・フォルホルト教授(微生物学研究所、生物学部、ETHチューリッヒ、チューリッヒ8093、スイス)にも感謝する。
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
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